CN120699945A - 一种高活性青霉素g酰化酶突变体、编码核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶催化技术领域，尤其涉及一种高活性青霉素G酰化酶突变体、编码核苷酸及其应用。该突变体与SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列相比，突变方式为：F71βY；或F146αK & F71βY；或F146αK & F71βY & N241βK；或F146αK & F71βY & N241βK & G385βY。本发明通过定点突变，获得了水解活力与合成活力强，两种酶活性相协调的青霉素酰化酶突变体。可用于β‑内酰胺类抗生素的合成生产，特别是催化青霉素钾盐等一步法制备阿莫西林，避免中间体6‑APA的分离。本发明为β‑内酰胺抗生素的高效制备提供关键酶，将极大推进β‑内酰胺抗生素制备技术革新。

Description

一种高活性青霉素G酰化酶突变体、编码核苷酸及其应用

本申请是申请号为202411396069.0，申请日为2024.10.08日，发明名称为《一种青霉素酰化酶突变体及其应用》的中国发明专利的分案申请。

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，尤其涉及一种高活性青霉素G酰化酶突变体、编码核苷酸及其应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素（β-lactams）是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，该类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点。但是，天然存在的β-内酰胺类抗生素（如青霉素与头孢菌素）有抗菌谱窄、不耐酸、容易产生抗药性和容易引起过敏反应等缺点。而半合成β-内酰胺类抗生素如半合成青霉素、半合成头孢菌素克服了这些缺点，已成为当前医疗领域主要使用的抗生素。

利用酶催化技术制备半合成β-内酰胺类抗生素，可以更高效、绿色可持续地生产半合成β-内酰胺抗生素，制备的产品质量优于传统化学合成法。青霉素酰化酶是催化该类产品合成的关键酶。酶催化合成半合成青霉素如氨苄青霉素、阿莫西林等当前主要由两步工艺组成，即先由水解用青霉素酰化酶催化青霉素及其盐（制备6-APA（6-氨基青霉烷酸），再由合成用青霉素酰化酶催化6-APA与酰基供体侧链（如D-对羟基苯甘氨酸甲酯）反应制备半合成β-内酰胺类抗生素。而半合成头孢菌素主要是由青霉素酰化酶催化头孢菌素中间体母核如7-ACA、7-ADCA与酰基供体反应。青霉素酰化酶(Penicillin Acylase, PA，EC3.5.1.11)是该制备技术的关键酶。当前现有技术均使用水解用青霉素酰化酶与合成用青霉素酰化酶两种酶分步分别催化水解制备6-APA（或7-ACA、7-ADCA）以及中间体母核与侧链合成两步反应。两步反应不仅反应过程长，且需要对中间体进行分离，生产工艺较复杂。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组青霉素G酰化酶、编码核苷酸及其应用，目的在于解决现有技术中的问题。本发明提供的突变体能够催化包括青霉素或者头孢菌素等β-内酰胺原料、活化的酰基供体反应合成半合成β-内酰胺类抗生素，包括半合成青霉素和半合成头孢菌素，实现半合成β-内酰胺类抗生素的快速高效合成新技术。

本发明是这样实现的，一种青霉素G酰化酶突变体，与SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列相比，包含以下突变位点中的至少一种：F146αK、F24βR、F71βY、N241βK、G385βY、G385βR。氨基酸简写代号说明：F：苯丙氨酸；K：赖氨酸；R：精氨酸；Y：酪氨酸；N：天冬酰胺；G：甘氨酸。

本发明还保护编码上述任一种青霉素酰化酶突变体的核苷酸。

本发明还提供了如上述的青霉素酰化酶突变体在制备β-内酰胺类抗生素中的应用。

进一步地，β-内酰胺类抗生素包括半合成青霉素、半合成头孢菌素。半合成青霉素包括阿莫西林、氨苄青霉素或匹氨青霉素；半合成头孢菌素包括头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢唑林、头孢尼西克、头孢噻吩或头孢甘酸。

进一步地，仅使用青霉素酰化酶突变体中的任一种作为反应体系中的唯一一种青霉素酰化酶，催化青霉素钾盐与酰基供体反应，一步合成半合成青霉素类β-内酰胺类抗生素。

进一步地，酰基供体包括苯甘氨酸甲酯或对羟基苯甘氨酸甲酯。

进一步地，使用青霉素酰化酶突变体中的任一种作为青霉素酰化酶，催化7-ACCA或7-ADCA，与苯甘氨酸甲酯反应，合成半合成头孢菌素类β-内酰胺类抗生素。

本发明将野生型青霉素酰化酶原底物结合区域的氨基酸进行突变，提高与底物的结合性能，减少底物结合位阻效应；同时将活性中心的底物-活性位点过渡态自由能降低促进中间态向产物转化，从而促进终产物的积累，最终大幅提高青霉素酰化酶合成半合成β-内酰胺类抗生素的能力。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过对嗜柠檬酸克鲁维氏菌（Kluyvera citrophila）来源的青霉素酰化酶进行突变，获得了水解活力与合成活力强，两种活性相协调、稳定性更好的青霉素酰化酶突变体。可用于β-内酰胺类抗生素如半合成青霉素类（如阿莫西林、氨苄青霉素或匹氨青霉素）、半合成头孢菌素类（如头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定）的合成，以及由青霉素钾盐等一步法制备（合成）阿莫西林、氨苄青霉素，避免6-APA等中间体的分离。本发明为β-内酰胺类抗生素的高效制备提供关键酶，将极大推进β-内酰胺抗生素制备技术革新。

附图说明

图1是野生型青霉素酰化酶氨基酸序列；

图2是重组质粒pET28a-kcPA的构建示意图；

图3是重组质粒PCR琼脂糖电泳检测图；

图4是E. coli BL21(DE3)/pET28a-kcPA菌体表达蛋白SDS-PAGE电泳图；

图5是实施例3中KcPA催化青霉素钾盐一步合成阿莫西林HPLC色谱图；

图6是实施例4反应过程中各物质含量变化；

图7是实施例5反应过程中各物质含量变化；

图8是实施例6反应过程中各物质含量变化；

图9是实施例7反应过程中各物质含量变化。

具体实施方式

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30°C，最好是15～25°C。缩写含义如下：“min”表示分钟，“s”表示秒，“U”表示酶活单位，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“rpm”表示转每分钟，“mol”表示摩尔，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“g”表示克，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“bp”表示碱基对，LB培养基表示Luria-Bertani培养基，Kan50表示培养基含50 μg/mL卡拉霉素。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（中文版）（J.萨姆布鲁克、M.R.格林编，贺福初译. 第四版，北京：科学出版社，2017年）及New England Biolabs（NEB）试剂盒中所述的方法进行。

本发明披露了一种青霉素酰化酶突变体及其应用。本发明提供的技术方案可避免中间体的分离，极大地简化生产过程，同时可提高反应产物收率，显著地节约生产成本，使半合成抗生素产业产生革命性变革。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

嗜柠檬酸克鲁维氏菌（Kluyvera citrophila）青霉素酰化酶突变体的构建、原核表达及功能鉴定

1、野生型PA表达载体pET28a-kcPA构建

本实施例中使用的野生型青霉素酰化酶来源于嗜柠檬酸克鲁维氏菌（Kluyveracitrophila）K. citrophila ATCC21285，其氨基酸序列见SEQ ID NO. 1。该氨基酸序列由四部分组成，从蛋白质的N端到C端依次为：第1～26位为信号肽，第27～235位为209 个氨基酸组成的α亚基、第236～289位由54个氨基酸组成的中间连接肽，第290～846位由557 个氨基酸组成的β亚基（同时见图1，其中单下划线部分为α亚基、波浪线部分为连接肽、双下划线部分为β亚基），核苷酸序列见SEQ ID NO. 2。

重组质粒pET28a-kcPA的构建示意图如图2所示。以K. citrophila ATCC21285基因组为模板，根据PA核苷酸序列（SEQ ID NO. 2）设计引物，正向引物（Forward primer）为：5'-CGG/AATTCATGAAAAACCGCAATCGCAT-3'，SEQ ID NO. 3；反向引物（Reverse primer）为5'-CCA/AGCTTTTAGCGCTGCACCTGCAGC-3'，SEQ ID NO. 4。分别引入EcoR I和HindIII限制性酶切位点（带下划线的碱基为限制性内切酶识别位点），利用PCR扩增出PA野生型目的片段。

PCR反应体系：

PCR 温度程序设计为：

选择EcoRI和HindIII两个限制性内切酶对质粒pET28a空白载体和目的片段进行双酶切。双酶切体系：

双酶切在37℃下反应1 h，再在80℃下失活20 min。将双酶切产物纯化回收，并根据其凝胶电泳图估算浓度，得到质粒pET28a的浓度约为50 ng/μL，目的基因kcPA的浓度约为140 ng/μL。

使用T4 DNA连接酶在16℃金属浴下对双酶切产物过夜连接，得到重组质粒pET28a-kcPA，将其热转入感受态细胞E. coli DH5α中。

目的片段与线性化载体连接体系：

为验证重组质粒是否成功转入，从含Kan50的LB平板上挑取单菌落至含Kan50的LB液体培养基中，次日使用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行PCR鉴定，利用琼脂糖电泳获得2500bp的目的条带（如图3）。对验证确认的表达载体pET28a-kcPA转化E. coli BL21(DE3)获得野生型PA的表达重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-kcPA。

2、突变体表达载体的获得

本实施例中通过定点突变共获得18个突变体，如下表所示，其中，“F146αK”表示α亚基上第146位氨基酸由F突变为K，其他突变位点的解释与此同理。

表1 突变体及对应的突变位点

首先设计各突变位点对应的引物，再以PA野生型目的片段为初始模版，利用定点突变试剂盒（NEB Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit（Q5 SDM Kit））进行定点突变。各突变位点引物如下（小写字母为突变位点碱基）：

引物交由核酸合成公司合成，然后用无菌水溶解，之后按照试剂盒进行操作。如下：

利用PCR对相应位点进行突变

PCR反应体系：

循环程序温度：

对于有2个以上突变位点的突变体，以获得的前一突变位点PCR产物为模版，逐次进行相应位点的定点突变。

Kinase, Ligase & DpnI (KLD)（激酶、连接酶和 DpnI 的特殊混合液）反应处理

反应体系如下：

室温下反应5min。

热激法转化

将5 μL KLD反应混合物加入50 μL化学感受态细胞E. coli BL21(DE3)混悬液中，在冰上孵育30 min，在42℃下热休克30 s，在冰上孵育5 min，加入950 μL SOC无菌液体培养基，37℃下轻轻摇晃1 h。将40-100 μL菌悬液涂布分散在Kan50的LB平板上，在37℃下孵育过夜，长出的单菌落为相应突变体表达菌株，分别命名为E. coli BL21(DE3)/pET28a-kcPA01~18

突变体鉴定

将获得的突变体表达菌株接种到25 mL含Kan50 LB液体培养基中，37℃培养过夜，利用质粒提取试剂盒提取质粒。送至第三方生物公司测序，确定对应产物为定点突变的目标产物。

3、野生型及突变体KcPA的表达

构建的重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-kcPA与E. coli BL21(DE3)/pET28a-kcPA01~18接种于Kan50的LB琼脂平板上，在37℃培养箱培养12-16 h。分别挑取单菌落，接种到25 mL添加Kan50的LB液体培养基中，在37℃、300 rpmin摇床上过夜培养。吸取500 μL菌液转接至50 mL Kan50的 LB液体培养基中，在37℃，280 rpmin摇床培养，监测OD₆₀₀的变化，在达到0.6-0.8时，加入IPTG溶液，使IPTG诱导浓度为0.3 mM，在25℃，220 rpm摇床内诱导表达10 h，离心发酵液收集菌体。将收集好的菌体细胞悬浮pH 7.5的PBS缓冲液冰上预冷10 min，随后在4℃，12000 rpmin的条件下离心6 min收集菌体。菌体加入50 mMpH 7.5的PBS缓冲液对离心管内菌体重悬，再在4℃，12000 rpm的条件下离心6 min，弃上清，收集最后的菌体以0.01 g/mL浓度进行重悬，使用超声波破碎仪对细胞进行破碎。破胞条件为：冰水浴，在400 W功率下，每个循环工作3 s，间歇5 s，共循环80次。破碎后混合物在4℃，12000 rpm条件下离心15 min，得到上清液即为粗酶液，收集粗酶液，利用SDS-PAGE对表达蛋白进行分析。

图4为菌体表达的蛋白质SDS-PAGE图；其中，泳道M为蛋白Marker；Lane 1: E.coli BL21(DE3)/pET28a表达上清液；Lane 2: E. coli BL21(DE3)/pET28a-kcPA未诱导上清液；Lane 3: 未诱导E. coli BL21(DE3)/pET28a-kcPA18上清液；Lane 4: IPTG诱导 E.coli BL21(DE3)/ pET28a-kcPA18上清液。

实施例2

1、KcPA水解活力的测定

测定的原理为：青霉素（PGK）钾盐在KcPA的作用下水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)和苯乙酸，6-APA在酸性条件下与对二甲氨基苯甲醛（PDAB）生成黄绿色物质，该物质在415nm处有最大吸收峰。酶活定义：在28℃、0.1 M的PBS缓冲液中，青霉素酰化酶催化20 mg/mL PGK，每分钟生成1 μmol 6-APA所需要的酶量为1个单位KcPA酶活，单位为U。

分别称取0.5 g PGK溶于上述缓冲溶液中，并定容至25 mL。吸取2 mL PGK溶液于离心管中，加入0.1 mL KcPA酶液。设置对照组为不加KcPA，其他条件保持一致。

将上述反应体系置于28℃、200 rpm水浴摇床内反应10 min，反应结束90℃水浴2min失活酶，取200 μL反应后溶液加入3 mL pH为3.0、0.1 M柠檬酸钠缓冲液，加入1 mL的显色液（0.5% PDAB），室温静置3 min后于415 nm处测吸光值。根据6-APA标准曲线得出反应后样品内6-APA浓度，根据公式计算出酶活，即水解活力。

计算公式：每mL青霉素酰化酶水解酶活

式中，C_6-APA：样品内6-APA浓度，μmol/L；V：反应体系体积，mL；V_E：加入青霉素酰化酶量，mL；t：反应时间，10 min。

2、KcPA合成活力的测定

6-氨基青霉烷酸（6-APA）和对羟基苯甘氨酸甲酯（DHPGM）在KcPA的作用下合成阿莫西林，通过高效液相色谱法即可测定阿莫西林含量从而计算出PA合成活力。酶活定义为：在一定条件下，单位青霉素酰化酶每分钟催化生成1 μmol的阿莫西林为1个合成酶活单位，用U表示。

称取1 g 6-APA和1.25 g D-HPGM溶于50 mL、0.1M、pH 6.3的PBS缓冲液中，调节pH至6.3，然后用上述缓冲溶液定容至100 mL。取0.1 mL KcPA，加入上述溶液中，在25℃、200rpm的条件下开始反应30 min，放入90℃水浴2 min失活酶结束反应，取0.5 mL反应液0.22μm的水系滤膜过滤，利用磷酸缓冲液定容至100 mL进行HPLC检测，得到阿莫西林含量。酶活计算公式：每mL青霉素酰化酶合成酶活。式中：V：反应液体积，mL； 200：稀释倍数；C_样：阿莫西林摩尔浓度，μmol/L；V_E：加入酶的体积mL；t：反应时间，min。

HPLC检测条件为：Agilent ZORBAX SB-C18 4.6x250 mm色谱柱，柱温25℃。进样量10 μL。流动相A（0.02 M pH4.7的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液）、流动相B（甲醇），开始由90% 的流动相A和10%的流动相B保持5min，5min ~7min 流动相B由10%升至50%其后保持10 min，17~19 min流动相B由50%降至10%，最后再由90% 的流动相A和10%的流动相B平衡5min，总流量为1 mL/min。

表2突变体与野生型活性比较

注：重组菌表达的KcPA野生型的水解活力为15 U/mL（发酵液），合成活力为80 U/mL。为了方便比较在表2中把KcPA野生型的酶活定义为100，各突变体与其进行比较。

由上表可知，对于单突变位点的突变体而言，各突变体的水解活性及合成活性相较于野生型均有明显提高，特别是α亚基上的F146αK突变体及β亚基上的G385βR突变体。单点F146αK突变体的水解活性及合成活性分别是野生型的5.8倍与15.3倍；G385βR突变体水解活性及合成活性分别是野生型的4.6倍与约11.2倍。G385βY突变体与G385βR突变体相比，G385βY突变体的水解活性更高，但是其合成活性并不突出。各突变位点叠加突变时，突变体的酶活性较单点突变有所增加，特别是五点突变体F146αK & F24βR & F71βY & N241βK &G385βR，水解活性及合成活性均较高。

实施例3

各突变体及野生型青霉素酰化酶催化PGK一步法合成阿莫西林

在pH7.0的PBS缓冲液中加入PGK使其浓度达到200 mM，同时加入对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPGM)使其终浓度为300 mM，加入酶量为30 U/mL（以合成酶活性计算），在28℃恒温搅拌反应3 h。反应结束后进行HPLC检测，计算阿莫西林收率。

HPLC检测条件为：Agilent ZORBAX SB-C18 4.6x250 mm色谱柱，柱温25℃。进样量10 μL。流动相A（0.02 M pH4.7的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液）、流动相B（甲醇），开始由90% 的流动相A和10%的流动相B保持5min，5min ~7min 流动相B由10%升至50%其后保持10 min，17~19 min流动相B由50%降至10%，最后再由90% 的流动相A和10%的流动相B平衡5min，总流量为1 mL/min。反应式如下：

突变体KcPA 18的HPLC检测图谱如图5所示，其中DHPG为D-对羟基苯甘氨酸，AMOX为阿莫西林，DHPGM为D-对羟基苯甘氨酸甲酯，PAA为苯乙酸，PGK为青霉素钾盐。由图中可以看出，中间产物6-APA的含量极低，几乎没有。

表3 各突变体催化合成阿莫西林的收率

由上表中的结果可知，各突变体均能够在一个反应体系中催化青霉素钾与对羟基苯甘氨酸甲酯反应，一步合成阿莫西林，且产物收率较野生型明显提高。

实施例4

KcPA18催化PGK一步法合成阿莫西林

反应体系与实施例3相比，区别仅在于：本实施例中PBS缓冲液pH为7.5。HPLC检测条件与实施例3中相同。

反应过程中各物质含量变化如图6，反应收率98%。

实施例5

KcPA18催化PGK一步法合成氨苄青霉素

在pH7.5的PBS缓冲液中加入PGK使其浓度达到240 mM，同时加入苯甘氨酸甲酯(D-PGM)使其终浓度为480 mM，加入酶量为30U/mL（以合成酶活性计算），在25℃恒温搅拌反应3h，反应过程中定时取样检测。

HPLC检测条件与实施例3中相同，反应式如下：

反应过程中各物质含量变化如图7，反应收率98%。

实施例6

KcPA18催化7-ACCA合成头孢克洛

在pH7.5的PBS缓冲液中加入7-ACCA使其浓度达到200 mM，同时加入苯甘氨酸甲酯（D-PGM）使其终浓度为240 mM，加入酶量为20 U/mL（以合成酶活性计算），在15℃恒温搅拌反应2.25 h，反应过程中定时取样检测。

HPLC分析条件为，使用0 .01M磷酸钠（pH6 .8）和甲醇（95:5）作为流动相，流量为1.0 mL/min，Agilent ZORBAX SB-C18 4.6x250 mm色谱柱，进样量10 μL。反应式如下：

反应过程中各物质含量变化如图8，反应收率95%。

实施例7

KcPA18催化7-ADCA合成头孢拉定反应效果

在pH8.0的PBS缓冲液中加入7-ADCA使其浓度达到180 mM，同时加入苯甘氨酸甲酯(D-PGM)使其终浓度为270 mM，加入酶量为25 U/mL（以合成酶活性计算），在10℃恒温搅拌反应2.25 h，反应过程中定时取样检测。

HPLC分析条件为，使用0 .01M磷酸钠(pH5.5)和甲醇(93:7)作为流动相，流量为1.0 mL/min，Agilent ZORBAX SB-C18 4.6x250 mm色谱柱，进样量10 μL。反应式如下：

反应过程中各物质含量变化如图9，反应收率99%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高活性青霉素G酰化酶突变体，其特征在于：与SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列相比，突变方式为：F71βY；或F146αK & F71βY；或F146αK & F71βY & N241βK；或F146αK &F71βY & N241βK & G385βY。

2.编码如权利要求1所述的青霉素G酰化酶的核苷酸。

3.如权利要求1所述的青霉素G酰化酶在制备β-内酰胺类抗生素中的应用，所述β-内酰胺类抗生素包括阿莫西林、氨苄青霉素、头孢克洛或头孢拉定。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：仅使用所述青霉素G酰化酶作为反应体系中的唯一一种酶，催化青霉素钾盐与酰基供体反应，一步合成半合成青霉素类β-内酰胺类抗生素；所述酰基供体包括苯甘氨酸甲酯或对羟基苯甘氨酸甲酯。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：使用所述青霉素G酰化酶作为青霉素酰化酶，催化7-ACCA或7-ADCA，与苯甘氨酸甲酯反应，合成半合成头孢菌素类β-内酰胺类抗生素。