[go: up one dir, main page]

CN120641557A - 来源于多能细胞的红系谱系 - Google Patents

来源于多能细胞的红系谱系

Info

Publication number
CN120641557A
CN120641557A CN202380082687.5A CN202380082687A CN120641557A CN 120641557 A CN120641557 A CN 120641557A CN 202380082687 A CN202380082687 A CN 202380082687A CN 120641557 A CN120641557 A CN 120641557A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
hla
hscs
cell
ipscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202380082687.5A
Other languages
English (en)
Inventor
D·沙哈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Garuda Cell Therapy Co
Original Assignee
Garuda Cell Therapy Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Garuda Cell Therapy Co filed Critical Garuda Cell Therapy Co
Publication of CN120641557A publication Critical patent/CN120641557A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/18—Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2311—Interleukin-11 (IL-11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开在各个方面和实施例中提供了用于产生用于细胞疗法的造血谱系的方法，包括红系祖细胞、祖细胞成红血细胞、粒细胞‑巨噬细胞祖细胞(GMP)、以及巨核细胞红系祖细胞(MEP)和红系细胞。在各种实施例中，本发明提供了用于从人类诱导多能干细胞(iPSC)开发此类造血谱系(包括但不限于祖细胞成红血细胞和成红血细胞谱系)的高效体外方法。根据本公开在各种实施例中产生的细胞是功能性的和/或更接近地类似于从外周血或骨髓中分离的对应谱系。本发明还提供了通过本文公开的方法产生的经分离的细胞和细胞组合物，以及用于细胞疗法的方法。

Description

来源于多能细胞的红系谱系
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年10月5日提交的美国临时专利申请号63/413,439的权益和优先权，其内容特此以引用方式全文并入。
序列表
本申请含有已经以XML格式通过EFS-Web提交并特此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2023年9月26日的所述XML副本命名为GRU-012PC_Sequence_Listing.xml并且大小为30,040字节。
背景技术
据美国红十字会称，它正面临全国血液危机——十多年来最严重的血液短缺，给患者护理带来了令人担忧的风险。在这场危机中，医生被迫就谁接受输血以及谁需要等待直到更多产品可用做出艰难的决定。因此，迫切需要开发现成的红血细胞(red bloodcell)(RBC)或红细胞(erythrocyte)或其祖细胞。来源于诱导多能细胞的造血干细胞提供了这样的机会。然而，由于红细胞谱系细胞扩增的限制或去核不足，目前用于从iPSC产生RBC的方法已被证明是不够的。因此，从iPSC体外成功产生红血细胞产品将满足巨大的需求。
发明内容
本公开在各个方面和实施例中提供了用于产生用于细胞疗法的造血谱系的方法，包括基因编辑的造血干细胞(HSC)、红系祖细胞、祖细胞成红血细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)、巨核细胞红系祖细胞(MEP)和红系细胞。在各种实施例中，本发明提供了用于从人类诱导多能干细胞(iPSC)开发此类造血谱系(包括但不限于祖细胞成红血细胞和成红血细胞谱系)的高效体外方法。根据本公开在各种实施例中产生的细胞是功能性的和/或更接近地类似于从外周血或骨髓中分离的对应谱系。本发明还提供了通过本文公开的方法产生的经分离的细胞和细胞组合物，以及用于细胞疗法的方法。
在其他方面和实施例中，本公开提供了来源于经基因编辑以编码高反应性EPO受体的iPSC的HSC或红系祖细胞。这些HSC或红系祖细胞群体可以用于更高效的体外红细胞生产，或者在其他方面，可以用于将HSC或红系祖细胞递送给有需要的患者，以减少或消除对定期输血的需求。
一方面，本公开提供了一种用于制备造血谱系的细胞群体的方法。该方法包括制备多能干细胞(PSC)群体，诸如分化为胚状体(EB)的诱导多能干细胞(iPSC)群体，并富集CD34+细胞，以从而制备CD34+富集的群体。在CD34+富集的群体中诱导内皮细胞到造血细胞转变(EHT)，以从而制备造血干细胞(HSC)群体，之后任选地进一步富集CD34+细胞。在一些实施例中，一些实施例中所得的HSC群体(或其级分)可以分化为红系造血谱系(例如，红系祖细胞)。在各种实施例中，造血谱系选自红细胞(即红血细胞)、祖细胞成红血细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)和巨核细胞红系祖细胞(MEP)。
在各种实施例中，HSC及来自其的红系谱系细胞来源于经经基因编辑为以下之一的iPSC：(i)HLA-A-B+C+DP-DR+DQ+，(ii)HLA-A-B+C+DP+DR+DQ-，(iii)HLA-A-B+C+DP-DR+DQ-；(iv)HLA-A-B-C+DP-DR+DQ+；(v)HLA-A-B-C+DP+DR+DQ-、(vi)HLA-A-B-C+DP-DR+DQ-。在一些实施例中，HSC和红系谱系细胞来源于经基因编辑为以下的iPSC：HLA-Aneg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1neg和HLA-DQB1neg。在一些实施例中，iPSC对于HLA-DRB1是进一步纯合的。
在一些实施例中，本公开的iPSC经基因编辑以编码反应性EPO受体。红细胞生成是红血细胞产生的过程。促红细胞生成素(EPO)是负责有效红细胞生成的关键激素。促红细胞生成素受体(EPOR)是由EPOR基因编码的蛋白质。EPOR最得到确认的功能是促进增殖并挽救红系(红血细胞)祖细胞免于细胞凋亡。EPOR的有益突变增加红血细胞数量并使氧输送得到改善。例如，通过截短突变(仅去除与负调节因子结合的细胞内EPORC末端)可以使EPOR对EPO具有高反应性。
这些HSC群体或红系祖细胞可以用于更高效的体外红细胞生产，或者在其他实施例中，可以用于将HSC或红系祖细胞递送给有需要的患者，以减少或消除对定期输血的需求。此外，由于此类细胞可以经基因编辑以使某些HLA基因缺失(如上所述)，因此HSC群体和红系祖细胞可以容易地与受体进行HLA匹配。根据本公开，HSC分化为各种造血谱系(类似于骨髓CD34+细胞)，并且能够恢复受体的造血系统。
在一些实施例中，iPSC分化进行直至细胞为至少约10％ CD34+，或至少约20％CD34+，或至少约25％ CD34+，或至少约30％ CD34+。在一些实施例中，CD34富集和EHT可以在iPSC分化的第7天至第14天(诸如例如第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天)被诱导。可以通过任何已知的方法从分化的iPSC中收获的CD34+细胞中诱导EHT。在一些实施例中，EHT使用机械、生物化学、药理学和/或遗传学手段(例如，通过刺激、抑制和/或遗传修饰)通过内皮细胞或造血内皮细胞(HEC)前体产生HSC。
在一些实施例中，该方法包括增加DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(Dnmt3b)在PSC、胚状体、CD34+富集的细胞、EC、HEC或HSC中的表达或活性，这可以通过机械、遗传、生物化学或药理学手段进行。在一些实施例中，对EHT的诱导包括增加造血内皮细胞中dnmt3b的表达或活性。在一些实施例中，细胞与有效量的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂接触，该激动剂增加Dnmt3b的活性或表达。在一些实施例中，机械敏感受体是Piezol。
在各种实施例中，从经历内皮细胞到造血转变的培养物中收获CD34+细胞(例如，漂浮细胞和/或贴壁细胞)，并任选地在培养物中扩增。产生红系、髓系和淋巴谱系的造血干细胞(HSC)可以基于CD34+的表达和谱系特异性标记物(称为Lin-)的缺乏来鉴定并任选地分选或富集。
在一些实施例中，HSC群体或其级分分化为红细胞、或其祖细胞或衍生物。例如，将HSC群体(或从中分离的细胞)与例如EPO、IL-3和SCF(和/或其他细胞外基质组分)和/或其组合一起培养，以产生包含红系祖细胞或衍生物细胞群体(例如，红细胞)的群体。细胞的HSC群体产生高百分比的红系爆式集落形成单位(BFU-E)细胞和红系集落形成单位(CFU-E)细胞，这些细胞是诱导红细胞生成的指标。
在其他方面，本发明提供了一种通过本文所述的方法产生的红系谱系群体或其药学上可接受的组合物。在各种实施例中，组合物包含所需的细胞群体(例如，红细胞)和药学上可接受的载体。药物组合物可以包含每mL至少约107个红细胞。药物组合物可以以约50mL至约500mL、或约100mL至约500mL或约250至约500mL的单位提供。
在某些方面，提供了一种具有高反应性EPOR的HSC组合物或红系祖细胞，并且其可以通过本文所述的方法产生。在一些实施例中，HSC或红系祖细胞是HLA-Aneg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的)、以及HLA-DPB1neg和HLA-DQB1neg。在一些实施例中，iPSC对于HLA-DRB1是进一步纯合的。本公开的细胞组合物可以进一步包含适用于静脉输注或其他施用途径的药学上可接受的载体或赋形剂，并且该组合物可以包含合适的防冻剂。示例性的载剂是DMSO(例如，约10％ DMSO)。细胞组合物可以以单位小瓶或小袋提供，并冷冻保存直至使用。
根据本公开产生的细胞可以在例如用于以下的疗法中施用或使用：遗传性或获得性红细胞疾患、骨髓衰竭疾患、高原相关生理和病理性病症、贫血(例如，镰状细胞性贫血)、红细胞酶缺乏症(例如G6PD)、红细胞膜疾患(例如遗传性球形红细胞增多症)、血红蛋白病(例如镰状细胞病和地中海贫血)、溶血性贫血、营养性贫血(例如缺铁性贫血和叶酸缺乏症)、血红素产生疾患(例如铁粒幼细胞性贫血)、血色素沉着病、与化学物质或辐射暴露相关的病症，和/或用于治疗经历HSC移植的受试者。在进一步的实施例中，根据本公开制备的红细胞作为药学上可接受的组合物提供，所述组合物递送或包封药物(包括但不限于酶)、氧载体或其他合适的材料，以治疗人类疾病或生理或病理性病症。
在某些实施例中，本公开提供了用于治疗贫血的组合物和方法。在实施例中，本公开提供了造血干细胞(HSC)组合物或红系祖细胞组合物，其可提供持久且有效的贫血细胞疗法。在实施例中，HSC被截短和/或突变的EPOR超负荷，从而导致高反应性EPOR。在实施例中，本公开的组合物和方法可以为患者提供足够的红血细胞以供应健康的氧合水平。
在各种实施例中，本公开提供了一种治疗需要红血细胞产生的受试者的方法，包括向受试者施用本公开的HSC或红系祖细胞组合物。因此，根据本公开产生的HSC可以用于以持久且有效的方式在体内产生红血细胞。在一些实施例中，接受者受试者患有贫血。在一些实施例中，接受者受试者患有镰状细胞性贫血、再生障碍性贫血、与骨髓疾病或骨髓衰竭相关的贫血、失血性贫血或溶血性贫血。在一些实施例中，接受者受试者患有范可尼贫血。在一些实施例中，受试者患有地中海贫血。在一些实施例中，HSC或红系祖细胞用于制备血液产品，用于治疗与血液、骨髓、免疫、代谢或线粒体疾患相关的合并症。
从以下详细的公开内容和工作实例中，本公开的其他方面和实施例将变得显而易见。
附图说明
图1显示ETV2过表达(OE)不影响多能性。图1显示代表iPSC用腺病毒载体过表达ETV2和GFP序列的转导效率的FACS图。如TRA-1-60干细胞标记物的表达所示，ETV2过表达不影响iPSC干细胞特性。
图2显示ETV2过表达(OE)增加造血内皮细胞的产率。造血内皮细胞(描述为CD235a-CD34+CD31+)的代表性流式细胞仪分析和相对定量表明ETV2-OE增强造血内皮细胞的形成。
图3显示ETV2过表达(OE)增强iPSC分化期间CD34+细胞的形成。CD34+细胞的代表性流式细胞仪分析，并且相对定量表明ETV2-OE增强CD34+细胞的形成。
图4A和图4B显示，来源于CD34+细胞的EHT的iPSC来源的HSC(在该实例中用Piezo1激活)经历类似于骨髓(BM)-HSC的原T细胞分化。图4A是来源于CD34+细胞的EHT的骨髓(BM)HSC和iPSC-HSC(在该实例用Piezo1激活)向34+CD7+原T细胞分化效率的FACS图。图4B是对通过(1)BM-HSC和(2)iPSC-HSC(Piezo1激活)来源的CD34+CD7+细胞(％)的定量。图4B显示三次实验的平均值。
图5A和图5B显示用EHT产生的iPSC来源的HSC(在该实例用Piezo1激活)经历T细胞分化，并且可以类似于BM-HSC被CD3/CD28珠激活。图5A是BM-HSC和iPSC来源的HSC(在该实例用Piezo1激活产生)分化的T细胞的激活效率(CD3+CD69+表达)的FACS图。图5B是对通过(1)BM-HSC和(2)iPSC-HSC(Piezo1激活)来源的CD3+CD69+细胞(％)的定量。图5B显示三次实验的平均值。
图6显示，用CD34+细胞的EHT产生的iPSC来源的HSC(在该实例中用Piezo1激活)可以分化为功能性T细胞。IFNγ表达是T细胞受体(TCR)经由CD3/CD28珠刺激后T细胞激活的结果。由iPSC来源的HSC(D8 34+细胞的EHT，包括用Piezo1激活)分化的T细胞中IFNγ表达增强了HSC进一步分化为功能性造血谱系(在该例中为T细胞)的能力。图6显示三次实验的平均值。
图7A和图7B显示通过FACS和免疫荧光进行的HLA编辑的(例如，三重敲除)细胞的表型分析。图7A显示HLAI类分子(HLA-A、HLA-B和HLA-C)在细胞表面的总体表达，其中HLA编辑的细胞对总体HLAI类表达呈阳性，其程度与野生型细胞(gHSC)相似。图7B显示经由免疫荧光的HLA-A的细胞表达，其中HLA-A在HLA编辑的克隆中不表达。
图8显示HLA编辑的克隆保留它们的多能性(保持三系分化)，如免疫荧光所示，其中外胚层分化由巢蛋白-488和PAX6-594染色指示，中胚层分化由GATA-488染色指示，并且内胚层分化由CXCR4-488和FOX2A-594染色指示。
图9显示了HLA编辑的HSC的免疫相容性。将HLA编辑的HSC和对照HSC(WT、B2M KO和HLA II类无效)与HLA-B和HLA-C匹配但HLA-A不匹配的外周血单核细胞(PBMC)共培养，并且通过膜联蛋白V染色测定来测量PBMC介导的细胞毒性。
图10显示HLA编辑的HSC的体内移植潜力。将等比例的mCherry HLA编辑的HSC和野生型HSC(gHSC)混合，用于竞争性移植到小鼠中，其中通过FACS评估骨髓(BM)和外周血样品，以比较样品中存在的每种细胞类型的相对量。
图11A和11B显示，HLA-A的缺失不影响I类肽的呈递。图11A显示免疫肽组分析的示意图。图11B显示免疫肽组分析的结果，结果显示WT和HLA编辑细胞的I类分子呈递的肽和代表性蛋白的数量存在极小差异。
图12A和12B显示HLA-DP和DQ的缺失不影响II类肽的呈递。图12A显示免疫肽组分析图。图12B显示，尽管HLA-DP和DQ的缺失，细胞仍然保留了其通过HLAII类呈递广谱肽的能力。
图13是抗原介导免疫反应在体内测试的示意图：分别为迟发型超敏反应测定(DTH)、致敏阶段和消除阶段。
图14A和14B显示经HLA编辑的HSC重建了功能性免疫系统，如通过免疫缺陷小鼠的DTH反应证实。图14A显示对移植小鼠进行的迟发型超敏反应测定，该测定涉及不同类型的免疫细胞的相互作用。通过皮下注射绵羊红细胞(抗原)使小鼠致敏。功能性免疫系统导致左爪肿胀，用微型卡尺测量。如图14A中可以看出，非移植小鼠由于其免疫缺陷，没有显示任何左爪肿胀。相反地，移植有脐带血CD34+细胞的小鼠显示组织肿胀，并且其左爪直径增加一倍。图14B是对图14A所示结果的图形评估。
图15显示HSC分化为T细胞亚型的潜能。经过35天的分化期后，通过细胞分选评估原T细胞中CD4+、CD8+和AB+T细胞群体的存在。图15比较了根据本发明制备的骨髓来源的CD34+细胞、胚状体CD34+细胞和HSC(“gHSC”)(例如，使用Piezo1激活)的分化潜能。
图16显示从HSC来源的T细胞与CD19+淋巴瘤细胞在抗CD3/CD-19双特异性抗体的存在下的共培养物测量的T细胞介导的细胞毒性程度。根据本公开，由造HSC制备的T细胞(“gHSC”)表现出对靶细胞的高水平的细胞毒性。
图17显示HSC发育成原T细胞的能力，如通过其CD34-CD7+标记物所测量。
图18A和18B显示根据本公开，来源于HSC的原T细胞中T细胞特异性转录因子和胸腺植入分子的表达增加。图18A显示TCF7 mRNA表达，图18B显示CCR7 mRNA表达。
图19A和19B显示HSC来源的原T细胞在胸腺中植入并分化。图19A展示植入和分析程序。图19B显示了以CD45+细胞群体设门的CD3细胞群的FACS分析，这表明HSC来源的原T细胞在胸腺中具有优异的植入和分化潜能。
图20显示HSC来源的T细胞可以在体外被激活。顶部小图显示了来自不同来源(包括根据本公开制备的HSC)的激活T细胞的FACS分析。本公开的T细胞表现出相当或更优异的激活作用，如通过增加的CD107的表达所测量的。下方小图显示Dynabeads激活，其中激活的T细胞表达炎性细胞因子。HSC来源的T细胞表达更高水平的炎性细胞因子，如通过TNF-α和干扰素γ的表达水平所例示。
图21A和21B显示WT和HLA编辑的HSC可以分化为单核细胞/巨噬细胞谱系，并且还保留了I类和II类分子两者的整体表达，如通过CD11b+CD14+标记物所鉴定(图21A)。图21B显示以CD11b+CD14+设门的细胞的HLA-I和HLA-II分析。
图22A至22C显示HLA-DQB1和HLA-DPB1缺失不影响其他HLAII类分子的表达。图22A是HLA编辑的iPSC分化为巨噬细胞的示意图。图22B是免疫荧光实验，证实了DPB1和DQB1分子的特异性缺失。图22C显示相同的细胞保留了II类DRB1的表达。
图23显示HLA编辑的HSC可以分化为巨核细胞(MK)，其可以进一步分化为血小板。左边处的图像显示，通过放大1000倍的光学显微镜，HSC中的血小板的比例增加。右侧处的图显示，与BM CD34+和iPSC-34+细胞群体相比，HLA编辑的HSC分化的血小板比例在统计学上显著增加。
术语“gHSC”在本文中用于指本公开的iPSC来源的造血干细胞。
术语“野生型”(WT)、“未编辑的”、“非HLA编辑的”在本文中可互换使用，以指代本公开的非基因编辑的细胞。
EB34+细胞指胚胎体来源的CD34+细胞。这些包括造血内皮细胞。
具体实施方式
本公开在各个方面和实施例中提供了用于产生用于细胞疗法的造血谱系的方法，包括基因编辑的造血干细胞(HSC)、红系祖细胞、祖细胞成红血细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)、巨核细胞红系祖细胞(MEP)和红系细胞。在各种实施例中，本发明提供了用于从人类诱导多能干细胞(iPSC)开发此类造血谱系(包括但不限于祖细胞成红血细胞和成红血细胞谱系)的高效体外方法。根据本公开在各种实施例中产生的细胞是功能性的和/或更接近地类似于从外周血或骨髓中分离的对应谱系。本发明还提供了通过本文公开的方法产生的经分离的细胞和细胞组合物，以及用于细胞疗法的方法。
在其他方面和实施例中，本公开提供了来源于经基因编辑以编码高反应性EPO受体的iPSC的HSC。这些HSC群体可以用于更高效的体外红细胞生产，或者在其他方面，可以用于将HSC或红系祖细胞递送给有需要的患者，以减少或消除对定期输血的需求。
根据本公开的方面和实施例，人类诱导多能干细胞(hiPSC)产生基本上无限的多能干细胞(PSC)的能力被用来产生无限的造血细胞供应，包括但不限于产生治疗性人类红细胞或红血细胞(“RBC”)或其红系祖细胞。RBC用于治疗目的的用途因其可用性、细胞数量和受限的扩增潜力而受到严重限制。此外，与原代细胞相比，hiPSC可以更容易地在体外进行遗传修饰，从而提供改善细胞靶向特异性、细胞数量以及绕过例如HLA匹配问题。此外，与原代细胞相比，完全工程化的hiPSC克隆可以作为稳定且安全的来源(Nianias和Themeli，2019)。此外，由于hiPSC与人类胚胎干细胞(hESC)不同，是非胚胎来源的，因此它们也没有伦理顾虑。因此，使用根据本公开的hiPSC具有优于原代细胞的若干有点，以产生治疗性造血谱系(诸如红系谱系)。
一方面，本公开提供了一种用于制备造血谱系的细胞群体的方法。该方法包括制备多能干细胞(PSC)群体，诸如分化为胚状体的诱导多能干细胞(iPSC)群体，并富集CD34+细胞，从而制备CD34+富集的群体。在CD34+富集的群体中诱导内皮细胞到造血细胞转变(EHT)，以从而制备造血干细胞(HSC)群体，之后任选地进一步富集CD34+细胞。在一些实施例中，所得HSC群体(或其级分)可以分化为红系造血谱系。在各种实施例中，造血谱系选自红细胞(即红血细胞)、祖细胞成红血细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)和巨核细胞红系祖细胞(MEP)。
传统上，通过iPSC分化为胚状体直至第8天以收获CD34+细胞来制备造血谱系。CD34通常用作造血内皮细胞、造血干细胞和造血祖细胞的标记物。根据本公开的方面和实施例，发现诱导CD34+细胞群体的内皮细胞到造血细胞转变(EHT)并且其可以来源于iPSC胚状体，可以用于体外产生高级造血干细胞和造血谱系，包括红系谱系。
在一些实施例中，本公开内容提供了一种用于产生有成红血细胞群体(例如，早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞和形态学上可识别的红系前体)或该群体的衍生物的方法。例如，该方法包括从iPSC(例如，hiPSC)产生包含人类长期造血干细胞(LT-HSC)的造血干细胞(HSC)群体。HSC群体是通过诱导CD34+细胞(例如，来源于胚状体的CD34+细胞)的内皮细胞到造血细胞转变而获得的。将HSC群体(或从中分离的细胞)与例如EPO、IL-3和SCF(和/或其他细胞外基质组分)和/或其组合一起培养，以产生包含红系祖细胞或衍生物细胞群体(例如，红细胞)的群体。细胞的HSC群体产生高百分比的红系爆式集落形成单位(BFU-E)细胞和红系集落形成单位(CFU-E)细胞，这些细胞是诱导红细胞生成的指标。
本公开的各方面和实施例可以用于从造血干细胞(HSC)群体分化或来源的细胞中产生网织红细胞和/或去核成熟红细胞，该造血干细胞(HSC)群体包含来源于iPSC(例如，hiPSC)的人类长期造血干细胞(LT-HSC)。例如，可以在生物反应器(例如，搅拌式生物反应器)中在红系分化条件下培养iPSC来源的HSC，当在最佳物理条件(pH值范围为约7.0至约7.5，约25％至约75％氧(例如，约50％氧)，无需气体鼓泡，并进行机械搅拌(叶轮转速大约300-450rev/min))下培养时其将产生纯度约为80％的去核细胞。可以向红系分化条件添加补充化合物(诸如细胞因子和生长因子)，以促进去核细胞的产量。
在各种实施例中，iPSC通过对体细胞进行重编程来制备。术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指源于体细胞的细胞，诸如已经被重编程回到胚胎样多能状态的皮肤或血细胞。在一些实施例中，iPSC由体细胞产生，诸如(但不限于)成纤维细胞或PBMC(或从其分离的细胞)。在一些实施例中，iPSC来源于淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞等)、脐带血细胞、PBMC、CD34+细胞或其他人类原代组织。在一些实施例中，iPSC来源于从外周血、骨髓或脐带血中分离的CD34+细胞。在各种实施例中，iPSC对于受体(需要如本文所述治疗的受试者)而言是自体的或同种异体的(例如，在一个或多个基因座处HLA匹配的)。在各种实施例中，iPSC可以经基因编辑以帮助HLA匹配(诸如使一个或多个HLAI类和/或II类等位基因或它们的主调节因子缺失，包括但不限于β-2-微球蛋白(B2M)、CIITA等)，或经基因编辑以使其他功能缺失或表达其他功能。例如，iPSC可以经基因编辑以使HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一者或多者缺失，并且使HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR中的一者或多者缺失。在某些实施例中，iPSC保留至少一种HLA I类和至少一种HLA II类复合物的表达。在某些实施例中，iPSC对于至少一个保留的I类和II类基因座是纯合的。在一些实施例中，iPSC来源于脐带血CD34+细胞或CD36+成红血细胞。iPSC可以来源于形成通用供体红细胞(即O型)的CD34+细胞。也可以使用其他血型。
在各种实施例中，HSC及来自其的红系谱系细胞来源于经经基因编辑为以下之一的iPSC：(i)HLA-A-B+C+DP-DR+DQ+，(ii)HLA-A-B+C+DP+DR+DQ-，(iii)HLA-A-B+C+DP-DR+DQ-；(iv)HLA-A-B-C+DP-DR+DQ+；(v)HLA-A-B-C+DP+DR+DQ-、(vi)HLA-A-B-C+DP-DR+DQ-。对于保留的HLA(例如HLA-B、HLA-C和HLA-DR)，细胞可以是纯合的或仅保留基因的单个拷贝。例如，经修饰的细胞至少被鉴定为(a)HLA-C+和HLA-DR+，并且任选被鉴定为(b)HLA-B-、(c)HLA-DP-和(d)HLA-DQ-中的一者或多者。在示例性实施例中，经修饰的细胞是HLA-B+、HLA-DP-和HLA-DQ-。
在一些实施例中，来源于iPSC的HSC和红系谱系细胞经基因编辑为HLA-Aneg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1neg和HLA-DQB1neg。在一些实施例中，iPSC对于HLA-DRB1是进一步纯合的。
如本文所用，关于特定HLA类或II类分子的术语“阴性”(-)或“阴性”指示该基因的两个拷贝在细胞系或群体中均已被破坏，并且因此该细胞系或群体不显示该基因的显著功能性表达。此类细胞可以通过全部或部分基因缺失或破坏产生，或者替代性地通过其他技术诸如siRNA产生。如本文所用，术语“缺失”在靶基因的遗传修饰(即，基因编辑)的上下文中是指对应的基因产物(即，对应的多肽)的功能性表达的废除。此类基因编辑包括编码序列的全部或部分基因缺失或破坏，或关键顺式作用表达控制序列的缺失。
在一些实施例中，iPSC是使用长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多核苷酸的gRNA进行基因编辑。在一些实施例中，gRNA包含在5'末端处或其附近的修饰(例如，在5'末端的1至10、1至5或1至2个核苷酸内)和/或在3'末端处或其附近的修饰(例如，在3'末端的1至10、1至5或1至2个核苷酸内)。在一些实施例中，经修饰的gRNA表现出对核酸酶的抗性增加。在一些实施例中，gRNA包含两个单独的RNA分子(即，“双gRNA”)。双gRNA包含两个单独的RNA分子：“crispr RNA”(或“crRNA”)和“tracr RNA”，并且是本领域技术人员所熟知的。
通常，各种基因编辑技术是已知的，其可以根据本公开的各种实施例来应用。基因编辑技术包括但不限于锌指(ZF)、转录激活因子样效应器(TALE)等。含有这些DNA结合结构域和Fokl核酸内切酶的切割结构域中的一者或多者的融合蛋白可用于在细胞中的DNA的所需区域中产生双链断裂(参见，例如，美国专利申请公开号US2012/0064620、美国专利申请公开号US2011/0239315、美国专利号8,470,973、美国专利申请公开号US 2013/0217119、美国专利号8,420,782、美国专利申请公开号US2011/0301073、美国专利申请公开号US2011/0145940、美国专利号8,450,471、美国专利号8,440,431、美国专利号8,440,432和美国专利申请公开号2013/0122581，其所有内容特此以引用的方式并入)。在一些实施例中，基因编辑使用本领域已知的CRISPR相关Cas系统(例如，CRISPR-Cas9)来进行。参见例如US 8,697,359、US 8,906,616和US 8,999,641，这些中的每一者特此以引用方式全文并入。在各种实施例中，基因编辑采用II型Cas核酸内切酶(诸如Cas9)或V型Cas核酸内切酶(诸如Cas12a)。II型和V型Cas核酸内切酶是RNA引导的。引导所需基因编辑(同时限制或避免脱靶编辑)的gRNA设计是本领域已知的。参见例如Mohr SE等人,CRISPR guide RNA design for research applications,FEBS J.2016年9月；283(17):3232–3238。在其他实施例中，可以采用与化脓性链球菌Cas9或普雷沃氏菌和弗朗西斯菌1(Cpf1或Cas12a)具有同源性(尽管一级序列同源性低)的非规范II型或V型Cas核酸内切酶。本领域已知许多此类非规范Cas核酸内切酶。Nidhi S,等人Novel CRISPR–Cas Systems:An Updated Review of the Current Achievements,Applications,and Future Research Perspectives,Int J MolSci.2021年4月；22(7):3327。在其他实施例中，基因编辑采用碱基编辑或引物编辑来结合突变，而不引起双链断裂。参见例如Antoniou P等人,Base and Prime Editing Technologies for Blood Disorders,Front.Genome编辑,2021年1月28日；Matsuokas IG,Prime Editing:Genome Editing for Rare Genetic Diseases Without Double-Strand Breaks or Donor DNA,Front.Genet.,2020年6月9日。各种其他基因编辑过程是已知的，包括使用死Cas(dCas)系统(例如，Cas融合蛋白)将DNA修饰酶导向所需靶，使用dCas作为引导RNA导向系统。Brezgin S,Dead Cas Systems:Types,Principles,and Applications,IntJ Mol Sci.2019年12月；20(23):6041。
可以在不产生双链DNA断裂的情况下安装精确基因组改变的碱基编辑器也可以用于细胞(例如，iPSC)中的基因编辑(例如，设计基因疗法载体)。碱基编辑器基本上包含催化禁用的核酸酶，诸如Cas9镍酶(nCas9)，它不能产生DSB，并且与核碱基脱氨酶融合，并且在一些情况下，与DNA糖基化酶抑制剂融合。目前，存在2种主要的碱基编辑器，胞苷碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，它们催化C>T和A>G转变。碱基编辑器可通过例如HDAd5/35++载体递送，以高效地编辑启动子和增强子，从而将基因激活或失活。示例性的方法描述于美国专利号9,840,699；10,167,457；10,113,163；11,306,324；11,268,082；11,319,532；和11,155,803。还设想包含与Cas核酸内切酶缀合(例如，融合)的逆转录酶和用作DNA合成模板的与引导RNA缀合(例如，融合)的多核苷酸的引物编辑器，如WO 2020/191153中所述。
可用于基因组编辑应用的示例性载体包括但不限于质粒、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体(例如，Ad5/35、Ad5、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48)、细小病毒(例如，腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒诸如小核糖核酸病毒和甲病毒以及双链DNA病毒(包括疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如金丝雀痘病毒、痘苗病毒或改良痘苗病毒))。可以通过本领域已知的任何方法，包括但不限于转导、转染、感染和电穿孔，将包含目的核酸分子的载体递送至细胞(例如，iPS细胞、内皮细胞、造血内皮细胞、HSC(ST-HSC或LT-HSC))。这些载体中的任一者都可以包括转座元件(诸如背负式转座子或睡美人转座子)。转座子将特定的DNA序列插入脊椎动物的基因组中。一旦从转座子上切除，的基因可以通过转座酶催化切割存在于细胞核基因组内的相似切除位点而整合到哺乳动物细胞的基因组中。
为了提高效率，在一些实施例中，Cas和gRNA可以在被递送到细胞中之前进行组合。Cas-gRNA复合物被称为核糖核蛋白(RNP)。已经开发出将RNP直接递送至细胞的许多方法。例如，可以通过脂转染或电穿孔将RNP递送到培养物中的细胞中。可以采用使用核转染方案的电穿孔，并且此程序允许RNP快速进入细胞核，因此可以立即开始切割基因组。参见例如Zhang S,Shen J,Li D,Cheng Y.Strategies in the delivery of Cas9ribonucleoprotein for CRISPR/Cas9 genome editing.Theranostics.2021年1月1日；11(2):614-648，其特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，Cas9和gRNA作为RNP电穿孔到供体iPSC和/或HSC中。
通常，原间隔区相邻基序(PAM)是Cas核酸酶切割所需要的，并且该原间隔区相邻基序通常在切割位点下游3至4个核苷酸处发现。PAM是短的DNA序列(通常长度为2至6个碱基对)，它位于针对由CRISPR系统(诸如CRISPR-Cas9)切割的DNA区域之后。在一些实施例中，靶向HLA基因座的单倍型或多态性的PAM序列、sgRNA或碱基编辑工具不包括四个G、四个C、GC重复序列或其组合。
在一些实施例中，对独特HLA单倍型具有特异性的CRISPR/Cas9系统可通过设计靶向供体特异性HLA-A、HLA-DPB1和HLA-DQB1基因(例如)中的每一者的单一gRNA，使用本文所述的gRNA来开发。为了进行基因敲除，gRNA将Cas9蛋白靶向到合适的位点进行编辑。接下来，Cas9蛋白可以执行双链断裂(DSB)，其中DNA通过非同源末端连接(NHEJ)机制进行修复，该机制产生导致移码突变的indels，并且终止所得蛋白质的功能。然而，脱靶基因修饰可以发生并且改变其他完整基因的功能。例如，即使在一定程度的不匹配存在的情况下，Cas9核酸内切酶仍可以在不需要的脱靶位置处产生DSB。这种脱靶活动可以产生基因组不稳定事件，诸如点突变和基因组结构变异。在各种实施例中，靶向HLA-A的sgRNA可以靶向定义为29942532-29942626的6号染色体区域。在各种实施例中，靶向HLA-DQB1的sgRNA可以靶向定义为32665067-32664798的6号染色体区域。在各种实施例中，靶向HLA-DPB1的sgRNA可以靶向定义为33080672-33080935的6号染色体区域。
gRNA可用于开发克隆iPSC。可以评估此类iPSC系的(i)靶上编辑，(ii)脱靶编辑，和(iii)易位编辑，例如使用测序，如本文所述。具体来说，此种测定可以通过多重PCR进行，该多重PCR利用经设计以靶向和富集目的区域的引物，然后进行下一代测序(例如，扩增子测序，AMP-seq)。靶上组和易位组可以扩增预期的编辑区域，允许选择具有预期编辑的iPSC克隆，其没有由非预期的DSB切割位点融合引起的染色体易位。脱靶组可以富集通过测序鉴定的任何潜在的脱靶区域，并且允许选择脱靶突变可忽略的iPSC克隆。总之，这些测定使iPSC克隆的筛选能够选择具有所需编辑的克隆，同时排除潜在的CRISPR/Cas9相关的基因组完整性问题。
在一些实施例中，为了进一步确保经重编程和编辑的iPSC的基因组稳定性和完整性，可以执行遗传和基因组测定以选择例如没有经历易位和突变事件并且没有整合附加型载体的克隆。例如，对CD34+细胞和重编程后的iPSC克隆进行全基因组测序(WGS)，其中比较基因组的因编辑而产生的差异。这些分析提供对哪些iPSC克隆基因组不同于CD34+起始材料的评估，使得能够明智地选择在重编程期间不产生突变的iPSC克隆。
在一些实施例中，使用系统诸如KARYOSTAT测定的核型分析用于选择在重编程期间不产生indel和易位的iPSC克隆，例如在Ramme AP,等人,“Supporting dataset of two integration-free induced pluripotent stem cell lines from related human donors,”Data Brief.2021年5月15日；37:107140中所述，其特此以引用方式全文并入。KARYOSTAT测定允许以类似于G显带核型分析的分辨率将染色体畸变可视化。对于染色体获得，可以检测到的结构异常的大小>2Mb，并且对于染色体丢失，可以检测到的结构异常的大小>1Mb。KARYOSTAT阵列经功能化用于通过低分辨率DNA拷贝数分析来实现平衡的全基因组覆盖，其中测定覆盖所有36,000个RefSeq基因，包括14,000个OMIM靶标。该测定能够检测非整倍体、亚显微畸变和镶嵌事件。
在一些实施例中，使用阵列比较基因组杂交(aCGH)分析来选择在重编程期间不产生拷贝数畸变(CNA)的iPSC克隆，例如如Wiesner等人“Molecular Techniques”，编辑：Klaus J.Busam,Pedram Gerami,Richard A.Scolyer,“Pathology of MelanocyticTumors,”Elsevier,2019,364-373页,ISBN 9780323374576；以及Hussein SM,等人“Copynumber variation and selection during reprogramming to pluripotency,”Nature.2011年3月3日；471(7336):58-62中所述，其特此以引用方式全文并入。aCGH是通过比较样品DNA和参考DNA来分析CNA的整个基因组的技术。
在一些实施例中，靶向血红素恶性肿瘤NGS组分析用于选择在重编程期间不产生血液恶性肿瘤突变的iPSC克隆。例如，靶向血红素恶性肿瘤NGS组可以专注于髓性白血病、淋巴瘤和/或其他血液恶性肿瘤相关基因，以产生比更广泛的方法更小、更易于管理的数据集。靶向血红素恶性肿瘤NGS组分析包括使用高度多重PCR扩增与血液恶性肿瘤相关联的区域，然后进行下一代测序。
在一些实施例中，液滴式数字PCR(ddPCR)用于选择iPSC克隆，其不整合附加型载体，并且已经足够传代以进行附加型载体清除。如本文所述，CD34+细胞的iPSC重编程可以通过递送编码重编程因子的附加型载体来实现。然而，尽管很少，附加型载体可以随机整合到细胞基因组中，这可能破坏发育过程、体内平衡等。因此，ddPCR方法可用于检测iPSC培养物中残留的附加型载体，并且能够选择不整合附加型载体的iPSC克隆。
在一些实施例中，在评估所选择的克隆没有与编辑相关的基因组畸变后，可以另外测试克隆在扩增期间可能出现的自发突变。例如，影响血液恶性肿瘤基因、indel、易位、数量畸变的突变，例如，如经预编辑的重编程克隆所述。自发突变的分析可包括全基因组测序(WGS)、KARYOSTAT分析、阵列比较基因组杂交(aCGH)分析、靶向血红素恶性肿瘤NGS组AMP-Seq分析和/或液滴式数字PCR(ddPCR)。
体细胞可以通过表达选自Sox2、Oct3/4、c-Myc、Nanog、Lin28和klf4的重编程因子而被重编程。在一些实施例中，重编程因子是Sox2、Oct3/4、c-Myc、Nanog、Lin28和klf4。在一些实施例中，重编程因子是Sox2、Oct3/4、c-Myc和klf4。在一些实施例中，重编程因子包括Oct-4、Sox-2、Klf-4、1-Myc、Lin-28、SV40大T抗原(“SV40LT”)以及靶向p53的短发夹RNA(“shRNA-p53”)。用于制备iPSC的方法描述于例如美国专利10,676,165；美国专利9,580,689；美国专利10,221,395，以及美国专利9,376,664，这些专利特此以引用方式全文并入。在各种实施例中，使用众所周知的病毒载体系统诸如慢病毒、仙台病毒或麻疹病毒系统来表达重编程因子。替代性地，可通过将编码重编程因子的mRNA导入体细胞来表达重编程因子。此外，可以通过引入表达重编程因子的非整合型附加型质粒来产生iPSC，即，用于产生无转基因和无病毒的iPSC。可以采用已知附加型质粒，其具有有限的复制能力并且因此在经过几代细胞后会丢失。在一些实施例中，该方法包括使用表达POU5F1/OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC作为多顺反子单元的载体(例如，病毒载体或附加型载体)对CD36+嗜碱性成红血细胞进行重编程来获得多能性。在一些实施例中，该方法包括用Oct4、Sox2、Lin28、Klf4和L-myc对PBMC进行重编程。
在一些实施例中，人类多能干细胞(例如，iPSC)经基因编辑。基因编辑可以包括但不限于HLA基因的修饰(例如，一个或多个HLA I类和/或II类基因的缺失)、β2微球蛋白(β2M)的缺失以及CIITA的缺失。
在一些实施例中，本公开的iPSC经基因编辑以编码反应性EPO受体。红细胞生成是红血细胞产生的过程。促红细胞生成素(EPO)是负责有效红细胞生成的关键激素。促红细胞生成素受体(EPOR)是由EPOR基因编码的蛋白质。EPOR是具有单糖链的52kDa肽，从而导致在EPO应答细胞表面形成大约56至57kDa的蛋白质。EPOR最得到确认的功能是促进增殖并挽救红系(红血细胞)祖细胞免于细胞凋亡。
已经报道EPOR中存在有益突变，其中红血细胞数量的增加允许改善运动耐力项目中的氧输送，而不会对运动员的健康产生明显的不利影响。de La Chapelle等人,PNAS1993；90.10:4495-4499。已报道，通常，仅去除细胞内EPOR C末端与负调节因子结合的部分的截短突变与原发性红细胞增多症相关，同时EPO水平降低和血红蛋白水平升高。这些突变使EPOR对EPO具有高反应性，并伴随血红蛋白水平升高的副作用。参见Juvonen,E.,Ikkala,E.,Fyhrquist,F.&Ruutu,T.Autosomal dominant erythrocytosis caused by increased sensitivity to erythropoietin.Blood 1991；78,3066–3069。SHP-1已知经由其SH2结构域与受体结合并对关键底物进行去磷酸化，在EPOR的信号转导中发挥重要作用。Jiao,H.,Berrada,K.,Yang,W.,Tabrizi,M.,Platanias,L.C.,&Yi,T.Direct association with and dephosphorylation of Jak2kinase by the SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatase SHP-1.Molecular and Cellular Biology,1996；16(12),6985–6992。
因此，在各种实施例中，本公开的HSC群体表达具有截短突变的EPOR。在一些实施例中，本公开的HSC群体表达缺乏或具有突变的SHP-1抑制结构域的EPOR。在一些实施例中，本公开的HSC群体表达具有一个或多个错义或移码突变的EPOR，这些突变导致高反应性，任选地通过SHP-1抑制结构域的突变或缺失来实现。
这些HSC群体可以用于更高效的体外红细胞生产，或者在其他实施例中，可以用于将HSC或红系祖细胞递送给有需要的患者，以减少或消除对定期输血的需求。此外，由于此类细胞可以经基因编辑以使某些HLA基因缺失(如上所述)，因此HSC群体和红系祖细胞可以容易地与受体进行HLA匹配。根据本公开，HSC分化为各种造血谱系(类似于骨髓CD34+细胞)，并且能够恢复受体的造血系统。
在各种实施例中，使用常规培养系统制备和扩增iPSC。可以从培养物中回收经扩增的iPSC，以产生胚状体(EB)。由iPSC分化产生的EB是iPSC的三维聚集体，并且基于分化方法包含三个(或者两个或一个)胚胎胚层。例如，EB的制备描述于US2019/0177695中，其特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，通过iPSC的分化制备的EB在生物反应器中扩增，例如Abecasis B.等人,Expansion of 3D human induced pluripotent stem cell aggregates in bioreactors:Bioprocess intensification and scaling-up approaches.J.of Biotechnol.246(2017)81-93中所述。EB可用于产生任何所需细胞类型。用于EB的扩增或分化的其他方法，包括3D悬浮培养描述于WO 2020/086889中，其特此以引用方式全文并入。
在一些实施例中，根据每个方面的方法可以包括从多能干细胞(例如，EB)产生CD34+富集的细胞并且诱导内皮细胞到造血细胞分化。包含相对高频率LT-HSC的HSC可使用以下从细胞群体中产生：各种刺激或因素，包括机械、生物化学、代谢和/或地形刺激，以及诸如细胞外基质、小生境因素、细胞外源性因素、细胞内在特性的诱导等因素；并且包括药理学和/或遗传学手段。
在一些实施例中，该方法包括在对EHT诱导之前，从多能干细胞制备具有造血潜能的内皮细胞。在一些实施例中，该方法包括在iPSC中过量表达E26转化特异性变体2(ETV2)转录因子。ETV2可通过引入编码非整合附加型质粒来表达，用于ETV2的组成型或诱导型表达，以及用于产生无转基因的造血EC。在一些实施例中，ETV2由引入至iPSC中的mRNA表达。可以使用任何可用的方法引入mRNA，包括电穿孔或脂转染。表达ETV2的细胞的分化可以包括添加VEGF-A。参见Wang K,等人,Robust differentiation of human pluripotent stemcells into endothelial cells via temporal modulation of ETV2 withmRNA.Sci.Adv.第6卷(2020)。根据本公开的实施例，以这种方式产生的细胞可用于产生CD34+细胞和诱导EHT。
在CD34+富集后，使用机械、生物化学、药理学和/或遗传刺激或修饰从内皮细胞产生HSC。
在一些实施例中，iPSC分化进行直至细胞为至少约10％ CD34+，或至少约20％CD34+，或至少约25％ CD34+，或至少约30％ CD34+。在一些实施例中，CD34富集和EHT可以在iPSC分化的第7天至第14天(诸如例如第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天)被诱导。在一些实施例中，在约第8天收获CD34+细胞。iPSC的分化可以根据已知的技术进行。在一些实施例中，iPSC分化涉及以下因子，诸如但不限于bFGF、Y27632、BMP4、VEGF、SCF、EPO、TPO、IL-6、IL-11和/或IGF-1的组合。在一些实施例中，使用无饲养层、无血清和/或GMP相容材料(诸如泊马度胺或来那度胺)来分化hPSC。在一些实施例中，hPSC与小鼠骨髓来源的饲养层细胞(诸如OP9或MS5细胞系)在含血清的培养基中共培养。培养物可以含有生长因子和细胞因子以支持胚状体或单层系统的分化。OP9共培养系统可以用于产生多能HSPC，其可以进一步分化为若干造血谱系，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨核细胞、单核细胞或巨噬细胞以及红细胞。参见Netsrithong R.等人,Multilineage differentiation potential of hematoendothelial progenitors derived from human induced pluripotent stem cells,Stem Cell Research&Therapy 11卷481条(2020)。替代性地，可以使用利用具有特定信号的限定条件的逐步过程。例如，HOXA9、ERG、RORA、SOX4和MYB在人类PSC中的表达有利于直接分化为具有多系潜能的CD34+/CD45+祖细胞。此外，因子诸如HOXB4、CDX4、SCL/TAL1或RUNX1a的表达支持人类PSC中的造血程序。参见Doulatov S.等人,Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors,CellStemCell.2013年10月3日；13(4)。
对EHT的诱导可以用任何已知的方法进行。在一些实施例中，对EHT的诱导产生包含LT-HSC的造血干细胞(HSC)群体。在一些实施例中，EHT使用机械、生物化学、药理学和/或遗传学手段(例如，通过刺激、抑制和/或遗传修饰)通过内皮细胞或造血内皮细胞(HEC)前体产生HSC。在一些实施例中，EHT产生干细胞群体，该干细胞群体包含长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)和造血干细胞祖细胞中的一者或多者。
在一些实施例中，该方法包括增加dnmt3b在PSC、胚状体、CD34+富集的细胞、EC、HEC或HSC中的表达或活性，这可以通过机械、遗传、生物化学或药理学手段进行。在一些实施例中，该方法包括增加细胞中的DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(Dnmt3b)和/或GTP酶IMAP家族成员6(Gimap6)的活性或表达。参见WO 2019/236943和WO 2021/119061，它们特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，对EHT的诱导包括增加dnmt3b的表达或活性。
在一些实施例中，细胞与有效量的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂接触，该激动剂增加Dnmt3b的活性或表达。在一些实施例中，机械敏感受体是Piezol。示例性的Piezol激动剂是Yoda1。在一些实施例中，机械敏感受体是Trpv4。示例性的Trpv4激动剂是GSK1016790A。Yodal(2-[5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]硫代]-1,3,4-噻二唑-2-基]-吡嗪)是针对机械敏感离子通道Piezol开发的小分子激动剂。Syeda R,Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezol.eLife(2015)。Yoda 1具有以下结构：
Yodal的衍生物可用于各种实施例中。例如，在一些实施例中，采用包含2,6-二氯苯基核的衍生物。示例性激动剂公开于Evans EL,等人,Yoda1 analogue(Dooku1)which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation,BritishJ.of Pharmacology 175(1744-1759):2018中。其他Piezo1激动剂包括Jedi1、Jedi2、单链(ss)RNA(例如，ssRNA40)及其衍生物和类似物。参见Wang Y等人,A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive Piezo1channelNature Communications(2018)9:1300；Sugisawa等人,RNA Sensing by Gut Piezo1Is Essential for Systemic Serotonin Synthesis,Cell,Volume 182,Issue 3,2020,Pages609-624，以引用方式全文并入本文。这些Piezo1激动剂是市售的。在各种实施例中，Piezo1激动剂或衍生物物的有效量在约1μM至约500μM、或约5μM至约200μM、或约5μM至约100μM的范围内，或者在一些实施例中，在约25μM至约150μM、或约25μM至约100μM、或约25μM至约50μM的范围内。
在各种实施例中，将药理学Piezo1激活应用于CD34+细胞(即，CD34+富集的细胞)。在某些实施例中，药理学Piezo1激活可以进一步应用于iPSC、胚状体、EC、血原性内皮细胞(HEC)、HSC、造血祖细胞以及造血谱系。在某些实施例中，至少对从iPSC产生的iPSC、EB、或从EB分离的CD34+细胞和/或其组合应用Piezo1激活，根据各种实施例，与用于诱导EHT的其他方法相比，这允许更好地产生红系祖细胞。
在一些实施例中，在EHT的诱导期间不使用Piezo1激活。
在某些实施例中，造血细胞的扩增还可以包括将细胞与免疫调节化合物(例如，TNF-α抑制化合物)并且以足以使造血细胞在给定时间内增殖显著增加的量(与未接触免疫调节化合物的同等数量造血细胞相比)接触培养一段时间。参见例如美国专利号7,498,171，其公开特此以引用方式全文并入。在实施例中，免疫调节化合物是3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'-氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮；4-氨基-2-[(3RS)-2,6-二氧代哌啶-3-基]-2H-异吲哚-1,3-二酮；α-(3-氨基邻苯二甲酰亚胺基)戊二酰亚胺；泊马度胺、来那度胺或沙利度胺。
替代性地或另外，Dnmt3b的活性或表达可以在细胞中(例如在CD34富集的细胞中)直接增加。例如，Dnmt3b的mRNA表达可通过将编码Dnmt3b的转录物递送至细胞，或通过引入编码Dnmt3b的转基因，或无转基因方法(不限于将非整合附加体引入细胞)来增加。在一些实施例中，采用基因编辑向细胞中的Dnmt3b表达元件引入遗传修饰，诸如但不限于增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性和/或影响RNA剪接。
在一些实施例中，该方法包括增加Gimap6在细胞中的活性或表达，单独或与Dnmt3b和/或在周期性应变或压电激活时被上调或下调的其他基因组合。为了增加Gimap6的活性或表达，可以将编码Gimap6的mRNA转录物引入细胞，也可以采用无转基因方法，包括但不限于将附加体引入细胞；或者替代性地编码Gimap6的转基因。在一些实施例中，采用基因编辑将遗传修饰引入细胞中的Gimap6表达元件(诸如一个或多个修饰以增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性或影响RNA剪接)。
在本公开的采用mRNA递送至细胞的实施例中，可以使用已知的化学修饰来避免细胞中的先天免疫反应。例如，仅包含规范核苷酸的合成RNA可以结合模式识别受体，并且可以在细胞中触发有效的免疫反应。这种反应可导致翻译阻断、炎性细胞因子的分泌和细胞死亡。包含某些非常规核苷酸的RNA可以逃避先天免疫系统的检测，并且可以高效翻译成蛋白质。参见US 9,181,319，其特此以引用方式并入，特别是关于核苷酸修饰以避免先天免疫反应。
在一些实施例中，通过将转基因引入细胞来增加Dnmt3b和/或Gimap6的表达，这可以指导所需过表达水平(具有不同的启动子强度或表达控制元件的其他选择)。可以使用本领域已知的各种病毒载体或转染试剂(包括脂质纳米颗粒)来引入转基因。在一些实施例中，Dnmt3b和/或Gimap6的表达通过无转基因方法(例如，附加体递送)来增加。在一些实施例中，使用基因编辑技术增加Dnmt3b和/或Gimap6或本文公开的其他基因的表达或活性，例如，以引入一个或多个修饰以增加启动子强度、核糖体结合或RNA稳定性。
在一些实施例中，该方法包括对细胞应用循环2D、3D或4D拉伸。在各种实施例中，经受周期性2D、3D或4D拉伸的细胞选自CD34富集的细胞、iPSC、EC和HEC中的一种或多种。例如，将细胞群体引入提供周期性应变生物力学拉伸的生物反应器，如WO 2017/096215中所述，其特此以引用方式全文并入。周期性应变生物力学拉伸可以增加Dnmt3b和/或Gimap6的活性或表达。在这些实施例中，机械手段向细胞或其上培养有细胞(例如，EC或HEC)的细胞培养表面施加拉伸力。例如，计算机控制的真空泵系统或用于提供附接到柔性生物相容性和/或仿生表面的拉伸力的其他构件(例如，FlexCellTM张力系统、Cytostretcher系统)可用于在限定和受控的周期性应变条件下对细胞施加体外周期性2D、3D或4D拉伸。例如，施加的周期性拉伸可以是约1％至约20％的周期性应变(例如，约6％的周期性应变)，持续数小时或数天(例如，约7天)。在各种实施例中，施加周期性应变至少约一小时、至少约两小时、至少约六小时、至少约八小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约96小时、至少约120小时、至少约144小时或至少约168小时。
替代性地或另外，EHT通过Trpv4激活来刺激。Trpv4激活可以通过使细胞(例如，CD34富集的细胞、EC或HEC)与一种或多种Trpv4激动剂接触，该激动剂任选地选自GSK1016790A、4α-PDD或其类似物和/或衍生物。
当细胞群体在本文中被描述为具有某种表型时，应理解该表型代表细胞群体的显著部分，诸如细胞群体的至少25％、至少40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％。此外，在各个步骤处，细胞群体可以富集所需表型的细胞，和/或去除不需要的表型的细胞，使得细胞群体包含所需表型的至少约75％，或至少约80％，或至少约90％。此种阳性和阴性选择方法是本领域已知的。例如，可以基于细胞表面抗原(包括本文所述的那些)使用荧光激活细胞分选仪或结合细胞与某些细胞表面抗原的磁珠来分选细胞。可以使用阴性选择柱来移除表达不需要的细胞表面标记物的细胞。在一些实施例中，富集细胞用于CD34+细胞(在经历EHT之前和/或之后)。在一些实施例中，在促进CD34+细胞的扩增的条件下培养细胞群体，从而产生扩增的干细胞群体。
在各种实施例中，从经历内皮细胞到造血细胞转变的培养物中收获CD34+细胞(例如，漂浮细胞和/或粘附细胞)。在各种实施例中，HSC或CD34富集的细胞进一步扩增。例如，可以根据以下文献中公开的方法扩增HSC或CD34富集的细胞：US 8,168,428；US 9,028,811；US10,272,110；以及US10,278,990，这些专利特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，HSC或CD34富集的细胞的体外扩增采用前列腺素E2(PGE2)或PGE2衍生物。在本公开的一些实施例中，HSC包含至少约0.01％ LT-HSC，或至少约0.05％LT-HSC，或至少约0.1％ LT-HSC，或至少约0.5％ LT-HSC，或至少约1％ LT-HSC。
产生红系、髓系和淋巴谱系的造血干细胞(HSC)可以基于CD34+细胞的表达和谱系特异性标记物(称为Lin-)的缺乏来鉴定。在一些实施例中，富集包含HSC的干细胞群体，例如，如US 9,834,754中所述，其特此以引用方式全文并入。例如，该方法可以包括基于CD34、CD90、CD38和CD43(HSC标记物)或CD71(早期红系祖细胞标记物)或CD235a(成熟红系祖细胞标记物)中的一种或多种的表达对细胞群体进行分选。可以选择CD34+、CD90+、CD38-和CD43-中的一种或多种的级分用于进一步分化。在一些实施例中，用于分化成造血谱系的干细胞群体是至少约80％ CD34+、或至少约90％CD34+、或至少约95％ CD34+。
在一些实施例中，干细胞群体、或CD34富集的细胞或其级分、或衍生细胞群体如US2020/0308540中所述进行扩增，其特此以引用方式全文并入。例如，通过将细胞暴露于包括例如SR1或SR1衍生物的芳香烃受体拮抗剂来扩增细胞。另外参见Wagner等人,Cell StemCell 2016；18(1):144-55和Boitano A.等人,Aryl Hydrocarbon Receptor AntagonistsPromote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells.Science 2010年9月10日；329(5997):1345–1348。
在一些实施例中，促进CD34+细胞扩增的化合物包括嘧啶并吲哚衍生物，包括例如UM171或UM729(参见US2020/0308540，其特此以引用方式并入)。
在一些实施例中，干细胞群体或CD34富集的细胞进一步富集表达骨膜蛋白和/或血小板源生长因子受体α(pdgfra)的细胞，或对其进行修饰以表达骨膜蛋白和/或pdgfra，如WO 2020/205969(其特此以引用方式全文并入)中所述。此种表达可通过将编码转录物递送至细胞，或通过引入编码转基因，或无转基因方法(不限于将非整合附加体引入细胞)来进行。在一些实施例中，采用基因编辑来向细胞中的表达元件引入遗传修饰，诸如以修饰启动子活性或强度、核糖体结合、RNA稳定性或影响RNA剪接。
在其他实施例中，干细胞群体或CD34富集的细胞与组蛋白甲基转移酶EZH1抑制剂一起培养。替代性地，EZH1在干细胞群体中部分或完全缺失或失活或暂时沉默。对EZH1的抑制可将骨髓祖细胞(例如，CD34+CD45+)引导至成红血细胞谱系。在其他实施例中，EZH1在干细胞群体中过表达。
在一些实施例中，HSC群体或其级分分化为红细胞、或其祖细胞或衍生物。例如，将HSC群体(或从中分离的细胞)与例如EPO、IL-3和SCF(和/或其他细胞外基质组分)和/或其组合一起培养，以产生包含红系祖细胞或衍生物细胞群体(例如，红细胞)的群体。细胞的HSC群体产生高百分比的红系爆式集落形成单位(BFU-E)细胞和红系集落形成单位(CFU-E)细胞，这些细胞是诱导红细胞生成的指标。这些细胞可以进一步富集和/或扩增。
例如，从外周血样品产生iPS细胞系可以包括以下初始步骤：成红血细胞富集和iPSC启动。在成红血细胞富集步骤中，对细胞进行重编程，例如用POU5F1/OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转染(或如本文另外描述)。在一些实施例中，富集后成红血细胞群体超过80％。一旦通过多能性标记物(诸如但不限于POU5F1/OCT4、SOX2、LIN28、KLF4和NANOG)的存在确认iPSC细胞的多能性，则在培养条件下培养重编程的iPSC以产生胚状体(EB)。在iPSC分化的第8天与第14天之间，从解离的EB中分离/富集CD34+细胞(如前所述)。在CD34+细胞中诱导EHT后(任选地，随后进一步富集CD34+细胞和/或用其他红系祖细胞标记物富集)，将细胞在红系分化的条件下培养。
在一些实施例中，HSC群体或其级分分化为红系细胞或其祖细胞或衍生物，而不依靠使用机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂(诸如Yoda1)。在一些实施例中，机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂(诸如Yoda1)的使用是任选的。因此，在一些实施例中，从分化的多能干细胞群体中富集CD34+细胞，以制备CD34+富集的群体。诱导CD34+富集的细胞群体进行内皮细胞到造血细胞转变至少持续两天，但不超过12天，其中机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂(诸如Yoda1、jedi1、jedi2、ssRNA40)的使用是任选的。HSC和/或HSPC分化为祖细胞红系细胞群体或红系细胞群体。
在一些实施例中，CD34+富集的细胞群体的内皮细胞到造血细胞转变被诱导至少两天，并且任选地进一步持续至少约4小时、或至少约8小时、或至少约12小时、或至少约16小时、或至少约20小时、或至少约24小时、或至少约2天、或至少约3天、或至少约4天、或至少约5天、或至少约6天、或至少约7天、或至少约8天、或至少约9天、或至少约10天。通常，诱导EHT持续不超过12天。
在分化期间，可以通过评估红系定型细胞在半固体培养基中的集落形成能力来评估其增殖祖细胞阶段。例如，收获的细胞可以产生具有高百分比的红系爆式集落形成单位(BFU-E)和红系集落形成单位(CFU-E)的造血集落。细胞的Hb含量通常可用于确定其发育阶段，例如通过评估体外γ到β珠蛋白的转换。
在一些实施例中，该方法利用符合良好生产规范(GMP)的无血清、无异源物方案。在一些实施例中，该方法利用饲养层(诸如OP9)或与其他细胞(诸如基质细胞作为实例)共培养。在一些实施例中，该方法利用小分子，诸如StemRegenin(SR1，RasGAP和ERK1/2双抑制剂)、Yoda1、Jedi1、Jedi2、ssRNA 40或其类似物或衍生物、BIO(原型GSK3b抑制剂)、CHIR99021(GSK3b抑制剂)、IBMX(cAMP和cGMP磷酸二酯酶的非特异性抑制剂)和A-A014418(GSK3b抑制剂VIII)作为生长因子或各种细胞因子的替代品，以减少副作用和培养基成本。
本发明的各种实施例和方面中，还考虑使用生物反应器、利用巨噬细胞和小分子改造微环境以及利用基因改变来增强成熟RBC的存活、提高去核率并促进血红蛋白转换。作为使用生物反应器产生去核细胞的实例，可以在一种或多种成熟条件下在生物反应器中培养HSC或红系祖细胞。成熟条件可以包括：(i)预定的pH；(ii)预定的或特定的(溶解)氧水平；以及(iii)机械应力。
预定的pH可以选自约4.0至约7.9的pH。例如，成熟条件可以包括在约5.0至约7.9、或约6.0至约7.9或约7.0至约7.9(诸如约7.4至约7.5)范围内的pH。成熟条件可以包括以上列出的pH值中的一个或多个；例如，成熟条件可以在不同的pH水平之间调节，例如在第一pH值和第二pH值之间调节。
成熟条件可以利用低于大气氧的约90％或者在其他实施例中低于约80％、或低于约70％、或低于约60％、或低于约50％、或低于约40％或低于约30％的氧水平。例如，本发明的方法可以利用低于大气氧约50％的氧水平(例如，大气氧的约25％至约50％)。成熟条件可以利用约2％至约29％、诸如如约5％至约20％、或约5％至约15％(例如约11％)的溶解氧(即溶解在培养基中的氧)水平。
可以控制生物反应器叶轮尖端穿过细胞培养物的速度来产生机械应力水平。可以使用约50至约500rpm，例如约100至约450rpm、或约150至约300rpm、或约200至约250rpm的叶轮尖端速度。所用的机械应力水平可在两个或更多个预定的机械应力水平之间调节。在这种情况下，并且当使用生物反应器施加必要的机械应力时，可以经由选择(和使用)一个或多个不同的叶轮速度来产生可变的或调节的机械应力。可以施加一个或多个机械应力水平，持续任何合适的时间段。例如，可以施加一个或多个种机械应力水平，持续几分钟(例如，10至60分钟)、一或数小时(例如，一至十小时)或一或数天(例如，一至十天)。例如，可以在整个时间段连续或间歇地施加一个或多个机械应力水平。
在实施例中，使用至少包含EPO并任选包含细胞因子和生长因子的红系扩增培养基，其可以补充有选自以下的小分子化合物中的一种或多种：(i)piezo1激动剂、(ii)Trpv4激动剂、(iii)磷酸二酯酶抑制剂或(iv)GSK 3抑制剂的，包括本文所述的化合物和浓度。
hESC来源的RBC临床应用的另一个关键问题是它们是否可以在体外去核。在本文公开的条件下，RBC经历分化事件，包括尺寸逐渐减小和血型糖蛋白A表达(成熟RBC的标记物)增加以及染色质/核浓缩，这导致固缩核挤出以形成直径为6至8μm的去核红细胞，其与正常RBC相似。
与去核相关的事件可以通过检查与红细胞成熟过程相关的多个特征来评估。例如，在去核发生之前，细胞大小和核质比(N/C)逐渐减小，这些细胞的大小和N/C随着时间的推移而显著减小，指示在此过程中发生了实质的核浓缩。此外，在此期间，细胞表达高水平的CD71(早期成红血细胞标记物)，并随着时间的推移而降低其表达。尽管它们在开始时显示低至可忽略不计的CD235a(血型糖蛋白A)蛋白(成熟红细胞标记物)，但随着其成熟，其表达急剧增加。联苯胺染色可用于显示血红蛋白在细胞中的逐渐积累以及细胞大小随时间的减小。
在一些实施例中，可以对红细胞或红血细胞或其前体细胞(例如，iPSC)进行基因工程化，使得它们能够携带各种有用的物质到体内的特定位置。
在其他方面，本发明提供了一种通过本文所述的方法产生的红细胞或红系谱系群体、或其药学上可接受的组合物。在各种实施例中，组合物包含所需的细胞群体(例如，红细胞)和药学上可接受的载体。药物组合物可包含每mL至少约105个、或至少约106个或至少约107个红细胞。药物组合物可以以约50mL至约500mL、或约100mL至约500mL或约250至约500mL的单位提供。
在一些方面，HSC组合物提供有高反应性EPOR(如所述)。本公开的HSC组合物包含至少0.0001％的LT-HSC。在本公开的一些实施例中，HSC包含至少约0.05％ LT-HSC、或至少约0.1％ LT-HSC、或至少约0.5％ LT-HSC、或至少约1％ LT-HSC。在其他方面，本发明提供了一种通过本文所述的方法产生的细胞群体或其药学上可接受的组合物。在各种实施例中，制备用于RBC疗法的组合物，其包含细胞群体和药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以包含每千克体重至少约102个细胞，或至少约103、或至少约104、或至少约105、或至少约106、或至少约107、或至少约108个细胞，或至少约109个细胞、或至少约1010个细胞、或至少约1011个细胞、或至少约1012个细胞、或至少约1013个细胞、或至少约1014个细胞。例如，在一些实施例中，施用药物组合物，其包含在每千克约100,000至约400,000个细胞(例如，约200,000个细胞/千克)范围内的HSC(例如，具有高反应性EPOR)。在其他实施例中，以每千克约105至约5×105个细胞(例如，约2.55×105个细胞/kg)、或每千克约106至约5×106个细胞(例如，约2.5×106个细胞/kg)、或每千克约5×106至约107个细胞(例如，约5×106个细胞/kg)、或每千克约107至约108个细胞(例如，约5×107个细胞/kg)、或每千克约108至约109个细胞(例如，约5×108个细胞/kg)、或每千克约109至约1010个细胞、或每千克约1010至约1011或约1011至约1012个细胞、或每千克约1012至约1013个细胞、或每千克接受者体重约1013至约1014个细胞施用RBC。
在一些实施例中(如所述)，HSC是HLA-Aneg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、HLA-DPB1neg和HLA-DQB1neg。在一些实施例中，iPSC对于HLA-DRB1是进一步纯合的。
本公开的细胞组合物可以进一步包含适用于静脉输注或其他施用途径的药学上可接受的载体或赋形剂，并且该组合物可以包含合适的防冻剂。示例性的载剂是DMSO(例如，约10％ DMSO)。细胞组合物可以以单位小瓶或小袋提供，并冷冻保存直至使用。
根据本公开产生的细胞可以在例如用于以下的疗法中施用或使用：遗传性或获得性红细胞疾患、骨髓衰竭疾患、高原相关生理和病理性病症、贫血(例如，镰状细胞性贫血)、红细胞酶缺乏症(例如G6PD)、红细胞膜疾患(例如遗传性球形红细胞增多症)、血红蛋白病(例如镰状细胞病和地中海贫血)、溶血性贫血、营养性贫血(例如缺铁性贫血和叶酸缺乏症)、血红素产生疾患(例如铁粒幼细胞性贫血)、血色素沉着病、与化学物质或辐射暴露相关的病症，和/或用于治疗经历HSC移植的受试者。在进一步的实施例中，根据本公开制备的红细胞作为药学上可接受的组合物提供，所述组合物递送或包封药物(包括但不限于酶)、氧载体或其他合适的材料，以治疗人类疾病或生理或病理性病症。
在某些实施例中，本公开提供了用于治疗贫血的组合物和方法。在实施例中，本公开提供了造血干细胞(HSC)组合物或红系祖细胞组合物，其可提供持久且有效的贫血细胞疗法。在一些实施例中，HSC被截短和/或突变的红细胞生成素受体(EPOR)超负荷，从而导致高反应性EPOR。在实施例中，本公开的组合物和方法可以为患者提供足够的红血细胞以供应健康的氧合水平。在实施例中，本公开的组合物和方法有效地利用诱导多能干细胞(iPSC)的潜力来产生包含大量用于疗法的长期(LT)-HSC的HSC群体，从而提供红血细胞在体内的持久产生。
贫血是指患者缺乏足够的健康红血细胞来携带足够的氧到身体组织的病症。贫血的主要症状包括感觉疲倦和虚弱。贫血有多种形式，诸如镰状细胞性贫血、再生障碍性贫血以及与骨髓疾病或骨髓衰竭相关的贫血等。例如，镰状细胞病是一组遗传性红血细胞疾患，其中患者的β珠蛋白基因发生突变，导致异常血红蛋白，称为血红蛋白S。血红蛋白S会使柔韧的红血细胞变成僵硬的镰状细胞。镰状细胞性贫血是镰状细胞病中最常见且最严重的类型，其中红血细胞提前死亡，使健康红血细胞短缺。
目前，镰状细胞病和其他类型贫血的治疗包括输血、以及血液移植和骨髓移植。经历现有治疗的患者仍然面临重大困难和并发症。例如，用长期输血疗法治疗(例如，为了提高携氧能力并降低镰状血红蛋白(HbS)相对于血红蛋白A(HbA)的比例)的患者面临重大负担，包括需要定期住院，并且通常需要接受铁螯合疗法。Howard J.Sickle cell disease: when and how to transfuse.Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2016；2016(1):625-631。用血液移植和骨髓移植(即用来自捐献者的造血干细胞替换患者的造血干细胞)治疗的患者仍然面临重大风险，包括移植物抗宿主病、暴露于感染以及化疗需求。Rangarajan,H.G.,Abu-Arja,R.,Pai,V.,Guilcher,G.,&Soni,S.Outcomes of Unrelated Donor Stem Cell Transplantion with Post-Transplant Cyclophosphamide for Graft-versus-Host Disease Prophylaxis in Patients with Severe Sickle Cell Disease.Biology of Blood and Marrow Transplantation.2018；24(2),413–417。
使用本文所述的方法产生的HSC或红系祖细胞例如通过静脉输注或骨髓内移植施用于受试者(接受者)。该方法可以在清髓性、非清髓性或基于免疫毒素(例如抗c-Kit、抗CD45等)的预处理方案之后进行。在一些实施例中，该方法在没有清髓性、非清髓性或基于免疫毒素(例如抗c-Kit、抗CD45等)的预处理方案的情况下进行。
在各种实施例中，本公开提供了一种治疗需要红血细胞产生的受试者的方法，包括向受试者施用本公开的HSC或红系祖细胞组合物。因此，根据本公开产生的HSC可以用于以持久且有效的方式在体内产生红血细胞。
在一些实施例中，接受者受试者患有贫血。在一些实施例中，接受者受试者患有镰状细胞性贫血、再生障碍性贫血、与骨髓疾病或骨髓衰竭相关的贫血、失血性贫血或溶血性贫血。在一些实施例中，接受者受试者患有范可尼贫血。在一些实施例中，受试者患有地中海贫血。在一些实施例中，HSC或红系祖细胞用于制备血液产品，用于治疗与血液、骨髓、免疫、代谢或线粒体疾患相关的合并症。
如本文所用，术语“约”意指相关数值的±10％。
参考以下实例进一步描述本公开的某些方面和实施例。
实例
实例1–ETV2过表达增加造血内皮细胞的产率，并且增强iPSC分化期间CD34+细胞的形成，但不影响多能性。
方法
通过本领域已知的附加型重编程从hCD34+细胞发育iPSC，并且基本上如Yu等人Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells,Science318,1917-1920,(2007)；和J.Yu,等人Human induced pluripotent stem cells free ofvector and transgene sequences.Science 324,797-801,(2009)所述。胚状体和造血内皮分化基本上如以下文献所述：R.Sugimura等人,Haematopoietic stem and progenitorcells from human pluripotent stem cells.Nature 545,432-438,(2017)；C.M.Sturgeon等人,Wnt signaling controls the specification of definitive andprimitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.Nat Biotechnol 32,554-561,(2014)；J.Yu,等人Induced pluripotent stem cell lines derived fromhuman somatic cells.Science 318,1917-1920,(2007)；和J.Yu,等人Human inducedpluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science 324,797-801,(2009)所述。
简言之，将hiPSC解离并重悬于补充有L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、抗坏血酸、人全转铁蛋白、单硫代甘油、BMP4和Y-27632的培养基中。接下来，将细胞接种在10cm培养皿(EZSPHERE或低附接平板)中用于EB形成。在第1天，向培养基中添加bFGF和BMP4。在第2天，用含有SB431542、CHIR99021、bFGF和BMP4的培养基替换培养基。在第4天，用补充有VEGF和bFGF的培养基替换细胞培养基。在第6天，用补充有bFGF、VEGF、白细胞介素(IL)-6、IGF-1、IL-11、SCF和EPO的培养基替换细胞培养基。将细胞保持在5％ CO2、5％ O2和95％湿度的培养箱中。为了收获CD34+细胞，在第8天解离EB，通过70μm滤器过滤细胞，并且通过CD34磁珠染色分离CD34+细胞。
结果
使用在EF1A启动子控制下的含有ETV2和GFP序列的腺病毒载剂来转导诱导多能干细胞(iPSC)。在转导后，观察到约45％的iPSC培养物为GFP阳性，从而证实ETV2过表达(ETV2-OE)。进一步观察到，iPSC细胞中的ETV2-OE保留iPSC的多能性特性，如通过干性标记物表达TRA-1-60所示(图1)。图1显示代表iPSC用腺病毒载体过表达ETV2和GFP序列的转导效率的FACS图。
接下来，ETV2-OE-iPSC(以及用携带GFP序列但不含ETV2的载体转导的对照iPSC)分化为胚状体，并且随后分化为造血内皮细胞(Strugeon等人,2014)。结果表明，ETV2的过表达促进造血内皮细胞的形成，如CD235a-群体内的CD34+和CD31+标记物的表达所证明的(图2)。具体而言，图2显示造血内皮细胞(此处定义为CD235a-CD34+CD31+)的代表性流式细胞仪分析，并且相对定量表明，与对照相比，ETV2-OE增强造血内皮细胞的形成。
此外，结果表明ETV2-OE增强CD34+细胞的形成(图3)。图3显示CD34+细胞的代表性流式细胞仪分析，并且相对定量表明ETV2-OE增强CD34+细胞的形成。
总体而言，这些数据指示ETV2在iPSC中的过表达不影响它们的多能性，并且促进它们经历造血内皮和造血分化的能力。
实例2–利用Piezo1激活产生的iPSC来源的HSC经历与骨髓来源的HSC相似的T细胞分化。
方法
为了分析EHT，将EB来源的CD34+细胞悬浮在含有Y-27632、TPO、IL-3、SCF、IL-6、IL-11、IGF-1、VEGF、bFGF、BMP4和FLT3的培养基中。细胞粘附于孔底约4至18小时(通过目视检查)后，将Yoda1添加到培养物中。4至7天后，收集细胞用于分析。
iPSC分化为胚状体8天。在第8天，收获来自iPSC来源的胚状体的CD34+细胞，并且再培养5至7天以诱导内皮细胞到造血细胞(EHT)转变。然后，在第5天至第7天之间从EHT培养物中收获CD34+细胞，用于进一步的造血谱系分化。
在第5至7天之间(或从iPSC分化的第13至21天总计)从EHT培养物中收获的CD34+细胞，被接种到预先包被有rhDL4和重组人纤维蛋白片段的48孔板中。在含有aMEM、FBS、ITS-G、2BME、抗坏血酸-2-磷酸盐、Glutamax、rhSCF、rhTPO、rhIL7、FLT3L、rhSDF-1a和SB203580的培养基中诱导T谱系分化。
第2天至第6天，每隔一天更换80％的培养基。在D7，将细胞转移到新的包被板中并分析原T细胞(CD34+CD7+CD5+/-)的存在。
第8天至第13天，每隔一天更换80％的培养基。在D14，将100,000个细胞/孔转移到新的包被板中，并分析细胞中是否存在前T细胞(CD34-CD7+CD5+/-)。
第15天至第20天，每隔一天更换80％的培养基。在D21收获细胞，并经由FACS分析细胞的CD3、CD8、CD5、CD7、TCRab表达，作为T细胞的替代物，和/或使用CD3/CD28珠激活以评估其功能特性。
分化21天后，收集细胞并以大约80,000个细胞重新接种到于RPMI 1640(无L-谷氨酰胺；无酚红)加FBS、L-谷氨酰胺、IL-2中的新96孔培养板中，并且然后用1:1CD3/CD28珠激活。用CD3/CD28珠激活72小时后，通过FACS分析细胞的CD3、CD69、CD25表达，并使用RT-qPCR分析IFN-γ表达。通过ELISA分析上清液。
结果
图4A和图4B显示，来源于第8天34+细胞的EHT的iPSC来源的HSC(在该实例中用Piezo1激活)经历类似于骨髓(BM)-HSC的原T细胞分化。此外，图5A和图5B显示，用D8 34+细胞的EHT产生的iPSC来源的HSC(在该例中用Piezo1激活)经历T细胞分化，并且可以类似于BM-HSC被CD3/CD28珠激活。图6显示，用D8 34+细胞的EHT产生的iPSC来源的HSC(该例中用Piezo1激活)可以分化为功能性T细胞，如通过CD3/CD28珠刺激后INFγ的表达所证实。总之，这些结果表明，来自分化的iPSC的34+细胞的EHT增强了HSC在体外进一步分化为造血谱系(诸如祖细胞T细胞和功能性T细胞等)的能力。
实例3–评估HLA剔除HSC中的脱靶编辑
执行三重敲除的(HLA编辑的)HSC克隆的HLA分型，以检查不需要的编辑，并且确保在6号染色体的其他区域内没有发生主要的编辑事件，例如缺失。执行测序方法和分析以评价gRNA脱靶活性的程度，并且选择代表影响非靶HLA基因的低风险的gRNA。
通过将全长P5测序接头连接到末端制备的DSB，在固定和透化的细胞中使用原位断裂标记执行测序。提取基因组DNA，片段化，末端制备，并且使用化学修饰的半功能性P7接头来连接。所得DNA文库含有功能性DSB标记片段(P5:P7)和非功能性基因组DNA片段(P7:P7)的混合物。随后对富含DNA标记片段的DNA文库进行DNA测序，除去所有外来的、非功能性DNA。由于文库制备不含PCR，所获得的每个测序读数相当于来自细胞的单个标记的DSB末端。这产生了DNA断裂读数，使得能够通过测序直接检测和量化基因组DSB，而不需要纠错，并且能够绘制脱靶突变的清晰列表。
下表1总结两个代表性克隆相对于野生型细胞的编辑策略的结果。
表1：克隆HSC HLA敲除。
表2提供实验中使用的gRNA的非限制性实例，其可用于敲除指定HLA基因的表达。
表2：示例性gRNA序列
结果表明，编辑策略成功地选择性靶向HLA-A、DPB1和DQB1基因，而不影响其他HLA基因或在别处引入主要缺失。
通过FACS和免疫荧光对HLA编辑的克隆进行表型分析，证实了这些结果。如图9A和图9B所示，与野生型细胞的HLA-I类分子的总体表达相比，HLA编辑的细胞的HLA-I类分子的总体表达测试为阳性。通过免疫荧光的HLA-A的特异性表达证实了HLA-A在HLA编辑的细胞中不表达，证实了基因编辑策略仅成功使HLA-A基因缺失的发现。具体地说，图7A显示HLA编辑的细胞对于I类HLA都是阳性的，其程度与野生型(WT)(即非HLA编辑的)细胞相同。这一结果指示，尽管HLA-A缺失，但其他I类分子如HLA-B和C被表达，并且不受基因编辑策略的影响。
为了证实HLA-A基因缺失，用免疫荧光分析了HLA-A的特异性表达。从图7B中可以看出，HLA-A在HLA编辑的克隆中不表达，指示基因编辑策略仅在使HLA-A基因特异性地缺失方面是高效的。此种保留全部I类表达并且HLA-A缺失将促进患者配型，同时避免NK细胞介导的排斥。
实例4–评价HLA编辑的HSC的多能性和免疫相容性
评价HLA编辑的细胞保留多能性的能力。如图8所示，HLA编辑的iPSC克隆的免疫荧光评价指示它们保持三系分化，其中外胚层分化由巢蛋白-488和PAX6-594染色指示，中胚层分化由GATA-488染色指示，并且内胚层分化由CXCR4-488和FOX2A-594染色指示。
HLA I类分子在所有有核细胞的表面上表达，并且如果在供体与受体之间，HLA I类分子不匹配，则细胞可以被CD8+T细胞识别并且杀死。此外，HLA不匹配可能导致细胞因子释放综合征(CRS)和移植物抗宿主病(GVD)。相反，通过B2M KO使HLA-I分子完全缺失，将使细胞成为NK细胞介导的细胞毒性的靶标。保留全部I类表达并且HLA-A缺失可促进患者配型，同时防止NK细胞介导的排斥。因此，通过与外周血单核细胞(PBMC)共培养来测试HLA编辑的HSC的免疫相容性，以评价免疫细胞是否将排斥HSC的移植物。
将野生型(WT)和HLA编辑的HSC与HLA-B和HLA-C标记物匹配但HLA-A不匹配的PBMC共培养。缺乏HLA-I类分子表达的B2M KO HSC和缺乏HLA-II类分子表达的CIITA KO HSC用作对照，以分别比较HLA无效和HLA不匹配的PBMC介导的细胞毒性程度。图9显示通过膜联蛋白V染色测量的共培养物中的PBMC介导的细胞毒性测定的结果。结果显示在HLA编辑的HSC中HLA-A的缺失会保护细胞免受PBMC介导的细胞毒性影响，而WT、B2M KO和CIITA KO易受PBMC介导的细胞毒性影响。与来自同一PBMC供体的分选的CD8+T细胞共培养的HSC保护HLA编辑和B2M KO HSC免受CD8+T细胞的细胞毒性影响。相反，与分选的NK细胞共培养的HSC仅保护WT和HLA编辑的细胞免受NK细胞介导的细胞毒性影响。
总之，免疫相容性结果显示，PBMC样品中存在的CD8+T细胞负责杀死HLA分子(WT和CIITA KO)不匹配的细胞，而PBMC中存在的NK细胞负责杀死HLA无效的细胞(B2M KO)。然而，HLA编辑的HSC经保护不受CD8+T细胞介导的细胞毒性影响(因为不匹配的HLA-A已经被敲除)，并且经保护不受NK细胞介导的细胞毒性的影响(因为HLAI类分子的表达在很大程度上被保留)。
实例5–评价HLA编辑的HSC的体内移植潜力
为了评价HLA编辑的HSC的移植潜力，通过针对WT HSC的竞争性移植来评估细胞的体内移植能力。将等比例的mCherry HLA编辑的HSC和野生型HSC混合，并移植到小鼠中，其中通过FACS回收和评价骨髓(BM)和外周血样品，以比较样品中存在的每种细胞类型的相对量。如图10所示，HLA编辑的HSC和WT HSC两者促成在BM和外周血样品中大致相等的移植。这些结果证实HLA编辑的HSC(根据本公开制备的)在其移植和重建潜力方面与WT HSC相当。因此，预期WT(未编辑的，亲代)HSC的性质与本公开的HLA编辑的HSC的性质一致，用于产生T细胞谱系。
实例6–HLA编辑的HSC向CD4+/CD8+T细胞的分化
抗原呈递细胞(APC)通过HLA-II分子将抗原呈递给辅助性CD4+T细胞。辅助性CD4+T细胞的激活促进抗原特异性CD8+T细胞的产生，这些CD8+T细胞进一步发育成抗原特异性CTL。同样，HLA I类分子在所有有核细胞表面上表达，并将细胞内蛋白质的肽片段展示给CD8+CTL。CTL在识别细胞表面上表达的HLA-I-肽复合物后，诱导靶(受感染的)细胞的细胞毒性杀伤。因此，进行研究以确定HLA-A的缺失是否影响编辑的HSC的I类肽呈递。如图11A和11B所示，免疫肽组分析显示，HLA-A的缺失不影响I类肽的整体呈递。与野生型(未HLA编辑的)HSC相比时，HLA-A编辑的细胞显示相当的肽和蛋白质呈递。此外，如图12A和12B所示，HLA-DQB1和HLA-DPB1的缺失不影响通过由HSC分化的巨噬细胞对II类肽的整体呈递。总之，这些数据表明，尽管HLA-A、HLA-DQ和HLA-DP分子缺失，这些细胞(及其来源的谱系)仍保留了其呈递广谱I类和II类肽的能力。
实例7–抗原介导免疫反应的体内测试。
图13是迟发型超敏反应的示意图，显示抗原呈递的致敏和诱发阶段。简而言之，抗原注射后，抗原由抗原呈递细胞(APC)处理，并由APC表面的MHC II类分子呈递。CD4+T细胞识别抗原呈递细胞(APC)上的肽-MHC。当受到抗原激发(antigenic challenge)时，CD4+辅助性T细胞被激活，并且细胞因子募集巨噬细胞和其他免疫细胞，这诱导组织肿胀。
对移植小鼠进行了迟发型超敏反应测定。具体来说，通过皮下注射绵羊红细胞作为抗原使小鼠致敏。如果小鼠具有功能性免疫系统，APC处理抗原并将肽抗原呈递给CD4+T细胞。接下来，通过在小鼠左爪皮下注射相同的抗原进行激发。此时，T细胞被激活并分泌细胞因子，这些细胞因子在抗原注射部位募集巨噬细胞和其他免疫细胞，从而引起组织肿胀。在该测定中，功能性免疫系统导致左爪肿胀，如用微型卡尺所测量。
如图14A和14B中可以看出，对照(未移植)小鼠由于其免疫缺陷，左爪未出现肿胀。相反地，移植有脐带血CD34+细胞的小鼠显示组织肿胀，并且其左爪直径增加一倍。在移植了WT(未编辑HSC)和HLA编辑的HSC两者的小鼠中均发现了相似的免疫系统反应。
实例8–评估HSC来源的T细胞(原T细胞)的分化和成熟
接下来，测试了HSC来源的T细胞(原T细胞)分化为成熟T细胞的能力。经过35天的分化期后，通过细胞分选评估原T细胞中CD4+、CD8+和AB+T细胞群体的存在。如图15所示，原T细胞比骨髓(BM)来源的CD34+细胞和来源于胚肽体(EB)的CD34+细胞更有效地分化为CD4+、CD8+和αβ+T细胞。
接下来，为了测试功能特性，将每个T细胞群体与CD19+淋巴瘤细胞系和抗CD3/CD-19双特异性抗体共培养。在该实验模型中，双特异性抗体同时作用于T细胞上的CD3受体和淋巴瘤细胞的CD19细胞表面受体，从而触发T细胞激活。通过测量随后的T细胞介导的、与泛T细胞阳性对照比较的细胞毒性来评估激活程度。如图16所示，与BM CD34+T细胞和EB CD34+T细胞相比，原T细胞在细胞毒性方面表现出在统计学上显著的优越性。
实例9–评估HSC发育为原T细胞的特性。
通过测量原T细胞上的CD34-CD7+标记物来评估HSC发育为原T细胞的能力。如图17所示，FACS分析显示，与骨髓来源的CD34+细胞或EB来源的CD34+细胞相比，根据本公开产生的HSC成功分化为CD34-CD7+原T细胞。
接下来，测量了T细胞特异性转录因子和胸腺植入分子的表达。图18A显示，本公开的HSC来源的原T细胞中TCF7表达增加，并且图18B显示，CCR7表达增加。图19A显示，HSC来源的原T细胞在胸腺中植入并分化。图19B显示以CD45+细胞群体设门的CD3细胞群体的FACS分析，其显示HSC来源的原T细胞在胸腺中具有优异的植入和分化潜能。该实例的原T细胞已如前文所述利用Piezo1激活由HSC制备。
如图20所示，还测量了HSC来源的T细胞的体外激活。图20的顶部小图显示来自不同来源，包括本公开的HSC(例如，使用Piezo1激活制备)的激活T细胞的FACS分析。由本公开的HSC制备的T细胞表现出相当或更优异的激活，如通过增加的CD107表达所衡量。下方小图显示Dynabeads激活，其中激活的T细胞表达炎性细胞因子。根据本公开，HSC来源的T细胞(例如，使用Piezo1激活制备)表达了更高水平的炎性细胞因子，如通过TNF-α和干扰素γ的表达水平所例示。
实例10：HLA编辑的HSC分化为造血谱系，即原单核细胞/巨噬细胞
进行实验以确定HLA缺失是否影响HSC分化为不同类型的免疫细胞的能力。使用基本如实例2中描述的方法，HLA编辑的HSC分化为原单核细胞/巨噬细胞。确定HLA编辑的HSC能够分化为与WT(非HLA编辑的)HSC相当的单核细胞/巨噬细胞谱系，如通过其CD11b+-CD14+表达所测量(图21A)。此外，CD11b+-CD14+设门群体显示等效的HLA-I和HLA-II表达(图21B)，指示HLA编辑的HSC也保留了I类和II类分子两者的整体表达。
通过评估由HSC分化的巨噬细胞的表达，评估了由编辑的HSC支持的HLA-DQB1和HLA-DPB1中的其他II类分子的整体表达。研究设计示意性地显示在图22A中。发现，HLA-DQB1和HLA-DPB1的缺失不影响其他HLA II类分子的表达(图22B)。例如，HLA-DR在WT和HLA编辑的细胞两者中均有相当的表达(图22C)。在图22B和22C中，CIITA-KO作为阳性对照。
实例11：HLA编辑的HSC分化为原血小板
已确定HLA编辑的HSC能够分化成巨核细胞(MK)并且进一步分化成血小板。针对骨髓(BM)来源的CD34+细胞和iPSC-CD34+细胞来比较分化。如图23所示，与BM CD34+和iPSC-34+细胞群体相比，HLA编辑的HSC表现出血小板含量的统计学显著增加。因此，HLA编辑的HSC可以分化为巨核细胞(MK)，巨核细胞可以进一步支持分化为血小板。
参考文献
1.Nianias,A.&Themeli,M.Induced Pluripotent Stem Cell(iPSC)–DerivedLymphocytes for Adoptive Cell Immunotherapy:Recent Advances andChallenges.Curr Hematol Malig Rep 14,261–268(2019)。
2.Brauer,P.M.,Singh,J.,Xhiku,S.&J.C.T Cell Genesis:InVitro Veritas Est？Trends Immunol 37,889–901(2016)。
3.Kennedy,M.等人T Lymphocyte Potential Marks the Emergence ofDefinitive Hematopoietic Progenitors in Human Pluripotent Stem CellDifferentiation Cultures.Cell Reports 2,1722–1735(2012)。
4.Sturgeon,C.M.,Ditadi,A.,Awong,G.,Kennedy,M.&Keller,G.Wnt SignalingControls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis FromHuman Pluripotent Stem Cells.Nat Biotechnol 32,554–561(2014)。
5.Chang,C.-W.,Lai,Y.-S.,Lamb,L.S.&Townes,T.M.Broad T-Cell ReceptorRepertoire in T-Lymphocytes Derived from Human Induced Pluripotent StemCells.PLoS One 9,(2014)。
6.Nishimura,T.等人Generation of Rejuvenated Antigen-Specific T Cellsby Reprogramming to Pluripotency and Redifferentiation.Cell Stem Cell 12,114–126(2013)。
7.Themeli,M.等人Generation of tumor-targeted human T lymphocytesfrominduced pluripotent stem cells for cancer therapy.Nat Biotechnol 31,928–933(2013)。
8.Vizcardo,R.等人Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cellsfrom iPSCs Derived from Mature CD8+T Cells.Cell Stem Cell 12,31–36(2013)。
9.Montel-Hagen,A.等人Organoid-induced differentiation of conventionalT cells from human pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 24,376-389.e8(2019)。
10.Guo,R.等人Guiding T lymphopoiesis from pluripotent stem cells bydefined transcription factors.Cell Research 30,21–33(2020)。
11.Nagano,S.等人High Frequency Production of T Cell-Derived iPSCClones Capable of Generating Potent Cytotoxic T Cells.Molecular Therapy-Methods&Clinical Development 16,126–135(2020)。
12.Iriguchi,S.等人A clinically applicable and scalable method toregenerate T-cells from iPSCs for off-the-shelf T-cell immunotherapy.NatureCommunications 12,430(2021)。

Claims (84)

1.一种用于制备红系谱系的细胞群体的方法，所述方法包括：
从分化的多能干细胞(PSC)群体富集CD34+细胞，以制备CD34+富集的群体；
诱导CD34+富集的细胞群体进行内皮细胞到造血细胞转变至少两天，但不超过12天，以制备包含造血干细胞(HSC)和/或造血干细胞祖细胞(HSPC)的群体；以及
使包含HSC和/或HSPC的所述群体分化为红系谱系群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PSC群体是来源于成红血细胞、淋巴细胞、脐带血细胞、外周血单核细胞、CD34+细胞或人类原代组织的人类iPSC群体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述iPSC群体来源于从外周血分离的CD34+富集的细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述iPSC对一个或多个HLAI类和/或II类基因为纯合的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述iPSC对于HLA-DRB1是纯合的。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述iPSC对于HLA-B和HLA-C两者是纯合的。
7.根据权利要求2所述的方法，其中对所述iPSC进行基因编辑以使一个或多个HLA I类基因缺失、使一个或多个II类基因缺失和/或使支配HLA或MHC表达或呈递能力的一个或多个基因缺失。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述iPSC包括HLA-A的缺失。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述iPSC包含HLA-DPB1和/或HLA-DQB1的缺失。
10.根据权利要求7所述的方法，其中支配HLA或MHC表达或呈递能力的所述一个或多个基因是β2-微球蛋白和/或CIITA。
11.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述iPSC包含HLA-A的缺失、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的，包含HLA-DPB1和HLA-DQB1的缺失，并且对于HLA-DRB1为纯合的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述HSC和/或HSPC经基因编辑以编码高反应性EPO受体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在iPSC分化的第8天到第15天诱导CD34+富集和内皮细胞到造血细胞转变。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述内皮细胞到造血细胞转变产生HSC群体，所述HSC群体包含长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞和造血干细胞祖细胞中的一者或多者。
15.根据权利要求13所述的方法，其中从经历内皮细胞到造血细胞转变的培养物中收获CD34+细胞，包括收获CD34+漂浮细胞和/或粘附细胞。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述HSC群体包含长期造血干细胞(LT-HSC)。
17.根据权利要求13所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的所述诱导包括增加dnmt3b的表达或活性。
18.根据权利要求13所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的所述诱导包括对所述CD34富集的细胞施加周期性拉伸。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述周期性拉伸是2D、3D或4D周期性拉伸。
20.根据权利要求13所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的所述诱导包括Piezo1激活。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述Piezo1激活是通过将所述CD34+富集的细胞或其级分与一种或多种Piezo1激动剂接触来进行，所述一种或多种Piezo1激动剂任选地选自Yoda1、Jedi1、Jedi2、ssRNA40或其类似物或衍生物。
22.根据权利要求13所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的所述诱导包括Trpv4激活。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述Trpv4激活是通过将所述CD34+富集的细胞与一种或多种Trpv4激动剂接触来进行，所述一种或多种Trpv4激动剂任选地选自GSK1016790A、4α-PDD或其类似物或衍生物。
24.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述红系谱系选自红系祖细胞、祖细胞成红血细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)、以及巨核细胞红系祖细胞(MEP)和红系细胞。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中将HSC或其级分或其子代用EPO、IL-3和SCF培养以制备定型红系谱系。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述方法产生(i)具有高百分比的红系爆式集落形成单位(BFU-E)的造血集落和/或(ii)红系集落形成单位(CFU-E)细胞。
27.根据权利要求25或26所述的方法，所述方法进一步包括：
在足以产生去核红细胞的培养条件下培养所述红系谱系，其中所述培养任选地包含SCF、EPO和IL-3中的一种或多种。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述子代分化为以(i)CD36+/CD45+标记物为特征的细胞，并且(ii)随着时间进一步分化为以CD36+/CD45-标记物为特征的细胞，其中(ii)中至少80％的所述细胞被鉴定为CD36+。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的方法，其中红系谱系在选自以下的一种或多种培养条件下培养：
(i)pH为约4.0至约7.9；
(ii)低于约75％的大气氧的氧水平；以及
(iii)机械应力。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述pH是约pH 7.0至约pH 7.9。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述氧水平包含低于约50％的大气氧和/或低于或等于15％的溶解氧。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述机械应力在生物反应器内产生。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述机械应力是通过调节生物反应器叶轮的速度来控制的。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述机械应力可以在整个红细胞/网织红细胞培养方案中连续施加或持续施加。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述红系扩增培养基补充有以下中的一种或多种：(i)piezo1激动剂、(ii)Trpv4激动剂、(iii)磷酸二酯酶抑制剂或(iv)GSK 3抑制剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述红系扩增培养基补充有以下中的一种或多种：(i)干细胞因子(SCF)；(ii)胰岛素生长因子I(IGF1)；(iii)IL3；(iv)IL11；和(v)EPO。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述红系扩增培养基补充有(i)Flt3-配体；和/或(ii)骨形态发生蛋白4(BMP4)。
38.一种通过根据权利要求1至37中任一项所述的方法制备的红细胞谱系的细胞群体。
39.一种用于治疗患者的方法，所述患者患有遗传性或获得性红细胞疾患、骨髓衰竭疾患、高原相关生理和病理性病症、贫血、红细胞酶缺乏症、红细胞膜疾患、血红蛋白病、溶血性贫血、营养性贫血、血红素产生疾患或血色素沉着病，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求33所述的红细胞谱系。
40.一种造血干细胞(HSC)或红系祖细胞组合物，其中所述HSC或红系祖细胞表达对EPO具有高反应性的红细胞生成素受体(EPOR)。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述组合物包含含有至少0.0001％LT-HSC的HSC。
42.根据权利要求40或41所述的组合物，其中所述组合物包含至少约102、至少约103、或至少约104、或至少约105、或至少约106个HSC或红系祖细胞。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的组合物，其中所述EPOR具有截短突变。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述EPOR缺乏所述SHP-1抑制结构域。
45.根据权利要求40至43中任一项所述的组合物，其中所述EPOR包含一个或多个导致高反应性的错义或移码突变，所述高反应性任选地通过所述SHP-1抑制结构域的突变来实现。
46.根据权利要求40至45中任一项所述的组合物，其中所述HSC或红系祖细胞是由诱导多能干细胞(iPSC)分化的。
47.权利要求46所述的组合物，其中HSC或红系祖细胞是HLA-Aneg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1neg和HLA-DQB1neg。在一些实施例中，iPSC对于HLA-DRB1是进一步纯合的。
48.根据权利要求46或47所述的组合物，其中所述iPSC经基因编辑以编码高反应性EPO受体。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的组合物，其中iPSC通过包括增加dnmt3b或Gimap6表达或活性的方法分化为HSC。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的组合物，其中所述HSC是在包括施加周期性拉伸的方法中由iPSC制备的。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中使细胞经受2D或3D周期性拉伸，并且经受周期性拉伸的所述细胞任选地选自iPSC、内皮细胞、造血内皮细胞(HEC)和造血干细胞(HSC)中的一种或多种。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中使iPSC分化为内皮细胞或HEC，并对所述内皮细胞或HEC施加周期性拉伸。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中从iPSC或由其制备的胚体(EB)中富集CD34+细胞，并对所述CD34+细胞或其亚群施加周期性拉伸。
54.根据权利要求46至53中任一项所述的组合物，其中HSC在包括通过Piezo1激活或通过Trpv4激活进行刺激的方法中由iPSC制备。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中使细胞经受Piezo1激活，并且所述经受Piezo1激活的细胞任选地选自iPSC、EC、HEC和HSC中的一种或多种。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中从iPSC或由其制备的胚体(EB)中富集CD34+细胞，并对所述CD34+细胞或其亚群施加Piezo1激活。
57.根据权利要求55或56所述的组合物，其中所述Piezo1激活是通过将多能干细胞或由其来源或分化的细胞与一种或多种Piezo1激动剂接触来进行，所述一种或多种Piezo1激动剂任选地选自Yoda1、Jedi1、Jedi2、ssRNA40或其类似物。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述Piezo1激动剂的有效量在0.1μM至500μM的范围内、或在0.1μM至100μM的范围内。
59.根据权利要求40至58中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含适用于输注给患者的药学上可接受的载体。
60.一种用于制备HSC群体的方法，所述方法包括：制备携带编码对EPO具有高反应性的EPOR基因的iPSC群体，并使所述iPSC分化为包含LT-HSC的HSC。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述EPOR具有截短突变。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述EPOR缺乏SHP-1抑制结构域。
63.根据权利要求60所述的方法，其中所述EPOR包含一个或多个导致高反应性的错义或移码突变，所述高反应性任选地通过所述SHP-1抑制结构域的突变来实现。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的方法，其中所述HSC是由诱导性多能干细胞(iPSC)分化的。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述iPSC来源于通用相容的供体细胞。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述iPSC经基因编辑以编码所述高反应性EPO受体。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的方法，其中通过包括增加dnmt3b或Gimap6表达或活性的方法使iPSC分化为HSC。
68.根据权利要求60至67中任一项所述的方法，其中所述HSC是在包括施加周期性拉伸的方法中由iPSC制备的。
69.根据权利要求68所述的方法，其中使细胞经受2D或3D周期性拉伸，并且经受周期性拉伸的所述细胞任选地选自iPSC、内皮细胞、造血内皮细胞(HEC)和造血干细胞(HSC)中的一种或多种。
70.根据权利要求69所述的方法，其中使iPSC分化为内皮细胞或HEC，并对所述内皮细胞或HEC施加周期性拉伸。
71.根据权利要求69所述的方法，其中从iPSC或由其制备的胚胎体(EB)中富集CD34+细胞，并对所述CD34+细胞或其亚群施加周期性应变。
72.根据权利要求60至71中任一项所述的方法，其中所述HSC在包括通过Piezo1激活或Trpv4激活进行刺激的方法中由iPSC制备。
73.根据权利要求72所述的方法，其中使细胞经受Piezo1激活，并且所述经受Piezo1激活的细胞任选地选自iPSC、EC、HEC和HSC中的一种或多种。
74.根据权利要求73所述的方法，其中从iPSC或由其制备的胚体(EB)中富集CD34+细胞，并对所述CD34+细胞或其亚群施加Piezo1激活。
75.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述Piezo1激活是通过使多能干细胞或由其分化的细胞与一种或多种Piezo1激动剂接触来实现的，所述一种或多种Piezo1激动剂任选地选自Yoda1、Jedi1、Jedi2、ssRNA40或其类似物。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述Piezo1激动剂的有效量在0.1μM至500μM的范围内或在0.1μM至100μM的范围内。
77.根据权利要求60至76中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少0.0001％LT-HSC。
78.根据权利要求60至77中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少约102、至少约103、或至少约104、或至少约105个、或至少约106个HSC。
79.一种细胞组合物，其包含携带编码高反应性EPOR的红细胞生成素受体(EPOR)基因的HSC群体或红系祖细胞群体，其中所述HSC群体是通过根据权利要求60至78中任一项所述的方法制备的。
80.一种治疗需要红细胞产生的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求39至59和79中任一项所述的组合物。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述受试者患有贫血。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述受试者患有镰状细胞性贫血、再生障碍性贫血、与骨髓疾病或骨髓衰竭相关的贫血、失血性贫血或溶血性贫血。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述受试者患有范可尼贫血。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述受试者患有地中海贫血。
CN202380082687.5A 2022-10-05 2023-10-05 来源于多能细胞的红系谱系 Pending CN120641557A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202263413439P 2022-10-05 2022-10-05
US63/413,439 2022-10-05
PCT/US2023/076093 WO2024077146A2 (en) 2022-10-05 2023-10-05 Erythroid lineages derived from pluripotent cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN120641557A true CN120641557A (zh) 2025-09-12

Family

ID=90608797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202380082687.5A Pending CN120641557A (zh) 2022-10-05 2023-10-05 来源于多能细胞的红系谱系

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4599051A2 (zh)
JP (1) JP2025533906A (zh)
KR (1) KR20250084950A (zh)
CN (1) CN120641557A (zh)
AU (1) AU2023356354A1 (zh)
IL (1) IL320067A (zh)
WO (1) WO2024077146A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20250332260A1 (en) * 2024-04-10 2025-10-30 Garuda Therapeutics, Inc. Immune compatible cells for allogeneic cell therapies to cover global, ethnic, or disease-specific populations
CN118421559B (zh) * 2024-07-04 2024-09-27 成都赛济元生物医药有限公司 定向分化淋巴造血前体细胞的小分子组合、试剂盒及方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007047894A2 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Advanced Cell Technology, Inc. Totipotent, nearly totipotent or pluripotent mammalian cells homozygous or hemizygous for one or more histocompatibility antigen genes
JP5748654B2 (ja) * 2008-05-06 2015-07-15 オカタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法
BR112012020958A2 (pt) * 2010-02-22 2015-09-15 Univ Paris Curie "meio de cultura para a criação e/ou diferenciação de células da linhagem hemapo
ES2953925T3 (es) * 2015-11-04 2023-11-17 Fate Therapeutics Inc Ingeniería genómica de células pluripotentes
IL307219A (en) * 2021-03-31 2023-11-01 Garuda Therapeutics Inc Pluripotent stem cell-derived hematopoietic lineages

Also Published As

Publication number Publication date
EP4599051A2 (en) 2025-08-13
WO2024077146A2 (en) 2024-04-11
WO2024077146A3 (en) 2024-06-20
IL320067A (en) 2025-06-01
KR20250084950A (ko) 2025-06-11
JP2025533906A (ja) 2025-10-09
AU2023356354A1 (en) 2025-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7560502B2 (ja) 多能性幹細胞からｈｌａホモ接合免疫細胞への指向分化方法
JP7072808B2 (ja) 多能性幹細胞から免疫細胞療法用ｔ細胞を誘導する方法
JP7061961B2 (ja) 多能性幹細胞の免疫細胞への分化を誘導する方法
CN120641557A (zh) 来源于多能细胞的红系谱系
JP2023548115A (ja) ヒト多能性幹細胞からのｃｄ４＋エフェクターおよび制御性ｔ細胞の生成
US20250368955A1 (en) B cell lineages derived from pluripotent cells
US20250332260A1 (en) Immune compatible cells for allogeneic cell therapies to cover global, ethnic, or disease-specific populations
EP4598554A1 (en) Pluripotent stem cell-derived megakaryocytes and platelets
EP4599054A1 (en) Pluripotent stem cell-derived t cell populations and progenitors thereof
CN120265300A (zh) 来源于多能细胞的自然杀伤细胞谱系
CN120303392A (zh) 来源于多能细胞的髓系谱系

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination