CN120699137A - 一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，属于水蛭素分离提取技术领域。所述方法包括饥饿处理菲牛蛭后，用含苹果酸、柠檬酸、消旋酮异亮氨酸钙等组分的诱导溶液结合猪血提取物诱导分泌，经离心得到粗提液；通过L‑半胱氨酸功能化修饰与氨基阳离子淀粉交联制备固定化微球载体，固定化凝血酶后与粗提液混合萃取，经洗脱、冻干得到水蛭素产品。本发明通过优化诱导分泌体系与固定化吸附纯化工艺，解决了传统方法中分泌诱导效率低、纯化复杂、活性保留率不足的问题，实现了水蛭素的活体重复提取，具有提取效率高、产物纯度高、比活力强及水蛭活体可重复利用等优势，可以满足规模化生产需求。

Description

一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法

技术领域

本发明属于水蛭素分离提取技术领域，尤其涉及一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法。

背景技术

药用水蛭在中医药领域具有悠久的应用历史，其性味咸、苦、平，具有破血、逐瘀、通经等功效。现代药理研究表明，水蛭体内含有多种生物活性成分，使其具备抗凝血、抗血栓、降脂、抗肿瘤、抗细胞凋亡及抗炎等作用，在心脑血管疾病(如动脉硬化、脑血栓)、肿瘤、痛风、肾病等疾病的治疗和预防中展现出重要价值。其中，从水蛭体内提取的水蛭素是一种由65-66个氨基酸组成的酸性肽类化合物，其分子结构中含有3对二硫键，是目前已知的天然凝血酶抑制剂中活性最强的物质。在临床应用中，水蛭素已被用于治疗弥漫性血管内凝血(DIC)、不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AM)及连续性肾脏替代治疗(CRRT)等，其高效的抗凝血和抗栓特性为相关疾病的治疗提供了新的思路。

随着医药行业对天然水蛭素需求的增加，如何高效提取和纯化水蛭素成为研究热点。目前，水蛭素的提取方法主要包括解剖提取法、诱导分泌法及基因工程表达法等。然而，解剖提取法需杀死水蛭，不仅无法实现活体重复利用，还可能因细胞破碎释放蛋白酶导致水蛭素降解；传统诱导分泌法多采用单一刺激物(如血液提取物)诱导水蛭分泌，存在分泌量低、成分复杂、后续纯化难度大等问题；基因工程方法虽可实现水蛭素的重组表达，但存在表达产物活性低、纯化成本高等局限性。现有技术中，针对菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法仍存在分泌诱导效率低、纯化工艺复杂、活性保留率不足等问题，难以满足规模化生产需求。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，通过优化诱导分泌体系与固定化吸附纯化工艺，实现水蛭素的活体重复提取，解决了传统方法中分泌诱导效率低、纯化工艺复杂、活性保留率不足等问题，具有提取效率高、产物纯度高、水蛭活体可重复利用等优势，能够满足规模化生产需求。

为了实现上述目的，采用了如下技术方案：本发明提供了一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，包括以下步骤：

S1、水蛭素粗提液的提取：将菲牛蛭进行饥饿处理20天，将菲牛蛭置于密闭容器中，加入配制好的诱导溶液，在18-22℃下避光静置30min，诱导菲牛蛭分泌水蛭素，随后向容器中加入猪血提取物，刺激菲牛蛭持续分泌，收集分泌液4小时，将收集到的分泌液在4℃、12000r/min下离心20min，去除杂质，收集上清液，即得到水蛭素粗提液；

S2、固定化微球载体的制备：

S201、将L-半胱氨酸与1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮加入到二甲亚砜中，在60℃下搅拌反应6小时，反应结束后，将反应液倒入3倍体积的冰水中，析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀3次，真空干燥，得到磺酸基和吡唑啉酮功能化L-半胱氨酸；

S202、将功能化L-半胱氨酸加入到反应器中，在氮气的保护下加入乙酸乙酯得到第一溶液，将三光气溶解于乙酸乙酯中得到第二溶液，第一溶液在80℃下回流0.5小时，再将第二溶液滴加至第一溶液中，在80℃下继续回流反应3小时，反应结束后冷却至室温，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液各交替洗涤两次，用乙酸乙酯萃取分液后，浓缩，用浓缩液2倍体积的乙酸乙酯/石油醚混合溶液重结晶，得到功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐；

S203、将功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐与氨基阳离子淀粉加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下于40℃下反应24小时，反应结束后，将反应液缓慢滴加到5倍体积的无水乙醇中，析出沉淀放入截留分子量为3500Da的透析袋中，用离子水透析48小时，将产物冷冻干燥48小时，得到功能化聚半胱氨酸改性的氨基阳离子淀粉，即为固定化微球载体；

S3、固定化凝血酶的制备：将所述固定化微球载体加入到质量分数为5％的氯化钠溶液中，将凝血酶溶解于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到凝血酶溶液，将凝血酶溶液加入到上述固定化微球载的氯化钠溶液中，使所述凝血酶在体系中的终浓度为1g/L，再加入体积分数为2％的戊二醛溶液，在25℃下进行固定化酶反应4小时，反应结束后，过滤，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，得到所述固定化凝血酶；

S4、将水蛭素粗提液与固定化凝血酶混合，在25℃、150r/min下振荡萃取2小时，萃取结束后，在4000r/min下离心10min，分离清液，将沉淀进行洗脱，收集洗脱液浓缩至原体积的1/10，在-50℃、0.01mbar下冻干24小时，得到水蛭素产品。

进一步地，所述步骤S1中的诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹果酸0.5-2％、柠檬酸0.5-1.5％、氯化钠0.8-1％、葡萄糖0.5-1.2％、消旋酮异亮氨酸钙0.4-0.8％、3-烯丙氧基-4-甲氧基苯甲醛0.01-0.05％、油醇聚醚-7磷酸酯钠0.05-0.2％，其余为水。

进一步地，所述诱导溶液与菲牛蛭的质量比为3-8：1。

进一步地，所述步骤S1中猪血提取物的添加量为混合溶液质量的5-10％，所述猪血提取物由新鲜猪血经冷冻干燥后粉碎至100目得到。

进一步地，所述步骤S201中L-半胱氨酸、1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮与二甲亚砜的质量比为1：1.2-1.8：12-18。

进一步地，所述步骤S202中第一溶液中功能化L-半胱氨酸与乙酸乙酯的质量比为1：20-40。

进一步地，所述步骤S202中第二溶液中三光气与乙酸乙酯的质量比为1：8-12。

进一步地，所述步骤S202中L-半胱氨酸与三光气的质量比为1：1.1-1.3。

进一步地，所述步骤S202中乙酸乙酯/石油醚混合溶液中乙酸乙酯与石油醚的体积比为1：2-3。

进一步地，所述步骤S203中功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐、氨基阳离子淀粉和N,N-二甲基甲酰胺的质量比为3-8：1：40-60。

所述步骤S3中固定化微球载体、氯化钠溶液的质量比为1：30-50。

所述凝血酶溶液的浓度为5-10g/L。

所述步骤S3中戊二醛溶液的加入量为体系总体积的1-5％。

进一步地，所述步骤S4中水蛭素粗提液与固定化凝血酶按照体积比为10-20：1混合。

进一步地，所述步骤S4中的洗脱液为含有0.5-1.0mol/LNaCl的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。

本发明的有益效果是：

(1)通过特定组合的诱导液促使经饥饿处理的菲牛蛭分泌唾液，其中消旋酮异亮氨酸钙作为氨基酸衍生物，可模拟菲牛蛭天然食物中的氮源，激活其消化系统相关酶的分泌通路，同时通过钙信号调节细胞膜通透性，促进水蛭素从分泌细胞中释放，油醇聚醚-7磷酸酯钠作为非离子型表面活性剂，可降低分泌液的表面张力，促进水蛭素从分泌腺中扩散到溶液中，同时稳定分泌液中的蛋白质结构；

(2)本发明通过L-半胱氨酸功能化修饰与氨基阳离子淀粉交联制备固定化载体，通过1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮与L-半胱氨酸反应后，在载体表面引入带负电荷的磺酸基和具有共轭结构的吡唑啉酮基团，磺酸基可通过静电作用吸附带正电荷的水蛭素分子，提高吸附特异性，吡唑啉酮的共轭体系可与水蛭素的芳香基团形成π-π堆积作用，增强吸附亲和力，同时其环状结构可为水蛭素提供特定的结合位点，功能化L-半胱氨酸通过N-羧基环内酸酐开环聚合形成聚半胱氨酸链，与氨基阳离子淀粉的交联形成三维网状结构，氨基阳离子淀粉的正电荷表面可通过静电作用吸附带负电的凝血酶，同时其多糖骨架的亲水性可维持凝血酶的天然构象，三维网状结构提供了较大的比表面积，使凝血酶均匀分布，增加与水蛭素的接触概率，提高吸附效率，从而得到更高收率、更高纯度的水蛭素产品。

(3)本发明的固定化凝血酶对水蛭素具有较高的吸附容量，吸附后通过氯化钠的离子强度破坏凝血酶与水蛭素的静电结合，实现水蛭素的高提取率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附表，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例、基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法、下述实施例中所用的试验材料如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1：一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，包括以下步骤：

S1、水蛭素粗提液的提取：将菲牛蛭进行饥饿处理20天，将菲牛蛭置于密闭容器中，加入配制好的诱导溶液，在18℃下避光静置30min，诱导菲牛蛭分泌水蛭素，所述诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹果酸0.5％、柠檬酸0.5％、氯化钠0.8％、葡萄糖0.5％、消旋酮异亮氨酸钙0.4％、3-烯丙氧基-4-甲氧基苯甲醛0.01％、油醇聚醚-7磷酸酯钠0.05％，其余为水，所述诱导溶液与菲牛蛭的质量比为3：1；随后向容器中加入猪血提取物，刺激菲牛蛭持续分泌，所述猪血提取物的添加量为混合溶液质量的5％，所述猪血提取物由新鲜猪血经冷冻干燥后粉碎至100目得到；收集分泌液4小时，将收集到的分泌液在4℃、12000r/min下离心20min，去除杂质，收集上清液，即得到水蛭素粗提液；

S2、固定化微球载体的制备：

S201、将L-半胱氨酸与1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮加入到二甲亚砜中，在60℃下搅拌反应6小时，所述L-半胱氨酸、1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮与二甲亚砜的质量比为1：1.2：12；反应结束后，将反应液倒入3倍体积的冰水中，析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀3次，真空干燥，得到磺酸基和吡唑啉酮功能化L-半胱氨酸；

S202、将功能化L-半胱氨酸加入到反应器中，在氮气的保护下加入乙酸乙酯得到第一溶液，所述第一溶液中功能化L-半胱氨酸与乙酸乙酯的质量比为1：20；将三光气溶解于乙酸乙酯中得到第二溶液，所述第二溶液中三光气与乙酸乙酯的质量比为1：8；所述L-半胱氨酸与三光气的质量比为1：1.1；第一溶液在80℃下回流0.5小时，再将第二溶液滴加至第一溶液中，在80℃下继续回流反应3小时，反应结束后冷却至室温，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液各交替洗涤两次，用乙酸乙酯萃取分液后，浓缩，用浓缩液2倍体积的乙酸乙酯/石油醚混合溶液重结晶，所述乙酸乙酯/石油醚混合溶液中乙酸乙酯与石油醚的体积比为1：2；得到功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐；

S203、将功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐与氨基阳离子淀粉加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下于40℃下反应24小时，所述功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐、氨基阳离子淀粉和N,N-二甲基甲酰胺的质量比为3：1：40；反应结束后，将反应液缓慢滴加到5倍体积的无水乙醇中，析出沉淀放入截留分子量为3500Da的透析袋中，用离子水透析48小时，将产物冷冻干燥48小时，得到功能化聚半胱氨酸改性的氨基阳离子淀粉，即为固定化微球载体；

S3、固定化凝血酶的制备：将所述固定化微球载体加入到质量分数为5％的氯化钠溶液中，所述固定化微球载体、氯化钠溶液的质量比为1：30；将凝血酶溶解于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到凝血酶溶液，所述凝血酶溶液的浓度为5g/L；将凝血酶溶液加入到上述固定化微球载的氯化钠溶液中，使所述凝血酶在体系中的终浓度为1g/L，再加入体积分数为1％的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液的加入量为体系总体积的1％；在25℃下进行固定化酶反应4小时，反应结束后，过滤，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，得到所述固定化凝血酶；

S4、将水蛭素粗提液与固定化凝血酶混合，所述水蛭素粗提液与固定化凝血酶按照体积比为10：1；在25℃、150r/min下振荡萃取2小时，萃取结束后，在4000r/min下离心10min，分离清液，将沉淀进行洗脱，所述洗脱液为含有0.5mol/LNaCl的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液；收集洗脱液浓缩至原体积的1/10，在-50℃、0.01mbar下冻干24小时，得到水蛭素产品。

实施例2：一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，包括以下步骤：

S1、水蛭素粗提液的提取：将菲牛蛭进行饥饿处理20天，将菲牛蛭置于密闭容器中，加入配制好的诱导溶液，在22℃下避光静置30min，诱导菲牛蛭分泌水蛭素，所述诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹果酸2％、柠檬酸1.5％、氯化钠1％、葡萄糖1.2％、消旋酮异亮氨酸钙0.8％、3-烯丙氧基-4-甲氧基苯甲醛0.05％、油醇聚醚-7磷酸酯钠0.2％，其余为水，所述诱导溶液与菲牛蛭的质量比为8：1；随后向容器中加入猪血提取物，刺激菲牛蛭持续分泌，所述猪血提取物的添加量为混合溶液质量的10％，所述猪血提取物由新鲜猪血经冷冻干燥后粉碎至100目得到；收集分泌液4小时，将收集到的分泌液在4℃、12000r/min下离心20min，去除杂质，收集上清液，即得到水蛭素粗提液；

S2、固定化微球载体的制备：

S201、将L-半胱氨酸与1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮加入到二甲亚砜中，在60℃下搅拌反应6小时，所述L-半胱氨酸、1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮与二甲亚砜的质量比为1：1.8：18；反应结束后，将反应液倒入3倍体积的冰水中，析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀3次，真空干燥，得到磺酸基和吡唑啉酮功能化L-半胱氨酸；

S202、将功能化L-半胱氨酸加入到反应器中，在氮气的保护下加入乙酸乙酯得到第一溶液，所述第一溶液中功能化L-半胱氨酸与乙酸乙酯的质量比为1：40；将三光气溶解于乙酸乙酯中得到第二溶液，所述第二溶液中三光气与乙酸乙酯的质量比为1：12；所述L-半胱氨酸与三光气的质量比为1：1.3；第一溶液在80℃下回流0.5小时，再将第二溶液滴加至第一溶液中，在80℃下继续回流反应3小时，反应结束后冷却至室温，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液各交替洗涤两次，用乙酸乙酯萃取分液后，浓缩，用浓缩液2倍体积的乙酸乙酯/石油醚混合溶液重结晶，所述乙酸乙酯/石油醚混合溶液中乙酸乙酯与石油醚的体积比为1：3；得到功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐；

S203、将功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐与氨基阳离子淀粉加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下于40℃下反应24小时，所述功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐、氨基阳离子淀粉和N,N-二甲基甲酰胺的质量比为8：1：60；反应结束后，将反应液缓慢滴加到5倍体积的无水乙醇中，析出沉淀放入截留分子量为3500Da的透析袋中，用离子水透析48小时，将产物冷冻干燥48小时，得到功能化聚半胱氨酸改性的氨基阳离子淀粉，即为固定化微球载体；

S3、固定化凝血酶的制备：将所述固定化微球载体加入到质量分数为5％的氯化钠溶液中，所述固定化微球载体、氯化钠溶液的质量比为1：50；将凝血酶溶解于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到凝血酶溶液，所述凝血酶溶液的浓度为10g/L；将凝血酶溶液加入到上述固定化微球载的氯化钠溶液中，使所述凝血酶在体系中的终浓度为1g/L，再加入体积分数为5％的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液的加入量为体系总体积的5％；在25℃下进行固定化酶反应4小时，反应结束后，过滤，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，得到所述固定化凝血酶；

S4、将水蛭素粗提液与固定化凝血酶混合，所述水蛭素粗提液与固定化凝血酶按照体积比为20：1；在25℃、150r/min下振荡萃取2小时，萃取结束后，在4000r/min下离心10min，分离清液，将沉淀进行洗脱，所述洗脱液为含有1.0mol/LNaCl的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液；收集洗脱液浓缩至原体积的1/10，在-50℃、0.01mbar下冻干24小时，得到水蛭素产品。

实施例3：一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，包括以下步骤：

S1、水蛭素粗提液的提取：将菲牛蛭进行饥饿处理20天，将菲牛蛭置于密闭容器中，加入配制好的诱导溶液，在20℃下避光静置30min，诱导菲牛蛭分泌水蛭素，所述诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹果酸1.3％、柠檬酸1.0％、氯化钠0.9％、葡萄糖0.9％、消旋酮异亮氨酸钙0.6％、3-烯丙氧基-4-甲氧基苯甲醛0.03％、油醇聚醚-7磷酸酯钠0.12％，其余为水，所述诱导溶液与菲牛蛭的质量比为5：1；随后向容器中加入猪血提取物，刺激菲牛蛭持续分泌，所述猪血提取物的添加量为混合溶液质量的7.5％，所述猪血提取物由新鲜猪血经冷冻干燥后粉碎至100目得到；收集分泌液4小时，将收集到的分泌液在4℃、12000r/min下离心20min，去除杂质，收集上清液，即得到水蛭素粗提液；

S2、固定化微球载体的制备：

S201、将L-半胱氨酸与1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮加入到二甲亚砜中，在60℃下搅拌反应6小时，所述L-半胱氨酸、1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮与二甲亚砜的质量比为1：1.5：15；反应结束后，将反应液倒入3倍体积的冰水中，析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀3次，真空干燥，得到磺酸基和吡唑啉酮功能化L-半胱氨酸；

S202、将功能化L-半胱氨酸加入到反应器中，在氮气的保护下加入乙酸乙酯得到第一溶液，所述第一溶液中功能化L-半胱氨酸与乙酸乙酯的质量比为1：30；将三光气溶解于乙酸乙酯中得到第二溶液，所述第二溶液中三光气与乙酸乙酯的质量比为1：10；所述L-半胱氨酸与三光气的质量比为1：1.2；第一溶液在80℃下回流0.5小时，再将第二溶液滴加至第一溶液中，在80℃下继续回流反应3小时，反应结束后冷却至室温，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液各交替洗涤两次，用乙酸乙酯萃取分液后，浓缩，用浓缩液2倍体积的乙酸乙酯/石油醚混合溶液重结晶，所述乙酸乙酯/石油醚混合溶液中乙酸乙酯与石油醚的体积比为1：2.5；得到功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐；

S203、将功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐与氨基阳离子淀粉加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下于40℃下反应24小时，所述功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐、氨基阳离子淀粉和N,N-二甲基甲酰胺的质量比为5.5：1：50；反应结束后，将反应液缓慢滴加到5倍体积的无水乙醇中，析出沉淀放入截留分子量为3500Da的透析袋中，用离子水透析48小时，将产物冷冻干燥48小时，得到功能化聚半胱氨酸改性的氨基阳离子淀粉，即为固定化微球载体；

S3、固定化凝血酶的制备：将所述固定化微球载体加入到质量分数为5％的氯化钠溶液中，所述固定化微球载体、氯化钠溶液的质量比为1：40；将凝血酶溶解于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到凝血酶溶液，所述凝血酶溶液的浓度为7.5g/L；将凝血酶溶液加入到上述固定化微球载的氯化钠溶液中，使所述凝血酶在体系中的终浓度为1g/L，再加入体积分数为3％的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液的加入量为体系总体积的3％；在25℃下进行固定化酶反应4小时，反应结束后，过滤，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，得到所述固定化凝血酶；

S4、将水蛭素粗提液与固定化凝血酶混合，所述水蛭素粗提液与固定化凝血酶按照体积比为15：1；在25℃、150r/min下振荡萃取2小时，萃取结束后，在4000r/min下离心10min，分离清液，将沉淀进行洗脱，所述洗脱液为含有0.75mol/LNaCl的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液；收集洗脱液浓缩至原体积的1/10，在-50℃、0.01mbar下冻干24小时，得到水蛭素产品。

实施例4：一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，本实施例与实施例3的区别仅在于所述诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹果酸0.5％、柠檬酸0.5％、氯化钠0.9％、葡萄糖0.5％、消旋酮异亮氨酸钙0.4％、3-烯丙氧基-4-甲氧基苯甲醛0.05％、油醇聚醚-7磷酸酯钠0.05％，其余为水；其余组分、制备过程均与实施例3相同。

实施例5：一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，本实施例与实施例3的区别仅在于所述诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹果酸0.5％、柠檬酸0.5％、氯化钠0.9％、葡萄糖0.5％、消旋酮异亮氨酸钙0.4％、3-烯丙氧基-4-甲氧基苯甲醛0.01％、油醇聚醚-7磷酸酯钠0.2％，其余为水；其余组分、制备过程均与实施例3相同。

对比例1：本对比例中与实施例3的区别仅在于所述诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹苹果酸1.3％、柠檬酸1.0％、氯化钠0.9％、葡萄糖0.9％，其余为水；其余组分、制备过程均与实施例3相同。

对比例2：本对比例中与实施例3的区别仅在于直接使用未修饰的氨基阳离子淀粉作为载体，具体操作为：将氨基阳离子淀粉分散于质量分数为5％的氯化钠溶液中，按实施例3相同参数固定化凝血酶；其余组分、制备过程均与实施例3相同。

对比例3：本对比例采用统层析法对水蛭素粗提液提取分离，具体操作为：将水蛭素粗提液上样至Heparin-Sepharose亲和层析柱(5mL柱体积)，用含0.5mol/LNaCl的pH7.4磷酸盐缓冲溶液梯度洗脱，收集活性峰并冻干。

对比例4：对比例将水蛭素粗提液与游离凝血酶混合，比例与实施例3相同，25℃振荡萃取2小时，离心后取上清液冻干；其余组分、制备过程均与实施例3相同。

测试例：对各组实施例和对比例得到的水蛭素的关键指标进行检测，包括水蛭素收率、比活力、抗凝血活性和纯度，具体方法如下：

采用高效液相色谱法测定最终水蛭素产品中的水蛭素含量，并计算收率。具体操作如下：使用Agilent1100HPLC系统，配备制备型C18色谱柱(规格3.5mm×20cm)。将待测的最终水蛭素产品溶解于适量溶剂中，直接上样。色谱柱首先用含0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶液充分平衡。洗脱采用线性梯度程序：在30分钟内，乙腈比例从0％线性增加至60％(流动相A：0.1％TFA水溶液；流动相B：0.1％TFA乙腈溶液)，洗脱流速设定为1.2mL/min。通过紫外检测器监测洗脱过程，波长为215nm，收集对应于水蛭素活性峰的馏分。通过比较最终产品中测得的水蛭素总量与初始水蛭素粗提液中的水蛭素总量，计算收率。

收率(％)＝(最终产品中水蛭素总量/粗提液中水蛭素总量)×100％。

纯度(％)＝(水蛭素主峰面积/所有色谱峰总面积)×100％。

采用双缩脲法测定总蛋白质含量：取6支试管，按0-5标号，分别按照下列比例加入各组分，0号试管加入0.5mL蒸馏水和4.0mL标准双缩脲试剂，1号试管加入0.1mLBSA标准液、0.4mL蒸馏水和4.0mL标准双缩脲试剂，2号试管加入0.2mLBSA标准液、0.3mL蒸馏水和4.0mL标准双缩脲试剂，3号试管加入0.4mLBSA标准液、0.2mL蒸馏水和4.0mL标准双缩脲试剂，4号试管加入0.2mLBSA标准液、0.5mL蒸馏水和4.0mL标准双缩脲试剂，5号试管加入0.5mLBSA标准液和4.0mL标准双缩脲试剂，摇匀后，37℃水浴保温30分钟，冷却至室温。以空白管调零，在540nm波长处测定各管吸光度，以蛋白质浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程。再称取0.1g水蛭素样品，用PBS溶解并定容至10mL，取0.5mL稀释后的样品溶液，加入4.0mL双缩脲试剂，摇匀，37℃水浴30分钟，冷却后测定540nm处的吸光度。根据标准曲线方程，代入样品计算样品溶液中的蛋白质浓度(C，mg/mL)。

总蛋白质含量(mg/g样品)＝C×稀释倍数×定容体积(mL)÷样品质量(g)。

采用生色底物法测定水蛭素抗凝血酶活性单位，通过下列公式计算比活力：

比活力＝抗凝血酶活性单位(IU)÷总蛋白质含量(mg)。

从表1可以看出，在收率上，本发明通过特定诱导溶液促使菲牛蛭分泌，如消旋酮异亮氨酸钙模拟氮源激活分泌通路、油醇聚醚-7磷酸酯钠促进水蛭素扩散，结合猪血提取物刺激持续分泌，使得水蛭素收率较传统方法大幅提升，各实施例的收率达到29.5-31.8mg/g水蛭，在纯度方面，本发明通过固定化微球载体通过磺酸基静电吸附和吡唑啉酮π-π堆积作用，特异性结合水蛭素，有效排除杂蛋白，各实施例的纯度高达95.2％-97.8％，此外蛋白质含量也高于对比例，比活力也得到显著增强，固定化微球载体的三维网状结构维持凝血酶天然构象，增强与水蛭素的结合特异性，整体而言，本发明实现了水蛭素提取收率、纯度及活性的全面提高。

表1：水蛭素的关键指标检测检测结果

项目	收率(mg/g水蛭)	蛋白质含量(mg/g样品)	比活性(IU/mg)	纯度(％)
					实施例1	29.5	92.3	15200	95.2
实施例2	30.1	88.7	15800	96.5
					实施例3	31.8	85.4	16500	97.8
实施例4	29.7	90.1	15500	95.8
					实施例5	31.2	89.9	16100	96.9
对比例1	18.3	75.6	8300	78.5
					对比例2	22.6	80.7	10200	85.2
对比例3	26.4	65.8	13800	91.7
					对比例4	24.1	78.2	7600	72.3

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的应用并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、水蛭素粗提液的提取：将菲牛蛭进行饥饿处理20天，将菲牛蛭置于密闭容器中，加入配制好的诱导溶液，在18-22℃下避光静置30min，诱导菲牛蛭分泌水蛭素，随后向容器中加入猪血提取物，刺激菲牛蛭持续分泌，收集分泌液4小时，将收集到的分泌液在4℃、12000r/min下离心20min，去除杂质，收集上清液，即得到水蛭素粗提液；

S2、固定化微球载体的制备：

S201、将L-半胱氨酸与1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮加入到二甲亚砜中，在60℃下搅拌反应6小时，反应结束后，将反应液倒入3倍体积的冰水中，析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀3次，真空干燥，得到磺酸基和吡唑啉酮功能化L-半胱氨酸；

S202、将功能化L-半胱氨酸加入到反应器中，在氮气的保护下加入乙酸乙酯得到第一溶液，将三光气溶解于乙酸乙酯中得到第二溶液，第一溶液在80℃下回流0.5小时，再将第二溶液滴加至第一溶液中，在80℃下继续回流反应3小时，反应结束后冷却至室温，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液各交替洗涤两次，用乙酸乙酯萃取分液后，浓缩，用浓缩液2倍体积的乙酸乙酯/石油醚混合溶液重结晶，得到功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐；

S203、将功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐与氨基阳离子淀粉加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下于40℃下反应24小时，反应结束后，将反应液缓慢滴加到5倍体积的无水乙醇中，析出沉淀放入截留分子量为3500Da的透析袋中，用离子水透析48小时，将产物冷冻干燥48小时，得到功能化聚半胱氨酸改性的氨基阳离子淀粉，即为固定化微球载体；

S3、固定化凝血酶的制备：将所述固定化微球载体加入到质量分数为5％的氯化钠溶液中，将凝血酶溶解于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到凝血酶溶液，将凝血酶溶液加入到上述固定化微球载的氯化钠溶液中，使所述凝血酶在体系中的终浓度为1g/L，再加入体积分数为2％的戊二醛溶液，在25℃下进行固定化酶反应4小时，反应结束后，过滤，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，得到所述固定化凝血酶；

S4、将水蛭素粗提液与固定化凝血酶混合，在25℃、150r/min下振荡萃取2小时，萃取结束后，在4000r/min下离心10min，分离清液，将沉淀进行洗脱，收集洗脱液浓缩至原体积的1/10，在-50℃、0.01mbar下冻干24小时，得到水蛭素产品。

2.根据权利要求1所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S1中的诱导溶液包括如下质量百分数的组分：苹果酸0.5-2％、柠檬酸0.5-1.5％、氯化钠0.8-1％、葡萄糖0.5-1.2％、消旋酮异亮氨酸钙0.4-0.8％、3-烯丙氧基-4-甲氧基苯甲醛0.01-0.05％、油醇聚醚-7磷酸酯钠0.05-0.2％，其余为水，所述诱导溶液与菲牛蛭的质量比为3-8：1。

3.根据权利要求2所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S1中猪血提取物的添加量为混合溶液质量的5-10％，所述猪血提取物由新鲜猪血经冷冻干燥后粉碎至100目得到。

4.根据权利要求3所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S201中L-半胱氨酸、1-(2-氯-5-磺酸基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮与二甲亚砜的质量比为1：1.2-1.8：12-18。

5.根据权利要求4所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S202中第一溶液中功能化L-半胱氨酸与乙酸乙酯的质量比为1：20-40；

所述步骤S202中第二溶液中三光气与乙酸乙酯的质量比为1：8-12；

所述步骤S202中L-半胱氨酸与三光气的质量比为1：1.1-1.3。

6.根据权利要求5所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S202中乙酸乙酯/石油醚混合溶液中乙酸乙酯与石油醚的体积比为1：2-3。

7.根据权利要求6所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S203中功能化L-半胱氨酸的N-羧基环内酸酐、氨基阳离子淀粉和N,N-二甲基甲酰胺的质量比为3-8：1：40-60。

8.根据权利要求7所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S3中固定化微球载体、氯化钠溶液的质量比为1：30-50，所述凝血酶溶液的浓度为5-10g/L，所述步骤S3中戊二醛溶液的加入量为体系总体积的1-5％。

9.根据权利要求8所述的菲牛蛭活体高效提取水蛭素的方法，其特征在于：所述步骤S4中水蛭素粗提液与固定化凝血酶按照体积比为10-20：1混合；

所述步骤S4中的洗脱液为含有0.5-1.0mol/LNaCl的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液。