CN120699939A

CN120699939A - 具有改善的稳定性的新玻尿酸酶变体及含有其的药物组合物

Info

Publication number: CN120699939A
Application number: CN202510864007.6A
Authority: CN
Inventors: 朴淳宰; 郑惠信; 李承柱; 金奎完; 宋炯楠; 柳善儿; 李昌禹
Original assignee: Alteogen Inc
Current assignee: Alteogen Inc
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2025-09-26
Also published as: CN113840921A; KR20220069045A; WO2021150079A1; US20230250408A1; AU2021211348B2; TW202302845A; BR112021022739A2; CA3137324A1; TW202140780A; EP3992285A1; AU2024200091A1; KR20250065714A; CN120966799A; JP2024095673A; ZA202206370B; KR102801434B1; JP2022552756A; EP3992285A4; MX2022008060A; AU2021211348A1

Abstract

本申请涉及具有改善的稳定性的新玻尿酸酶变体及含有其的药物组合物。本申请公开了新颖的PH20变体或其片段，具有改善热稳定性及酶活性的人类玻尿酸酶，其中玻尿酸酶为水解玻尿酸的酶，尤其是关于在具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的变体中包含一个或多个氨基酸残基取代的PH20变体或其片段，其中一或多氨基酸残基在N端及/或C端更被选择性地删除。

Description

具有改善的稳定性的新玻尿酸酶变体及含有其的药物组合物

相关申请

本申请为2021年11月11日提交的、发明名称为“具有改善的稳定性的新玻尿酸酶变体及含有其的药物组合物”、申请号为202180003323.4的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明是关于新颖人类PH20变体或其片段，其相较于人类玻尿酸酶(hyaluronidase)具有增加的酶活性及热稳定性，其中所述玻尿酸酶为一种水解玻尿酸(hyaluronic acid)的酶。本发明尤其是关于在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的玻尿酸酶变体中包含一或多氨基酸残基取代(substitution)、删除(deletion)及/或插入(insertion)的PH20变体或其片段，且其中一或多氨基酸残基选择性地被从N端及/或C端删除，用于制造所述PH20变体或其片段的方法，及包含所述PH20变体或其片段的药物组合物。

背景技术

人类皮肤是由表皮、真皮及皮下脂肪层组成，且皮肤中有六种醣胺聚多醣(glycosaminoglycan)。这些醣胺聚多醣包含玻尿酸、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素(heparin)及硫酸角质素(keratin sulfate)。

这些醣胺聚多醣是由重复的双醣糖单元(disaccharide sugar unit)组成。各醣胺聚多醣中的重复的双醣糖单元的数量有所不同，但其差异量的范围是从几百个至几千个。在这些醣胺聚多醣中，玻尿酸在皮肤中的含量占人体的一半以上。玻尿酸是由细胞膜中的玻尿酸合成酶所合成，为单独存在而不与蛋白多醣(proteoglycans)结合，且为唯一不具有硫酸盐基团(sulfate group)的醣胺聚多醣。其他醣胺聚多醣与蛋白多醣结合，且具有硫酸盐基团。玻尿酸由透过β-1，4及p-1，3链交替连接的葡萄糖醛酸(glucuronic acid)及N-乙酰葡萄胺糖(N-acetylglucosamine)组成，且由这些双醣的5000个重复单元构成。已知的是，人体中每天约有三分之一(5g)的玻尿酸被降解。

玻尿酸酶为降解细胞外基质(extracellular matrix)中的玻尿酸的酶。六个已知的人类玻尿酸酶基因：Hyal1、Hyal2、Hyal3、Hyal4、HyalPS1及PH20/SPAM1。人类的Hyal1及Hyal2基因表达在多数组织中。PH20/SPAM1(以下简称PH20)表达在精子细胞膜(spermplasma membrane)及顶体膜(acrosomal membrane)。然而，HyalPS1因其为假基因(pseudogene)而未被表达。取决于玻尿酸的切割方法，玻尿酸酶被分为三类：利用水分子(H₂O)切割N-乙酰葡萄胺糖与葡萄糖醛酸之间的β-1，4链的酶(EC 3.2.1.35)；利用水分子切割N-乙酰葡萄胺糖与葡萄糖醛酸之间的β-1，3链的酶(EC 3.2.1.36)；以及不使用水分子切割β-1，4链的细菌型(bacterial)玻尿酸酶(EC 4.2.99.1)。

Hyal1的催化氨基酸(catalytic amino acid)为透过底物辅助催化(substrate-assisted catalysis)水解玻尿酸的D129及E131。Hyal1在酸性pH值3至4下表达出最优选活性，在pH值4.5或以上不具有活性。相较于Hyal1，PH20在广泛的pH值范围3至8皆表现出活性。

Arming等人辨识出PH20的催化氨基酸为D111及E113(Arming等人，1997)。Arming等人指定Leu为PH20的第一个氨基酸，其中信号肽(signalpeptide)等被移除，并因此包含信号肽的PH20的催化氨基酸分别对应到D146及E148。

玻尿酸酶水解玻尿酸，进而降低细胞外基质中玻尿酸的粘性(viscosity)，并增加其向组织(皮肤)的渗透性。皮肤的皮下区域具有中性的pH值约7.0至7.5。因此，在玻尿酸酶的各种类型中，PH20在临床上被广泛地使用(Bookbinder等人，2006)。在PH20在临床上被使用的实例中，PH20在眼科手术中是作为眼部松弛剂及麻醉添加剂，且亦与皮下注射的抗体治疗剂被共同施用(Bookbinder等人，2006)。此外，基于玻尿酸在肿瘤中会过度表达的特性，PH20用于水解肿瘤细胞的细胞外基质中的玻尿酸，进而增加抗肿瘤治疗剂进入肿瘤细胞的机会。此外，其亦用于促进人体组织中过量存在的体液及血液的吸收。

PH20是由Lathrop等人首次在天竺鼠的精液中被辨识出来，也已知在不同物种的精子中表达。人类PH20基因是由Lin等人及Gmachl等人克隆。人类的PH20具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其由509个氨基酸残基组成，且表现出与60％的天竺鼠的PH20基因的同一性(identity)。人类的PH20酶系由SPAM1(sperm adhesion molecule-1)基因编码，且PH20的Ser490在精子细胞膜表面上及顶体膜中以与多醣磷脂肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)结合的形式存在。当精子穿过卵子富含玻尿酸的卵丘层(cumulus layer)渗透进卵子时，精子使用PH20以水解玻尿酸。PH20的含量相当于精子中蛋白质含量的1％或更少，且具有六个N-醣基化位点(N-glycosylation site)(N82、N166、N235、N254、N368及N393)。

目前可商购的PH20是透过从牛或绵羊的丸中萃取而得的。其实例包含(胎牛玻尿酸酶(bovine hyaluronidase))及(绵羊玻尿酸酶(sheephyaluronidase))。

胎牛丸玻尿酸酶(BTH)是透过在翻译后修饰(post-translationalmodification)期间，从胎牛野生型PH20在C端移除信号肽及56个氨基酸而得。BTH也是一种醣蛋白，且基于包含氨基酸在内的总成分，其甘露糖(mannose)含量为5％，葡萄糖胺(glucosamine)含量为2.2％。当动物来源的玻尿酸酶被以高剂量重复地施用于人体时，可以产生中和抗体。由于动物来源的玻尿酸酶除了PH20外还含有其他生物材料，当被施用于人体时其可能导致过敏反应(Bookbinder等人，2006)。尤其，由于担心疯牛病，从牛萃取出的PH20的制造及使用可能受到限制。为了克服这个问题，已经对人类PH20的重组蛋白进行很多研究。

人类PH20的重组蛋白已被发现在酵母(P.pastoris)、DS-2昆虫细胞及动物细胞中表达。在昆虫细胞及酵母中制造的PH20重组蛋白的N-醣基化在翻译后修饰期间的形态与人类PH20不同。

玻尿酸酶，其蛋白质结构已辨识为Hyal1(PDB ID：2PE4)(Chao等人，2007)及蜂毒玻尿酸酶(PDB ID：1FCQ，1FCU，1FCV)。Hyal1由两个结构域(domain)组成，分别为催化结构域及表皮生长因子样结构域(EGF-like domain)。催化结构域为(β/α)₈形式，其中表征蛋白质二级结构的α螺旋(α-helix)及贝他股(beta-strand)各重复八次(Chao等人，2007)。在其中Hyal1的C端以不同剪接方式的变体中，表皮生长因子样结构域完全保留。Hyal1及PH20的氨基酸序列有35.1％的同一性，且PH20的蛋白质结构尚未被发现。

人类PH20的蛋白质重组是由Halozyme Therapeutic，Inc.开发，且已被以商品名称售出(Bookbinder等人，2006；Frost，2007)。

当PH20的催化氨基酸D146及E148分别被变异为天冬酰胺(asparagine)(D146N)及麸酰胺(glutamine)(E148Q)时不存在酶活性(Arming等人，1997)。此外，当PH20的R246被麸酰胺酸(glycine)替代时，酶活性降低90％，而当E319被麸酰胺酸替代时，酶活性消失。相较于野生型PH20，在C端移除36个氨基酸(截断氨基酸474-509)的PH20的变体，其酶活性降低了75％。此突变体不是在细胞外分泌的，而是存留在希拉细胞(HeLa cell)中。在C端移除134个氨基酸的PH20的突变体不具有酶活性，且不是在细胞外分泌的。根据Frost等人，PH20的C端的477-483区对于可溶性表达(soluble expression)是不可少的(Frost，2007)。完整长度的PH20(1-509)或在C端的467位置被截断的PH20变体的活性仅为在C端的477-483其中一个位置被截断的PH20变体的10％(Frost，2007)。

重组的PH20在医学上被用为载体以促进药物在皮下的传递，以降低患有眼科疾病的病人的眼压、以在手术后推迟狭窄(stenosis)、作为分散剂(dispersant)以促进例如癌症等疾病中的化疗药物的活性、在手术中作为辅助治疗剂等。

特别是在蛋白质药物的情况下，近来，开发出了浓度范围从每1毫升(mL)有几十毫克至几百毫克不等的高剂量产品，且因此重组PH20作为载体以促进如蛋白质药物的皮下传递的应用亦增加。蛋白质药物可能有因其高浓度而造成黏度及蛋白质聚集(aggregation)程度增加进而导致的低物理稳定性的问题。此外，蛋白质聚集是不可逆的，且少量的蛋白开始聚集且聚集会形成更大的块(clump)(Sch6n等人，2015)。亦即，合并施用的重组PH20会发生聚集，进而降低蛋白质药物的稳定性。

同时，在热稳定性及表达程度上，传统的重组PH20仍是不足的。因此，产业上对具有进一步改善的生物和物理化学性质的重组玻尿酸酶的需求很大。

参考文献

Arming，S.，Strobl，B.，Wechselberger，C.，and Kreil，G.(1997).In-vitromutagenesis of PH-20 hyaluronidase from human sperm.Eur.J.Biochem.247，810-814.

Bookbinder，LH.，Hofer，A.，Haller，M.F.，Zepeda，M.L.，Keller，G.A.，Lim，J.E.，Edgington，T.S.，Shepard，H.M.，Patton，J.S.，and Frost，G.I.(2006).A recombinanthuman enzyme for enhanced interstitial transport oftherapeutics.J.Control.Release 114，230-241.

Chao，K.L.，Muthukumar，L，and Herzberg，O.(2007).Structure of humanhyaluronidase-1，a hyaluronan hydrolyzing enzyme involved in tumor growth andangiogenesis.Biochemistry 46,6911-6920.

Frost，G.I.(2007).Recombinant human玻尿酸酶hyaluronidase(rHuPH20)：anenabling platform for subcutaneous drug and fluid administration.ExpertOpin.Drug Deliv.4，427-440.

A.，Clarkson，B.R.，Siles，R.，Ross，P.，Brown，R.K.，Freire，E.(2015)Denatured state aggregation parameters derived from concentration dependenceof protein stability.Anal.Chem.488，45-50

WO 2020/022791A(2020.1.30.)

发明内容

因此，鉴于上述问题而完成本发明，本发明一目的在于提供一种PH20变体或其片段，相较于野生型PH20，尤其成熟的野生型PH20，其热稳定性、酶活性及表达程度会受到改善。

本发明另一目的在于提供一种组合物，其中组合物包含PH20变体或其片段。

根据本发明一方面，上述及其他目的能通过提供PH20变体或其片段来达成，其中PH20变体或其片段在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列之玻尿酸酶变体中包含一个或多个氨基酸残基取代、删除及/或插入，其中在N端或在C端之一个或多个氨基酸残基选择性删除。

根据本发明另一方面，提供有一种用于治疗癌症的组合物及使用其治疗癌症之方法，其中组合物包含PH20变体或其片段。

发明功效

当在CHO(ExpiCHO)细胞中表达时，根据本发明的PH20变体或其片段具有提升的蛋白质表达程度，且蛋白质聚集温度(aggregation temperature)增加约4至11.5℃，故根据本发明的PH20变体或其片段被有效地生产，且相较于成熟的野生型PH20具有更高的热稳定性。

此外，如作为量测玻尿酸酶的活性的多个测试之一的底物胶测定(substrate-gelassay)的结果，根据本发明的PH20变体或其片段具有改善蛋白质重新折迭(proteinrefold)的效果，因此与成熟的野生型PH20相比，其复性(re-nature)速度更快，且不论C端的切割位至，仍能保留原始的酶活性。

再者，根据本发明的PH20变体或其片段具有低免疫原性(immunogenicity)，而使得其能重复地施用于人体。

附图说明

从以下结合附图的详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，其中：

图1示出基于具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的PH20变体的各种变体所进行之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的结果，以下关于各变体的SDS-PAGE分析结果是透过管柱色谱法(column chromatography)纯化表达每个变体的动物细胞培养液，并对最终纯化的变体进行10％的SDS-PAGE分析而取得；

更具体地，图1A示出关于变体HM98、HM99、HM130、HM143、HM71、HM100、HM131、HM72、HM101及HM114的SDS-PAGE的结果；

图1B示出关于变体HM63、HM102、HM115、HM64、HM103、HM116、HM125、HM132、HM65、HM133、HM144、HM104及HM117的SDS-PAGE的结果；

图1C示出关于变体HM66、HM105、HM134、HM76、HM106、HM135、HM136及HM67的SDS-PAGE胶的结果；

图1D示出关于变体HM82、HM83、HM84、HM85、HM86、HM88、HM89、HM107、HM118、HM90、HM91、HM92、HM93、HM94及HM95的SDS-PAGE的结果；

图1E示出关于变体HM73、HM111、HM121、HM139、HM74、HM112及HM140的SDS-PAGE的结果；

图1F示出关于变体HM75、HM141、HM145、HM70、HM77、HM142、HM78、HM79、HM96、HM146、HM147、HM149及HM150的SDS-PAGE的结果；

图2示出成熟的野生型PH20、Hyal2变体、Hyal3变体及Hyal4变体的表达程度，其中Hyal2变体、Hyal3变体及Hyal4变体为野生型PH20的区域M345至I361分别被替换为Hyal2、Hyal3及Hyal4的对应序列，其中SDS-PAGE的行CS为培养液样本，SDS-PAGE的行FT为组氨酸标签(HisTag)柱的未结合的杂质，而行E为HisTag柱的析出液；

图3示出基于具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的PH20变体，对各种变体进行SDS-PAGE分析的结果，以下关于各变体的SDS-PAGE分析结果是透过管柱色谱法纯化表达每个变体的动物细胞培养液，并对最终纯化的变体进行10％的SDS-PAGE分析而取得；

图3A示出关于变体HM152、HM153、HM154、HM155、HM156、HM157、HM158、HM159、HM160、HM161、HM162、HM163、HM164、HM165、HM166、HM167、HM168及HM169的SDS-PAGE的结果；

图3B示出关于变体HM170、HM171、HM172、HM173、HM174、HM175、HM176、HM177、HM178、HM179、HM180、HM181、HM182、HM183、HM184、HM185及HM186的SDS-PAGE的结果；

图3C示出关于变体HM190、HM191、HM192、HM193、HM194、HM195、HM196、HM197、HM198、HM199、HM203、HM204及HM205的SDS-PAGE的结果；

图3D示出关于变体HM208、HM210、HM211、HM212、HM213、HM214、HM216、HM217、HM218、HM219及HM220的SDS-PAGE的结果；

图3E示出关于变体HM231、HM232、HM233、HM234、HM235、HM243、HM245及HM246的SDS-PAGE的结果；

图3F示出关于变体HM254、HM261、HM262、HM263、HM266、HM268、HM271、HM275、HM276、HM279、HM280、HM287及HM288的SDS-PAGE的结果；以及

图4示出SDS-PAGE的结果，确认了野生型PH20(L36-Y482)及具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的PH20变体(F38-F468)的热稳定性，其中行A、B、C及D示出以下的SDS-PAGE分析的结果：关于初始的野生型PH20(行A及C)及在还原型(reduced form)(行A及B)以及非还原型(行C及D)中的SEQ ID NO：3的PH20变体(行B及D)，而行E、F、G及H示出了以下各样本在42℃下被储存七天后的SDS-PAGE分析的结果：关于初始的野生型PH20(行E及G)及在还原型(行E及F)以及非还原型(行G及H)中的SEQ ID NO：3的PH20变体(行F及H)。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所使用之所有技术及科学术语具有相同于本发明所属领域中具有通常知识者所理解的含意。一般而言，本文所使用之命名为本领域习知的且为通常所使用的。

在本发明中，当被描述为基于野生型PH20时，各变体的氨基酸残基的位置系参考自SEQ ID NO：1的氨基酸序列被描述，当被描述基于具有SEQ ID NO：3的PH20变体时，各变体的氨基酸残基的位置系参考自SEQ ID NO：3氨基酸序列。

本案发明人透过先前研究发现一种玻尿酸酶PH20变体，并提出了关于此发现的专利申请(请见WO 2020/022791A)，此玻尿酸酶PH20变体在具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型PH20(优选为成熟的野生型PH20)中在对应α螺旋域及/或其连接链域(优选为α螺旋8域(S347至C381)及/或α螺旋7及α螺旋8之间的连接链域(A333至R346))的区域包含一个或多个氨基酸残基取代，其中可选地，一个或多个N端及/或C端氨基酸残基被选择性切割或删除，相较于习知的野生型PH 20或其片段，此玻尿酸酶PH20变体展现出优越的功效。

如本文所使用的术语“成熟的野生型PH20”是指由SEQ ID NO：1的L36至Y482或L36至S490的氨基酸残基组成的蛋白质，所述的氨基酸残基缺乏在野生型PH20的SEQ ID NO：1的氨基酸序列中形成信号肽的M1至T35，以及与PH20的实质酶功能无关的N483至L509或A491至L509的其中一者。

具体而言，本案发明人透过先前研究发现，当在具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型PH20中对应T341至I361的氨基酸位置(其为α螺旋8域(S347至C381)及/或α螺旋7及α螺旋8之间的连接链域(A333至R346)的一部分)以对应具有SEQ ID NO：2的序列的野生型Hyal1的氨基酸残基取代时，表达效率及酶活性会受到改善，并且在N端及C端的部分氨基酸序列删除的片段亦展现出优越的表达效率及高酶活性。

表1：野生型PH20及野生型Hyal1的氨基酸序列

作为其持续研究的结果，本案发明人发现尽管具有SEQ ID NO：3的序列的变体包含氨基酸残基的额外的取代、删除及/或插入，以及更可选地包含在N端及/或C端之一个或多个氨基酸残基的删除，但具有SEQ ID NO：3的序列的变体相较于野生型PH20仍展现出优异的表达效率、高酶活性以及显著改善的蛋白质聚集温度(aggregation temperature，Tagg)，其中具有SEQ ID NO：3的序列的变体系通过将对应具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型PH20的T341至I361的氨基酸区域以对应具有SEQ ID NO：2的野生型Hyal1的氨基酸序列取代来建构而得。基于此发现，完成本发明。

具有SEQ ID NO：3的序列的变体系通过将15个氨基酸残基取代来建构而得，亦即，在具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型PH20中的T341S、L342W、S343E、I344N、M345T、S347T、M348K、K349E、L352Q、L353A、L354I、D355K、N356E、E359D及I361T。

在此方面，根据本发明的PH20变体或其片段在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的PH20变体中包含一个或多个氨基酸残基的取代、删除及/或插入，并可选地在N端及/或C端包含一个或多个氨基酸残基的删除。

如上所述，具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体系野生型PH20的T341至I361的氨基酸残基被野生型Hyal1对应的氨基酸残基取代的变体(请见表2)。在先前研究中，在N端及C端包含氨基酸残基删除的具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体或其片段被认为是在活性及稳定性上优于野生型PH20的变体。

表2：野生型PH20的位置T341至I361的氨基酸残基被Hyl1对应的氨基酸残基取代的PH20变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)

具体而言，根据本发明的PH20变体或其片段可包含一个或多个突变，优选为在SEQID NO：3氨基酸序列中之一个或多个氨基酸残基的取代、删除及/或插入，并具有较野生型PH20更高的蛋白质聚集温度(T_agg)，其中蛋白质聚集温度为表示蛋白质稳定性的指标。此外，根据本发明的PH20变体不包含SEQ ID NO：1的野生型PH20。

如本文所使用的术语“PH20变体”旨在包含一种变体，其不仅具有一个或多个氨基酸残基的突变(优选为一个或多个氨基酸残基的取代、删除及/或插入)，更具有在其N端或C端一个或多个氨基酸残基删除与氨基酸残基的取代、删除及/或插入，且其用法与“PH20变体或其片段”的含意实质上相同。

优选地，依据本发明的PH20变体包含氨基酸残基在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体中选自R39、D65至L68、N82、T84、I102至I105、T132至Y134、N166、L179至T182、T185至K187、V241至K244、N266至Q269、P271、V272、K290至P292、Q311至K314、G340至N363、L441、S442、D451至D453、D461、V463及D461至V463中的至少一个位置包含氨基酸残基的取代、删除及/或插入，且具有较野生型PH20高的蛋白质聚集温度(T_agg)。

依据本发明的PH20变体PH20在SEQ ID NO：3氨基酸序列中可以在20或更少(优选为17或更少，更理想为15或更少)的氨基酸位置包含突变，但不限于此。

优选地，依据本发明的PH20变体或其片段包含在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体中，选自R39K、D65A、E66A、P67A、L68A、N82A、T84N、I102A、D103A、S104A、S104N、I105A、I105Q、T132A、T132S、F133A、Y134A、N166A、N166K、L179A、L179S、L179I、L179F、S180T、S180A、L181A、L181M、T182A、T185A、E186A、E186D、K187A、V241A、E242A、I243A、K244A、N266A、T267A、Q268A、Q268D、Q268I、Q268N、Q269A、P271A、V272A、K290A、I291A、I291G、I291L、P292A、P292D、Q311A、V312A、L313A、L313P、L313M、K314A、G340Q、S341H、S341D、S341T、W342I、W342D、W342H、W342L、E343V、E343S、E343Y、E343Q、N344F、N344I、T345E、T345K、T345S、R346M、R346F、R346L、R346T、R346S、R346A、T347Q、T347E、T347V、T347W、T347H、T347S、K348Q、K348F、K348D、K348T、K348E、K348M、E349L、E349W、E349A、S350Q、S350I、S350D、S350T、S350E、S350N、Q352E、Q352G、Q352Y、Q352W、Q352T、A353E、A353Y、A353H、A353K、I354E、I354Q、I354S、I354V、I354A、I354N、I354T、I354R、I354W、I354L、K355Q、K355H、K355D、E356M、E356F、E356I、E356L、E356Q、E356V、E356D、Y357W、Y357F、M358V、M358R、M358Y、M358L、D359K、D359V、D359Y、D359Q、D359T、D359S、D359E、T360Y、T360R、T360L、T360D、T360S、T361M、T361E、T361H、T361L、T361D、T361I、L362A、N363M、N363E、L441A、S442A、D451A、D451S、T452A、T452D、T452H、T452K、T452G、T452P、T452M、T452F、D453A、D461R、D461A、G462A、V463Y以及V463A中的至少一个氨基酸残基取代，但不限于此。

在本发明中，由氨基酸残基码的一个字母与数字组成的描述(如S341)，是指在SEQID NO：1或SEQ ID NO：3氨基酸序列中在每个位置的氨基酸残基。

例如，“S341”是指SEQ ID NO：3氨基酸序列中在位置341的氨基酸残基为丝胺酸(serine)，而“S341H”是指在SEQ ID NO：3的位置341的丝胺酸被组胺酸(histidine)取代。

依据本发明的PH20变体或其片段被解释为包含变体或其片段，且其中在具体氨基酸残基位置的氨基酸残基被保守地取代。

如本文所使用的术语“保守取代”是指PH20变体的修饰，其是关于以其他具有相似生化特性的氨基酸取代一个或多个氨基酸，其中所述具有相似生化特性是指不会造成PH20变体的生物或生化功能丧失。

术语“保守氨基酸取代”是指以具有相似侧链的另一氨基酸残基取代氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族已被定义且并且在本发明所属领域中是为人所知的。这家些族包含具有基本侧链的氨基酸(如赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)及组胺酸(histidine))、具有酸侧链的氨基酸(如天冬酰胺酸(aspartic acid)及谷氨酸(glutamicacid))、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如天门冬素、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)及半胱氨酸(cysteine))、具有非极性侧链的氨基酸(如甘胺酸、丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、白氨酸(leucine)、异白胺酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)及色氨酸(tryptophan))、具有β(beta)侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸及异白胺酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及组胺酸。

本发明的PH20变体或其片段被发现尽管具有保守的氨基酸取代，仍保有其活性(activity)。

此外，依据本发明的PH20变体或其片段被解释为包含具有与依据本发明的PH20变体或其片段实质上相同的功能及/或效果的PH20变体及其片段，且具有至少80％或85％与依据本发明的PH20变体或其片段同源(homology)的氨基酸序列，优选为至少90％同源，更佳为至少95％同源，且最优选为至少99％同源。

依据本发明的PH20变体或其片段具有上升的表现程度及蛋白重新折迭率，且进而具有较成熟的野生型PH20更高的热稳定性。此外，尽管热稳定性的上升，PH20变体的酶活性仍大于或相近于野生型PH20的酶活性。

同时，虽然在C端具有切割的成熟的野生型PH20已知为具有降低的酶活性，依据本发明的PH20变体尽管在C端的一个或多个氨基酸残基，及/或在N端的1至7(优选为1至5)的氨基酸残基被切割及删除，仍展现了相近或增加的酶活性及表达效率，以及因较快速的蛋白重新折迭率及其热稳定性而有高的蛋白质聚集温度(T_agg)。

据此，依据本发明的PH20变体或其片段的特征在于其包含一个或多个氨基酸突变(优选为在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列等的变体中的一个或多个氨基酸取代、删除及/或插入)及在N端及/或C端的一个或多个氨基酸残基被额外删除，但不限于此。

在一实施方案中，依据本发明的PH20变体或其片段可以为其中切割是发生在自从N端的选自M1至P42的氨基酸残基之前，优选是在SEQ ID NO：3氨基酸序列中N端的L36、N37、F38、R39、A40、P41或P42氨基酸残基之前，以使N端的一个或多个氨基酸残基被删除，及/或切割是发生在自从C端的选自V455至L509的氨基酸残基之后，优选是在选自V455至S490的氨基酸残基之后，更佳是在选自V455、D456、C458、D461、C464、I465、D466、A467、F468、K470、P471、P472、M473、E474、T475、E476、P478、I480、Y482、A484、P486、T488或S490的氨基酸残基之后，以使在C端的一个或多个氨基酸残基被删除。

所述“切割是发生在自从N端的选自M1至P42的氨基酸残基之前”是指紧接在从在N端的M1至P42中所选氨基酸残基之前的一部份的氨基酸残基被切割并删除。所述“切割发生在M1之前”是指没有切割是发生在N端。

举例来说，所述“切割发生在氨基酸残基L36、N37、F38、R39、A40、P41或P42之前”是指在依据本发明的SEQ ID NO：3氨基酸序列中，从M1至T35的所有紧接在L36之前的氨基酸残基、从M1至L36的所有紧接在N37之前的氨基酸残基、从M1至N37的所有紧接在F38之前的氨基酸残基、从M1至F38的所有紧接在R39之前的氨基酸残基、从M1至R39的所有紧接在A40之前的氨基酸残基、从M1至A40的所有紧接在P41之前的氨基酸残基或从M1至P41的所有紧接在P42之前的氨基酸残基被切割及删除。

此外，所述“切割是发生在自从C端的选自V455至L509的氨基酸残基之后”是指紧接在从在C端的V455至L509中所选氨基酸残基之后的一部份的氨基酸残基被切割及删除。

举例来说，所述“切割发生在C端的氨基酸残基V455、D456、C458、D461、C464、I465、D466、A467、F468、K470、P471、P472、M473、E474、T475、E476、P478、I480、Y482、A484、P486、T488或S490之后”是指在依据本发明的SEQ ID NO：3氨基酸序列中，在氨基酸残基V455、D456、C458、D461、C464、I465、D466、A467、F468、K470、P471、P472、M473、E474、I475、E476、P47B、I480、Y482、A484、P486、T488或S490之后的氨基酸残基被切割，或紧接在所选的氨基酸残基之后至L509的所有氨基酸残基被删除。

优选地，根据本发明的新颖的PH20变体或其片段的特征在于，其包含在具有SEQID NO：3氨基酸序列的变体中一个或多个位置的氨基酸残基取代、删除或插入、在N端在F38之前的截断及在C端在F468之后的截断。

更佳地，根据本发明的新颖的PH20变体或其片段可以包含选自SEQ ID NOS：163至316氨基酸序列的氨基酸序列，但不限于此。

建构于依据本发明具体实施方案中的在PH20变体中被取代或切割的氨基酸的序列如表6所示。

此外，在本发明中，尝试使用在动物细胞中高度表现的其他信号肽以增加重组PH20蛋白质的表现，而不是使用PH20原始的信号肽。

因此，在另一实施方案中，根据本发明的新颖的PH20变体可以如下表3所示为其中N端更包含具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA的人类生长贺尔蒙信号肽、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS的人类血清白蛋白信号肽，或具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列MAAHLLPICALFLTLLDMAQG的人类Hyal1信号肽，代替由M1至T35组成的野生型PH20的信号肽，但不限于此。

所述“代替由M1至T35组成的野生型PH20的信号肽”是指SEQ ID NO：3氨基酸序列中信号肽被部分或完全删除的情况，且因此不会进行其功能。此外，上述说明是欲包含N端的一部份被进一步删除的情况，例如，发生了切割发生在N37、F38、R39、A40、P41或P42残基之前的情况，使N端的额外删除与野生型PH20的信号肽的删除一起发生。

表3：根据本发明的信号肽序列

另一方面，本发明涉及一种用于治疗癌症的组合物及使用所述组合物以治疗癌症的方法，其中所述组合物包含根据本发明的新颖的PH20变体或其片段。

可由根据本发明的新颖的PH20变体或其片段治疗的癌症(cancer)或癌(carcinomas)并不特别限制，但包含实质固态瘤与血癌。所述癌症可选自皮肤癌，例如黑素瘤、肝癌、肝细胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、大肠直肠癌、结肠癌、子宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾癌、食道癌、胆管癌、睾丸癌、直肠癌、头颈癌、输尿管癌、骨肉瘤、神经细胞瘤、肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤等，但不限于此。优选地，可由根据本发明的组合物治疗的癌症可选自大肠直肠癌、乳癌、肺癌及肾癌，但不限于此。

本发明的组合物可以为药物组合物。药物组合物可以更包含医学上可接受的组合物。所述组合物可以含有选自乳糖、右旋糖(dextrose)、蔗糖、山梨醇(sorbito1)、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶(gum acacia)、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、明胶、硅酸钙、微晶纤维素(microcrystalline cellulose)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石(talc)、硬脂酸镁(magnesium stearate)及矿物油中的一个或多个物质，其中上述组合物可以含有的物质常用于制备药物，但不限于此。此外，药物组合物更可含有选自稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、芳烃、乳化剂、悬浮液(suspension)和防腐剂，其中上述组合物可以含有的物质常用于制备药物。

药物组合物可以透过口服或非口服的方式施用。非口服的施用方式是由静脉注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给药、局部给药、鼻腔给药、肺内给药、直肠给药等。对于口服给药，考虑到胜肽及蛋白质会在胃中分解，口服组合物中的活性成分需要配制成涂覆(coated)剂型或可以保护活性成分不致于在胃中分解的剂型。可替代地，本发明的组合物可以透过任何活性成分可以移动到目标细胞的装置施用。

药物组合物可以配制为液体、悬浮液、糖浆或在油或水性介质中的乳剂(emulsion)的形式，或以萃取物、微粒、粉状、颗粒、锭(tablet)或胶囊的形式，且为了配制目的可以额外包含分散剂或稳定剂。

尤其，根据本发明的用于治疗癌症的组合物可以与其他抗癌药物合并使用。

可以与根据本发明的新颖的PH20变体或其片段合并使用的抗癌药物优选为化学抗癌药物、基于抗体的抗癌药物、生物抗癌药物、RNAi或细胞治疗剂，但不限于此。

优选地，可与根据本发明的新颖的PH20变体或其片段合并使用的抗癌药物优选为一免疫肿瘤试剂(immuno-oncologic agent)，且更佳为一免疫检查点抑制剂(immunecheckpoint inhibitor)，但不限于此。

此外，本发明涉及使用新颖的PH20变体或其片段与其他抗癌药物的组合以治疗癌症的方法，尤其是上述的抗癌药物。

另一方面，本发明涉及对PH20变体或其片段进行编码(encoding)的核酸。

如本文所用，核酸可以存在于细胞中、存在于细胞溶解产物(cell lysate)中或以部分纯化或实质上纯化的形式存在。当提及核酸时，“被分离”或“被实质上纯化”是指已经透过标准技术纯化并因此与其他细胞成分或其他污染物分离的核酸(例如其他核酸或蛋白质)，所述标准技术包含碱/SDS处理、CsCl显带(banding)、管柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)和其他本领域熟知的方法。本发明的核酸可以为DNA或RNA。

在又另一方面，本发明涉及重组表达载体(expression vector)，包含核酸。对于根据本发明的PH20变体或其片段的表现，DNA编码PH20变体或其片段可以透过标准分生技术取得(如聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)放大技术或使用表现PH20变体的融合瘤(hybridoma)的cDNA克隆(clone))，且DNA可以被插入表达载体使其与转录及转译控制序列“有效连接(operativelylinked)”。

如本文所用，术语“有效连接”是旨在表示编码PH20变体或其片段的基因接合(ligated)到载体中，使得转录及转译控制序列起到调节编码PH20变体或其片段的基因的转录及转译的预期功能。所选的表达载体及表现控制序列为与所使用的表现宿主细胞兼容。编码PH20的基因透过标准方法(如连接编码PH20变体或其片段的基因片段上的互补限制性酶切位点(complementary restriction enzyme site)与载体，若不存在限制性酶切位点，则进行平滑端接合(blunt-end ligation))被插入表达载体。

此外，重组表达载体载有控制在宿主细胞中编码PH20变体或其片段的基因表现的调节序列(regulatory sequence)。所述“调节序列”旨在包含启动子(promoter)、增强剂(enhancer)及其他控制编码PH20变体或其片段的基因的转录及转译的表现控制元素(如多腺苷酸化(polyadenylation)讯号)。本领域通常知识者将理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可取决于如以下的因素：待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达程度等等。

在又一方面，本发明涉及宿主细胞，包含核酸或载体。根据本发明的宿主细胞优选选自动物细胞、植物细胞、酵母、大肠杆菌(E.coli)及昆虫细胞，但不限于此。

具体地，根据本发明的宿主细胞包含原核细胞(prokaryotic cell)、菌类、酵母及真核细胞(eukaryotic cell)。原核细胞例如为大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌属(Streptomyces sp)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)或葡萄球菌属(Staphylococcus)。菌类例如为曲菌属(Aspergillus sp)。酵母例如为嗜甲醇酵母菌(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp)及红面包霉菌(Neurospora crass)。真核细胞例如为较低等的真核细胞，及其他较高等的真核细胞(如昆虫细胞)。

此外，可用于本发明的宿主细胞可以从植物或哺乳类动物取得。优选地，宿主细胞的实例包含但不限于：猴子肾细胞(COS7)、NSO cells、SP2/0、中国仓鼠卵(Chinesehamster ovary，CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(baby hamster kidney，BHK)细胞、MDCK、骨髓癌细胞(myeloma cell)、HuT 78细胞及HEK293细胞。更佳地，可以使用CHO细胞。

核酸或载体被转染(transfect)进宿主细胞。转染可以透过使用通常用于将外来的核酸(DNA或RNA)引入原核细胞或真核细胞的各种技术而被进行，例如，电泳、磷酸钙沉淀(alcium phosphate precipitation)、DEAE-葡聚醣转染(DEAE-dextran transfection)或脂质转染(lipofection)。为了表现本发明的H20变体或其片段重组表达载体与宿主细胞的各种组合可以被使用。用于真核细胞的优选的表达载体包含基因表现调节序列、具有广泛的宿主范围的受体、以各种噬菌体λ衍生物为例(如λgt10、λgt11及NM989)的噬菌体DNA以及其他DNA噬菌体。基因表现调节序列是从SV40、胎牛乳突病毒(bovine papillomavirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus)、细胞巨大病毒(cytomegalovirus)及反转录病毒(retrovirus)取得，但不限于此。可以用于细菌宿主的表达载体包含从E.Coli取得的细菌受体，例如pET、pRSET、pBluescript、pGEX2T、pUC载体、colE1、pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物。具有广泛的宿主范围的受体例如为RP4。所述其他DNA噬菌体例如为M13及丝状单股DNA噬菌体(filamentous single-stranded DNA phage)。可用于酵母细胞的表达载体可以是2-μm受体及其衍生物。用于昆虫细胞的表达载体包括pVL941。

在另一方面，本发明涉及用于制造PH20变体或其片段的方法，该方法包含培养根据本发明的宿主细胞及表现PH20变体或其片段。

当能够表现PH20变体或其片段的重组表达载体被引入哺乳动物的宿主细胞时，PH20变体或其片段可以透过培养宿主细胞一段时间而被制造出来，使PH20变体或其片段在宿主细胞中表现，其中所述一段时间优选为使PH20变体在宿主细胞的培养期间被分泌进培养液的一段时间。

在另一实施方案中，可以表现的PH20变体或其片段从宿主细胞中分离和纯化出来。PH20变体或其片段的分离和纯化可以是以传统用于蛋白质的分离/纯化方法进行(如色谱法)。色谱法可以包含选自亲和色谱法(affinity chromatography)、离子交换色谱法(ion exchange chromatography)及疏水作用色谱法(hydrophobic chromatography)的一个或多个组合，但不限于此。除了色谱法，过滤、超滤、盐析、透析等亦可以被使用。

为了确认酶的产业利用性，有必要分析酶的催化反应速率。酶反应的类型包含具有固定反应性的活性部位(active site)的酶反应及具有多种反应性的几个活性部位的酶反应。已知具有固定反应性的活性部位的酶如玻尿酸酶的催化反应速率遵循Michaelis-Menten速率公式。

Michaelis-Menten酶动力学是建立在酶反应为两阶段反应系统的假设上，所述两阶段反应系统包含形成酶(E)-底物(S)的复合体[ES]的可逆反应阶段及ES复合体解离以产生产物(P)的不可逆反应阶段。在此情况下，k_f、k_r及k_cat为反应在每个方向上的速率常数(Alan Fersht(1977)酶结构及机制)。

酶反应假设与底物反应产生ES复合体的过程迅速达到平衡，或假设透过充分降低酶的浓度而满足则可以认为是拟稳态(pseudo-steady state)，其中充分降低酶的浓度是透过进行维持够高的底物浓度实现。由于速率公式假设快速平衡及拟稳态是以相同方式推导得到，故在多数实验中都假设了底物浓度最初高于酶浓度的拟稳态。

当“酶量在反应前后为恒定”及“当化学反应达到化学平衡时，获得产物的反应速率等于产物再次分解的速率”的情况作为假设时，最终产物的反应速率可以如下Michaelis-Menten速率公式表示。在此情况下，K_M＝(k_r+k_cat)/k_f，且V_max＝k_cat[E]₀。

Lineweaver-Burk方程式用于使用Michaelis-Menten速率公式以实验性地分析酶反应速率。此方程式示出了实验中测得的反应速率的倒数1/V与实验中给定底物浓度的倒数l/[S]之间的关系。此方程式为线性方程式的统计验证展现了酶反应为遵循Michaelis-Menten的速率公式的反应，且K_M及V_max可以透过使用此方程式而被计算出。

催化化学反应的酶在于活性部位与底物结合后具有过渡态(transition state)，且具有高能量的用于达到过渡态的活化能量透过与底物的多次结合而被降低。用于达成此过渡态的平衡常数与kcat/K_M成比例。于此，1/K_M为结合酶-底物复合体透过将酶结合至底物而产生的程度与酶-底物复合体保持不变而不被分解的程度的指数，而k_cat为产物从酶-底物复合体取得的平衡常数。因此，k_cat/K_M可以被视为有多少产物能够从底物与酶取得的指标，即酶的催化效率。

玻尿酸酶的产业利用性与其催化效率成比例。尤其，当该酶与聚合药理活性物质(polymeric pharmacologically active substance)一起注射至皮下时，玻尿酸酶的催化效率即扮演重要的脚色。在根据本发明的变体具有较野生型PH20更高的k_cat/K_M的情况下，当与聚合药理活性物质合并的玻尿酸酶一起注射至皮下时，其中的玻尿酸被快速地分解并因此可获得快速分散(disperse)聚合药理活性物质的功效。此外，当根据本发明的变体具有较野生型PH20更大的k_cat的情况下，最大反应速率V_max在相同酶浓度下增加，进而在同样时间内提供分解更大量的玻尿酸，及在更广的区域分散聚合药理活性物质的优异效果。

因此，为了证实根据本发明的PH20变体的酶特性，每个变体的酶反应速率皆被分析，且其V_max(最大酶反应速率)、K_M(底物浓度为50％的V_max的情况)、k_cat(底物转换率)及k_cat/K_M(酶催化效率)在实施例4中被比较。上述的结果显现出根据本发明的PH20变体较野生型PH20更好。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域通常知识者显而易见的是，提供这些实施例仅用于举例说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：建构PH20变体

为建构PH20变体，从韩国人类基因银行(Korean Human Gene Bank)购买野生型PH20的cDNA(clone ID：hMU002604)。野生型PH20编码从L36至S490的氨基酸。PH20基因透过聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，以下简称PCR)被放大并被插入至pcDNA3.4-TOPO载体的限制酶部位XhoI及NotI。为ExpiCHO细胞中的表现，人类生长贺尔蒙、人类血清贺尔蒙或人类Hyal1的信号肽被作为一信号肽，而非PH20的原始信号肽。为使用HisTrap管柱的蛋白质纯化，His-tag的DNA序列位于PH20的cDNA的3’端。PH20变体的氨基酸取代系使用PCR进行，且氨基酸取代系透过DNA测序确认。

用于克隆PH20变体的引物(primer)列表已总结于如下表4，而具体的引物序列已总结于如下表5。

表4：用于克隆根据本发明的PH20变体的引物的列表

表5：用于克隆PH20变体的引物序列

在找到具有增加的酶活性及热稳定性的PH20变体后，PH20变体的不具有PH20变体的cDNA亦被建构。

PH20变体透过如下使用H20变体的cDNA被建构。

变体的表现是使用ExpiCHO表现系统所进行。当ExpiCHO细胞的细胞密度达6x10⁶/mL时，包含插入pcDNA3.4-TOPO载体的野生型PH20或PH20变体cDNA的质体(plasmid)透过使用ExpiFectamine CHO反应剂(转染试剂)而被转染进ExpiCHO细胞。作为细胞培养基，ExpiCHO表现培养液(100至500mL)被使用。在转染后，ExpiCHO细胞被在130rpm震荡(shaking)下培养总共6天，在此期间将细胞在37℃下培养1天，然后在32℃的低温下进一步培养5天。在完成培养后，细胞悬浮液透过以10000rpm的转速离心30分钟的方式收集。

C端附有His-tag的野生型PH20及PH20变体的重组蛋白(在ExpiCHO细胞中制造)透过使用AKTA引物系统(GE Healthcare Systems)的三个阶段的管柱色谱法来纯化，且取决于变体，所述三个阶段的管柱色谱法透过分别使用HisTrap HP管柱-Q Sepharose管柱-phenylHP管柱及Q Sepharose管柱-HisTrap HP管柱-butyl HP管柱而被进行。

使用HisTrap HP管柱、Q Sepharose管柱及phenyl HP管柱的纯化被以如下方式进行。对于使用HisTrap HP柱的蛋白质纯化，缓冲液A(20mM的磷酸钠，pH 7.5，0.5M的氯化钠(NaCl))及缓冲液B(20mM的磷酸钠，pH 7.5，0.5M的氯化钠(NaCl)，0.5M的咪唑(imidazole))被制备。所述蛋白质与HisTrap HP管柱结合，且该管柱被以5管柱体积(columnvolume，CV)的缓冲液A冲洗以移除非具体结合蛋白。确认导电率(conductivity)维持在恒定的程度后，该管柱接着被以5CV的20％缓冲液B冲洗以洗涤(elute)该蛋白。洗涤后的蛋白被以透析液(20mM的磷酸钠，pH 7.5，50mM的氯化钠)透析。对于使用Q Sepharose管柱的蛋白质纯化，缓冲液A(20mM的磷酸钠，pH7.5)及缓冲液B(20mM的磷酸钠，pH 7.5，0.5M的氯化钠)被制备。所述蛋白质与Q Sepharose管柱结合，且管该柱被以5CV的缓冲液A冲洗以移除非具体结合蛋白，并接着以5CV的缓冲液B以0至100％的浓度梯度冲洗以洗涤该蛋白。对于使用phenyl HP管柱的蛋白质纯化，缓冲液A(20mM的磷酸钠，pH 7.0，1.5M的硫酸铵((NH₄)₂SO₄))及缓冲液B(20mM的磷酸钠，pH 7.0)被制备。所述蛋白质与phenyl管柱结合，且该管柱被以5CV的缓冲液A冲洗以移除非具体结合蛋白，并接着被以5CV的缓冲液B以0至100％的浓度梯度冲洗以洗涤该蛋白。

使用Q Sepharose管柱、HisTrap HP管柱、butylHP管柱的纯化以如下方式进行。对于使用Q Sepharose柱的蛋白质纯化，缓冲液A(20mM的磷酸钠(NaPi)，15mM的氯化钠，pH8.0)及缓冲液B(20mM的磷酸钠，500mM的氯化钠，pH 8.0)被制备。为了将培养液的pH值及传导性调整为与缓冲液A相同，使用1 M Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)将pH值滴定至8，并透过向其中添加水(PW)以将电导率调整至5mS/cm或更小。接着，培养液透过具有0.22μm孔的膜被过滤。所述蛋白质与Q Sepharose管柱结合，且该管柱被以5CV的缓冲液A冲洗以移除非具体结合蛋白，并接着以5CV的缓冲液B冲洗以洗涤目标蛋白。对于使用HisTrapHP管柱的蛋白质纯化，缓冲液A(20mM的磷酸钠，500mM的氯化钠，pH 7.5)及缓冲液B(20mM的磷酸钠，500mM的氯化钠，500mM的咪唑，pH 7.5)被制备。所述蛋白质与HisTrap HP管柱结合，且该柱被以10 CV的7％缓冲液B冲洗以移除非具体结合蛋白，并接着以3CV的40％缓冲液B冲洗以洗涤该蛋白。对于使用butylHP管柱的蛋白质纯化，缓冲液A(20mM的磷酸钠，1.5M的硫酸铵(ammonium sulfate)，pH 7.0)及缓冲液B(20mM的磷酸钠，pH 7.0)被制备。3M的硫酸铵及欲装载至该管柱上的蛋白样品被以1：1的比例混和，且接着所产生的混合物透过具有0.22μm孔的膜被过滤。所述蛋白样品结合至butylHP管柱，且该管柱被以5CV的缓冲液A冲洗以移除杂质。接着，目标蛋白被以0至100％的线性浓度梯度的缓冲液B洗涤，且被使用透析缓冲液(20mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH 7.0)透析。根据本发明的变体被以本发明所建议的方法纯化，10％的SDS-PAGE分析被进行于每个被纯化的产物，且结果如图1及3所示。

野生型PH20及PH20变体的酶活性系以浊度测试(turbidimetric assay)量测。

浊度测试为一种量测当玻尿酸与白蛋白(BSA)混合时产生的沉淀物中的吸亮度的方法。当玻尿酸被PH20水解时，与白蛋白混和时产生的沉淀物的吸亮度下降。浊度测试通常是以如下方式进行。玻尿酸酶PH20(Sigma)被稀释至1、2、5、7.5、10、15、20、30、50及60单位(units)/mL并制备于各试管中。纯化的蛋白样品被溶于酶稀释缓冲液(20mM Tris.HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液)，pH 7.0，77mM氯化钠，0.01％(w/v)胎牛血清白蛋白)，稀释至100X、300X、600X、1200X及2400X，并制备于各别的试管。在在新的试管中，浓度3mg/mL的玻尿酸溶液被稀释10倍至0.3mg/mL的浓度，以使每支试管中的体积变为180μL。60μL的酶被加入至稀释的玻尿酸溶液并与其及混合，并让其在37℃下反应45分钟。在反应完成后，50μL的已反应酶及250μL的酸性白蛋白溶液被加入至96孔盘中的每个孔，并摇晃10分钟，接着使用分光光谱仪(spectrophotometer)以600nm量测其吸亮度。

量测蛋白质的热稳定度的方法包含透过动态光散射(dynamic lightscattering，DLS)量测聚集温度的方法、透过Sypro-Orange染剂在实时PCR(real-timePCR)中量测熔点温度(T_m)的方法，及在让蛋白质在预定温度下放置预定时间后量测酶活性的方法等。在透过DLS量测聚集温度的方法中，分子的聚集透过光散射被量测，并因此灵敏度高且聚集温度通常是低于该蛋白质的熔点温度。由于每个变体被以制备为相同浓度(0.2mg/mL)的溶液且接着被量测，故可以透过使用结果值作为聚集温度来比较每个变体的物理特性(Philo，J.S.(2009)Cur.Pharm.Biotech.10，359-372)。

本发明中通过从具有SEQ ID NO：3序列的PH20变体的取代或切割氨基酸建构而成的PH20变体的氨基酸序列如下表6所示。

在本发明中，实验是在变体上进行的，其中所述变体在表6所示的序列中的C端添加了用于蛋白质纯化的六个组氨酸。此在C端的添加被发现并未影响酶活性或蛋白质稳定度。根据本发明的变体被命名为HM及序列号的组合，且根据实施例3的变体被命名为“Hyal2-变体(Hyal2-variant)”、“Hyal3-变体(Hyal3-variant)”及“Hyal4-变体(Hyal4-variant)”。

表6：根据本发明的PH20变体的氨基酸序列及其取代/切割特性

实施例2：根据本发明的PH20变体的特性

透过对变体的研究对该蛋白质的结构和功能进行了进一步研究，其中变体包含基于SEQ ID NO：3氨基酸序列在N端及C端的切割。表7所示的聚集温度作为制备的变体的表现量及活性的分析结果。

表现程度及具体活性系透过如实施例1中所描述的浊度测试所分析。测试的结果如所示。此时，基于为培养液中纯化后的各活性所设的定量极限(limit ofquantification，LOQ)，培养液中的活性超过300unit/mL被标记为“>LOQ”，而在纯化后的活性超过15unit/μg被标记为“>LOQ”。在相反的情况中，不等式符号改变。活性分析的表现程度及定量极限及以此为基础的测试结果如表7所示。SEQ ID NO：1的野生型PH20(L36-Y482)的聚集温度为46.5℃，而SEQ ID NO：3的PH20变体(F38-F468)的聚集温度为51℃。

表7：根据本发明的PH20变体的表现程度、具体活性及聚集温度

从如上表7可知，在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多个变体中，总共有133种具有一个氨基酸残基取代的变体(即HM63、HM64、HM65、HM66、HM67、HM69、HM70、HM71、HM72、HM73、HM74、HM75、HM76、HM77、HM78、HM79、HM82、HM83、HM84、HM85、HM86、HM88、HM89、HM90、HM91、HM92、HM93、HM94、HM95、HM97、HM98、HM99、HM100、HM101、HM102、HM103、HM104、HM105、HM106、HM107、HM110、HM111、HM112、HM114、HM115、HM116、HM117、HM118、HM121、HM125、HM126、HM130、HM131、HM132、HM133、HM134、HM135、HM136、HM138、HM139、HM140、HM141、HM142、HM143、HM144、HM145、HM152、HM153、HM154、HM155、HM156、HM157、HM158、HM159、HM160、HM161、HM162、HM163、HM164、HM165、HM166、HM167、HM168、HM169、HM170、HM171、HM172、HM173、HM174、HM175、HM176、HM177、HM178、HM179、HM180、HM181、HM182、HM183、HM184、HM185、HM186、HM190、HM191、HM192、HM193、HM194、HM195、HM196、HM197、HM198、HM199、HM203、HM204、HM205、HM208、HM210、HM211、HM212、HM213、HM214、HM216、HM217、HM218、HM219、HM220、HM231、HM232、HM233、HM234、HM235、HM243、HM245及HM246)为在纯化后在获得的纯化级分(purified fraction)中仍维持活性且具有48至58℃的聚集温度的变体，并因此展现良好的热稳定性。其中，总共65种变体(即HM63、HM64、HM65、HM66、HM67、HM69、HM70、HM71、HM72、HM73、HM74、HM75、HM76、HM77、HM78、HM79、HM82、HM83、HM84、HM85、HM86、HM88、HM89、HM90、HM91、HM92、HM93、HM94、HM95、HM98、HM99、HM100、HM101、HM102、HM103、HM104、HM105、HM106、HM107、HM110、HM111、HM112、HM114、HM115、HM116、HM117、HM118、HM121、HM125、HM126、HM130、HM131、HM132、HM133、HM134、HM135、HM136、HM138、HM139、HM140、HM141、HM142、HM143、HM144及HM145)为在从PH20的SEQ ID NO：3的序列中多个取代部位的其中一个有所突变且具有48至58℃的聚集温度的变体。其中，总共68种变体(HM97、HM152、HM153、HM154、HM155、HM156、HM157、HM158、HM159、HM160、HM161、HM162、HM163、HM164、HM165、HM166、HM167、HM168、HM169、HM170、HM171、HM172、HM173、HM174、HM175、HM176、HM177、HM178、HM179、HM180、HM181、HM182、HM183、HM184、HM185、HM186、HM190、HM191、HM192、HM193、HM194、HM195、HM196、HM197、HM198、HM199、HM203、HM204、HM205、HM208、HM210、HM211、HM212、HM213、HM214、HM216、HM217、HM218、HM219、HM220、HM231、HM232、HM233、HM234、HM235、HM243、HM245及HM246)为在从PH20的SEQ ID NO：3中的取代部位之外的一个位置有所突变且具有48至56℃的聚集温度的变体。

因此，可以知道的是，不论取代位置为何，在从SEQ ID NO：3的一个位置有取代的变体相较于SEQ ID NO：1的野生型PH20(L36-Y482)具有更高的聚集温度。然而，在其中，HM174、HM208、HM210及HM211被发现在培养液中具有低于300unit/mL(其为LOQ)的活性，但在纯化后有高于15unit/μg(其为LOQ)的活性。在此情况下，当仅在培养液中测定变体的活性时，不能准确地分析变体本身的特性。

此外，如以上表7所示，在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体中，HM146、HM147、HM149、HM262及HM263保有与具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体相同的突变，所述突变即为氨基酸残基的取代，但更包含在N端及C端的切割，表示具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体中的蛋白质的表现及活性不受进一步在N端及C端的切割影响。这些变体具有49℃至53℃的聚集温度，其与SEQ ID NO：3的变体的差异不大，表示变体的物理特性亦不受进一步在N端及C端的切割影响。

此外，在具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的变体中，总共13种变体(即HM96、HM150、HM254、HM261、HM266、HM268、HM271、HM275、HM276、HM279、HM280、HM287及HM288，其为在上表7列的变体中包含一个或多个氨基酸取代及切割的变体)成功表现蛋白质，更保留了酶活性，且具有48℃至59℃的聚集温度。这表示即使在多个取代的情况中，仍能保留蛋白质的活性及物理特性。然而，多个取代表现出无法预测的酶活性及聚集温度，其中酶活性及聚集温度仅有在透过组成相同的每个单一取代中获得的特征组合才是无法预测的。

实施例3：以序列Hyal2、Hyal3及Hyal4取代的变体的活性分析

Hyal2(TTSTETCQYLKDYLTRL)、Hyal3(SSSEEECWHLHDYLVDT)及Hyal4(TASKANCTKVKQFVSSD)的氨基酸序列是人体内除了Hyal1之外的玻尿酸酶的对应部分，取代了SEQ ID NO：1的野生型PH20的氨基酸序列中M345至I361的位置，以研究蛋白质的稳定性如何变化。

通过以对应序列Hyal2、Hyal3及Hyal4取代成熟野生型PH20(L36-S490)的M345至I361的位置而建构成的变体分别被称为“Hyal2-变体”、“Hyal3-变体”及“Hyal4-变体”。

Hyal2-变体、Hyal3-变体及Hyal4-变体被建构，接着这些变体的热稳定性被分析(见图2)。结果为，由DLS量测得的Hyal2-变体的聚集温度为48℃，其较野生型PH20的46.5℃聚集温度高出1.5℃，表示热稳定性增加。

此外，为了确认这些变体是否在ExpiCHO细胞培养中表现，这些变体被以使用HisTrap管柱的同样方式纯化，且蛋白质的表现程度由SDS-PAGE分析进行比较。结果显示Hyal3-变体的表现程度为最高，其次为Hyal2-变体及Hyal4-变体。

实施例4，根据本发明的变体的热稳定性分析

SDS-PAGE分析被进行以确认根据本发明的变体的热稳定性。SEQ ID NO：1(L36-Y482)的纯化的野生型PH20及根据本发明的PH20变体的SEQ ID NO：3(F38-F468)的纯化的蛋白质被储存在42℃下连续7天，接着在降低及非降低状态的情况下进行10％SDS-PAGE分析(图4)。

结果为，观察到野生型PH20(L36-Y482)聚集(图4中的行G)，而SEQ ID NO：3的PH20变体(F38-F468)则未聚集(图4中的行H)。发现这种聚集的差异是由于两种蛋白质之间的聚集温度差。据此，根据本发明的变体被视为展现出更高的热稳定性，并因其相较于野生型PH20有较高的聚集温度而有望在产业上被广泛地应用。

实施例5：根据本发明的变体的酶动力学(enzyme kinetics)分析

为了分析根据本发明的变体的酶动力学，酶活性透过Morgan-Elson方法被量测(Takahashi，T.等人(2003)，Anal.Biochem.322：257-263)。Morgan-Elson方法为比色法(colorimetric method)，用于分析由玻尿酸酶与二甲基胺硼烷(para-dimethylaminobenzaldehyde，DMAB)水解玻尿酸产生的乙酰基葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)的还原端反应生成的红色物质(在545nm)，其为一种Ehrlich试剂。乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc，Sigma)在稀释缓冲液(0.1M的磷酸钠，0.1M的氯化钠，1.5mM的葡萄糖二酸1，4-内酯(saccharic acid 1，4-lactone)，pH 5.35)中被稀释至0.25、0.50、0.75、1.00或1.25mM，且在每个试管中被稀释后的乙酰基葡萄糖胺被以四硼酸盐(tetraborate)处理来还原，接着加入DMAB以诱发比色反应。在反应完后，以545nm量测吸亮度以产生GlcNAc的标准反应曲线。作为底物的玻尿酸在每个试管中被以稀释缓冲液稀释至0.54、0.65、0.87、1.23或2.17pM，并在其中加入玻尿酸酶，接着让其在37℃反应5分钟并以100℃加热5分钟以终止酶反应。酶反应后得到的样品透过用四硼酸盐处理而还原，并加入DMAB以诱导比色反应。在反应完后，以545nm量测吸亮度，而酶活性透过使用上述GlcNAc的标准反应曲线量测。SEQ ID NO：1的野生型PH20及根据本发明的PH20变体的酶动力学透过使用此方法被分析。Lineweaver-Burk曲线的线性被侦测到以作为结果，表示根据本发明的PH20变体遵循Michaelis-Menten酶动力学方程式。

表8示出关于SEQ ID NO：1的野生型PH20(L36-Y482)、SEQ ID NO：3的PH20变体(F38-F468)、HM261及HM268的酶动力学分析结果获得的V_max(最大酶反应速率)、K_M(50％底物浓度)、k_cat(底物转换率)及k_cat/K_M(酶催化效率)。可以看到的是，随着K_M值降低，酶的底物结合能力增加，而随着k_cat值增加，酶的底物转换率增加，故每个PH20变体的k_cat/K_M(酶催化效率)高于野生型PH20的k_cat/K_M。此外，SEQ ID NO：3、HM261及HM268中的每一个的k_cat皆大于SEQ ID NO：1的野生型PH20的k_cat，并因此酶的底物转换率大于SEQ ID NO：1的野生型PH20的底物转换率，故每个PH20变体的产业可利用性皆大于野生型PH20。

表8：根据本发明的PH20变体的酶动力学分析的结果

Claims

1.一种PH20变体或其片段，其在包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的变体中的至少一个位置包含氨基酸残基取代、删除或插入，且其具有较野生型PH20的聚集温度更高的聚集温度。

2.如权利要求1所述的PH20变体或其片段，其中所述PH20变体或其片段在具有SEQ IDNO:3氨基酸序列的所述变体中选自R39、D65至L68、N82、T84、I102至I105、T132至Y134、N166、L179至T182、T185至K187、V241至K244、N266至Q269、P271、V272、K290至P292、Q311至K314、G340至N363、L441、S442、D451至D453、D461、V463及D461至V463中的至少一个位置包含所述氨基酸残基取代。

3.如权利要求2所述的PH20变体或其片段，其中所述氨基酸残基取代包含选自R39K、D65A、E66A、P67A、L68A、N82A、T84N、I102A、D103A、S104A、S104N、I105A、I105Q、T132A、T132S、F133A、Y134A、N166A、N166K、L179A、L179S、L179I、L179F、S180T、S180A、L181A、L181M、T182A、T185A、E186A、E186D、K187A、V241A、E242A、I243A、K244A、N266A、T267A、Q268A、Q268D、Q268I、Q268N、Q269A、P271A、V272A、K290A、I291A、I291G、I291L、P292A、P292D、Q311A、V312A、L313A、L313P、L313M、K314A、G340Q、S341H、S341D、S341T、W342I、W342D、W342H、W342L、E343V、E343S、E343Y、E343Q、N344F、N344I、T345E、T345K、T345S、R346M、R346F、R346L、R346T、R346S、R346A、T347Q、T347E、T347V、T347W、T347H、T347S、K348Q、K348F、K348D、K348T、K348E、K348M、E349L、E349W、E349A、S350Q、S350I、S350D、S350T、S350E、S350N、Q352E、Q352G、Q352Y、Q352W、Q352T、A353E、A353Y、A353H、A353K、I354E、I354Q、I354S、I354V、I354A、I354N、I354T、I354R、I354W、I354L、K355Q、K355H、K355D、E356M、E356F、E356I、E356L、E356Q、E356V、E356D、Y357W、Y357F、M358V、M358R、M358Y、M358L、D359K、D359V、D359Y、D359Q、D359T、D359S、D359E、T360Y、T360R、T360L、T360D、T360S、T361M、T361E、T361H、T361L、T361D、T361I、L362A、N363M、N363E、L441A、S442A、D451A、D451S、T452A、T452D、T452H、T452K、T452G、T452P、T452M、T452F、D453A、D461R、D461A、G462A、V463Y和V463A中的至少一者。

4.如权利要求1至3的任一项所述的PH20变体或其片段，其还包含在C端及/或N端的至少一个氨基酸残基的删除。

5.如权利要求4所述的PH20变体或其片段，其中所述至少一个氨基酸残基是通过在选自M1至P42的氨基酸残基之前从N端切割而删除。

6.如权利要求5所述的PH20变体或其片段，其中所述至少一个氨基酸残基是通过在L36、N37、F38、R39、A40、P41或P42的氨基酸残基之前从N端切割而删除。

7.如权利要求4所述的PH20变体或其片段，其中所述至少一个氨基酸残基是通过在选自V455至L509的氨基酸残基之后从C端切割而删除。

8.如权利要求7所述的PH20变体或其片段，其中所述至少一个氨基酸残基是通过在选自V455至S490的氨基酸残基之后从C端切割而删除。

9.如权利要求7所述的PH20变体或其片段，其中所述至少一个氨基酸残基是通过在V455、D456、C458、D461、C464、I465、D466、A467、F468、K470、P471、P472、M473、E474、T475、E476、P478、I480、Y482、A484、P486、T488或S490氨基酸残基之后从C端切割而删除。

10.如权利要求4所述的PH20变体或其片段，其中所述至少一个氨基酸残基是通过在F38的氨基酸残基之前从N端及在F468的氨基酸残基之后从C端切割而删除。