CN120665803A - 黄芪甲苷在调节孤雌激活胚胎发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及黄芪甲苷在调节孤雌激活胚胎发育中的应用。本发明确定在绵羊卵母细胞体外成熟液中添加黄芪甲苷等物质可显著提高卵母细胞成熟率。首先，在卵母细胞成熟液中分别添加番茄红素、黄芪甲苷、异甘草素、连翘苷和黄芩素，以第一极体排出率、卵裂率和囊胚率筛选出各添加物的最佳剂量；最后根据筛选出的最佳剂量将添加物组合添加至卵母细胞成熟液中，并检测第一极体排出率、卵裂率和囊胚率确定最佳组合物，并检测最佳组合物的ROS、GSH、线粒体膜电位、氧化应激和凋亡相关基因的水平，以判进一步确定其应用效果。

Description

黄芪甲苷在调节孤雌激活胚胎发育中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及黄芪甲苷在调节孤雌激活胚胎发育中的应用。

背景技术

加强种质资源是当前社会的重要行动，要打牢种质资源基础，保护好、利用好种质资源。畜禽遗传资源是农业种质资源的重要组成部分，是培育优良品种的源头，关系着畜产品稳产保供安全。畜禽种业是我国种业振兴的重要方面之一，同时也是实现牧业强国的重要支撑。新疆肉品需求量最大的是羊肉，尤其是在南疆，羊肉消费更是硬性需求。为了提高羊体外胚胎生产的效率，打破羊养殖生产效率低的瓶颈，培养出生产性能优良的后代，体外胚胎生产技术（IVP）是解决该问题的重要手段。

IVP技术包括卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外发育等步骤。其中卵母细胞体外成熟是影响IVP结果的主要环节。然而，体外培养的绵羊卵母细胞质量极差，成熟率仅为45%~59%。因此，如何提高卵母细胞体外培养质量是本领域技术人员急需解决的重要问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了黄芪甲苷在调节孤雌激活胚胎发育中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，番茄红素在制备绵羊卵母细胞体外培养试剂中的应用。

进一步地，番茄红素调控卵母细胞体外培养的第一极体排出率、卵裂率、囊胚率。

本发明还提供了一种卵母细胞成熟液，卵母细胞成熟液中包含番茄红素。

进一步地，还包含黄芪甲苷、异甘草素、连翘苷和黄芩素中的至少一种。

进一步地，所述黄芪甲苷的浓度为10μM-40μM。

进一步地，所述异甘草素的浓度为20μM-60μM。

进一步地，所述连翘苷的浓度为20μM-60μM。

进一步地，所述卵母细胞成熟液培养卵母细胞的条件为38.5℃、5% CO₂。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提出了一种含有黄芪甲苷的卵母细胞体外成熟培养液，通过大量实验发现该培养液能够使卵母细胞第一极体排出率提升至81.67±2.89%、卵裂率提升至92.89±1.49%、囊胚率提升至63.30±2.05%、活性氧水平显著降低（P=0.0407）、谷胱甘肽含量显著增加（P=0.0043），减轻氧化应激对卵母细胞的损伤。同时，可以有效改善卵母细胞线粒体膜电位水平（P＜0.0001），维持线粒体的氧化磷酸化能力，改善卵母细胞健康状况。

附图说明

图1是联合添加番茄红素和黄芪甲苷对绵羊卵母细胞氧化应激水平的影响；

图2是联合添加番茄红素和黄芪甲苷对绵羊卵母细胞线粒膜电位的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30°C，最好是15～25°C。

本发明披露了黄芪甲苷在调节孤雌激活胚胎发育中的应用。本发明确定在绵羊卵母细胞体外成熟液中添加番茄红素、黄芪甲苷等物质可显著提高卵母细胞成熟率。首先，在卵母细胞成熟液中分别添加番茄红素、黄芪甲苷、异甘草素、连翘苷和黄芩素，以第一极体排出率、卵裂率和囊胚率筛选出各添加物的最佳剂量；最后根据筛选出的最佳剂量将添加物组合添加至卵母细胞成熟液中，并检测第一极体排出率、卵裂率和囊胚率确定最佳组合物，并检测最佳组合物的ROS、GSH、线粒体膜电位、氧化应激和凋亡相关基因的水平，以判进一步确定其应用效果。

本发明涉及的采卵液、培养液配方及操作方法如下：

采卵液：TCM199 基础培养基（500 mL），肝素钠（0.025 g），庆大霉素（0.025 g），胎牛血清（2%，使用时添加）。过滤，4℃冰箱保存。

表 1 卵母细胞培养基础液成分

卵母细胞成熟液：使用时将处理好的药物添加到卵母细胞基础液中，最终配置成不同浓度的卵母细胞成熟液。

表 2 早期胚胎发育液成分

卵母细胞采集与培养：

采卵前先配制采卵液和卵母细胞成熟培养液。将采卵液加入90mm培养皿中（加入量为培养皿的三分之二），用于后续采卵。将1mL卵母细胞成熟培养液加入30mm培养皿中，制作两个洗盘，用于洗去卵母细胞周围杂质。取一个四孔板，每孔加入600μL含不同浓度番茄红素的卵母细胞成熟培养液。将培养皿和四孔板都移入38.5℃、5% CO₂培养箱中过夜平衡

从保温壶中取出卵巢，用剪刀剪掉子宫等多余物质，只留卵巢。将卵巢放入氯化钠溶液中清洗3~4遍，清洗完毕后将卵巢放入含有氯化钠溶液的烧杯中，防止其干燥，后续进行采卵工作。将培养箱中预热的采卵液取出放置在操作台上，每次用镊子将清洗完毕的卵巢取出4~5个，放在纱布上，将卵巢表面的氯化钠溶液擦干，将卵巢放入采卵液中，使用手术刀将卵巢表面有明显卵泡的地方轻轻划破，对卵巢进行反复划割，尽可能地多采集卵母细胞。将洗盘取出放置在加热板上，等割卵完毕，将装有采卵液的培养皿移至体式显微镜下使用口吸管挑选卵母细胞，收集胞质均匀，有不少于三层的卵丘颗粒细胞包围的卵母细胞，将收集的卵母细胞放入洗盘中清洗。待挑选完卵母细胞后，将四孔板取出放置在加热板上，将洗净的卵母细胞，移至四孔板中，重复这一步骤，将所有卵母细胞转移完毕，将四孔板放回38.5℃、5% CO₂培养箱中，培养24h。

成熟卵母细胞处理：提前准备1个四孔板，每个孔中加入500μL采卵液和100μL1%透明质酸酶（透明质酸酶0.005g，TCM199培养基5mL，过滤，100μL分装，-20℃冰箱保存）放在恒温台上预热。将成熟卵母细胞从培养箱中取出放置在体式显微镜下，使用口吸管将四孔板中成熟的卵母细胞吸出，转入提前预热完毕含有透明质酸酶的采卵液中（每孔约100~150个卵母细胞），使用移液枪对卵母细胞反复轻柔地吹打（切勿直接将卵母细胞往孔壁上猛烈吹打），直至颗粒细胞完全脱离。

孤雌激活：提前1 d准备，准备1个四孔板，在1号孔中加入500μL的SOFaa溶液；在2号孔中加入500μL含有7%乙醇的SOFaa溶液（乙醇在激活前加入）；在3号孔和4号孔中加入500μL含有6-DMAP的SOFaa溶液，将其放入38.5℃、5%CO₂的培养箱中过夜预热平衡。将脱去颗粒细胞的卵母细胞转入1号孔中使用SOFaa溶液洗去透明质酸酶，清洗完毕后转入2号孔使用7%乙醇处理5min，乙醇处理完毕后将卵母细胞转入3号孔中洗去乙醇，清洗完毕后将卵母细胞转入4号孔中使用6-DMAP激活转入培养箱中激活4 h。

早期胚胎体外发育：在卵母细胞成熟前1 d下午准备发育液，准备1个60mm培养皿，在培养皿中使用SOFaa溶液制作50μL的成熟微滴，使用石蜡油将每个微滴完全覆盖；在30mm培养皿中加入2-3mL的SOFaa溶液当作洗盘，制作完毕后将两个培养皿转入38.5℃、5%CO₂的培养箱中过夜平衡。

在6-DMAP激活卵母细胞4 h后，使用口吸管将卵母细胞先转入装有SOFaa的洗盘中清洗掉6-DMAP，清洗完毕后再使用口吸管将卵母细胞分别转入60mm培养皿的SOFaa微滴中（每个微滴放入20-25个卵母细胞），放入38.5℃、5%CO₂的培养箱中培养。在培养第7d统计囊胚率。

实施例1 体外成熟液添加不同浓度番茄红素对孤雌激活胚胎发育的影响

（1）试验设计

对照组：未成熟卵母细胞在体外成熟基础培养液中培养24h。

H₂O₂组：未成熟卵母细胞在含有200μMH₂O₂的体外成熟基础培养液中培养24h。

处理组1-4：未成熟卵母细胞分别在含有5μM（处理组1）、10μM（处理组2）、15μM（处理组3）和20μM（处理组4）浓度番茄红素的体外成熟液中培养24h。

（2）卵母细胞体外成熟、孤雌激活和胚胎培养

收集未成熟的绵羊卵母细胞，使用上述分组的体外成熟培养液进行卵母细胞培养，统计卵母细胞卵裂率和囊胚率。

（3）试验结果

卵母细胞发育率统计结果如表3所示。数据表明，处理组1即5μM处理组第一极体排出率（68.34±1.86%）显著高于对照组（51.10±0.23%）。对照组和处理组2（50.98±1.08%）、处理组3（51.80±1.28%）、处理组4（50.71±1.47%）无统计学差异。与对照组卵裂率（61.29±1.41%）相比，处理组1卵裂率（82.01±0.88%）显著升高，处理组2、处理组3和处理组4卵裂率与对照组无统计学差异。同时，处理组1囊胚率（54.40±0.41%）显著高于对照组（43.55±1.40%）。H₂O₂显著降低了孤雌激活胚胎发育率，在卵母细胞体外成熟基础培养液中添加5μM番茄红素对孤雌激活胚胎发育率的提高最显著。

表 3 体外成熟液添加番茄红素对孤雌激活胚胎发育的影响

注：表中同列不同字母上标（a、b、c）表示各组存在显著差异P<0.05。

实施例2 体外成熟液添加不同浓度黄芪甲苷对孤雌激活胚胎发育的影响

（1）试验设计

对照组：未成熟卵母细胞在体外成熟基础培养液中培养24h。

H₂O₂组：未成熟卵母细胞在含有200μMH₂O₂的体外成熟基础培养液中培养24h。

处理组1-3：未成熟卵母细胞分别在含有10μM（处理组1）、20μM（处理组2）和40μM（处理组3）浓度黄芪甲苷的体外成熟液中培养24h。

（2）卵母细胞体外成熟、孤雌激活和胚胎培养

收集未成熟的绵羊卵母细胞，使用上述分组的体外成熟培养液进行卵母细胞培养，统计卵母细胞卵裂率和囊胚率。

（3）试验结果

卵母细胞发育率统计结果如表4所示。数据表明，处理组2即20μM处理组第一极体排出率（66.92±1.35%）显著高于对照组（52.70±3.64%），对照组与处理组1（52.01±2.09%）差异不显著，处理组3（38.32±0.91%）显著低于对照组。与对照组卵裂率（62.51±0.86%）相比，处理组2卵裂率（85.15±1.58%）显著升高，处理组1卵裂率（61.84±0.99%）与对照组无统计学差异，处理组3卵裂率（48.65±5.57%）显著低于对照组。同时，20μM处理组囊胚率（53.07±0.47%）显著高于对照组（42.18±0.82%）。H₂O₂显著降低了孤雌激活胚胎发育率，在卵母细胞体外成熟基础培养液中添20μM黄芪甲苷对孤雌激活胚胎发育率的提高最显著。

表 4 体外成熟液添加黄芪甲苷对孤雌激活胚胎发育的影响

注：表中同列不同字母上标（a、b、c）表示各组存在显著差异P<0.05。

实施例3 体外成熟液添加不同浓度异甘草素对孤雌激活胚胎发育的影响

（1）试验设计

对照组：未成熟卵母细胞在体外成熟基础培养液中培养24h。

H₂O₂组：未成熟卵母细胞在含有200μMH₂O₂的体外成熟基础培养液中培养24h。

处理组1-3：未成熟卵母细胞分别在含有20μM（处理组1）、40μM（处理组2）和60μM（处理组3）浓度异甘草素的体外成熟液中培养24h。

（2）卵母细胞体外成熟、孤雌激活和胚胎培养

收集未成熟的绵羊卵母细胞，使用上述分组的体外成熟培养液进行卵母细胞培养，统计卵母细胞卵裂率和囊胚率。

（3）试验结果

卵母细胞发育率统计结果如表5所示。数据表明，处理组2即40μM处理组第一极体排出率（66.72±1.55%）显著高于处理组1（59.14±0.71%）和处理组3（61.77±1.08%），处理组1和处理组3第一极体排出率高于对照组（53.20±1.12%）。与对照组卵裂率（63.08±1.55%）相比，处理组2卵裂率（81.26±1.81%）和处理组3（75.13±1.49%）显著升高。同时，处理组2囊胚率（50.59±1.03%）显著高于对照组（42.40±1.14%）。H₂O₂显著降低了孤雌激活胚胎发育率，在卵母细胞体外成熟基础培养液中添40μM异甘草素对孤雌激活胚胎发育率的提高最显著。

表 5 体外成熟液添加异甘草素对孤雌激活胚胎发育的影响

注：表中同列不同字母上标（a、b、c）表示各组存在显著差异P<0.05。

实施例4 体外成熟液添加连翘苷对孤雌激活胚胎发育的影响

（1）试验设计

对照组：未成熟卵母细胞在体外成熟基础培养液中培养24h。

H₂O₂组：未成熟卵母细胞在含有200μMH₂O₂的体外成熟基础培养液中培养24h。

处理组1-3：未成熟卵母细胞分别在含有20μM（处理组1）、40μM（处理组2）和60μM（处理组3）连翘苷的体外成熟液中培养24h。

（2）卵母细胞体外成熟、孤雌激活和胚胎培养

按照实例一所述方法收集未成熟的绵羊卵母细胞，使用上述分组的体外成熟培养液进行卵母细胞培养，同时按照实例一所述方法统计卵母细胞卵裂率和囊胚率。

（3）试验结果

卵母细胞发育率统计结果如表6所示。数据表明，处理组2即40μM处理组第一极体排出率（61.39±1.27%）显著高于对照组（51.11±1.73%），处理组1（54.17±1.44%）和处理组3（57.22±1.27%）无统计学差异。与对照组卵裂率（62.55±3.31%）相比，处理组1（71.87±4.15%）、处理组2（76.48±1.86%）和处理组3卵裂率（69.45±2.25%）显著升高，且无统计学差异。同时，处理组2囊胚率（55.70±3.30%）显著高于对照组（41.90±3.31%）。H₂O₂显著降低了孤雌激活胚胎发育率，在卵母细胞体外成熟基础培养液中添40μM连翘苷对孤雌激活胚胎发育率的提高最显著。

表 6 体外成熟液组合添加连翘苷对孤雌激活胚胎发育的影响

注：表中同列不同字母上标（a、b、c）表示各组存在显著差异P<0.05。

实施例5 体外成熟液添加不同浓度黄芩素对孤雌激活胚胎发育的影响

（1）试验设计

对照组：未成熟卵母细胞在体外成熟基础培养液中培养24h。

H₂O₂组：未成熟卵母细胞在含有200μMH₂O₂的体外成熟基础培养液中培养24h。

处理组1-3：未成熟卵母细胞分别在含有20μM（处理组1）、30μM（处理组2）、40μM（处理组3）浓度黄芩素的体外成熟液中培养24h。

（2）卵母细胞体外成熟、孤雌激活和胚胎培养

按照实例一所述方法收集未成熟的绵羊卵母细胞，使用上述分组的体外成熟培养液进行卵母细胞培养，同时按照实例一所述方法统计卵母细胞卵裂率和囊胚率。

（3）试验结果

卵母细胞发育率统计结果如表7所示。数据表明，处理组1即20μM处理组（55.56±1.27%）和处理组2第一极体排出率（55.56±0.48%）显著高于对照组（51.94±0.96%），处理组3（52.22±1.27%）和对照组无统计学差异。处理组1（61.02±2.52%）和处理组2（61.01±3.75%）与对照组卵裂率（60.46±3.40%）差异不显著，处理组3（57.97±0.69%）显著低于对照组。同时，处理组1（41.49±1.17%）和处理组2囊胚率（41.01±1.23%）与对照组（40.61±2.64%）差异不显著。H₂O₂显著降低了孤雌激活胚胎发育率，在卵母细胞体外成熟基础培养液中添30μM黄芩素可提高卵母细胞第一极体排出率，但囊胚率差异不显著。

表 7 体外成熟液添加黄芩素对孤雌激活胚胎发育的影响

注：表中同列不同字母上标（a、b、c）表示各组存在显著差异P<0.05。

实施例6 体外成熟液添加不同组合物对孤雌激活胚胎发育的影响

（1）试验设计

对照组：未成熟卵母细胞在体外成熟基础培养液中培养24h。

处理组1-10：未成熟卵母细胞分别在含有以下组合物的体外成熟液中培养24h。

表 8 不同处理组添加的组合物

（2）卵母细胞体外成熟、孤雌激活和胚胎培养

收集未成熟的绵羊卵母细胞，使用上述分组的体外成熟培养液进行卵母细胞培养，统计卵母细胞卵裂率和囊胚率。

（3）试验结果

卵母细胞发育率统计结果如表9所示。数据表明，添加两种组分的处理组中处理组1即5μM番茄红素+20μM黄芪甲苷的第一极体排出率、卵裂率及囊胚率最佳。以上结果显示，在卵母细胞体外成熟基础培养液中添5μM番茄红素+20μM黄芪甲苷对孤雌激活胚胎发育率的提高最显著。

表 9 体外成熟液添加不同组合物对孤雌激活胚胎发育的影响

注：表中同列不同字母上标（a、b、c）表示各组存在显著差异P<0.05。

实施例7 体外成熟液组合添加番茄红素和黄芪甲苷对卵母细胞成熟质量的影响

（1）实验设计

对照组：未成熟卵母细胞在体外成熟基础培养液中体外培养24h。

处理组：5μM番茄红素+20μM黄芪甲苷的体外成熟液中培养24h。

（2）卵母细胞体外成熟、孤雌激活和胚胎培养

收集未成熟的绵羊卵母细胞，使用上述分组的体外成熟培养液进行卵母细胞培养，进行体外受精和胚胎培养。

（3）GSH和ROS的检测

DCFH-DA检测ROS水平：用TCM199基础培养基稀释DCFH-DA，稀释1000倍，终浓度为10 μmol/L。制作80 μL的染色微滴，随机选取细胞，移入微滴中，置于38.5℃的培养箱中暗培养。25 min后取出，用TCM199培养基洗涤2遍，置于荧光倒置显微镜下观察，并使用ZEN软件获得图像。

CMF2HC用于检测GSH水平：CMF2HC用TCM199培养基稀释，10μL CMF2HC加990μLTCM199培养基。制作80 μL的染色微滴，随机选取细胞，移入微滴中。将细胞置于38.5℃避光的培养箱中暗培养，25 min后取出，用TCM199培养基洗涤2遍。在荧光倒置显微镜下观察，并使用ZEN软件获得图像。

使用Image J软件分析获得的荧光图像。

（4）线粒体膜电位的检测

使用JC-1检测线粒体膜电位：JC-1以5 μL JC-1（200×）与1 mL JC-1染色缓冲液的比例稀释。制作80 μL的染色微滴，随机选择细胞置于稀释好的JC-1染料微滴中。在38.5℃的培养箱中暗培养，25 min后取出，用TCM199培养基洗涤2遍。在荧光倒置显微镜下观察，使用ZEN软件获得图像，使用Image J软件分析红绿荧光图像。

（5）试验结果

ROS和GSH水平：为了评估联合添加番茄红素和黄芪甲苷对体外成熟卵母细胞的抗氧化作用，对对照组和处理组的成熟卵母细胞中的ROS和GSH水平进行了评估。如图1所示，根据荧光强度分析，与对照组相比，处理组卵母细胞中的ROS水平显著降低（P＜0.001），GSH水平显著降低（P=0.0043）。

线粒体膜电位：线粒体功能障碍和线粒体膜电位下降是导致卵母细胞成熟率下降的重要因素。因此，本实验使用JC-1检测线粒体膜电位变化。如图2所示，采集的JC-1染色后的代表性图像显示，与对照组相比，处理组显著提高了线粒体膜电位（P＜0.0001）。说明联合添加番茄红素和黄芪甲苷能够增强线粒体功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.黄芪甲苷在制备调节卵母细胞孤雌激活胚胎发育培养试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：黄芪甲苷调控卵母细胞体外培养的第一极体排出率、卵裂率、囊胚率。

3.一种卵母细胞成熟液，其特征在于：所述卵母细胞成熟液中包含黄芪甲苷、异甘草素、连翘苷和黄芩素中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的一种卵母细胞成熟液，其特征在于：所述黄芪甲苷的浓度为10μM-40μM。

5.根据权利要求3所述的一种卵母细胞成熟液，其特征在于：所述异甘草素的浓度为20μM-60μM。

6.根据权利要求3所述的一种卵母细胞成熟液，其特征在于：所述连翘苷的浓度为20μM-60μM。

7.根据权利要求3所述的一种卵母细胞成熟液，其特征在于：所述卵母细胞成熟液培养卵母细胞的条件为38.5℃、5% CO₂。