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CN120641136A - 用于额颞叶痴呆的基因疗法 - Google Patents

用于额颞叶痴呆的基因疗法

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Publication number
CN120641136A
CN120641136A CN202380091029.2A CN202380091029A CN120641136A CN 120641136 A CN120641136 A CN 120641136A CN 202380091029 A CN202380091029 A CN 202380091029A CN 120641136 A CN120641136 A CN 120641136A
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CN
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aav
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aav vector
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Application number
CN202380091029.2A
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R·D·贝尔
郑廷文
J·纳鲁拉
C·Q·潘
D·W·苏扎
R·塔贝特
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Alexen International Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Alexen International Pharmaceutical Co ltd
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Publication date
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Abstract

本公开描述了用于在转导细胞中表达前颗粒蛋白及其变体的改良载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体，以及此类载体用于在出现前颗粒蛋白缺乏的受试者诸如患有额颞叶痴呆(FTD)或额颞叶变性(FTLD)的某些受试者中增加前颗粒蛋白的量的用途。

Description

用于额颞叶痴呆的基因疗法
背景技术
额颞叶痴呆(FTD)是指一种临床综合征，其特征在于与额和颞皮层叶的选择性神经变性(额颞叶变性或FTLD)相关的语言、行为和执行功能的缺损逐渐恶化，而不是阿尔茨海默病和某些其他痴呆中常见的更普遍的神经变性。FTD患者通常在其壮年时期患上FTD，症状发作最常发生在45至64岁之间。随后症状迅速发展，导致功能减退并最终在平均8年内死亡。FTD的唯一治疗聚焦于管理不可避免的行为变化的影响，但这些治疗都无法有效减缓或逆转导致FTD的潜在脑叶神经变性。鉴于这种远未得到满足的医疗需求，本领域需要有效治疗或预防额颞叶变性及其导致的神经功能缺损和最终死亡的方法。
发明内容
为了解决本领域中的该需求，本公开提供了用于表达人前颗粒蛋白(PGRN)多肽或其变体的改良腺相关病毒(AAV)载体、产生此类AAV载体的方法以及使用此类AAV载体来预防或治疗以人PGRN或其变体的量缺乏为特征的受试者的疾病或障碍的方法，该疾病或障碍包括但不限于额颞叶变性(FTLD)和额颞叶痴呆(FTD)。
下面列出了本公开的某些列举的非限制性实施方案(E)。这些和相关的实施方案在具体实施方式(包括实施例和附图)中进一步详细描述。本领域技术人员仅需使用常规实验，就将认识到或就将能够确定本文所述的具体实施方案的等同物。
E1.一种重组腺相关病毒(AAV)载体，所述重组腺相关病毒(AAV)载体包含编码人前颗粒蛋白(PGRN)多肽或其变体的核苷酸序列。
E2.根据E1所述的AAV载体，其中所述PGRN多肽变体是缺少原本存在于全长野生型人PGRN多肽中的一个或多个氨基酸的羧基末端截短变体，使得与全长野生型人PGRN多肽相比，所述变体PGRN多肽与人分拣蛋白受体(SORT1)蛋白的结合降低。
E3.根据E2所述的AAV载体，其中所述PGRN多肽变体缺少存在于全长野生型人PGRN多肽中的最后三个羧基末端氨基酸。
E4.根据E1至E3所述的AAV载体，其中所述PGRN多肽变体的氨基酸序列包含SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。
E5.根据E1至E4所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列是野生型核苷酸序列。
E6.根据E1至E4所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列是密码子优化的核苷酸序列。
E7.根据E6所述的AAV载体，其中与编码所述PGRN多肽或其变体的野生型核苷酸序列相比，所述密码子优化的核苷酸序列具有减少数量的CpG二核苷酸。
E8.根据E7所述的AAV载体，其中与编码PGRN多肽或其变体的野生型核苷酸序列相比，编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列具有少1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5个的CpG二核苷酸。
E9.根据E7至E8所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述野生型核苷酸序列由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的核苷酸序列构成。
E10.根据E7所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列不含任何CpG二核苷酸。
E11.根据E1至E10所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的核苷酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同。
E12.根据E1至E5所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的核苷酸序列相同。
E13.根据E1至E12所述的AAV载体，其中所述基因组包含至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。
E14.根据E13所述的AAV载体，其中所述ITR的核苷酸序列是野生型的。
E15.根据E13所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰。
E16.根据E15所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰以降低或消除所述ITR进行末端解离的能力。
E17.根据E15所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰以使末端解离位点失活。
E18.根据E15所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰以降低或消除所述ITR支持包装进衣壳的能力。
E19.根据E15所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰以使D区失活。
E20.根据E13至E14所述的AAV载体，其中所述ITR是AAV2 ITR。
E21.根据E20所述的AAV载体，其中所述AAV2 ITR被截短。
E22.根据E13所述的AAV载体，其中所述ITR包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21的核苷酸序列或者所述序列各自的互补序列或反向互补序列。
E23.根据E13至E14所述的AAV载体，其中所述ITR不是AAV2ITR。
E24.根据E1至E23所述的AAV载体，其中所述载体包含位于其5'末端的第一AAVITR和位于其3'末端的第二AAV ITR。
E25.根据E24所述的AAV载体，其中所述载体还包含第三AAVITR。
E26.根据E25所述的AAV载体，其中所述第三ITR被修饰以使末端解离位点失活。
E27.根据E1至E26所述的AAV载体，其中所述载体还包含与编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列可操作地连接的转录控制区。
E28.根据E27所述的AAV载体，其中所述转录控制区是组成型的。
E29.根据E27所述的AAV载体，其中所述转录控制区是诱导型的。
E30.根据E27所述的AAV载体，其中所述转录控制区是组织或细胞类型特异性的。
E31.根据E30所述的AAV载体，其中所述转录控制区是脑组织特异性的或神经元细胞特异性的。
E32.根据E30所述的AAV载体，其中所述转录控制区在CNS神经元中比在肝细胞中更具转录活性。
E33.根据E27至E32所述的AAV载体，其中所述转录控制区包含启动子序列。
E34.根据E33所述的AAV载体，其中所述转录控制区还包含增强子序列。
E35.根据E34所述的AAV载体，其中所述增强子序列位于所述启动子的5'。
E36.根据E34所述的AAV载体，其中所述增强子序列位于所述启动子的3'。
E37.根据E33所述的AAV载体，其中所述启动子序列是脑组织特异性的或神经元细胞特异性的。
E38.根据E34所述的AAV载体，其中所述增强子序列是脑组织特异性的或神经元细胞特异性的。
E39.根据E34所述的AAV载体，其中所述启动子序列和所述增强子序列各自是脑组织特异性的或神经元细胞特异性的。
E40.根据E33所述的AAV载体，其中所述启动子序列和/或所述增强子序列来源于突触素基因。
E41.根据E34所述的AAV载体，其中所述启动子序列和/或所述增强子序列来源于突触素基因，所述突触素基因选自由哺乳动物突触素基因、小鼠突触素基因、大鼠突触素基因、灵长类动物突触素基因、猴突触素基因、黑猩猩突触素基因和人突触素1基因(SYN1)组成的组。
E42.根据E41所述的AAV载体，其中所述启动子序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其启动子功能子序列、修饰或变体。
E43.根据E41所述的AAV载体，其中所述增强子序列分别包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其增强子功能子序列、修饰或变体。
E44.根据E1至E43所述的AAV载体，其中所述载体还包含5'非翻译区(UTR)序列。
E45.根据E44所述的AAV载体，其中所述5'UTR序列位于所述启动子序列和/或所述增强子序列的3'以及编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列的5'。
E46.根据E44至E45所述的载体，其中所述5'UTR序列来源于突触素基因。
E47.根据E46所述的载体，其中所述5'UTR序列来源于突触素基因，所述突触素基因选自由哺乳动物突触素基因、小鼠突触素基因、大鼠突触素基因、灵长类动物突触素基因、猴突触素基因、黑猩猩突触素基因和人突触素1基因(SYN1)组成的组。
E48.根据E48所述的AAV载体，其中所述5'UTR序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其5'UTR功能子序列、修饰或变体。
E49.根据E1至E48所述的AAV载体，其中所述载体还包含转录终止信号序列。
E50.根据E49所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列是多聚腺苷酸化(多聚(A))信号序列。
E51.根据E50所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列来源于牛生长激素(bGH)基因。
E52.根据E51所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其转录终止信号功能子序列、修饰或变体。
E53.根据E1至E52所述的AAV载体，其中所述载体还包含内含子序列。
E54.根据E53所述的AAV载体，其中所述内含子序列位于编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列内并中断所述核苷酸序列。
E55.根据E53所述的AAV载体，其中所述内含子序列不中断编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列。
E56.根据E55所述的AAV载体，其中所述内含子序列位于编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列的5'。
E57.根据E56所述的AAV载体，其中所述内含子序列位于所述启动子的3'和编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列的5'。
E58.根据E1至E57所述的AAV载体，其中所述载体还包含转录后调控元件(PRE)序列。
E59.根据E58所述的AAV载体，其中所述PRE序列位于编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列的3'和所述转录终止信号序列的5'。
E60.根据E58至E59所述的AAV载体，其中所述PRE序列是WPRE或HPRE序列。
E61.根据E1至E60所述的AAV载体，其中所述载体还包含微RNA(miRNA)的结合位点。
E62.根据E61所述的AAV载体，其中所述miRNA结合位点位于编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列的3'和所述转录终止信号序列的5'。
E63.根据E1至E62所述的AAV载体，其中所述载体还包含足够长度的填塞或填充核苷酸序列，使得包含ITR在内的所述AAV载体的整个长度为大约3.5至5.0千碱基。
E64.根据E63所述的AAV载体，其中所述填塞或填充核苷酸序列来源于TATA结合蛋白(TBP)基因。
E65.根据E64所述的AAV载体，其中所述填塞或填充核苷酸序列是人TBP基因内含子或其子序列、修饰或变体。
E66.根据E65所述的AAV载体，其中所述填塞或填充核苷酸序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成。
E67.根据E1至E66所述的AAV载体，其中所述载体包含第一AAVITR、与编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列可操作地连接的转录控制区、转录终止信号序列和第二AAV ITR。
E68.根据E67所述的AAV载体，其中所述载体按5'至3'顺序包含所述第一AAV ITR、与编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列可操作地连接的所述转录控制区、所述转录终止信号序列和所述第二AAV ITR。
E69.根据E68所述的AAV载体，其中所述转录控制区包含位于编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列的5'的启动子和位于所述启动子的5'的增强子。
E70.根据E67至E69所述的AAV载体，其中所述载体还包含位于所述启动子与编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列之间的内含子。
E71.根据E68至E70所述的AAV载体，其中所述载体还包含位于编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列内并中断所述核苷酸序列的内含子。
E72.根据E68至E71所述的AAV载体，其中所述载体还包含位于编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列与所述多聚(A)信号序列之间的PRE。
E73.根据E68至E72所述的AAV载体，其中所述第一AAV ITR位于所述载体的5'末端，并且所述第二AAV ITR位于所述载体的3'末端。
E74.根据E73所述的AAV载体，其中所述载体还包含位于所述第一AAV ITR与所述第二AAV ITR之间的第三AAV ITR。
E75.根据E74所述的AAV载体，其中所述第三AAV ITR的末端解离位点是失活的。
E76.根据E68至E75所述的AAV载体，其中所述转录控制区是脑组织或神经元细胞特异性的。
E77.根据E76所述的AAV载体，其中所述转录控制区包含来源于突触素基因的启动子序列和/或增强子序列，所述突触素基因选自由哺乳动物突触素基因、小鼠突触素基因、大鼠突触素基因、灵长类动物突触素基因、猴突触素基因、黑猩猩突触素基因和人突触素1基因(SYN1)组成的组。
E78.根据E77所述的AAV载体，其中所述转录控制区包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其转录控制区功能子序列、修饰或变体。
E79.根据E67至E78所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列来源于牛生长激素(bGH)基因。
E80.根据E79所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其转录终止信号功能子序列、修饰或变体。
E81.根据E67至E80所述的AAV载体，所述AAV载体还包含位于所述转录终止信号序列的3'和所述第二AAV ITR的5'的经修饰的人TBP基因内含子序列。
E82.根据E1至E5所述的AAV载体，其中所述载体按5'至3'顺序包含：
(a)第一AAV2 ITR，
(b)来自突触素基因的启动子序列，
(c)来自突触素基因的5'UTR序列，
(d)与所述启动子序列可操作地连接的编码人PGRN多肽或其变体的核苷酸序列，
(e)来自牛生长激素(bGH)基因的转录终止信号序列，
(f)来自TBP基因内含子的序列，以及
(g)第二AAV2 ITR。
E83.根据E82所述的AAV载体，其中来自突触素基因的所述启动子序列包含SEQ IDNO:6的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成；来自突触素基因的所述5'UTR序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成；编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成；来自牛生长激素(bGH)基因的所述转录终止信号序列包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成；并且来自TBP基因内含子的所述序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成。
E84.根据E82至E83所述的AAV载体，其中所述第一AAV2 ITR和所述第二AAV2 ITR各自包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列或者所述序列各自的互补序列或反向互补序列。
E85.根据E82至E84所述的AAV载体，其中所述载体的所述核苷酸序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:19的核苷酸序列或其反向互补序列。
E86.根据E1至E85所述的AAV载体，其中所述载体的长度等于或小于5千碱基。
E87.根据E1至E86所述的AAV载体，其中所述载体的长度等于或小于4千碱基。
E88.一种AAV载体，所述AAV载体包含AAV衣壳和根据E1至E87所述的AAV载体，其中所述载体被所述衣壳包裹。
E89.根据E88所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳至少部分地是亲神经元的。
E90.根据E89所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳能够跨越非人灵长类动物或人中的血脑屏障(BBB)。
E91.根据E90所述的AAV载体，其中与AAV9衣壳相比，所述AAV衣壳至少同样有效地或更有效地跨越所述BBB。
E92.根据E89至E90所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳选自由以下各项组成的组：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-rh.10、AAVv66、AAV-PHP.B、AAV-PHP.B/eB、AAV PHP.eB、AAV PHP.S、AAV-DJ、MNM008、MNM004、9P31、9P801、AAV-F、AAV-S、CAP-B10、CAP-B22、PHP.V1、AAV9-retro、T2 3Y+T+dH、AAV8 THR、AAV2.5、AAV-B1、AAV-AS、AAV-BR1、AAVSCH9、AAV4.18、AAV2-retro、AAV2 HBKO、AAV-TT和AAV-801。
E93.根据E89至E92所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳是AAV-801衣壳，并且包含由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的VP3蛋白。
E94.根据E93所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳还包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的VP1蛋白或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的VP2蛋白。
E95.根据E88至E94所述的AAV载体，其中所述载体是单链DNA基因组。
E96.根据E88至E94所述的AAV载体，其中所述载体是自身互补DNA基因组。
E97.根据E95至E96所述的AAV载体，其中所述载体为正极性。
E98.根据E95至E96所述的AAV载体，其中所述载体为负极性。
E99.一种AAV载体，所述AAV载体包含包裹AAV载体的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是AAV-801衣壳，并且其中所述载体的所述核苷酸序列包含以下序列或由以下序列组成：SEQID NO:17的核苷酸序列或其反向互补序列。
E100.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据E88至E100所述的AAV载体和药学上可接受的赋形剂。
E101.一种预防或治疗人类受试者中由人PGRN多肽缺乏引起的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的根据E1至E100所述的AAV载体或组合物，以有效地增加所述受试者的至少一种生物流体、组织或细胞中PGRN多肽或其变体的量。
E102.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑脊液(CSF)中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的CSF中内源PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如6ng/mL。
E103.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的脑中PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
E104.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脊髓中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的脊髓中PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
E105.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的血清中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的血清中PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
E106.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中双(单酰甘油)磷酸酯(BMP)的量增加至健康人的脑中BMP的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中所述BMP可以是任何种类的BMP，诸如BMP 18:1/18:1或BMP 22:6/22:6。
E107.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的β-氨基己糖苷酶(HexA)酶活性降低至治疗前所述HexA酶活性的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
E108.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的β-半乳糖苷酶(β-Gal)酶活性降低至治疗前所述β-Gal酶活性的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
E109.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的TDP43片段化降低至治疗前TDP43片段化的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
E110.根据E101所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的脂褐素水平降低至治疗前所述脂褐素水平的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
E111.一种降低人类受试者中由人PGRN多肽缺乏引起的至少一种症状或体征的频率或严重度的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的根据E1至E100所述的AAV载体或组合物，以有效地降低此类症状或体征的频率或严重度。
E112.根据E111所述的方法，其中所述症状或体征是额颞叶变性(FTLD)的特征，包括例如FTLD-TDP A型。
E113.根据E112所述的方法，其中所述症状或体征是脑区萎缩，所述脑区选自由以下各项组成的组：额叶、前颞叶、内侧颞叶、后颞叶、眶额叶皮层、前扣带回、下顶叶、纹状体和丘脑。
E114.根据E112所述的方法，其中所述症状或体征是行为变异额颞叶痴呆(BV-FTD)的行为变化特征。
E115.根据E112所述的方法，其中所述症状或体征是非流利性变异型原发性进行性失语(NFV-PPA)的行为变化特征。
E116.根据E114或E115所述的方法，其中所述行为变化选自由以下各项组成的组：找词障碍、言语失用、语法缺失、对证命名障碍、单字理解障碍、音韵错误、单词重复错误、句子重复错误、句子理解错误、表层失读、妄想和幻觉。
E117.根据E112所述的方法，其中所述症状或体征是帕金森综合征或皮质基底综合征(CBS)的特征。
E118.根据E101至E117所述的方法，其中所述受试者被诊断患有额颞叶变性(FTLD)或额颞叶痴呆(FTD)。
E119.根据E101至E118所述的方法，其中所述受试者中的PGRN多肽缺乏由编码PGRN多肽的GRN基因中的纯合或杂合突变引起，所述突变相对于健康人降低PGRN多肽的量或活性。
E120.一种预防或治疗人类受试者的额颞叶痴呆的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的根据E1至E100所述的AAV载体或组合物，以有效地预防或治疗所述受试者的额颞叶痴呆。
E121.根据E101至E120所述的方法，其中所述AAV载体的所述有效量是范围为1×1010至1×1015个载体/千克(vg/kg)受试者体重的剂量。
E122.根据E101至E121所述的方法，其中向所述受试者经脑室内施用所述AAV载体或组合物。
E123.根据E101至E121所述的方法，其中向所述受试者经鞘内施用所述AAV载体或组合物。
E124.根据E101至E121所述的方法，其中向所述受试者经静脉内施用所述AAV载体或组合物。
E125.根据E1至E100所述的AAV载体在制造用于治疗或预防人类受试者的额颞叶痴呆的药剂中的用途。
E126.一种DNA质粒，所述DNA质粒包含根据E1至E87所述的AAV载体的所述核苷酸序列。
E127.一种用于AAV载体产生的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据E126所述的DNA质粒。
E128.根据E127所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是HEK293细胞。
E129.根据E127至E128所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码AAV Rep蛋白的基因，诸如包含在DNA质粒中的基因。
E130.根据E127至E129所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码AAV VP1衣壳蛋白的基因，诸如包含在DNA质粒中的基因。
E131.根据E127至E130所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码病毒辅助因子的基因，诸如包含在DNA质粒中的基因。
E132.一种制备AAV载体的方法，所述方法包括：在足以允许产生AAV载体的条件下温育根据E131所述的宿主细胞，并纯化由此产生的所述AAV载体。
E133.一种通过根据E132所述的方法产生的AAV载体。
附图说明
图1.人His标记的全长PGRN和PGRNΔ3蛋白与固定的人分拣蛋白受体(SORT1)和人鞘脂激活蛋白原(PSAP)结合的Biacore传感图。分图A示出了全长PGRN与SORT1的结合。分图B示出了全长PGRN和PGRNΔ3与PSAP的结合(分别在顶部和底部)，而分图C示出了与来自替代来源的PSAP的类似结合。
图2A.从人iPSC细胞分化的运动神经元中编码人前颗粒蛋白的mRNA的水平，该人iPSC细胞利用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN蛋白的AAVDJ载体转导。
图2B.在从人iPSC细胞分化的运动神经元的条件培养基中测量的前颗粒蛋白水平，该人iPSC细胞利用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN蛋白的AAVDJ载体转导。
图3A.从人iPSC细胞分化的皮层谷氨酸能神经元中编码人前颗粒蛋白的mRNA的水平，该人iPSC细胞利用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN蛋白的AAV6载体转导。
图3B.在从人iPSC细胞分化的皮层谷氨酸能神经元的条件培养基中测量的前颗粒蛋白水平，该人iPSC细胞利用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN蛋白的AAV6载体转导。还示出了来自相关实验的结果，其中谷氨酸能神经元从来自人FTD患者的iPSC细胞分化，然后利用用于表达人Δ3截短的PGRN蛋白的AAV6载体转导。
图4.与未处理的对照细胞和用对照载体AAV801-Luc转导的神经元相比，在由AAV801-PGRNΔ3载体转导后，由来源于iPS细胞的谷氨酸能神经元释放到培养基中的人PGRNΔ3蛋白浓度。统计学分析采用单因素方差分析检验，随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P值****：<0.0001。
图5.谷氨酸能神经元分化的iPSC细胞的裂解物中的β-氨基己糖苷酶酶活性。左侧，来自未处理的以及用对照载体AAV801-Luc和表达GRN转基因的载体AAV801-PGRNΔ载体转导的健康iPSC细胞的对照神经元的结果。右侧，来自未处理的以及用AAV801-Luc和AAV801-PGRNΔ载体转导的FTD iPSC细胞的神经元的结果。统计学分析采用双因素方差分析检验，随后使用多重比较检验进行事后分析。P值***：＝<0.0001；***：＝0.0004；ns：不显著。
图6A.向新生小鼠经ICV施用的用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAV9载体在脑组织中的转导效率。
图6B.在施用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAV9载体4周后，在来自新生小鼠的CSF中测量的前颗粒蛋白水平。
图6C.在施用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAV9载体4周后，在来自新生小鼠的CSF中测量的前颗粒蛋白水平。将数据归一化至样品中内源小鼠PGRN的量。
图6D.在施用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAV9载体4周后，在来自新生小鼠的血清中测量的前颗粒蛋白水平。
图7A.在施用用于表达绿色荧光蛋白的阴性对照AAV9载体4周后，通过免疫组织化学在来自新生小鼠的脑切片中检测到的前颗粒蛋白。
图7B.在施用用于表达人全长PGRN的AAV9载体4周后，通过免疫组织化学在来自新生小鼠的脑切片中检测到的前颗粒蛋白。
图7C.在施用用于表达人Δ3截短的PGRN的AAV9载体4周后，通过免疫组织化学在来自新生小鼠的脑切片中检测到的前颗粒蛋白。
图8A.向6月龄小鼠经ICV施用的用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAV1、AAVDJ和AAV9载体在脑组织中的转导效率。
图8B.当小鼠为6月龄时，在施用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAV1、AAVDJ和AAV9载体3个月后，在来自小鼠的CSF中测量的前颗粒蛋白水平。
图8C.当小鼠为6月龄时，在施用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAV9载体6个月后，在来自小鼠的CSF中测量的前颗粒蛋白水平。
图9A.向6周龄小鼠静脉内施用的用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAVPHP.B载体在脑组织中的转导效率。
图9B.当小鼠为6周龄时，在施用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAVPHP.B载体4周后，在来自小鼠的脑组织中测量的前颗粒蛋白水平。
图9C.当小鼠为6周龄时，在施用用于表达人全长和Δ3截短的PGRN的AAVPHP.B载体4周后，在来自小鼠的CSF中测量的前颗粒蛋白水平。
图10.当测试动物为6月龄时，在施用用于表达绿色荧光蛋白的阴性对照AAV9载体3个月后，来自小鼠的海马区(包括CA3)的显微照片。左上显微照片示出了人前颗粒蛋白的阴性染色。左下显微照片示出了内源小鼠Iba-1(小胶质细胞活化的标志物)的阴性染色。右显微照片通过H&E染色示出了完整的组织细胞结构。
图11.当测试动物为6月龄时，在施用人全长PGRN的AAV9载体3个月后，来自小鼠的海马区(包括CA3)的显微照片。左上显微照片示出了人前颗粒蛋白的阳性和局灶性染色。左下显微照片示出了内源小鼠Iba-1的阳性染色。右显微照片通过H&E染色示出了减少的细胞构成。
图12.当测试动物为6月龄时，在施用人Δ3截短的PGRN的AAV9载体3个月后，来自小鼠的海马区(包括CA3)的显微照片。左上显微照片示出了人前颗粒蛋白的阳性和弥漫性染色。左下显微照片示出了内源小鼠Iba-1没有染色或染色极少。右显微照片通过H&E染色示出了正常的细胞构成。
图13A.从经由脑室内(ICV)递送途径向一个半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠收获的肝脏样品中的载体拷贝(VGC)数。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn-/-KO小鼠用作对照。将VGC数归一化至细胞基因组DNA的量(μggDNA)。
图13B.从经由ICV递送途径向一个半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠收获的脑样品中的载体拷贝(VGC)数。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn-/-KO小鼠用作对照。将VGC数归一化至细胞基因组DNA的量(μg gDNA)。粉红点表示来自从注射的半球收获的脑样品的结果，并且黑点表示来自对侧半球的数据。
图13C.从经由ICV递送途径向一个半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠收获的脑样品中的hGRNΔ3mRNA数量。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn-/-KO小鼠用作对照。将RNA水平归一化至从管家基因表达的RNA量。粉红点表示来自从注射的半球收获的脑样品的结果，并且黑点表示来自对侧半球的数据。
图13D至图13F.来自经由ICV递送途径向一个半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠的流体和组织样品中的PGRNΔ3蛋白浓度。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn-/-KO小鼠用作对照。粉红点表示来自从注射的半球获取的流体和组织样品的结果，并且黑点表示来自对侧半球的数据。图13D示出了脑脊液(CSF)样品的结果。图13E示出了血清样品的结果。图13F示出了脑组织样品的结果。
图14A至图14B.从经由ICV递送途径向一个半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠收获的脑样品中的BMP 18:1/18:1种类(图14A)和BMP 22:6/22:6种类(图14B)的浓度。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn-/-KO小鼠用作对照。粉红点表示来自从注射的半球收获的脑样品的结果，并且黑点表示来自对侧半球的数据。统计学分析采用单因素方差分析，随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P值****：<0.0001；**：<0.01，*：<0.05；ns：不显著。
图15A至图15B.从经由ICV递送途径向一个半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠收获的脑样品中的β-氨基己糖苷酶(图15A)和β-半乳糖苷酶(图15B)的酶活性。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn-/-KO小鼠用作对照。粉红点表示来自从注射的半球收获的脑样品的结果，并且黑点表示来自对侧半球的数据。统计学分析采用单因素方差分析，随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P值****：<0.0001；**：<0.01；ns：不显著。
图16.来自经由ICV递送途径向一个半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠以及施用了PBS的年龄匹配的对照野生型小鼠和Grn-/-KO小鼠的脑样品中的TDP43片段化。使用半定量蛋白质印迹分析将片段化估计为全长TDP43蛋白与其20kDa片段的染色强度的比率，其中较低的比率指示更多的片段化。统计学分析采用单因素方差分析，随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P值*：<0.05；ns：不显著。
图17A至图17E.从经由ICV递送途径向一个右半球中施用了1e11 vg AAV9-PGRNΔ3载体的Grn-/-KO小鼠收获的脑样品的不同区域中的脂褐素积累的定量。通过相同途径施用了对照载体AAV9-Luc的年龄匹配的野生型小鼠和施用了PBS的Grn-/-KO小鼠用作对照。图17A示出了CA2/3海马区的结果。图17B示出了整个海马体的结果。图17C示出了前额叶皮层的结果。图17D示出了丘脑的结果。图17E示出了整个脑的结果。指示“右”的图例是指从注射了GRN载体的相同半球收集的数据，而“左”是指对侧半球。
图18A.从经由静脉内(IV)递送途径施用了AAVPHP.B-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或1e13 vg/kg)的Grn缺陷型敲入(KI)小鼠收获的肝脏样品中的载体拷贝(VGC)数。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的Grn缺陷型KI小鼠用作对照。将VGC数归一化至细胞基因组DNA的量(μggDNA)。统计学分析采用单因素方差分析，随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P值****：<0.0001；*：<0.05；ns：不显著。
图18B.从经由静脉内(IV)递送途径施用了AAVPHP.B-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或1e13 vg/kg)的Grn缺陷型敲入(KI)小鼠收获的脑样品中的载体拷贝(VGC)数。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的Grn缺陷型KI小鼠用作对照。将VGC数归一化至细胞基因组DNA的量(μggDNA)。统计学分析采用单因素方差分析，随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P值****：<0.0001；*：<0.05；ns：不显著。
图18C.从经由静脉内(IV)递送途径施用了AAVPHP.B-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或1e13 vg/kg)的Grn缺陷型KI小鼠收获的脑样品中的hGRNΔ3mRNA数量。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn缺陷型KI小鼠用作对照。将RNA水平归一化至从管家基因表达的RNA量。统计学分析采用单因素方差分析，随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P值****：<0.0001；*：<0.05；ns：不显著。
图18D至图18F.来自经由静脉内(IV)递送途径施用了AAVPHP.B-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或1e13 vg/kg)的Grn缺陷型KI小鼠的流体和组织样品中的PGRNΔ3蛋白浓度。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn缺陷型KI小鼠用作对照。图18D示出了脑脊液(CSF)样品的结果。图18E示出了血清样品的结果。图18F示出了脑组织样品的结果。统计分析与图18C所述的相同。
图18G至图18H.从经由静脉内(IV)递送途径施用了AAVPHP.B-PGRNΔ3载体(5e12vg/kg或1e13 vg/kg)的Grn缺陷型KI小鼠收获的脑样品中的BMP 18:1/18:1种类(图18G)和BMP 22:6/22:6种类(图15H)的浓度。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn缺陷型KI小鼠用作对照。统计分析与图18C所述的相同。
图18I.从经由静脉内(IV)递送途径施用了AAVPHP.B-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或1e13 vg/kg)的Grn缺陷型KI小鼠收获的脑样品中的β-氨基己糖苷酶的酶活性。通过相同途径施用了PBS的年龄匹配的野生型小鼠和Grn缺陷型KI小鼠用作对照。统计分析与图18C所述的相同。
图19A.在经由静脉内(IV)递送途径施用AAV801-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或2e13vg/kg)或AAV9-PGRNΔ3载体(2e13 vg/kg)14天和30天后，来自食蟹猴的CSF样品中的PGRNΔ3蛋白浓度。两只动物接受每种载体和剂量。在接受低剂量AAV801-PGRNΔ3的一只测试动物中以及在接受2e13 vg/kg AAV9-PGRNΔ3的两只测试动物中，PGRNΔ3蛋白是不可检测的。标记为“目标”的虚线指示在人类中天然存在的前颗粒蛋白水平。
图19B.在IV施用AAV801-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或2e13 vg/kg)或AAV9-PGRNΔ3载体(2e13 vg/kg)之前，以及在治疗后第3、7、14、21和28天，来自食蟹猴的血清样品中的PGRNΔ3蛋白浓度。两只动物接受每种载体和剂量。
图20.在IV施用AAV801-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或2e13 vg/kg)或AAV9-PGRNΔ3载体(2e13 vg/kg)28天后，从食蟹猴收获的脑和其他组织样品中的载体拷贝(VGC)数。对多个脑区、脊髓及外周神经和非神经组织取样。将VGC数归一化至细胞基因组DNA的量(μggDNA)。
图21.在IV施用AAV801-PGRNΔ3载体(5e12 vg/kg或2e13 vg/kg)或AAV9-PGRNΔ3载体(2e13 vg/kg)28天后，从食蟹猴收获的脑和其他组织样品中的hGRNΔ3mRNA数量。对多个脑区、脊髓及外周神经和非神经组织取样。将RNA水平归一化至从管家基因表达的RNA量。
图22A至图22G.通过在IV施用2e13 vg/kg AAV801-PGRNΔ3载体28天后对来自雄性食蟹猴的脑和脊髓组织样品进行原位杂交而显现的PGRNΔ3转基因表达的代表性图像。图22A示出了运动皮层的结果。图22B示出了内嗅皮层的结果。图22C示出了海马锥体细胞的结果。图22D示出了丘脑的结果。图22E示出了齿状核的结果。图22F示出了脊髓的结果。图22G示出了来自阴性对照动物的丘脑的结果。在这些图像中，mRNA以红色标记，并且细胞核以蓝色标记。
图23.与内源猕猴前颗粒蛋白的水平相比，在IV施用AAV801-PGRNΔ3载体(5e12vg/kg或2e13 vg/kg)或AAV9-PGRNΔ3载体(2e13 vg/kg)28天后，从食蟹猴收获的脑和其他组织样品中的PGRNΔ3蛋白浓度。对多个脑区、脊髓及外周神经和非神经组织取样。
具体实施方式
以下讨论涉及各种实施方案。本公开不旨在指代任何特定实施方案或以其他方式限制本公开的范围。尽管这些实施方案中的一个或多个实施方案可能是优选的，但是所公开的实施方案不应被解释为或以其他方式用于限制本公开(包括权利要求)的范围。此外，本领域技术人员应当理解，以下描述具有广泛的应用，并且对任何实施方案的讨论仅意在为该实施方案的示例，而不旨在暗示本公开(包括权利要求)的范围限于该实施方案。
某些定义
如本文所用，“腺相关病毒载体”意指包含包裹载体的天然存在或非天然存在的AAV衣壳的腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒载体可缩写为“AAV载体”，并且根据上下文，可用同义术语表示，诸如“重组AAV载体”、“rAAV载体”、“rAAV”或仅“载体”。
如本文所用，“载体”意指AAV基因组，其经过修饰，既包含异源核苷酸序列，又使任何含有该载体的AAV载体不具复制能力，如通过使内源AAV rep和/或cap基因失活或缺失。
如本文所用，“异源核苷酸序列”意指从不同生物体(包括生物体)引入生物体(包括病毒)中的核苷酸序列。异源核苷酸序列的序列可与天然存在的序列相同，或者可以是其修饰形式，或者甚至是部分或完全合成的。
如本文所用，“表达盒”意指包含与调控区或元件可操作地连接的转基因的核苷酸序列，该调控区或元件用于控制转基因从DNA转录成RNA的起始和终止。
如本文所用，“转基因”意指编码至少一种多肽的核苷酸序列，和/或编码至少一种功能性RNA分子的核苷酸序列。转基因可用同义术语“感兴趣的基因”表示。
如本文所用，“宿主细胞”意指其中产生AAV载体的细胞。生产细胞和包装细胞是宿主细胞的示例。宿主细胞可以是哺乳动物或昆虫，或者来自其他生物体，无论是单细胞还是多细胞。
如本文所用，术语“纯化(purify)”以及相关术语“纯化的(purified)”和“纯化(purification)”在与AAV载体或其样品或制备物结合使用时，表示与含有该载体的起始材料和/或在旨在纯化生物产物的连续纯化步骤的某方案中的先前中间纯化步骤相比，纯度相对增加或改善，并且不需要特定的定性或定量纯度，除非另外指明。
如本文所用，“转导”意指将AAV载体的基因组引入靶细胞中。转导有别于感染，后一术语用于指将复制型腺相关病毒的基因组引入细胞中。
如本文所用，“靶细胞”意指AAV载体被设计为或打算转导的细胞，或者实验观察到被AAV载体转导的细胞，无论是在体外还是在受试者体内。
如本文所用，“受试者”意指出于预防或治疗疾病、障碍或病症的目的向其施用AAV载体的生物体。
额颞叶痴呆和额颞叶变性
额颞叶痴呆(FTD)是指一种临床综合征，其特征在于与额和颞皮层叶的选择性神经变性(额颞叶变性或FTLD)相关的语言、行为和执行功能的缺损逐渐恶化，而不是阿尔茨海默病和某些其他痴呆中常见的更普遍的神经变性。许多FTD患者的发病年龄发生在他们的四十岁至六十岁早期，其中对于年龄小于45岁的患者，患病率为10％，对于年龄在45至64岁之间的患者，患病率为60％，并且对于年龄大于64岁的患者，患病率为30％。发病后，症状逐渐恶化，并且根据FTD的亚型，存活时间为6至11年，平均为8年，尽管一些侵袭性亚型可在少至2年内导致死亡。
根据神经变性的基本模式，FTD表现出不同的神经症状，并且已定义了三种临床变异。行为变异额颞叶痴呆(BV-FTD)与早期行为和执行功能缺损相关，非流利性变异型原发性进行性失语(NFV-PPA)的典型特征在于言语、语法和单词输出的进行性缺损，并且语义变异型原发性进行性失语(SV-PPA)的特征在于语义知识和命名的进行性障碍。对FTD患者临床变异之一的诊断取决于主要的行为和语言缺损，特别是在疾病过程的早期。对BV-FTD变异的诊断需要以下至少三种行为变化：脱抑制；情感淡漠或呆滞；同情心或同理心缺失；刻板、强迫或执拗行为；口欲亢进(hyperorality)或饮食改变；以及执行功能缺损，视觉空间技能和记忆力相对保留。原发性进行性失语(PPA)变异都需要存在语言缺损，其中失语最初是最突出的。如果早期在情节记忆、视觉记忆或视觉感知技能方面存在明显缺损，或出现行为障碍，则排除PPA。然后，PPA将进一步区分为语义变异与非流利性变异。对于SV-PPA，患者会表现出对证命名和单字理解障碍以及以下至少三种与语言有关的功能缺损或能力：客体知识障碍；表层失读或书写困难；重复能力保留；以及言语表达能力保留。另一方面，NFV-PPA需要言语表达中的语法缺失或言语失用中的至少一种，并且需要复杂句子理解障碍、单字理解能力保留和客体知识保留中的至少两种。运动症状也可影响少数FTD患者。略高于12％的BV-FTD患者也会患上运动神经元疾病，并且在PPA变异型FTD患者中较不常见。约20％的FTD患者也表现出帕金森综合征症状，并且也可能出现皮质基底综合征或进行性核上性麻痹综合征的特征。
尽管其他类型的痴呆或精神疾病患者也会出现FTD的许多症状，但FTD患者的脑将表现出额叶或颞叶的特征性萎缩，其中额岛区的萎缩特别指示FTD。可使用结构神经成像方法(诸如MRI或CT)或功能方法(诸如氟脱氧葡萄糖PET、功能MRI和SPECT)来检测与FTD相关的皮层萎缩的模式。
确认FTD通常需要检查疑似病例的脑以检测与额颞叶变性(FTLD)疾病过程相关的神经病理学变化。虽然FTLD的特征通常在于额叶、前颞叶、前扣带皮层和岛叶皮层中的神经元缺失、神经胶质增生和微泡变化，但几乎所有病例都可基于检测到某些蛋白的异常沉积物的对应存在而区分为三种主要类型FTLD-tau、FTLD-TDP和FTLD-FUS，这些异常沉积物也与神经变性(neurogeneration)的某些特征模式相关。FTLD-tau占所有FTLD病例的约36％至50％，其定义是神经病理学检查中存在微管相关蛋白tau(MAPT)沉积物，并与皮克氏病、皮质基底变性和进行性核上性麻痹的FTLD亚型相关。FTLD-FUS占FTLD病例的约10％，其定义是存在肉瘤融合(FUS)蛋白的脑沉积物，并与FTD行为症状早发、无运动和语言缺损相关。FTLD-TDP最为普遍，占FTLD病例的约50％，并且其由分子量为43kDa的TAR DNA结合蛋白(TDP-43)的脑沉积物定义。
基于脑中异常蛋白沉积的模式和神经变性的特征模式，FTLD-TDP进一步区分为三种亚型A、B和C。FTLD-TDP A型与不对称背侧萎缩相关，包括额叶和颞叶(前区、内侧区和后区)、眶额叶皮层、前扣带回、下顶叶、纹状体和丘脑。FTLD-TDP B型与累及内侧和极颞叶、前岛叶、扣带和内侧前额叶皮层以及眶额叶皮层的萎缩相关，其中额叶在后区受到更严重的影响。FTLD-TDP C型与右侧或左侧优势前颞叶萎缩相关，另外累及杏仁核、海马体、眶额叶皮层和岛叶皮层。据报道，不同的FTLD-TDP亚型也与某些FTD症状相关。因此，TDP A型占NF-PPA病例的约50％，占疑似皮质基底变性病例的25％，但只占BV-FTD(伴有或不伴有运动神经元疾病)的一小部分；B型占表现出运动神经元疾病的FTD病例的约三分之二，并且占总体BV-FTD的25％；并且C型占SV-PPA或颞叶变异型BV-FTD的所有病例的约90％。Bang,J.等人,Lancet,386:1672-82,2015。
人类遗传学研究已经确定，可能多达40％的FTLD病例是家族性的，并且在三个基因9ORF72、MAPT和GRN中鉴定出突变，这些突变导致总共约60％的遗传病例。GRN基因编码前颗粒蛋白(PGRN)，其是一种参与细胞周期调节、伤口修复、轴突生长和炎症等多种功能的分泌蛋白。除其他受体外，PGRN还结合肿瘤坏死因子受体(TNFR)，这表明它具有调节TNFα或其他炎症介质引起的炎症的机制。GRN基因中的杂合功能缺失突变导致单倍剂量不足，伴有脑脊液(CSF)和血清中PGRN浓度的大幅下降。已经在GRN基因中发现超过70种导致FTD的致病突变，其中大多数是触发编码前颗粒蛋白的mRNA降解的无义突变。在约5％至20％的家族性FTD病例中，导致单倍剂量不足和PGRN产生减少的GRN突变与FTD临床综合征、脑萎缩和神经病理学的特征模式相关。如Bang等人所报道的，GRN功能缺失突变与BV-FTD、NFV-PPA、帕金森综合征和皮质基底综合征(CBS)的神经症状和体征以及不对称的神经变性模式相关，主要影响前颞叶、颞顶叶、额叶(左侧与PPA综合征更相关，并且右侧与BV-FTD症状更相关)、前扣带皮层和岛叶皮层。另外，在神经病理学检查中，具有GRN突变的FTD患者的脑通常表现出FTLD-TDP A型特有的细胞变化和TDP蛋白沉积物。
腺相关病毒(AAV)
本公开提供了由重组修饰的腺相关病毒(AAV)产生的载体。AAV载体能够通过转导将可能受转录元件和其他调控元件控制的基因递送到靶细胞中。通过向内源形式缺失或突变的靶细胞提供基因的功能性拷贝，AAV载体可用于多种疾病和障碍的基因疗法。
AAV是一种小的无包膜的、明显非致病性细小病毒，其依赖于某些其他病毒来提供其自身复制所必需的基因产物(被称为辅助因子)，这是一种使AAV非常适合用作重组载体的生物学特性。例如，腺病毒(AdV)可通过在被腺病毒和AAV共感染的细胞中提供某些腺病毒因子(诸如E1A、E1B55K、E2A和E4ORF6蛋白以及VA RNA)而用作辅助病毒。也已经鉴定了其他辅助病毒，诸如单纯疱疹病毒。AAV复制依赖于其他病毒提供的附属因子，这使得AAV被表征为一种依赖病毒。AAV病毒粒子具有两个主要的结构特征，分别被称为衣壳和基因组。衣壳是包围和保护(包裹)病毒基因组的二十面体蛋白壳，其含有在受感染细胞中病毒复制所需的基因和其他序列。
AAV基因组是含有被称为rep和cap的两个基因的单链DNA。在AAV2(一种感染人类并且在生物学上特别良好表征的天然存在的AAV)中，基因组长度为约4.7千碱基。由于来自两个启动子的转录物的选择性剪接，rep基因能够产生四种相关的多功能蛋白，被称为Rep(在AAV2中被称为Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，根据其表观分子量命名)，它们参与病毒基因表达以及基因组的复制和包装。来自控制单个cap基因的单个启动子的转录物的选择性剪接产生三种相关的结构蛋白VP1、VP2和VP3，其中总共60个结构蛋白分别以大约1:1:10的比率自组装形成病毒的二十面体衣壳。VP1是三种VP蛋白中最长的，并且在其氨基末端区域中含有VP2中不存在的氨基酸，而VP2又比VP3长，并且在其氨基末端区域中含有VP3中不存在的氨基酸。除了容纳基因组之外，衣壳蛋白还介导与靶细胞表面上的受体的特异性结合相互作用，基于此，AAV可被限制其感染某些动物物种，甚至相同类型动物内的组织的能力，这种现象被称为嗜性。例如，与肌肉或神经元细胞相比，一种类型的AAV可优先感染肝脏细胞(例如，肝细胞)。
除了rep和cap基因之外，完整的AAV基因组还具有位于其5'和3'端中的每一者处的相对较短(在AAV2中145个核苷酸)的序列元件，被称为反向末端重复序列(ITR)。ITR含有嵌套回文序列，其可通过沃森-克里克碱基配对自退火而形成T形或发夹二级结构。在AAV2中，已经证明ITR具有病毒生命周期所需的重要功能，包括将单链DNA基因组转化为基因表达所需的双链形式，以及通过Rep蛋白将单链AAV基因组包装进衣壳组装体。
已经在不同物种中发现了许多天然存在的AAV类型。曾经有一段时间，只从生物样品中分离出六种类型的灵长类动物AAV(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5和AAV6)，其中前五种在结构上有足够差别，可基于抗体交叉反应性实验分类为不同的血清型。后来，通过使用靶向先前发现的AAV的cap基因中的高度保守区的引物对来自恒河猴的DNA进行PCR扩增，发现了两种新型AAV，被称为AAV7和AAV8(Gao,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:11854-9,2002)。随后，使用类似的方法从人和非人灵长类动物组织中克隆了许多新型AAV，极大地扩展了AAV衣壳蛋白序列的范围(Gao,G.等人,J.Virol.,78:6381-8,2004)。许多AAV衣壳蛋白序列彼此高度类似，或与先前鉴定的AAV高度类似，并且虽然通常被称为不同的AAV“血清型”，但如果通过抗体交叉反应性进行测试，并非所有此类衣壳都必然预期可在免疫学上区分开。在血清学上不能与确定的血清型区分但含有具有不同氨基酸序列的衣壳蛋白的AAV或AAV衣壳，最好被称为已知血清型的变体。已经发现由天然和非天然存在的衣壳蛋白制成的许多衣壳可用于产生AAV基因疗法载体。
在研究AAV2时证实，在结合细胞表面上的一个或多个受体分子后，AAV病毒颗粒通过内吞作用进入细胞。在达到溶酶体的低pH时，衣壳蛋白经历构象变化，从而允许衣壳逃逸到胞质溶胶中，然后被转运到细胞核中。一旦到达那里，衣壳就会解体，释放出基因组，在细胞DNA聚合酶的作用下，从3'端的ITR开始合成第二DNA链，该ITR在自退火后充当引物。然后rep和cap基因可开始表达，随后新病毒颗粒形成并从细胞中释放出来。
AAV载体
AAV结构和生命周期的相对简单性，以及还不知道其对人类有致病性的事实，启发了研究人员对AAV进行工程化并研究其是否可从病毒转化为用于基因疗法的重组载体。简而言之，这是通过以下方式完成的：将AAV2的整个基因组(包括两个ITR)克隆到质粒中，将rep和cap基因移除到单独的质粒中，并将它们替换为包含控制编码蛋白的转基因的启动子的异源基因表达盒。因此，载体中保留的唯一病毒基因组序列是ITR，因为它们在包装和基因表达中具有关键功能，并且没有ITR，就不能产生AAV载体，也无法在转导靶细胞后表达转基因。最后，为了避免需要与辅助病毒共感染(这是AAV病毒粒子复制所必需的)，将所谓的辅助因子(诸如，在AdV的情况下，E1A、E1B55K、E2A、E4ORF6和VA RNA辅助因子)的基因克隆到第三质粒中。
当这三个质粒(有时被称为转基因、rep/cap和辅助质粒)一起转染到哺乳动物宿主细胞中时，Rep和衣壳蛋白以及辅助病毒因子就从它们相应的质粒表达。然后这些基因产物在宿主细胞中发挥作用，以将载体从其序列所在的质粒复制成单链DNA，组装衣壳，并将单链基因组包装进衣壳中，从而形成载体。然后可从宿主细胞中纯化载体。由于rep和cap基因以反式形式存在于不同的质粒上，超出了两侧是ITR的其通常范围，因此它们没有被包装进载体中。因此，虽然以这种方式产生的AAV载体能够与靶细胞结合并将其基因组内的表达盒输送到靶细胞中，但它们不能复制并产生新的载体颗粒。
如果载体按预期发挥作用，则在转导后，表达盒将具有转录活性，并在靶细胞中产生由转基因编码的基因产物。AAV载体是高度通用的，因为可设计出各种构型的包含受不同功能序列和调控元件控制的多种转基因的载体，并且这些载体可与具有不同嗜性和其他特性的多种天然存在的和工程化的衣壳配对。因此，可产生许多类型的基因产物，并在一定程度上控制转导的细胞类型和产生的基因产物的量。
AAV载体包含由AAV衣壳包裹的载体。在一些实施方案中，AAV载体包含至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)和在转导的靶细胞中存在或表达时具有期望功能的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，异源核苷酸序列源自不同类型的病毒，或完全不同类型的生物体，诸如动物、植物、原生生物、真菌、细菌、古细菌或其他类型的生物体。在一些实施方案中，异源核苷酸序列替换一些或全部天然AAV rep和/或cap基因，使得载体不能在转导的靶细胞中表达功能性Rep或VP蛋白。在一些实施方案中，载体的整个序列由除位于基因组末端的AAV反向末端重复序列之外的异源核苷酸序列组成。
本公开的AAV载体的基因组(包含ITR)的长度可以是任何合适的长度，其通常(但不一定)不会超过特定AAV衣壳的平均基因组大小包装能力，这可在特定AAV载体的设计和产生中选择。因此，在一些非限制性实施方案中，本公开的AAV载体的基因组(包含ITR)的长度可以是至少或约1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100或5200个核苷酸(或碱基对(在基因组序列体现在用于载体产生的质粒中时))，或介于任何前述具体列举值之间的整数值或涵盖任何前述具体列举值的范围。
表达盒
在一些实施方案中，异源核苷酸序列包含表达盒或由表达盒组成，该表达盒所含的转基因与用于控制转基因从DNA到RNA的转录起始的启动子和任选的一个或多个增强子可操作地连接，并且与用于终止转基因到RNA的转录的转录终止元件(诸如多聚腺苷酸化信号序列)可操作地连接。AAV载体可包含多于一个转基因，它们作为一个转录单元的一部分，或者各自为其自身转录单元的一部分。如后面的章节所述，表达盒还可包含被设计成影响转录、转录物稳定性、翻译或其他功能的附加序列元件。
正如AAV载体通常所设计的，表达盒的结构和基因组整体受到衣壳的包装能力的限制，因此转基因在与载体功能所需的基因组中的所有其他元件(诸如转录控制元件和ITR)组合时的长度在AAV2的情况下不超过大约5千碱基，尽管其他类型的衣壳可能具有更大或更小的包装限制。然而，在大小限制内，可非常灵活地选择转基因、ITR以及载体发挥其预期功能所需的其他元件。
出于基因疗法的目的，转基因可以是任何基因，其产物将被理解为预防或治疗(尽管不一定治愈)需要预防或治疗的受试者的任何疾病、障碍或病症。在一些实施方案中，基因疗法旨在预防或治疗一种疾病、障碍或病症，其特征在于受试者体内天然存在的基因所产生的产物量异常低或甚至不存在，诸如可能由于功能缺失突变而发生。关于此类实施方案，转基因可以是这样的转基因，其旨在通过在表达时向受试者的至少一些细胞提供相同或类似的基因产物来补偿受试者的缺陷基因。非限制性示例将是一种载体，其被设计成表达凝血因子IX的功能形式以用于血友病B的基因疗法，血友病B由天然因子IX基因中的功能缺失突变引起。然而，在其他实施方案中，转基因可以是这样的转基因，其旨在抵消靶细胞中的有害功能获得突变的影响。在一些实施方案中，转基因可编码转录激活因子以提高产生期望基因产物的内源基因的活性，或相反，可编码转录阻遏因子以降低产生有害基因产物的内源基因的活性。
在一些实施方案中，转基因可编码多肽，或编码具有不同于编码蛋白的功能的RNA分子，诸如调控性非编码RNA分子(例如，微RNA、小干扰RNA、piwi作用RNA、增强子RNA、长非编码RNA等)。转基因中的蛋白编码序列可经过密码子优化，并且翻译起始位点(例如，Kozak序列)可经过修饰以增加或减少其起始翻译的倾向。在一些实施方案中，编码氨基酸序列的转基因可含有一个或多个开放阅读框，和/或含有一个或多个剪接供体和受体位点对以允许不同信使和来自此类信使的多肽序列的选择性剪接。编码蛋白的转基因还包含一个或多个终止密码子以终止多肽链的翻译。
在一些实施方案中，载体可被设计用于编辑或以其他方式修饰靶细胞的基因组的目的。例如，载体可包含表达盒或转基因，其两侧是同源臂，旨在促进载体和靶细胞基因组之间的同源重组。在另一个示例中，载体可被设计成通过表达引导RNA(gRNA)和/或能够结合gRNA并裂解由gRNA靶向的DNA序列的核酸内切酶(诸如Cas9)或相关核酸内切酶(诸如SaCas9)来进行CRISPR基因编辑。
PGRN转基因
在一些实施方案中，本公开的AAV载体包含含有表达盒的载体，该表达盒包含前颗粒蛋白(缩写为“PGRN”)或其变体(包括人前颗粒蛋白或其变体)的编码序列(转基因)。在一些实施方案中，前颗粒蛋白与593个氨基酸长的88kDa人前颗粒蛋白前体蛋白(NCBI参考序列：NP_002078.1或SEQ ID NO:16)相同，后者包含17个氨基酸长的信号肽(SEQ ID NO:18)和576个氨基酸长的成熟颗粒蛋白多肽(SEQ ID NO:18)。在一些实施方案中，在信号肽裂解之后，成熟颗粒蛋白多肽被进一步裂解成多种大约6kDa的肽，这些肽具有多效功能，具体取决于细胞或生物体背景。在其他实施方案中，表达盒包含非人前颗粒蛋白的编码序列。
在又其他实施方案中，PGRN蛋白可包含人PGRN蛋白的任何天然存在的变体，这些变体不含有致病突变，诸如过早翻译终止密码子，或大幅损害PGRN活性和/或蛋白稳定性的氨基酸置换、插入或缺失。在又进一步的实施方案中，PGRN蛋白可包含保留PGRN活性的人PGRN蛋白的工程化变体，诸如嵌合变体和具有氨基酸置换、插入或缺失的变体，这些氨基酸置换、插入或缺失被设计成调节PGRN活性，添加或去除糖基化位点，添加或去除或改变通常从成熟颗粒蛋白裂解的颗粒蛋白的内部裂解位点，或用于其他翻译后修饰的位点，或改变PGRN结构或功能的其他方面。在一些实施方案中，天然信号肽序列被来自类似或完全不同的分泌蛋白的信号肽序列修饰或完全替换。
在某些实施方案中，PGRN蛋白变体是羧基末端截短变体，其中与全长野生型人前颗粒蛋白氨基酸序列(诸如由SEQ ID NO:16提供的氨基酸序列)相比，通常存在于全长野生型人前颗粒蛋白中的一个或多个氨基酸发生缺失，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个氨基酸从前颗粒蛋白羧基末端缺失。在一些实施方案中，PGRN蛋白变体已经缺失了原本存在于全长野生型人PGRN蛋白中的最后3个羧基末端氨基酸(QLL)，并且具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。后一种PGRN蛋白变体在本文中有时被称为“PGRNΔ3”或“PGRNDel3”。在一些实施方案中，与全长野生型PGRN蛋白相比，PGRN蛋白变体(诸如PGRNΔ3)与被称为分拣蛋白1(SORT1)的受体蛋白的特异性结合减少或没有特异性结合。在一些实施方案中，PGRNΔ3变体在通过病毒载体递送后经历进一步的转录后和翻译后修饰。已知会发生附加末端裂解，例如，包括产生PGRNΔ4蛋白变体的羧基末端单氨基酸裂解。其他已知的转录后和翻译后加工事件可进一步修饰PGRNΔ3载体提供的蛋白，包括但不限于糖基化、异构化、完全或部分降解、氨基酸序列的裂解(例如，一个或多个信号序列的裂解)、分子(例如，肽“标签”或功能性或信号传导序列)的添加等。
在某些其他实施方案中，与全长野生型人前颗粒蛋白氨基酸序列(诸如由SEQ IDNO:16提供)相比，PGRN蛋白变体包含至少一个氨基酸置换突变，诸如与其野生型对应物相比，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个氨基酸发生改变。在这些实施方案中的一些实施方案中，置换突变可以是保守氨基酸置换，其中通常存在的氨基酸被具有类似物理化学和/或大小特征的R基团的另一氨基酸置换。另选地，在其他实施方案中，置换突变可以是非保守氨基酸置换，其中通常存在的氨基酸被具有非类似物理化学和/或大小特征的R基团的另一氨基酸置换。
为了用于本公开的AAV载体，编码PGRN蛋白的核苷酸序列可以是能够在期望被载体转导的细胞类型(诸如神经元)中编码期望的PGRN蛋白的任何核苷酸序列。在一些实施方案中，编码PGRN蛋白的核苷酸序列(即，转基因)与编码PGRN的天然存在的基因中存在的核苷酸序列(即，此类基因的外显子)相同，或者是与从此类基因转录的mRNA序列相对应的DNA序列。在一些实施方案中，其中PGRN蛋白是全长野生型人前颗粒蛋白，编码核苷酸序列由NCBI参考序列：NM_002087.4的核苷酸41至1822(包含终止密码子)提供或由SEQ ID NO:15提供。在一些实施方案中，其中PGRN蛋白是PGRNΔ3蛋白变体，编码核苷酸序列由SEQ IDNO:8提供。
在其他实施方案中，编码PGRN蛋白的核苷酸序列与天然存在的核苷酸序列相比可在一个或多个核苷酸位置处不同，并且由于遗传密码的冗余性，仍然编码与天然存在的基因序列相同的PGRN蛋白，或者编码PGRN蛋白变体，除了多肽相对于野生型PGRN的差异外，该变体由天然存在的基因序列编码。在一些实施方案中，可有意地修饰编码PGRN蛋白的核苷酸序列以影响其在转导细胞中的功能，诸如消除能够刺激先天免疫应答的序列基序、消除隐性剪接接头、消除替代起始密码子、增加对应mRNA的稳定性和/或增加mRNA翻译成蛋白的速率。在其他实施方案中，编码PGRN蛋白的核苷酸序列可以是无内含子的，或可包含一个或多个中断编码序列的内含子，但这些内含子会被转导细胞中的剪接装置去除，以便允许翻译期望的PGRN蛋白。
在本公开的AAV载体的一些实施方案中，转基因包含与由特定核苷酸参考序列编码的蛋白序列高度类似或相同的蛋白序列，但是其中转基因和参考序列的核苷酸序列不相同，而是共享特定同一性百分比，差异对应于不改变对应氨基酸的密码子内位置(即，是沉默改变)。例如，在一些实施方案中，转基因包含编码与SEQ ID NO:15相同的全长PGRN蛋白的序列或由该序列组成，并且具有与SEQ ID NO:15至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的核苷酸序列；或包含编码与SEQ ID NO:8相同的PGRNΔ3蛋白变体的序列或由该序列组成，并且具有与SEQ ID NO:8至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的核苷酸序列。
可通过本领域已知的任何方法来确定参考序列与转基因之间的核苷酸序列同一性的百分比。例如，在一些实施方案中，可将参考序列和转基因的核苷酸序列(或由它们编码的氨基酸序列)在其整个长度上进行比对和比较，并使用计算机算法计算核苷酸序列同一性百分比。用于对核苷酸序列进行全局比对和比较的示例性算法是Needleman-Wunsch算法。然而，在其他实施方案中，可使用局部比对算法，诸如BLAST算法(Needleman,S.和Wunsch,C.,J.Mol.Biol.,48:443-53,1970；States D.等人,Methods,3:66-70,1991；Pearson,W.,Curr.Protoc.Bioinformatics,43:3.5.1–3.5.9,2013)。在一些实施方案中，在参考序列和转基因序列中的一个序列或另一序列含有非编码序列(诸如内含子或终止密码子)的情况下，则忽略非编码序列，并且只对参考序列和转基因序列内的蛋白编码序列进行比对和比较。一旦建立了参考序列和转基因之间的最佳全局比对，就可计算比对序列之间相同核苷酸的百分比。
如本领域中已知的，序列比较算法可允许用户定义置换得分和空位罚分，这些参数用于计算可进行的许多可能比对的比对得分。然后，具有最高得分的比对被认为是最佳的。置换得分涉及为匹配分配数值奖励，并为不匹配分配罚分。相应匹配和不匹配得分的示例性集合包括1、-1；1、-2；1、-3；1、-4；2、-3；4、-5，但其他集合也是可能的。空位成本涉及为空位的存在(核苷酸的插入或缺失)分配数值罚分以及为形成后的空位宽度扩展分配罚分。增加空位成本将产生所引入的空位数量减少的比对。空位存在和扩展的相应成本的示例性集合包括0、-4；-2、-2；-2、-4；-3、-3；-4、-2；-4、-4；-5、-2；-6、-2，但其他集合也是可能的。在一些实施方案中，参考序列和转基因序列的比对和比较是使用随进行分析的计算机软件或算法一起提供的默认置换得分和空位罚分以及任何其他默认设置进行的。
信号肽序列
在一些实施方案中，本公开的AAV载体包含含有表达盒的载体，该表达盒包含具有成熟颗粒蛋白多肽序列的前颗粒蛋白的编码序列(转基因)，但是其中天然存在于野生型人前颗粒蛋白中的信号肽被来自人或另一物种的不同分泌多肽的信号肽(即，异源信号肽序列)替换，例如以提高在转导细胞中产生的PGRN(或其变体)的分泌速率，或出于一些其他原因，诸如降低的免疫原性。在一些实施方案中，成熟颗粒蛋白多肽包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其缺少最后3个氨基酸(QLL)的羧基末端截短。
本领域已知的有效地促使蛋白从合成其的细胞中分泌出来的任何信号肽序列均可与本公开的AAV载体结合使用。在一些实施方案中，在分泌过程中，细胞会从蛋白中去除这些信号肽。许多异源分泌信号肽是本领域已知的，并且可用于促进用本公开的AAV载体转导的细胞(诸如神经元或其他脑细胞)分泌PGRN(或其变体)。
在一些实施方案中，信号肽序列可源自或来源于由中枢或外周神经系统中的神经元或其他细胞制造和分泌的多种蛋白中的任一种。非限制性示例包括来自人蛋白的信号肽序列，该人蛋白诸如为生长激素、脑啡肽原A、β-新内啡肽-强啡肽、神经内分泌蛋白7B2、催乳素、胃泌素释放肽II、分泌粒蛋白I、生长激素释放因子、轴突蛋白I、神经内分泌转化酶2、血管升压素和肽素，以及本领域已知的许多其他蛋白。这些和其他分泌蛋白的氨基酸序列和编码核苷酸序列可在公共序列数据库(诸如Genbank)中获得。可修饰天然存在的信号肽的氨基酸序列以理想地改变其功能，也可修饰编码这种野生型或经修饰的信号肽的核苷酸序列以实现期望类型的序列优化，诸如去除CpG基序。在又其他实施方案中，可使用完全合成的分泌信号肽序列。
转录控制区
旨在在转导的细胞中和/或从转导的细胞表达PGRN蛋白的本公开的AAV载体还可包含与编码PGRN多肽序列的转基因可操作地连接的一个或多个转录控制区，作为载体的一部分。如下面进一步讨论的，本领域已知不同类型的转录控制区，其可用于控制转基因到RNA的转录起始。如本文所用，术语“可操作连接”和变化形式诸如“操作性连接”、“可操作地连接”和“操作性地连接”是指转录控制区与转基因之间的功能关系，使得控制区可影响转基因的转录(无论是正面的还是负面的)，而不指定它们之间的任何特定空间或结构关系。因此，例如，转录控制区可与转基因可操作地连接，即使它位于转基因的5'或3'和/或紧邻或远离转基因。转录控制区可具有组成型活性，在特定细胞或组织中具有活性，对一些环境刺激作出应答而具有诱导型活性，来源于(任何合适物种的)天然存在的基因并且可被修饰以改善或改变其功能，或甚至是完全合成的。
在一些实施方案中，转录控制区包含启动子区，该启动子区包含转录装置在转导细胞中起始转录所需的最小DNA序列(例如，TATA盒或起始子序列)，通常还包含一个或多个附加近端元件，这些元件单独或协同起作用以增加从基本启动子转录的速率。根据其序列，启动子可通过RNA聚合酶I、II或III起始转录，但是来自通常由RNA pol II转录的蛋白编码基因的启动子常用于旨在在转导细胞中表达多肽(诸如PGRN或其变体，如PGRNΔ3)的AAV载体。
在其他实施方案中，转录控制区包含或进一步包含至少一个增强子区，其功能是进一步增加基因转录速率，使其超过基本启动子单独可维持的速率。在其天然背景中，增强子通常位于其所作用的基因的启动子的远端，有时在上游(即5')数十至数百或数千个碱基对，但增强子也可出现在其他地方，诸如在其所作用的基因的内含子中或下游(即3')。虽然启动子区可含有近端增强子元件(如果被去除就会减少从基本启动子转录的子序列)，但增强子通常不含有可充当基本启动子的序列。尽管在自然界中增强子区通常位于其所作用的基因的启动子的远端，但当从其天然背景中去除并重新定位得更靠近启动子(无论是来自相同还是甚至不同的基因)时，增强子区或来自较大增强子区内的增强子元件(此类元件通常对应于转录因子的DNA结合位点)有时可保留其至少一些转录增强功能。
当与转基因和载体功能所需的其他基因组元件组合时，科学文献中描述的基因的增强子和启动子区可能太大而不能被AAV衣壳的包装能力所容纳。因此，在一些实施方案中，可使用普通技术人员熟悉的方法鉴定较长增强子或启动子区内的功能子序列，并且将较短功能子序列整合到用于本公开的载体的转录控制区中。以这种方式，可减小转录控制区的大小，同时保持其期望的功能。使用这种方法，可将来自天然存在的增强子或启动子的功能元件以新颖方式组合起来，诸如通过修改它们的数量、间距和/或排列，以产生具有改善的特性的杂合或合成增强子和/或启动子。在一些实施方案中，增强子和启动子可各自来源于相同的天然存在的基因，而在其他实施方案中，增强子和启动子可源自完全不同的基因，包括不同物种的基因。
在一些实施方案中，从编码链(即正链)单链DNA AAV载体的角度来看，启动子序列位于待转录成RNA的下游序列的5'，该下游序列诸如为编码蛋白(诸如PGRN或其变体，如PGRNΔ3)的转基因。在一些实施方案中，增强子元件或增强子区(如果存在)可位于启动子序列的5'，或者位于基因组中的其他位置，诸如在与转基因相邻的5'或3'非翻译区(UTR)中、在内含子中、在转录终止信号序列的3'或其他位置。在一些实施方案中，载体可包含多于一个增强子区(相同或不同类型)，这些增强子区可彼此相邻定位，或间隔开，和/或被基因组内的其他功能元件分开。在一些实施方案中，相同的增强子元件或增强子区以重复单元(诸如2、3、4个或更多个)的串联排列阵列提供。
在一些实施方案中，用于本公开的AAV载体的转录控制区是非组织特异性的，这意味着它们在许多不同的细胞类型中具有组成型活性，尽管不一定是所有细胞类型。根据一些实施方案，非组织特异性转录控制区包括来源于某些病毒的启动子(其可包含靠近基本启动子的增强子元件)，诸如人巨细胞病毒主要即刻早期基因(CMV-IE)(Boshart,M.等人,Cell,41:521-30,1985；Yew,N.等人,Hum.Gene Ther.,8:575-84,1997)；猿猴病毒40(SV40)；以及来自劳氏肉瘤病毒(RSV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)的逆转录病毒长末端重复序列(LTR)启动子。在其他实施方案中，非组织特异性转录控制区包括启动子(其可包含近端增强子元件)，其可来源于在许多不同细胞类型中具有活性的基因(有时被称为“管家”基因)，包括来自不同类型的动物，诸如人多肽链延伸因子(EF1α)基因；磷酸甘油酸激酶(PGK)基因；泛素C(UbiC)基因；鸡β-肌动蛋白(CBA)基因；U1a1或U1b2小核RNA启动子(Bartlett,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:8852-7,1996；Wu,Z.等人,Mol.Ther.,16:280-9,2008)；组蛋白H2或组蛋白H3启动子(Hurt,M.等人,Mol.Cell Biol.,11:2929-36,1991)。
同样，增强子区可来源于在来自不同类型的动物的不同细胞类型中有活性的病毒和基因。如所指出的，在一些实施方案中，可组合来源于相同基因的启动子和增强子以产生用于本公开的载体的转录控制区，但是可组合来自不同基因的增强子和启动子以产生杂合转录控制区。一个常用的示例是被称为CAG(或CAGGS)的1.6千碱基杂合enh/pro区，其包含CMV即刻早期增强子、鸡β肌动蛋白(CBA)基因启动子和CBA内含子/外显子1(Niwa,H.等人,Gene,108:193-9,1991)；Ikawa,M.等人,Dev.Growth Differ.,37:455-9,1995)，以及减小其大小的后续修饰，包括其中CBA内含子被替换为较小的猿猴病毒40(SV40)内含子的一种修饰(Wang,Z.等人,Gene Ther.,10:2105-11,2003)，以及另一种被称为CBA杂合内含子(CBh)的修饰，其将SV40内含子替换为由来自CBA 5'UTR的5'供体剪接位点和来自MVM内含子的3'受体剪接位点构成的杂合内含子(Gray,S.等人,Hum.Gene Ther.,22:1143-532011)。
在一些实施方案中，用于本公开的AAV载体的转录控制区可以是中枢神经系统(CNS)或脑组织特异性的，这意味着与其他组织或器官(诸如肌肉或肝脏)的细胞相比，它们在指导转基因在CNS或脑内的细胞类型中表达的活性更高或最高。在一些实施方案中，其中本公开的AAV载体的转录控制区优先具有活性的CNS或脑细胞类型包括但不限于神经元、胶质细胞(诸如小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞)和室管膜细胞，其中其他细胞类型也是可能的。不希望受任何特定操作理论的束缚，脑组织或神经元(或脑中的任何其他细胞类型)基因转录特异性可能发生的一种机制是在增强子和/或启动子中存在优先在脑细胞(诸如神经元或脑中的其他细胞类型)中表达的DNA结合转录激活因子蛋白的一个或多个特异性结合位点。在一些实施方案中，使用脑组织或神经元(或其他脑细胞类型)特异性转录控制区的有利之处可在于减少或甚至防止可由载体转导的脑外细胞或非神经元细胞(或其他脑细胞类型)中的转基因表达，从而可理想地降低脱靶效应的风险。
以高水平表达的某些脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性基因具有增强子和启动子，它们可被包含在本公开的AAV载体的转录控制区中。在一些实施方案中，可将来源于相同基因的增强子和启动子组合在脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性转录控制区中，而在其他实施方案中，可将来自一个基因的增强子和来自不同基因的启动子组合在杂合脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性转录控制区中。当来源于相同基因时，包含一个或多个增强子和启动子的转录控制区序列可在其存在于其所来源的天然基因背景中时被拷贝，或被工程化以减少其长度，诸如通过缺失将一个或多个增强子和启动子分开的非转录活性序列。在一些实施方案中，用于脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性转录控制区的增强子和启动子可来源于不同物种的基因。在又其他实施方案中，转录控制区中的增强子和/或启动子的序列可通过改变、添加或去除核苷酸来相对于其原始序列进行修饰，以改善其功能，诸如增加转录激活因子结合、减少转录阻遏因子结合或减小转录控制区的大小。
在一些实施方案中，是增强子提供脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性表达，并且启动子本身不是脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性的，而在其他实施方案中，是启动子提供脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性表达，并且增强子(如果存在)本身不是脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性的，但能够增加从脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性启动子转录的速率。例如，强病毒增强子(诸如人CMV主要即刻早期基因增强子)可与脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性启动子配对，或强脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性增强子(诸如来自突触素1基因)可与强病毒启动子(诸如SV40早期启动子)配对。在其他实施方案中，增强子和启动子各自均是脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性的。在一些实施方案中，可将不同的增强子区组合以形成在本公开的AAV载体中的转录控制区中使用的嵌合增强子区。
用于本公开的AAV载体的脑组织或神经元(或其他脑细胞类型)特异性转录控制区(无论是增强子、启动子还是两者)可来源于在脑或神经元(或其他脑细胞类型)中或甚至脑的特定区域或神经元亚型中以高水平天然表达的基因。例如但不限于，突触素1基因(SYN1)、神经元特异性烯醇酶(NSA)基因和微管蛋白α1基因各自含有神经元特异性启动子，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因启动子至少部分是星形胶质细胞特异性的，L7-6基因启动子至少是小脑浦肯野细胞特异性的，Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)基因启动子至少部分对前脑兴奋性神经元具有特异性，distalless同源盒II(DLX)基因增强子至少部分对前脑抑制性神经元具有特异性，谷氨酸脱羧酶(GAD)65基因启动子也至少部分对抑制性神经元具有特异性，酪氨酸羟化酶基因启动子至少部分对儿茶酚胺能神经元具有特异性，并且以下基因的转录控制区(启动子和/或增强子)至少部分对神经元具有特异性：ADORA2A、ATP6V1C2、AVP、C8ORF46、CARTPT、CCKBR、CCL27、CD68、CLDN5、CRH、CX3CR1、DBH、DCX、DDC、DRD1、FEV、FEZF2、GABRA6、GAL、GCHFR、GFAP、GPR88、GPX3、GRP、HAP1、HBEGF、HCRT、HSPA12B、HTR1A、ICMT、LCT、MKI67、NR2E1、NTSR1、OLIG1、OXT、PCP2、PITX3、PKP2、POGZ、RAMP3、RGS16、RLBP1L2、S100B、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC7A5、SLITRK6、TAC1、TAC3、TBR1、THY1、TNNT1、TRH、UGT8、VIM和VIP。
在一些实施方案中，在转导的神经元中表达PGRN蛋白或其变体(诸如PGRNΔ3)的本公开的AAV载体的转录控制区可包含以下部分或由以下部分组成：人突触素1基因(SYN1)的启动子区，其已被证明赋予神经元细胞特异性转录调控；或其保留此类神经元特异性转录调控的子序列。以下文献中进一步详细描述了人突触素1基因的启动子区：例如，Thiel,G等人,Characterization of tissue-specific transcription by the human synapsinI gene promoter,PNAS 88:3431-3435(1991)，Schoch,S等人,Neuron-specific GeneExpression of Synapsin I,JBC 271(6):3317–3323(1996)。在一些实施方案中，转录控制区可包含人突触素1基因(SYN1)启动子或由该启动子组成或进一步包含该启动子，在一些实施方案中，该启动子包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ IDNO:6的核苷酸序列或其神经元特异性转录功能子序列。
已经通过改造来自脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性基因的增强子和/或启动子，例如通过减小其长度，产生了用于基因疗法载体(例如，AAV、腺病毒或慢病毒载体)的多种脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性转录控制区，其中任一种可用于本公开的AAV载体中以在脑中的转导细胞(诸如神经元或其他脑细胞类型)中表达PGRN蛋白或其变体，诸如PGRNΔ3。此类脑或神经元(或其他脑细胞类型)特异性转录控制区的非限制性示例，包括人突触素1基因启动子的转录功能部分(Kügler,S.等人,Mol.Cell Neurosci.,17:78-96,2001；Kügler,S.等人,Gene Ther.,,10:337-47,2003；Hioki,H.等人,Gene Ther.,14:872-82,2007；Portales-Casamar,E.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107:16589-94,2010；Jackson,K.等人,Front.Mol.Neuro.,9:1-11,2016；Massaro,G.等人,Hum.Mol.Genet.,29:1933-49,2020；Finneran,D.等人,Front.Neurol.,12:1-12,2021；Radhiyanti,P.等人,Neurosci.Lett.,756:1-6,2021；美国专利号7,341,847)。
转录终止信号序列
在一些实施方案中，本公开的AAV载体包含含有转录终止子序列的载体，从编码(正)链单链DNA载体的角度来看，该转录终止子序列位于转基因的3'。在一些实施方案中，另一序列(诸如3'非翻译区(UTR)序列)可位于转基因序列与转录终止子序列之间(Proudfoot,N.,Genes Dev.,25:1770-82,2011；Kuehner,J.等人,Nat.Rev.Mol.CellBiol.,12:283-94,2011；Porrua,O和Libri,D.,Nat.Rev.Mol.CellBiol.,16:190-202,2015)。
在一些实施方案中，特别是当转基因含有蛋白编码序列(而不是具有除编码蛋白之外的一些功能的RNA的序列)时，转录终止子序列可以是多聚腺苷酸化信号序列(不同地缩写为“多聚A”、“pA”、“多聚(A)”或“p(A)”)。在一些实施方案中，pA信号序列可来源于天然存在的基因并用于载体中，而在其他实施方案中，可对pA信号进行修饰，诸如通过与其天然对应物相比缩短其长度或改变其序列以使其在转录终止时更有效。在其他实施方案中，pA信号可以是杂合序列，组合了来自不同基因的pA序列，也可以是合成的。
可用于本公开的载体中的pA信号的非限制性示例包括来自牛生长激素基因的pA信号(bGH pA)；人、小鼠或兔β-珠蛋白基因；SV40晚期基因；sNRP1；spA；单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)；或腺病毒5型L3多聚腺苷酸化位点，其中其他也是可能的。在其他实施方案中，用于本公开的载体的转录终止子包括终止RNA转录物而不指导多聚腺苷酸化的那些，诸如组蛋白H4基因mRNA 3'端加工信号(Whitelaw,E等人,Nucleic Acids Res,14:7059-70(1986))。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体包含含有转基因的载体，该转基因的转录通过包含以下多聚(A)位点来终止：来源于牛生长激素基因(bGH)的多聚(A)位点，在一些实施方案中，该多聚(A)位点包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成；来自SV40病毒的多聚(A)位点，在一些实施方案中，该多聚(A)位点包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成；或来自兔β-珠蛋白基因的多聚(A)位点，在一些实施方案中，该多聚(A)位点包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成。
其他载体基因组元件
除了转录控制区和转录终止信号之外，本公开的AAV载体的基因组中还可包含其他序列(包括顺式调控元件)，以改善、控制或调节转导细胞中的转基因表达和/或翻译，或为载体赋予其他功能。此类元件包括但不限于来自基因的5'和/或3'端的非翻译区、非编码外显子、内含子、剪接供体和受体位点、lox位点、内部核糖体进入位点(IRES)、编码2A肽的序列、稳定RNA转录物的元件、调控miRNA的结合位点、微RNA(miRNA)序列、增强mRNA核输出的元件，包括病毒转录后调控元件，诸如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，以及凭经验证明可改善转基因表达的任何其他元件，即使机制可能并不确定。在其他实施方案中，载体可包含所谓的填塞或填充序列，其仅旨在将载体的总长度增加至期望的大小，例如，达到接近但仍低于特定衣壳的包装能力的长度，从而降低将截短的载体或非载体DNA偶然包装进衣壳中的可能性。
在一些实施方案中，内含子可包含在载体中以增加转基因表达和/或转录物稳定性。在一些实施方案中，提供了编码蛋白的转基因，其中外显子和内含子的序列与天然存在的基因中的相同。然而，在具有多个外显子和内含子的基因中，可去除这些内含子中的一个或多个内含子，以使总长度最小化，从而便于包含其他元件，同时不超过衣壳包装能力。然而，在其他实施方案中，内含子可由与提供载体转基因的编码序列的基因完全不同的基因提供。无论内含子与转基因来自相同还是不同的基因，内含子都可从其原始序列进行修饰，例如通过改变某些核苷酸，或去除内部序列以减少其总长度，同时保持发生有效剪接所需的剪接供体和受体序列基序，或对功能重要的其他内含子顺式元件(例如，可能存在于原始未修饰内含子序列中的增强子)。内含子也可以是杂合的，其中来自一个基因的内含子的剪接供体部分与来自不同基因的内含子的剪接受体部分配对；或者是合成的，其序列不对应于任何已知基因的内含子。在一些实施方案中，内含子可位于转基因的编码序列内并因此中断转基因的编码序列(并且具有发生有效剪接所需的供体和受体位点)，而在其他实施方案中，存在内含子，但内含子不中断蛋白编码序列，而是位于编码序列的5'或3'。在内含子不中断编码序列的情况下，它可具有从其原始遗传背景中遗留下来的一些外显子序列，只要该外显子序列不含有隐性翻译起始信号即可。在一些实施方案中，内含子可位于启动子的3'(从正链ssDNA载体的角度来看)和编码序列的5'。在其他实施方案中，内含子可位于载体中的编码序列的远端，要么在上游，要么在下游。
可用于本公开的AAV载体中的内含子的非限制性示例包括来自小鼠微小病毒(MVM)的小内含子(Haut,D.和Pintel,D.,J.Virol.,72:1834-43,1998；Haut,D.和Pintel,D.,Virology,258:84-94,1999)；来自人凝血因子IX(FIXm1和FIXm2)的内部缺失内含子1(Kurachi,S.等人,J.Biol.Chem.,270:5276-81,1995)；嵌合的β珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白重链剪接受体内含子(GenBank U47120.2核苷酸890-1022)；来自小鼠α珠蛋白基因的内含子1；以及SV40小t抗原内含子，其可包含GenBank记录J02400.1的碱基对4644至4552或由这些碱基对组成，并且可在位置4582(g至c)、4580(g至c)、4578(a至c)和4561(a至t)处进行修饰(Nathwani,A.等人,Blood,107:2653-61,2006)。
在一些实施方案中，转录后调控元件(PRE)可被包含在载体中以增加转基因表达。PRE的示例包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)及其修饰(Donello,J.等人,J.Virol.,72:5085-92,1998；Loeb,J.等人,Hum.GeneTher.,10:2295-305,1999；Zanta-Boussif,M.等人,Gene Ther.,16:605-19,2009；Patricio,M.等人,Mol.Ther.Nucleic Acids,6:198-208,2017；美国公布专利申请2018-0353620A1)。在一些实施方案中，从编码(正)链单链DNA载体的角度来看，至少一个WPRE序列可位于转基因的下游(因此，位于编码多肽的转基因的终止密码子的3')和多聚(A)信号序列的上游。在一些实施方案中，可包含多个PRE，诸如2、3个或更多个相同或不同类型的PRE，它们可串联排列。在一些实施方案中，本公开的AAV载体包含含有WPRE元件的载体，在一些实施方案中，该WPRE元件包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成。
AAV反向末端重复序列(ITR)
位于腺相关病毒基因组末端的是被称为反向末端重复序列(缩写为“ITR”)的独特核苷酸序列，其既充当病毒DNA复制的起点，又充当引发位点以支持单链(ssDNA)基因组在受感染细胞中转化成双链形式(dsDNA)，该双链形式(dsDNA)有能力支持也包含在病毒基因组中的rep和cap蛋白编码基因的转录。ITR还起到将复制的ssDNA基因组包装进AAV衣壳的作用。AAV ITR含有多回文序列，其可通过链内互补碱基配对折叠回自身，从而形成dsDNA T形发夹二级结构。
如下面进一步解释的，本公开的AAV载体中的载体可包含一个或多个AAV ITR，其功能与它们在未修饰的病毒中的功能类似。除非另有说明，否则本文中使用的术语“反向末端重复序列”或“ITR”包括完整的全长ITR，以及具有修饰序列(诸如一个或多个核苷酸的截短、内部缺失(诸如trs或D序列的内部缺失)、添加和置换)的ITR，其保留了可归属于ITR的功能中的一种或多种功能(即使与相同类型的完整ITR相比效率较低)，包括但不限于从重组DNA(诸如质粒)中拯救载体、载体复制和/或将载体包装进组装的衣壳中。
当它们存在于包装的病毒和载体中时，位于ssDNA基因组的3'端的ITR将具有游离3'羟基，而位于ssDNA基因组的相对5'端的ITR将具有游离5'端。5'ITR也可被称为“左”ITR，并且3'ITR也可被称为“右”ITR。然而，在质粒(诸如可用于载体产生的质粒)的背景下，载体序列将以双链形式存在，使得5'ITR和3'ITR将各有两组。因此，为了避免歧义，应指定ITR位于哪条链上以区分它们。在没有这种说明的情况下，提及双链形式的载体(诸如在质粒中)的ITR是关于正链或有义链，即其上转基因的序列与转基因的多肽产物的编码序列相同的DNA链，或在转基因不编码蛋白的情况下，与功能性RNA的编码序列相同的DNA链。
在野生型AAV2中，ITR为145个碱基长，其中末端125个碱基包含回文子序列。当退火时，AAV2 ITR含有两个双链回文结构B-B'和C-C'(形成发夹的臂)，它们与较大的双链回文结构A-A'(形成发夹的茎)连接。ITR还含有朝向ITR非末端的D序列，其在ITR内没有互补序列，因此保持单链，但在基因组的相对端的ITR的D区中具有互补序列(因此，具有D和D')。A-A'茎结构包含含有四核苷酸重复基序的Rep结合元件(RBE)，大AAV Rep蛋白与这些四核苷酸重复基序结合，以便在ITR序列中的末端解离位点(trs)处(在AAV2 ITR中的核苷酸124与125之间，从3'端计数)引入序列特异性和链特异性切口，这是病毒基因组的DNA复制发生所需的步骤。
当它们复性时，ITR可折叠成两种构型，称为flip和flop，其中A和A'反向重复序列之间的序列作为相对于另一种构型的反向互补序列存在。对于5'ITR(左ITR)，flip构型的末端回文序列的顺序是5'-ABB'CC'A'D-3'，并且flop构型的顺序是5'-ACC'BB'A'D-3'。对于3'ITR(右ITR)，flip构型的末端回文序列的顺序是3'-A'B'BC'CAD'-5'，并且flop构型的顺序是3'-A'C'CB'BAD'-5'。因此，flip构型具有最靠近游离3'端的B'B回文结构，而flop构型具有最靠近游离3'端的C'C回文结构(Lusby,E.等人,J.Virol.,34:402-9,1980；Srivastava,A.等人,J.Virol.,45:555-64,1983；Samulski,R.等人,Cell,33:135-43,1983)。
据推测，ITR二级结构通过由内源细胞DNA聚合酶在具有游离3'羟基的ITR处起始的自引发单链置换延伸机制来支持病毒DNA复制。链延伸导致形成具有一个共价封闭端的单体dsDNA基因组复制中间体。双链体ITR在开放端重新折叠(异构化)成双发夹结构，形成新的3'ITR，其在互补链被置换时延伸。大AAV Rep蛋白在封闭端(下游)与ITR结合，并在其末端解离位点处切割DNA，从而起始第二DNA复制复合物，该第二DNA复制复合物在开放端起始的DNA复制复合物到达下游ITR之前拷贝下游ITR。原始复制复合物置换相对链(其ITR刚刚新合成)并完成复制到曾经的基因组封闭端、现在的开放端，其中双链体ITR可用于异构化为双发夹。因此，单体dsDNA基因组复制中间体重新产生以再次开始复制周期，而被置换的ssDNA基因组(其3'ITR是新产生的)可被包装进病毒颗粒。
被复制的ssDNA基因组将包括正向(正或有义)和负向(负或反义)链极性，并且证据表明它们以相同的效率单独包装进衣壳。因此，AAV载体颗粒的制备物，就像它们从其改造而来的病毒一样，在一些实施方案中可含有大约相等比例的有义或反义ssDNA基因组。然而，ITR也可通过从用于生成AAV载体的两个ITR之一选择性去除D序列来修饰，这样便将包装限制在载体的负链或正链上(Wang,X-S等人,J Virol,70(3):1668-77(1996))。因此，在一些其他实施方案中，AAV载体的制备物可含有载体颗粒，其中大多数或基本上所有载体是正链的或负链的。
感染后，AAV病毒粒子被转运到细胞核，在细胞核中ssDNA基因组从衣壳中释放出来。据推测，在病毒rep和cap基因可表达之前，ssDNA基因组必须首先通过细胞DNA聚合酶在3'ITR处起始链延伸的互补链合成来转化为dsDNA，这一过程被认为是缓慢且低效的。还据推测，可能存在一种更快的机制来形成细胞内dsDNA基因组，其中源自感染相同细胞的不同病毒粒子的互补正和负ssDNA基因组在细胞核中彼此相遇并通过分子间碱基配对来杂交。然后，这样的双链体基因组可支持转录，而不需要首先通过细胞DNA聚合酶进行延伸。
在设计AAV载体时，保留在载体中的唯一AAV病毒DNA序列是ITR，因为它们在产生期间的DNA复制和包装以及转导后ssDNA基因组向dsDNA的转化中起关键作用。编码Rep和Cap蛋白的序列以及病毒辅助功能(其也是产生载体所需要的)可以以本领域已知的多种方式反式提供。当载体序列(诸如可能包含在用于AAV载体产生的质粒中)包含两个完整的ITR，并且长度不超过约5kb的AAV衣壳包装能力时，如上所述，可包装ssDNA基因组，但是由于在基因表达可能发生之前进行dsDNA转化的低效率，对dsDNA转化这一步的需求可能导致转导效率低于预期。要克服通过内源细胞DNA聚合酶进行dsDNA转化的需求并潜在地提高异源序列(诸如治疗性转基因)的转导效率和表达，一种策略是依靠复制和包装“自身互补”AAV载体(scAAV)，由于它们在相同的DNA中含有正链和负链序列，因此它们可在靶细胞核中衣壳脱壳后通过分子内碱基配对(即，分子内杂交)快速复性而形成dsDNA转录模板。
至少有两种方式可促进自身互补基因组的产生，这两种方式都依赖于在待成为基因组的DNA分子的复制期间Rep无法在末端解离位点处切割ITR。在AAV的天然复制周期中，当Rep无法在开放端具有双发夹且在封闭端具有单个下游ITR的单体基因组复制中间体的下游ITR的末端解离位点处切割时，就会出现二聚体dsDNA基因组复制中间体分子。当这种情况发生时，通过初始DNA复制复合物的复制(从开放端的3'ITR开始)一直持续到下游(封闭端)ITR以及被置换的链，从而形成二聚体dsDNA基因组。该分子类似于上述单体dsDNA基因组复制中间体，但含有两个基因组。由于它具有带有双链体ITR的开放端，因此它可异构化以像单体形式一样开始DNA复制周期。另选地，封闭端发夹可经历末端解离，形成双链体ITR，该双链体ITR可异构化，使得DNA合成从解离的末端起始。在任一情况下，二聚体模板的复制生成新的二聚体dsDNA基因组复制中间体，并且置换含有5'ITR(一种极性的病毒基因组序列)、中心ITR(相反极性的病毒基因组序列)和3'ITR的ssDNA二聚体反向重复基因组。
通常，ssDNA二聚体反向重复病毒基因组不会被包装，因为它超过了正常的衣壳包装能力。然而，通过设计长度减少的载体，使得ssDNA二聚体反向重复基因组在形成时不会超过AAV包装能力，可以产生含有自身互补基因组的载体颗粒。在实践中，以这种方式产生的载体制备物可含有颗粒的混合物，其中包装了一个scDNA基因组，或一个或两个单体ssDNA基因组，所有这些基因组的比例可在制备物之间变化。
包装后，scDNA基因组很可能以单链形式(类似于ssDNA非自身互补基因组)存在于衣壳内，但随后在衣壳脱壳后快速退火而形成在一端具有共价封闭ITR且在另一端具有两个开放ITR的dsDNA分子，类似于通过自引发的dsDNA转化后的常规病毒基因组的结构。因此，虽然不希望受理论束缚，但所谓的ssDNA和scDNA基因组之间的主要差异不是被包裹时的拓扑结构，而是每种类型的基因组在衣壳脱壳和转导细胞内的基因组释放后可能获得的拓扑结构。
然而，进一步的修饰允许对含有scDNA基因组的载体颗粒的产生进行更大的控制。具体地，通过突变或缺失来自一个ITR的末端解离位点，诸如在含有用于载体产生的载体序列的质粒中，可以在载体复制周期期间抑制或消除该ITR处的单链切割。因此，在未突变的ITR处起始的复制复合物逐步经过突变的发夹并返回起始端，产生二聚体dsDNA基因组复制中间体，就像野生型ITR的末端解离不会偶然发生的情况一样。然而，该中间体将在一端含有封闭的野生型ITR，在分子中间含有突变的双链体ITR，并且在相对端含有能够异构化的双链体开放ITR。然后，该分子可经历正常轮次的复制和从每一端的野生型ITR的链置换，以产生被置换的子基因组拷贝，其含有5'野生型ITR、一种极性的载体序列、中间的突变ITR、相反极性的载体序列和3'端的野生型ITR。如果异源序列含有编码蛋白的转基因，则scDNA基因组将在相同DNA分子中含有编码序列及其互补序列。尽管这样的基因组被认为是以单链形式包装在衣壳内，但由于在ITR外存在大量的自身互补序列，它们也被认为能够在转导细胞的核内快速自退火成双链形式，在该形式下，它们可支持异源序列的转录。从含有突变ITR的构建体产生scAAV，可获得超过90％的scDNA基因组。
在AAV2衣壳中，该衣壳具有大约4.7kb的包装能力，于是排除ITR序列，ssDNA基因组可容纳大约4.4kb的异源序列，而scDNA载体可容纳约2.2kb。根据特定的非限制性实施方案，用于产生scAAV载体的基因组构建体大小(诸如可能包含在用于AAV载体产生的质粒内)为约2,500个核苷酸长，包含约2,200个核苷酸长的异源序列加上两个ITR(一个为野生型的，一个为突变的)。这将产生约4,700个核苷酸长的scAAV基因组，该长度低于典型的AAV衣壳包装能力。
可以以各种方式破坏ITR末端解离位点以促进scAAV载体的产生。例如，可将外源序列插入到末端解离位点(trs)序列本身中，或插入到ITR的相邻序列中，诸如在Rep结合元件和trs之间。另选地，可使trs序列部分或全部缺失。在其他实施方案中，可使相邻的D区部分或全部缺失。在又其他实施方案中，可用不同的核苷酸置换trs内的核苷酸，从而降低Rep对trs的切割频率。使ITR不可解离的其他方式属于本领域的普通技能。
关于AAV病毒和载体复制以及scAAV设计的进一步信息可见于McCarty,DM等人,Gene Therapy,10:2112-18(2003)；McCarty,DM等人,Gene Therapy,8:1248-54(2001)；McCarty,DM,Molecular Therapy,16(10):1648-56(2008)；美国专利号7,790,154。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体可含有一种或多种AAV ITR，这些AAV ITR源自不同AAV血清型和变体，具有不同的序列和长度，并且位于基因组内的不同位置。用于本公开的载体中的AAV ITR的序列可以是野生型的或修饰的。在其他实施方案中，AAV ITR序列也可作为载体序列的一部分包含在质粒和其他类型的载体(诸如杆状病毒)中，用于将载体序列引入宿主细胞中以达到产生载体的目的。
来自AAV2的ITR经常用于产生AAV载体，但另选实施方案可包括使用来自任何AAV血清型或变体的ITR，包括例如来自AAV1、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或已知或尚待发现的任何其他AAV血清型或变体的ITR，只要此类ITR在载体复制和包装以及转基因表达方面具有功能即可。ITR还可包含对野生型ITR序列的序列的修饰或者是完全合成的。经修饰的ITR可与野生型ITR序列(诸如来自AAV2的ITR序列)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，通过添加、缺失和/或改变核苷酸来修饰ITR，以破坏ITR的末端解离位点(trs)和/或D序列，或改变ITR的一些其他子序列。在一些实施方案中，载体可包含来自不同AAV血清型或变体的ITR。
在一些实施方案中，被选择用于载体产生的ITR将来自与衣壳相同的血清型或变体。例如，AAV2 ITR可与AAV2衣壳结合使用。然而，在其他实施方案中，载体可以是假型的或杂合的，这意味着具有来自一种血清型或变体的ITR的载体可被包装进来自不同血清型或变体的衣壳中。例如，具有来自AAV2的ITR的载体可被包装进来自AAV8的衣壳(或任何其他血清型或变体衣壳)中。这种假型通常缩写为AAV2/8，其中斜线前的数字表示ITR的起源，并且斜线后的数字表示衣壳的起源。
根据一些实施方案，本公开的AAV载体可含有具有不同数量的ITR的载体。例如，完整的AAV病毒基因组通常具有两个ITR，分别在5'和3'末端的位置各有一个，并且使用完整的ITR产生并与ssDNA基因组一起包装的AAV载体也可具有两个类似定位的ITR。然而，如上文所讨论的，载体可以以这样的方式设计，使得它们的基因组包含三个ITR，其中两个位于基因组的末端，如在病毒或常规载体中，但是另外一个位于中间或接近中间(完整的或突变的)，如在自身互补载体中。然而，还观察到，对于一些载体，特别是在基因组长度超过衣壳的平均包装能力时，5'ITR可能被截短或完全缺失，据推测这是由于过早或可变的包装终止造成的。尽管可产生缺陷性干扰颗粒，但还据推测，由于原本不完全的基因组的互补，此类颗粒仍可支持转基因表达(Kapranov,P.等人,Hum.Gene Ther.,23:46-55,2012)。因此，在一些实施方案中，本公开的AAV载体颗粒所含的基因组可包含单个功能性ITR，诸如在3'端或5'端，并且其中在相对端的是非功能性截短的ITR，或没有ITR序列。因此，在本公开的AAV载体的一些实施方案中，AAVITR可位于基因组的5'端，或位于基因组的3'端，或位于基因组的5'和3'端，以及位于其他位置。
AAV载体中可能发生的异质性的另一个来源可能是由于任何特定基因组中flip和flop ITR构型的差异存在。因此，例如，在一些实施方案中，样品中的任何特定载体颗粒可能含有这样的基因组，其在基因组的两端具有flip构型的ITR，或在基因组的两端具有flop构型的ITR，或在5'端具有flip ITR且在3'端具有flop ITR，或在5'端具有flop ITR且在3'端具有flip ITR。当与单链DNA基因组可作为正链或负链存在的观察结果结合时，AAV载体的样品可包含类似或潜在不同比例的八种可能的构型。除非另外指明，否则本公开的AAV载体的基因组不限于这些构型中的任一种；任何或全部构型都可被此类载体包装。
在一些实施方案中，AAV载体在其5'和3'端中的每一端处包含完整的全长ITR。因此，例如，如果两个ITR都来自AAV2，则此类全长ITR将是145个核苷酸长。然而，在其他实施方案中，这些ITR中的一个或多个ITR可被截短，相对于该类型ITR的典型全长序列缺失一个或多个末端核苷酸。因此，例如，相对于该类型ITR的典型全长序列，ITR可从其末端缺少至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更多。此类截短的ITR可出现在由本公开的AAV载体包装的基因组中，但也可出现在用于产生AAV载体的载体序列中，诸如质粒中。例如，据观察，如果一个ITR中缺失的序列保留在另一个ITR中，则截短的ITR由于具有自我修复的能力，仍可发挥产生AAV的作用(Wang,X-S.等人,J.Mol.Biol.,250:573-80,1995；Samulski,R.等人,Cell,33:135-43,1983)。
在一些非限制性和纯粹示例性的实施方案中，本公开的AAV载体的基因组可含有一个或多个AAV ITR，其包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中的任一者或多者的核苷酸序列(其他ITR序列也是可能的)，或任何前述具体列举的序列的互补序列或反向互补序列。
序列优化
在一些实施方案中，可优化AAV载体内的一个或多个序列以相对于起始参考序列改善其功能特征。例如但不限于，基于已知存在于不同物种之间以及在相同物种中以高或低水平表达的蛋白之间的遗传密码简并性和密码子使用偏好，载体中的任何蛋白编码序列可相对于野生型序列进行密码子优化。例如，可使用特定物种的密码子适应指数来鉴定此类密码子偏好。密码子适应指数(CAI)在Sharp,PM和Li,WH,Nucleic Acids Res,15:1281-95(1987)中有更详细的解释。在一些实施方案中，编码序列是经过人类密码子优化的，这意味着编码序列是基于人类密码子偏好进行优化的。可使用本领域已知的各种算法来促进密码子优化。如本领域已知的，可基于分析哪些高表达基因(诸如人基因)来构建不同的CAI。示例性人CAI在Haas,J等人,Current Biology,6(3):315-24(1996)中有所报道。如果需要，也可针对除人类以外的物种对蛋白编码序列进行密码子优化。
为了提高蛋白表达水平，已经提出并实施了不同的密码子优化策略。例如，最常用的同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)可被置换到没有出现该密码子的每个位置。另选地，可在整个编码序列上调整密码子使用，使其与宿主生物体的天然密码子偏好分布成比例。在一些实施方案中，密码子替换限于在物种中的高表达蛋白中相对很少出现的密码子，例如，如CAI中所反映的，频率为10％或更低。
在一些实施方案中，可通过用更常见的同义密码子置换至少一个稀有密码子来对本公开的AAV载体所要表达的蛋白编码序列进行密码子优化。在一些实施方案中，蛋白编码序列中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％以及在一些实施方案中100％的稀有密码子被替换为更常用的同义密码子，如CAI(诸如人CAI)中所反映的。在一些实施方案中，稀有密码子是出现频率小于或等于10％、9％、8％、7％、6％或5％的密码子，如CAI(诸如人CAI)中所反映的。
在一些实施方案中，可通过用如CAI(诸如人CAI)中反映的更常用的同义密码子替换一个或多个密码子来对本公开的AAV载体所要表达的蛋白编码序列进行密码子优化，使得为整个编码序列计算的CAI值相对于起始非密码子优化序列(其在一些实施方案中是蛋白的野生型编码序列)有所增加。因此，在一些实施方案中，参考特定的CAI参考表来计算起始参考序列的CAI值，并且用频率更高的同义密码子替换一个或多个密码子，使得现在经过密码子优化的编码序列的总CAI值增加至少或约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.55、0.60或0.70。
如本领域已知的，核酸中存在低甲基化的CpG二核苷酸可刺激免疫应答，从而消除转导的细胞。因此，耗尽载体中的CpG二核苷酸可增加载体转导带来长期基因表达的可能性。Wright,JF,Mol Ther,28(3):701-3(2020)。鉴于CpG二核苷酸的潜在有害效应，在一些实施方案中，基因组内的任何序列，包括例如增强子、启动子、内含子、编码蛋白或功能性RNA的开放阅读框、转录终止子、5'和/或3'非翻译区(UTR)序列、ITR或任何其他序列，均可被修饰以去除一个或多个CpG二核苷酸，只要这样做不会不可接受地干扰或破坏经修饰的元件的一些期望功能即可。由于载体内的某些元件(诸如ITR、启动子和增强子)的功能可能高度依赖于某些位置中的特定核苷酸的身份，因此显著耗尽CpG二核苷酸的此类元件的机会可能更有限。由于两种极性(例如，相对于基因组内的转基因的编码序列而言，有义和反义)的AAV载体以大约相等比例包装进衣壳中，因此在一些实施方案中，CpG耗尽策略可涉及从两种极性的载体的核苷酸序列中减少或消除CpG基序，而不仅仅从含有有义方向的蛋白编码序列的载体的核苷酸序列中减少或消除CpG基序。
在一些实施方案中，相对于参考起始序列，编码序列或整个载体序列(相对于有义和/或反义链)中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CpG二核苷酸发生缺失或被替换。在其他实施方案中，相对于起始参考序列，至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个CpG二核苷酸或任何前述值之间的范围发生缺失或被替换。在其他实施方案中，相对于参考起始序列，1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35、35至40、40至45、45至50、50至55、55至60、60至65、65至70、70至75、75至80、80至85、85至90、90至95或95至100个CpG二核苷酸发生缺失或被替换。
在其他实施方案中，序列优化可相对于起始参考序列增加或减少总GC含量。因此，在一些实施方案中，转基因或整个基因组中G或C核苷酸的总百分比相对于起始参考序列(诸如野生型蛋白编码序列)可增加至少或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％或40％或更多。在其他实施方案中，转基因或整个基因组中G或C核苷酸的总百分比相对于起始参考序列(诸如野生型蛋白编码序列)可减少至少或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％或40％或更多。
如普通技术人员将理解的，当优化编码序列时，用更普遍的密码子置换一种物种(诸如人)中的任何特定氨基酸的目标可能与其他优化策略不相容，因为引入更常用的密码子可能会引入CpG基序，或者消除CpG可能需要使用很少出现的密码子，或者密码子优化可能以不期望的方式增加或减少GC含量。在这些情况下，可能需要设计和测试不同的优化编码序列(编码相同的多肽)以鉴定在不同优化策略之间取得可接受平衡的形式，从而实现改善的蛋白表达。
除了密码子偏好和CpG含量之外，还可通过改变特征来优化转基因和载体序列。例如，可(从概念上(诸如通过使用算法)或凭经验)鉴定有时在序列中出现并负面影响转基因表达的任何以下特征并改变或消除这些特征，以减少它们的影响：隐性剪接位点；过早转录终止信号序列(例如，多聚A序列)；除预期起始子甲硫氨酸以外的翻译起始位点(例如IRES)；具有高GC含量的序列区；可形成发夹的mRNA 5'端序列；以及mRNA 3'非翻译区中的富含AU的元件(ARE)，其可被去稳定化RNA结合蛋白结合。可出现在转基因和载体中的在改变时可增强转基因表达的其他序列特征将为本领域普通技术人员所熟悉。
在其他实施方案中，可修饰转基因或载体序列以增强功能性。例如，蛋白编码序列中的第一个预期起始密码子可能仅微弱地支持从该位点的翻译起始，在这种情况下，可改变周围序列以匹配真核生物中翻译起始的所谓Kozak共有序列。Kozak,M.,Gene,234(2):187-208(1999)。
在一些实施方案中，与包含非优化的参考起始序列(诸如衍生出优化序列的野生型编码序列)的相同载体相比，CpG耗尽(部分或完全)或转基因编码序列的其他类型的序列优化(诸如密码子优化)可改善从转基因的蛋白表达。因此，例如，与非优化的参考起始序列(诸如编码序列的野生型形式)相比，转基因的优化编码序列的表达效率可至少达到25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更高。
AAV衣壳
本公开的AAV载体可利用任何AAV衣壳，无论是天然存在的、修饰的还是工程化的，包括目前已知的或尚待发现或开发的那些，它们适用于转导受试者中的细胞以从载体转基因表达PGRN蛋白或其变体。
在设计和产生AAV载体(以及在其产生中使用的对应cap基因序列)时使用哪种衣壳的选择可受到许多考虑和因素的引导。如上所述，由于与某些细胞表面受体特异性相互作用，不同的AAV衣壳可具有不同的细胞或组织嗜性，当希望优先转导某些组织而不是其他组织时，这可能是一个优点。例如，为了优先在脑中(诸如在神经元中)表达转基因产物，可使用与例如肌肉或肝脏相比对神经元具有更大嗜性的衣壳来设计和产生载体。相反，为了在肝细胞中表达转基因产物，可使用与神经元、肌肉或其他组织相比对肝细胞具有更大嗜性的衣壳来设计和产生载体。
其他因素也可能很重要。例如，据报道，由于暴露于天然存在的AAV，一些人对某些衣壳具有高中和抗体滴度，这可能干扰具有相同或类似衣壳的AAV载体转导靶细胞的能力。因此，在设计用于基因疗法的载体时，衣壳的选择在一些情况下可受到衣壳的免疫原性和/或待治疗患者的血清阳性率的引导。可能影响衣壳选择的其他考虑因素包括可制造性和储存期间的稳定性，以及本领域已知的其他相关引导性因素。
本公开的AAV载体可使用由来自天然存在的AAV的衣壳蛋白以及经修饰或工程化的衣壳蛋白制成的衣壳。例如，天然存在的衣壳蛋白可通过在VP1、VP2和/或VP3蛋白序列中插入或缺失氨基酸或肽或者引入氨基酸置换来修饰，旨在以某种方式改善衣壳功能，诸如组织嗜性、免疫原性、稳定性或可制造性。其他示例包括具有改善的特性的新衣壳，其通过将氨基酸或结构域从一个已知衣壳交换到另一个衣壳(例如，镶嵌或嵌合衣壳)，或使用DNA改组和定向进化方法发现具有期望特性的衣壳蛋白序列而产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体可包含来自已知AAV血清型和变体的衣壳，以及非天然存在的衣壳，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAV-DJ、AAV-PHP.B、Anc80、AAV2.5和AAV2i8，其中许多其他衣壳也是可能的。在一些实施方案中，本公开的AAV载体的衣壳包含VP1、VP2和/或VP3 AAV衣壳蛋白，其是已知VP1、VP2或VP3AAV衣壳蛋白的变体或衍生物。在一些实施方案中，此类变体或衍生物AAV衣壳蛋白的氨基酸序列可与任何已知AAV衣壳VP1、VP2或VP3蛋白序列的氨基酸序列至少或约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同，该已知AAV衣壳VP1、VP2或VP3蛋白序列包括但不限于以下的AAV衣壳VP1、VP2或VP3蛋白：AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAV-DJ、AAV-PHP.B、Anc80、AAV2.5和AAV2i8，或任何其他合适的AAV衣壳，包括例如下文讨论的嗜神经衣壳。在一些其他实施方案中，此类变体或衍生物AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与已知AAV衣壳VP1、VP2或VP3蛋白氨基酸序列相差(无论是由于氨基酸的缺失、插入还是置换)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸，该已知AAV衣壳VP1、VP2或VP3蛋白氨基酸序列包括但不限于以下的AAV衣壳VP1、VP2或VP3蛋白：AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAV-DJ、AAV-PHP.B、Anc80、AAV2.5和AAV2i8，或任何其他合适的AAV衣壳，包括例如下文讨论的嗜神经衣壳。
嗜神经AAV衣壳
在一些实施方案中，本公开的AAV载体包含嗜神经衣壳。嗜神经衣壳是对神经元具有嗜性的AAV衣壳。在一些实施方案中，此类神经元可以是脑中的神经元，包括脑的某些区域中的神经元，这些区域诸如但不限于大脑皮层，包括脑的额叶、颞叶、顶叶或枕叶的大脑皮层，或其他区域，诸如基底节、丘脑、海马体、边缘系统、嗅球、视网膜、中脑或脑干中的神经元，其他脑区也是可能的。在其他实施方案中，此类神经元可以是脊髓、周围神经系统或肠神经系统中的神经元。在其他实施方案中，本公开的AAV载体包含对CNS中或CNS外的细胞(除神经元外)具有嗜性的衣壳，这些细胞的非限制性示例包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞或室管膜细胞，其他细胞类型也是可能的。在一些非限制性实施方案中，本公开的AAV载体包含对神经元(诸如存在于人脑内)具有嗜性的衣壳。如本领域普通技术人员将理解的，嗜神经性不一定意味着衣壳仅能够转导神经元而将非神经元细胞排除在外。相反，嗜神经衣壳是表现出一些更大倾向转导神经元而不是一些其他细胞类型的衣壳，即使该倾向不是绝对的，或者即使所讨论的衣壳表现出更大倾向转导非神经元细胞类型而不是神经元。在后一种情况下，人们可能称这种衣壳是嗜神经的，即使主要不是如此。
嗜神经衣壳的示例包括但不限于：AAV1；AAV2；AAV4；AAV5；AAV7；AAV8；AAV9；AAV-rh.10；AAVv66(Hsu,H-L.等人,Nat.Commun.,11:3279,2020)；AAV-DJ(Grimm,D.等人,J.Virol.,82:5887-911,2008)；MNM008、MNM004、9P31、9P801、AAV-F、AAV-S、CAP-B10、CAP-B22、PHP.V1、AAV9-retro、T2 3Y+T+dH、AAV8 THR、AAV2.5、AAV-B1、AAV-AS(Bjorklund,T.和Davidsson,M.,J.Parkinson’s Dis.,11:S209-17,2021)；AAV2 HBKO(Sullivan,J.等人,Gene Ther.,25:205-19,2018)；AAV4.18(Murlidharan,G.等人,J.Virol.,89:3976-87,2015；Ojala,D.等人,Mol.Ther.,26:304-19,2017)；AAV2-retro(Tervo,D.等人,Neuron,92:372-82,2016)；AAV-TT(Tordo,J.等人,Brain,141:2014-31,2018)；AAV-PHP.B(Deverman,B.等人,Nat.Biotechnol.,34:204-9,2016)；AAV-PHP.S和AAV-PHP.eB(Chan,K.等人,Nat.Neurosci.,20:1172-9,2017)；AAV-CAP-B10和AAV-CAP-B22(Goertsen,D.等人,Nat.Neurosci.,25:106-15,2022)；AAV-SCH9(Ojala,D.等人,Mol.Ther.,26:304-19,2018)；嗜神经衣壳(US2022-0042044和WO 2021/230987)；以及许多其他衣壳，包括包含以下蛋白的AAV衣壳：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的VP1蛋白，和/或包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的VP2蛋白，和/或包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的VP3蛋白，该AAV衣壳在本文中可被称为AAV-801衣壳。
用于表达前颗粒蛋白的AAV载体
根据某些实施方案，本公开的AAV载体包含含有转基因的AAV载体，该转基因编码野生型前颗粒蛋白(PGRN)，诸如人PGRN蛋白，或其天然存在的或工程化的变体。在一些实施方案中，转基因包含信号肽序列的编码序列，以及PGRN蛋白的成熟形式的编码序列。在一些实施方案中，信号肽序列与天然存在的PGRN蛋白中的信号肽序列相同，但也可使用来自异源蛋白的信号肽。在一些实施方案中，成熟人PGRN多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且人PGRN信号肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，野生型人PGRN蛋白(包含天然信号肽)的氨基酸序列包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体包括包含转基因的AAV载体，该转基因编码人PGRN蛋白的变体，诸如与野生型人PGRN蛋白的氨基酸序列(例如，诸如由SEQ ID NO:16提供的氨基酸序列)相比包含至少一个氨基酸的插入、缺失和/或置换的变体。在一些实施方案中，转基因编码人变体PGRN蛋白，与野生型人PGRN氨基酸序列(例如，诸如由SEQ ID NO:16提供的氨基酸序列)的氨基酸序列相比，从该人变体PGRN蛋白的PGRN羧基末端(C末端)缺失了至少一个(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个)氨基酸。在一些实施方案中，转基因编码人PGRN变体蛋白，从该人PGRN变体蛋白缺失了存在于野生型人PGRN蛋白中的最后3个C末端氨基酸(QLL)(PGRNΔ3)。在一些实施方案中，PGRNΔ3的氨基酸序列与SEQ ID NO:14的氨基酸序列相同。在一些实施方案中，人PGRN的C末端缺失变体(包括PGRNΔ3变体)与分拣蛋白的结合降低(Zheng,Y.等人,PLOS One,6:1-7,2011)。
在一些实施方案中，编码人PGRN蛋白的转基因的核苷酸序列是野生型编码序列，该序列与其存在于编码人PGRN蛋白(即，GRN)的天然存在的基因的外显子中或存在于与从GRN基因转录并编码人PGRN蛋白的mRNA相对应的cDNA序列中时的编码序列相同。在一些实施方案中，野生型人PGRN蛋白的野生型编码序列由SEQ ID NO:15提供，并且人PGRNΔ3的野生型编码序列(但存在于野生型人PGRN的C末端处的最后3个氨基酸的密码子发生缺失)由SEQ ID NO:8提供。然而，在其他实施方案中，可对编码序列进行优化，诸如通过缺失一些或全部CpG二核苷酸，同时仍然编码相同的PGRN或PGRNΔ3蛋白。在一些实施方案中，通过用缺乏CpG二核苷酸的同义密码子替换其中出现CpG二核苷酸的密码子，从SEQ ID NO:15或SEQID NO:8中去除至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110个或更多个CpG二核苷酸(或涵盖任何前述具体列举值的任何范围)。在一些实施方案中，编码PGRN或PGRNΔ3蛋白的核苷酸序列不含CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码PGRN或PGRNΔ3蛋白的核苷酸序列分别相对于SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:8包含50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个CpG二核苷酸(或涵盖任何前述具体列举值的任何范围)。在一些实施方案中，CpG二核苷酸是相对于有义链中核苷酸的顺序来鉴定的，而在其他实施方案中，CpG二核苷酸是相对于反义链中核苷酸的顺序来鉴定的。
在其他实施方案中，编码野生型人PGRN蛋白的转基因的核苷酸序列与SEQ NO:15中提供的核苷酸序列相同(不考虑终止密码子)，而在其他实施方案中，转基因与SEQ NO:15的核苷酸序列至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同，同时编码与由SEQ NO:15编码的氨基酸序列(即，SEQ ID NO:16)相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，编码人PGRNΔ3蛋白的转基因的核苷酸序列与SEQ NO:8中提供的核苷酸序列相同(不考虑终止密码子)，而在其他实施方案中，转基因与SEQ NO:8的核苷酸序列至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同，同时编码与由SEQ NO:8编码的氨基酸序列(即，SEQ ID NO:14)相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体还包含位于基因组的5'和/或3'端的至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，载体还可包含位于基因组中与第一AAV ITR相对的一端的至少第二AAV ITR。在一些实施方案中，载体包含位于其5'末端的AAV ITR。在一些实施方案中，载体包含位于其3'末端的AAV ITR。在一些实施方案中，载体包含位于其5'末端的第一AAV ITR和位于其3'末端的第二AAV ITR。在一些实施方案中，载体包含位于其5'末端的第一AAV ITR和位于其3'末端的第二AAV ITR以及位于所述第一AAV ITR和所述第二AAV ITR之间的第三AAV ITR。
用于本公开的载体的AAV ITR可以是任何类型，诸如AAV2 ITR或非AAV2 ITR，并且可以是全长的或截短的，并且可具有与其存在于自然界中(野生型序列)时的任何已知AAV病毒ITR相同的序列，或可被修饰。示例性非限制性类型的修饰包括：减少ITR序列中出现的CpG二核苷酸的数量，降低或消除ITR序列通过AAV Rep蛋白进行末端解离的能力，诸如通过使末端解离位点(trs)突变、缺失或以其他方式失活，以及降低或消除ITR支持包装进衣壳的能力，诸如通过使ITR序列的D序列突变、缺失或以其他方式失活。在一些实施方案中，载体还可包含至少第三AAV ITR，诸如位于基因组的两端之间(诸如在载体序列的中心附近或中心处)的AAV ITR。在这些实施方案中的一些实施方案中，可对第三ITR进行修饰，诸如通过使其末端解离位点失活，使得包含转基因的载体是自身互补的。在一些实施方案中，载体包含AAV ITR，该AAV ITR包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列或者此类序列各自的互补序列或反向互补序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体还包含与编码PGRN或PGRNΔ3蛋白的转基因可操作地连接的转录控制区。在一些实施方案中，转录控制区可以是诱导型的、组成型活性的或者细胞类型或组织类型特异性的，诸如主要或仅在神经元或脑中具有活性(因此是神经元特异性的或脑组织特异性的)。在一些实施方案中，转录控制区包含启动子或由启动子组成，并且还可包含至少一个增强子区或元件。转录控制区中的任何区域或元件可来源于人基因或非人基因，诸如大鼠、小鼠、牛、非人灵长类动物、鸡或病毒基因，或其他物种或类型的生物体。转录控制区的区域或元件可彼此邻接或被载体的其他功能序列分开。因此，例如，启动子区可在转基因的近端和5'(上游)，而增强子区或元件可在载体中的任何其他地方，诸如远端上游，或其他地方，诸如转基因的远端3'(下游)。转录控制区的任何区域或元件可以是细胞类型或组织特异性的，诸如脑组织或神经元(或其他脑细胞类型)特异性的。因此，启动子可以是脑组织或神经元(或其他脑细胞类型)特异性的，增强子区或元件可以是脑组织或神经元(或其他脑细胞类型)特异性的，或者单独或协同作用的启动子和增强子两者可以是脑组织或神经元(或其他脑细胞类型)特异性的。
在一些实施方案中，用于本公开的载体的转录控制区可含有来源于人突触素1(SYN1)基因的启动子序列，其中这种启动子是整个人SYN1基因启动子，或这种人SYN1基因启动子的启动子功能子序列。因此，例如，启动子可包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其启动子功能子序列、修饰或变体。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体还包含5'非翻译区(UTR)，其来自位于启动子的3'和编码PGRN或PGRNΔ3蛋白的转基因的5'的基因。在一些实施方案中，5'UTR序列是来自基因的整个5'UTR序列或其子序列。在一些实施方案中，5'UTR序列来自人突触素1基因(SYN1)，而在其他实施方案中，5'UTR序列来自其他人突触素基因，或其他物种的突触素基因，或来自突触素1以外的基因。在一些实施方案中，5'UTR序列包含SEQ ID NO:7、基本上由SEQ ID NO:7组成或由SEQ ID NO:7组成。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体还包含转录终止信号序列，诸如多聚腺苷酸化(多聚(A))信号序列，诸如来源于牛生长激素(bGH)基因的多聚(A)信号序列，或此类bGH基因的多聚(A)信号序列的转录终止功能子序列。因此，例如，转录终止信号序列可包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其转录终止功能子序列、修饰或变体。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体还包含附加功能序列，诸如内含子、病毒转录后调控元件(PRE)序列，诸如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)或乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)，其中任一者可位于转基因的3'和转录终止信号序列的5'或基因组中的其他地方。在一些实施方案中，PRE可以是WPRE，该WPRE包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:29的核苷酸序列或其功能子序列、修饰或变体。可用于本公开的载体中的其他序列包括但不限于：微RNA(miRNA)的结合位点，其可位于转基因的3'和转录终止信号序列的5'或基因组中的其他位置；以及填塞或填充核苷酸序列，这些核苷酸序列虽然不一定旨在直接影响转基因的表达(尽管可能存在这种特性)，但它们的加入使得载体的总长度达到特定大小，例如足够长以便接近特定AAV衣壳的包装能力，从而减少包装在衣壳中的污染性非全长载体基因组DNA的量。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体还包含位于多聚(A)信号序列的3'和ITR的5'的填塞或填充序列。在一些实施方案中，填塞或填充序列来源于基因的内含子，该基因诸如为编码人或另一物种的TATA盒结合蛋白(TBP)的基因。在一些实施方案中，填塞或填充序列是TBP基因内含子或其修饰或变体，诸如由SEQ ID NO:11的核苷酸序列提供的序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体包含第一AAVITR、转录控制区、5'UTR序列、与转录控制区可操作地连接的编码人PGRN或PGRNΔ3蛋白的转基因、转录终止信号序列、填充序列和第二AAV ITR。在相关实施方案中，这些元件可按5'至3'的顺序依次排列，如将以有义方向出现在单链载体中，或在包含载体序列的双链DNA分子的有义链中，诸如在用于在宿主细胞中产生载体的质粒中。相反，这些元件可以以反义方向在单链载体中或在包含载体序列的双链DNA分子的反义链中按3'至5'顺序依次排列。因此，例如但不限于，如果有义方向的载体按5'至3'顺序包含启动子、转基因和多聚(A)信号序列，则互补反义载体序列将从其5'端开始按相反顺序包含那些相同元件，但应理解，在5'至3'方向读取的反义链基因组的核苷酸序列将是有义链基因组的核苷酸序列的反向互补序列。在自身互补载体(scAAV)的情况下，元件的排列将在其序列的约一半上按5'至3'顺序出现，然后在互补的一半中按3'至5'顺序出现。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体按5'至3'顺序包含在基因组的5'末端的来自AAV2的第一AAV ITR、转录控制区、5'UTR序列、与转录控制区可操作地连接的编码PGRN或PGRNΔ3蛋白的转基因、转录终止信号序列、填充序列和在基因组的3'末端的来自AAV2的第二AAVITR。在一些实施方案中，转录控制区包含启动子，该启动子可以是神经元特异性的，诸如来源于人突触素1基因的启动子，在一些实施方案中，其可包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成。在一些实施方案中，5'UTR还来源于人突触素1基因，在一些实施方案中，其可包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成。在一些实施方案中，转录终止信号序列来源于牛生长激素(bGH)基因，在一些实施方案中，其可包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成。在一些实施方案中，填充序列来源于来自TBP基因的内含子，在一些实施方案中，其可包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成。
在任何前述实施方案中，编码人PGRN蛋白的转基因的核苷酸序列可包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：SEQ ID NO:15的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:15的核苷酸序列至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同并编码与SEQ ID NO:16相同的氨基酸序列的核苷酸序列。另选地，在任何前述实施方案中，编码人PGRNΔ3蛋白的转基因的核苷酸序列可包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同并编码与SEQ ID NO:14相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
在任何前述实施方案中，第一AAV2 ITR和第二AAV2 ITR中的任一者或两者可以是全长的或截短的，并且可以是flip或flop构型。在任何前述实施方案中，第一AAV2 ITR和第二AAV2 ITR中的任一者或两者可包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列或者此类序列各自的互补序列或反向互补序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的载体还包含位于第一AAV ITR和第二AAVITR之间(诸如在载体的中间(即使不完全在中间))的第三AAV ITR，在一些实施方案中，该第三AAV ITR可具有不经历末端解离的突变或改变的末端解离位点。在这些实施方案中的一些实施方案中，载体可以是自身互补的，并且在包装在衣壳中时可具有范围为约3000至5000或4000至5000个核苷酸的长度，或者在其序列包含在适用于在宿主细胞中产生scAAV载体的质粒中时，可具有范围为约1500至2500或2000至2500个核苷酸的长度。
在任何前述实施方案中，载体可包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:19的核苷酸序列或其反向互补序列。在任何前述实施方案中，载体可以是单链的，这意味着它不是自身互补的(在ITR之外)，并且可具有范围为约3500至5000个核苷酸、约3500至4700个核苷酸、约3800至4500个核苷酸、约3800至4300个核苷酸、约3800至4100个核苷酸、约3800至4000个核苷酸、约3900至4000个核苷酸、约3950个核苷酸或约3942个核苷酸的长度。在任何前述实施方案中，载体可处于有义方向或处于反义方向。
在任何前述实施方案中，载体可被AAV衣壳(诸如嗜神经AAV衣壳)包裹，该AAV衣壳的非限制性示例包括衣壳AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-rh.10、AAVv66、AAV-DJ、MNM008、MNM004、9P31、9P801、AAV-F、AAV-S、CAP-B10、CAP-B22、PHP.V1、AAV9-retro、T2 3Y+T+dH、AAV8 THR、AAV2.5、AAV-B1、AAV-AS、AAV2 HBKO、AAV4.18、AAV2-retro、AAV-TT、AAV-PHP.B、AAV-PHP.S、AAV-PHP.eB、AAV-CAP-B10、AAV-CAP-B22或AAV-SCH9或AAV-801衣壳，其包含以下蛋白：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的VP1蛋白、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的VP2蛋白以及包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的VP3蛋白。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体包含包裹(包装)有义或反义方向的AAV载体的AAV-801衣壳，其中有义方向的基因组按5'至3'顺序包含位于基因组5'末端的第一AAVITR、神经元特异性转录控制区、5'UTR序列、与转录控制区可操作地连接的编码人PGRNΔ3蛋白的转基因、转录终止信号序列、填充序列以及位于基因组3'末端的第二AAV ITR，其中AAVITR中的任一者或两者是AAV2 ITR，其中启动子来源于人突触素1基因，其中5'UTR也来源于人突触素1基因，其中转录终止信号序列是来源于牛生长激素(bGH)基因的多聚(A)信号序列，其中填充序列是来自人TBP基因的修饰内含子，其中启动子的核苷酸序列包含SEQID NO:6的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成，其中5'UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成，其中编码人PGRNΔ3蛋白的转基因的核苷酸序列包含以下核苷酸序列、基本上由以下核苷酸序列组成或由以下核苷酸序列组成：SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少70％相同并编码与由SEQ ID NO:8编码的多肽相同的多肽的核苷酸序列，其中多聚(A)信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成，其中填充序列的核苷酸序列包含SEQID NO:11的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成，并且其中反义方向的基因组包含与有义方向的载体的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列。在某些相关实施方案中，有义方向的载体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列、基本上由该核苷酸序列组成或由该核苷酸序列组成。
AAV载体产生
如本领域已知的，可以以多种方式产生AAV载体，包括大规模产生。例如，AAV载体可在哺乳动物或昆虫细胞中制备，然后纯化。不依赖于与辅助病毒共感染的传统方法涉及使用如上所讨论的三个质粒。一个质粒含有辅助病毒因子的基因，第二质粒含有双链形式的AAV基因组序列，并且第三质粒含有AAV rep和cap基因。rep/cap质粒通常含有来自AAV2的rep基因，但这不是必需的，并且基于希望哪种AAV衣壳蛋白构成衣壳来选择cap基因序列。在实践中，通常将这三个质粒单独地在细菌中复制，纯化，以预先确定的比例在溶液中混合在一起，然后与转染剂混合。然后使用转染混合物转染合适的哺乳动物宿主细胞(在贴壁或悬浮细胞培养中)，在足以使宿主细胞表达辅助因子及rep和cap基因，并且足以使AAV载体从其质粒模板复制并包装进衣壳中的条件下，将宿主细胞温育足够的时间(例如，48至72小时等)。在一些实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞，其组成型表达AdV辅助因子E1A和E1B，使得辅助质粒仅需要含有AdV E2A、E4ORF6和VA RNA基因。使用自身不产生AdV或其他病毒辅助因子的其他哺乳动物宿主细胞时，必须使用含有缺失或另行需要的任何辅助因子的辅助质粒。尽管通常采用上述所谓的三重转染方法，但不要求在单独的质粒上提供辅助因子的基因以及rep和cap基因。原则上，所有这些基因可容纳在一个质粒中，例如，在这种情况下，可使用两个质粒进行转染。
为了寻求更有效的大规模产生AAV载体的方法，已经建立了稳定的细胞系，这些细胞系含有原本需要通过瞬时转染引入细胞中的一些而非全部组分。包装细胞系含有稳定整合的AAV rep和cap基因。在包装细胞中产生AAV需要用含有AAV载体的质粒瞬时转染细胞，并用辅助病毒感染细胞。也可以不经转染而在包装细胞中产生AAV载体，方法是先用AdV(野生型或E2b基因缺失的AdV)感染包装细胞，该AdV提供AdV E1基因产物(可诱导细胞中的rep和cap表达)以及AAV复制所需的辅助因子；然后用复制缺陷型杂合AdV进行感染，其中AAV载体替换了该杂合病毒的基因组中的E1基因。
在另一个选项中，生产细胞系含有稳定整合的AAV rep和cap基因，并且还含有AAV载体。在生产细胞中产生AAV需要用辅助病毒感染它们。已经描述了包装细胞和生产细胞(Martin,J.等人,Hum.Gene Methods,24:253-69,2013；Gao,G.等人,Hum.Gene Ther.,9:2353-62,1998；Clément,N.和Grieger,J.,Mol.Ther.Methods Clin.Dev.,3:16002,2016)。用于在哺乳动物细胞中产生AAV载体(包括以商业规模产生)的其他细胞系统也是可能的。
还采用了杆状病毒系统来产生AAV载体，其中用重组杆状病毒载体感染Sf9昆虫细胞，这些载体不同程度地含有AAV rep和cap基因以及AAV基因组。表达外源基因，然后将基因组包装进细胞内的载体颗粒中。在该系统的早期形式中，每个组分rep、cap和基因组由三个单独的杆状病毒携带。后来又进行了修饰，诸如将rep和cap组合到单个杆状病毒中，这样就只需要两种类型的杆状病毒，以及产生含有稳定整合的AAV rep和cap基因的Sf9细胞系，该细胞系只需要用含有AAV载体的单一类型的重组杆状病毒感染(Urabe,M.等人,Hum.GeneTher.,13:1935-43,2002；Virag,T.等人,Hum.Gene Ther.,20:807-17,2009；Smith,R.等人,Mol.Ther.,17:1888-96,2009；Mietzsch,M.等人,Hum.Gene.Ther.,25:212-22,2014)。用于在昆虫细胞中产生AAV载体(包括以商业规模产生)的其他细胞系统也是可能的。
宿主细胞
如本文所用，“宿主细胞”意指适合或适于体外产生AAV载体的细胞。宿主细胞通常是能够在衰老阻止生长之前分裂多代或甚至可以是永生的克隆细胞系。为了产生载体，可通过引入外源遗传信息来瞬时或非瞬时地修饰宿主细胞，该外源遗传信息被设计成指导AAV载体组装所需的各种组分(特别是AAV衣壳蛋白、Rep蛋白、辅助病毒因子和载体)在宿主细胞中的生物合成。例如，可以用外源提供的核酸(诸如一个或多个DNA质粒的形式)来转染宿主细胞，该核酸含有编码所需载体组分的核苷酸序列。
用核酸转染宿主细胞的各种方式在本领域中是已知的。这些方式包括但不限于将核酸与某些化合物混合，这些化合物可与核酸复合，然后被摄入细胞中，这些化合物包括磷酸钙或阳离子有机化合物，诸如DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚凝胺、环糊精、阳离子脂质和本领域已知的其他化合物。还可通过电穿孔法和更特殊的技术(诸如基因枪颗粒递送)进行非化学转染。如本领域已知的，转染可以是瞬时的或稳定的。在瞬时转染时，转染的核酸在细胞中存在有限的时间段，并且在DNA的情况下，不整合到基因组中。在稳定转染时，引入到细胞中的DNA可作为附加体质粒或整合到染色体中而长期存在。通常，为了产生稳定转染的细胞，将含有选择标志物基因以及编码一种或多种所需载体组分的核苷酸序列的质粒转染到细胞中，然后使细胞在选择压力下，即在杀死非转染细胞或因某种原因失去外源DNA(包括其选择标志物)的转染细胞的条件下生长和维持。例如，质粒可含有抗生素抗性基因，并且可通过将抗生素添加到细胞生长的培养基中来选择转染细胞。在一些实施方案中，引入到稳定转染的宿主细胞中的编码一种或多种所需载体组分的核苷酸序列受诱导型启动子控制，并且除非在细胞生长过程中引入诱导该启动子的环境因素，诸如药物、金属离子或温度升高，否则不会表达或仅以低水平表达。
在其他实施方案中，可使用基因工程方法(诸如敲入或基因编辑方法)以非瞬时和靶向方式修饰宿主细胞基因组，以指导宿主细胞产生一种或多种所需载体组分。在其他实施方案中，可通过转导将编码一种或多种所需载体组分的核苷酸序列引入宿主细胞中以便指导AAV载体的产生，在该转导过程中，宿主细胞被含有此类核苷酸序列的修饰病毒感染。可用于此类目的的病毒载体的示例包括腺病毒、逆转录病毒(包括慢病毒)、杆状病毒、牛痘病毒和单纯疱疹病毒，其中其他病毒也是可能的。
宿主细胞可以是本领域已知的可用于产生AAV载体的任何类型的细胞。宿主细胞通常是动物细胞，其中不同的类型或物种也是可能的，诸如昆虫细胞或哺乳动物细胞，包括大鼠、小鼠或人细胞，其中其他细胞也是可能的。在一些实施方案中，可用于产生本公开的AAV载体的宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，其示例包括HeLa细胞、Cos细胞、HEK293细胞(和HEK293细胞的变体，诸如HEK293E、HEK293F、HEK293H、HEK293T或HEK293FT细胞)、A549细胞、BHK细胞、Vero细胞、NIH 3T3细胞、HT-1080细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、C127细胞、AGE1.HN细胞、CAP细胞、HKB-11细胞、WI-38细胞、MRC-5细胞或PER.C6细胞，其中许多其他细胞也是可能的。在一些实施方案中，可用于产生本公开的AAV载体的宿主细胞是昆虫宿主细胞，其示例包括Sf9细胞、ExpiSf9、Sf21细胞、S2细胞、D.Mel2细胞、Tn-368细胞或BTI-Tn-5B1-4细胞，其中许多其他细胞也是可能的。在一些实施方案中，宿主细胞(包括但不限于HEK293细胞及其变体)可适于在悬浮培养中生长。
为了产生AAV载体，宿主细胞通常在有利于其生长和载体生物合成的受控条件下在培养中生长或维持。例如，宿主细胞可在具有确定化学组成的液体培养基中生长，该液体培养基提供细胞生长和生物合成所需的所有营养物。示例性培养基包括用于哺乳动物宿主细胞的DMEM、DMEM/F12、MEM、RPMI 1640以及用于某些昆虫细胞的Express Five SFM、Sf-900 II SFM、Sf-900 III或ExpiSf CD。此类培养基可补充有已知会刺激使用中的特定细胞类型的生长的抗生素、生长因子或细胞因子(重组产生或存在于动物血清诸如FBS中)，以及AAV载体的最佳生物合成可能需要但其供应会受到限制的其他成分。示例性补充剂包括必需氨基酸、谷氨酰胺、维生素K、胰岛素、BSA或转铁蛋白。除了生长培养基之外，还可控制其他培养条件以优化细胞的生长和/或生产力，诸如pH、温度及CO2和氧浓度。
培养中的宿主细胞可在本领域已知的许多容器中生长或维持，诸如搅拌罐生物反应器、波浪袋(wave bag)、旋转瓶、中空纤维生物反应器或滚瓶，其中一些容器可被设计和配置用于单次使用或多次使用。根据所讨论的宿主细胞的特征，宿主细胞可在贴壁细胞培养中生长，其中细胞附着于物理基质并在与物理基质接触时生长；或者在悬浮细胞培养中生长，其中单细胞在支持它们的培养基中自由漂浮，或者附着于悬浮在培养基中的珠粒微载体。如本领域已知的，已经开发了各种技术，并且可使用这些技术使宿主细胞生长至高细胞密度，诸如灌注培养，由此可增加每次生产运行所生成的AAV载体的总量。
如本领域已知的，宿主细胞样品通常维持在冷冻细胞库中，诸如主细胞库和工作细胞库，这有利于随时间推移分多批次产生生物产物，同时确保宿主细胞的一致性能。在产生AAV载体的举措之前，通常将来自细胞库的宿主细胞的冷冻样品解冻，接种到小的培养体积中，并在体积不断增加的培养物中生长至更高的密度或数量。当宿主细胞在培养中达到期望的细胞密度和/或体积时，可诸如通过用质粒DNA转染或用病毒载体感染或转导来引入外源遗传物质，以使它们开始产生AAV载体。另选地，如果使用非瞬时修饰的宿主细胞，其中编码一种或多种所需载体组分的核苷酸序列受诱导型控制，则可引入诱导表达所必需的环境因子。然后可在足以使宿主细胞产生AAV载体的条件下，使宿主细胞在培养中生长或维持一定时间。
AAV载体纯化
在宿主细胞中生物合成后，可以以本领域已知的多种方式纯化AAV载体。例如，在一些实施方案中，可机械地或化学地(诸如用洗涤剂)裂解宿主细胞，然后去除宿主细胞DNA和其他组分，再进行诸如密度梯度离心或使用一种或多种色谱分离方法的步骤，以获得用于研究或治疗方法的AAV载体的高度纯化的制备物。
用于纯化AAV载体的色谱方法包括但不限于尺寸排阻色谱法(SEC)；亲和色谱法，其使用附着于色谱树脂或基质的能够特异性结合衣壳的任何亲和配体，诸如抗体、凝集素或聚糖；固定化金属螯合色谱法(IMAC)；嗜硫吸附色谱法；疏水相互作用色谱法(HIC)；多模式色谱法(MMC)；拟亲和色谱法；以及离子交换色谱法(IEX或IEC)，诸如阴离子交换色谱法(AEX)或阳离子交换色谱法(CEX)。
在一些实施方案中，可使用基于抗体的亲和色谱法纯化AAV载体，其中抗体或其抗体片段附着于装载到色谱柱中的固定相(基质或树脂)上，将宿主细胞裂解物泵送通过该色谱柱，然后洗涤和洗脱已经与抗体结合的载体。与固相结合的抗体可以是IgG或其片段，或单链骆驼抗体(诸如重链可变区骆驼抗体)，其他类型的抗体也是可能的。配体亲和树脂的非限制性示例包括Sepharose AVB、POROS CaptureSelect AAVX、POROS CaptureSelectAAV8和POROS CaptureSelect AAV9(Terova,O.等人,BioPharm Intl.eBook第27-35页,2017；Mietzsch,M.等人,Mol.Ther.Methods Clin.Dev.,19:362-73,2020；Rieser,R.等人,Pharmaceutics,13:748,2021)。
在其他实施方案中，可使用配体色谱法纯化AAV载体，其中固定相上附着有已知某些AAV在与细胞结合时使用的相同类型的配体，诸如聚糖、唾液酸(例如，O连接或N连接的唾液酸)、半乳糖、肝素、硫酸乙酰肝素或蛋白聚糖，如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)。例如，可使用含有唾液酸残基的亲和基质纯化具有与唾液酸特异性结合的衣壳的AAV载体(例如，AAV1、AAV4、AAV5或AAV6)；可使用含有半乳糖的亲和基质纯化具有与半乳糖特异性结合的衣壳的AAV载体(例如，AAV9)；并且可使用含有肝素、乙酰肝素或HSPG的亲和基质纯化具有与HSPG特异性结合的衣壳的AAV载体(例如，AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV6或AAV13)。
根据载体的物理化学特征，诸如衣壳上的电荷，可通过进行阴离子交换、阳离子交换或疏水相互作用色谱法来进一步纯化AAV载体。也可使用可用于纯化AAV载体的其他下游处理步骤，诸如但不限于脱盐和缓冲液交换、超滤、纳滤、渗滤和切向流过滤(TFF)。可以使用多于一个下游处理步骤，并且根据本领域普通技术人员的知识，可以以任何顺序进行多个下游处理步骤。
治疗方法
除了用于表达PGRN蛋白或其变体(诸如PGRNΔ3)的AAV载体和包含此类AAV载体的组合物之外，本公开还提供了通过向受试者施用治疗有效量的本公开的AAV载体或包含此类AAV载体的组合物来治疗需要治疗额颞叶痴呆(FTD)、额颞叶变性(FTLD)或PGRN缺乏症的受试者(诸如人类受试者)的方法。还提供了用于表达PGRN蛋白或其变体(诸如PGRNΔ3)的AAV载体在制造用于本文所公开的治疗方法的药剂中的用途。另外提供了用于表达PGRN蛋白或其变体(诸如PGRNΔ3)的AAV载体或含有此类AAV载体的药物组合物，以用于本文所公开的治疗方法。在一些实施方案中，在治疗方法中采用的或由药剂或药物组合物包含的AAV载体是本文描述为AAV801-PGRNΔ3的载体，其含有本文描述为克隆249的载体。
在一些实施方案中，基于标准诊断标准，受试者在治疗时已被诊断患有FTD或FTLD(或疑似FTD或FTLD)，该标准诊断标准诸如但不限于评估神经或精神症状或体征，和/或使用MRI、CT、PET或其他脑成像方法进行结构或功能性脑成像以鉴定脑萎缩模式，在每种情况下都是FTD或FTLD的特征。在一些实施方案中，受试者在治疗时已被诊断患有行为变异额颞叶痴呆(BV-FTD)或非流利性变异型原发性进行性失语(NFV-PPA)。在一些实施方案中，受试者在治疗时已被诊断为一个或多个脑区萎缩，诸如但不限于额叶(例如，眶额叶皮层或前扣带回)、颞叶(例如，前颞叶、内侧颞叶或后颞叶)或其他脑区(诸如下顶叶、纹状体或丘脑或其他脑区)萎缩。
在一些实施方案中，使用生物化学测试来确认诊断，例如，通过检测从受试者获得的血清或脑脊液(CSF)样品中低于正常水平的前颗粒蛋白(PGRN)，和/或在一些其他实施方案中，鉴定受试者中编码PGRN的GRN基因中的一个或多个杂合或纯合有害(功能完全或部分丧失)突变。在一些实施方案中，对于GRN基因和从任一或两个GRN等位基因产生的PGRN的量，受试者出现单倍剂量不足。在一些实施方案中，例如，基于脑组织的神经病理学分析，受试者被诊断患有FTLD-TDP A型、FTLD-TDP B型或FTLD-TDP C型。
对患有FTD、FTLD或PGRN缺乏症的受试者的治疗不一定要获得治愈才能被视为有效，其中“治愈”被定义为停止疾病进展，或部分或完全恢复受试者在症状发作或恶化之前的健康状况，或相对于没有FTD、FTLD或PGRN缺乏症的健康人而言的健康状况。相反，本公开的AAV载体(包括但不限于本文描述为AAV801-PGRNΔ3的载体)或含有此类AAV载体的药物组合物的治疗有效量可以是这样的量，其用于至少部分地逆转、减轻或改善受试者中与FTD、FTLD或PGRN缺乏症相关的至少一种症状或体征的程度或严重度；或至少部分地逆转、减轻或改善受试者中由FTD、FTLD或PGRN缺乏症引起的身体、器官、组织或细胞的至少一种障碍或功能紊乱的程度或严重度；或减缓受试者中FTD、FTLD或者PGRN缺乏症的其他有害效应的进展；或改善患有FTD、FTLD或出现PGRN缺乏症的有害效应的受试者的生活质量。与FTD、FTLD或PGRN缺乏症相关的症状、体征、障碍或功能紊乱的示例包括但不限于皮层或叶脑萎缩(例如，影响眶额叶皮层、内侧前额叶皮层、前扣带回、前岛叶皮层、扣带皮层、岛叶皮层、下顶叶或者颞叶的前部、内侧和后部区域)、皮层下脑萎缩(例如，影响纹状体、丘脑、杏仁核或海马体)和脑萎缩的行为后果，包括例如帕金森综合征、皮质基底综合征(CBS)、找词障碍、言语失用、语法缺失、对证命名障碍、单字理解障碍、音韵错误、单词重复错误、句子重复错误、句子理解错误、表层失读、妄想、幻觉和生活质量(QoL)下降。
在其他实施方案中，本公开的AAV载体(包括但不限于本文描述为AAV801-PGRNΔ3的载体)或含有此类AAV载体的药物组合物的治疗有效量是这样的量，其至少部分地将与FTD、FTLD或PGRN缺乏症相关的生物标志物的值校正或改变为更能反映正常功能的值。与FTD、FTLD或PGRN缺乏症相关的生物标志物的示例包括但不限于CSF、血清或血浆或脑组织中低于正常量的PGRN蛋白、脑组织中低于正常量的双(单酰甘油)磷酸酯(BMP)、脑组织中高于正常量的β-氨基己糖苷酶(HexA)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)酶活性、脑组织中高于正常量的TDP43片段化以及脑组织中高于正常量的脂褐素。
在一些纯粹示例性和非限制性实施方案中，具有有害GRN突变的人的血浆中的PGRN蛋白的平均量或中值量是健康人中的约28％，并且具有有害GRN突变的人的CSF中的PGRN蛋白的平均量或中值量是健康人中的约39％(Meeter,L.等人,Dement.Geriatr.Cogn.Dis.Extra,6:330-40,2016)。本领域普通技术人员将理解，来自具有GRN突变的人或健康人的生物流体和组织样品中的PGRN蛋白浓度的平均值或中值可根据测定和样品群体以及其他变量而变化。
在一些实施方案中，本文所公开的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法可用于治疗具有在GRN基因中或影响GRN基因的任何类型的纯合或杂合有害突变的人类受试者的FTD、FTLD或PGRN缺乏症。有害突变的非限制性示例包括GRN基因的任一个或两个等位基因中的缺失、插入、重组、剪接位点变异、错义或无义突变，影响GRN基因的任一个或两个等位基因的转录控制区(例如，增强子或启动子)的突变，和/或降低从GRN基因的任一个或两个等位基因表达的mRNA的稳定性或从此类mRNA转录物翻译的蛋白的量的突变，只要突变导致产生的PGRN蛋白量减少或丢失即可。用于将受试者基因分型为在GRN基因的任一个或两个等位基因中具有有害突变的方法(诸如通过RFLP分析或者基因或基因组测序)是本领域普通技术人员熟悉的，用于检测和定量来自受试者的生物流体或组织样品中的PGRN蛋白的量的方法也是如此。
可在患有FTD、FTLD或PGRN缺乏症的个体受试者中通过观察或测量和比较治疗前(基线)和治疗后FTD、FTLD或PGRN缺乏症特有的任何症状、体征、障碍、功能紊乱或生物标志物值的严重度或大小来评估本文所公开的治疗方法的治疗功效。这种比较可在治疗后的一个或多个时间进行，诸如在治疗后的0、1、2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、60、72或84个月或一些其他时间。来自个体受试者的用于比较的数据可以是单个数据点，或者是多个数据点(如果可用的话)的平均值。在一些其他实施方案中，可在充当其自身对照的患有FTD、FTLD或PGRN缺乏症的受试者群体(即两个或更多个)中通过在群体内的个体间观察或测量治疗前(基线)和治疗后FTD、FTLD或PGRN缺乏症特有的任何症状、体征、障碍、功能紊乱或生物标志物值的严重度或大小并将治疗前的平均数据与治疗后的平均数据进行比较来评估治疗功效。这种比较可在治疗后的一个或多个时间进行，诸如在治疗后的0、1、2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、60、72或84个月或一些其他时间。在一些其他实施方案中，旨在建立和定量治疗功效的研究可被设计成将用本公开的AAV载体治疗的受试者群体(治疗组)的治疗效果与接受安慰剂的受试者群体(对照组)的治疗效果进行比较。通常(尽管不一定)，研究中治疗组和对照组内的受试者在相关受试者特征方面是匹配的，诸如年龄、性别和干预时的疾病严重度。在其他实施方案中，对照群体则是通过自然史研究在统计学上定义或确定的，在自然史研究中，跟踪了在没有任何干预(可能的标准护理除外)的情况下患有FTD、FTLD或PGRN缺乏症的患者的疾病进展。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地治疗任何年龄的患有FTD、FTLD或PGRN缺乏症的受试者，包括但不限于至少或约30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70岁或以上，或涵盖任何前述具体列举的年龄的年龄范围的受试者。
在一些实施方案中，在用本公开的AAV载体(包括但不限于本文描述为AAV801-PGRNΔ3的载体)或含有此类AAV载体的药物组合物治疗时，受试者尚未表现出FTD、FTLD或PGRN缺乏症的任何明显体征或症状，但基于基因检测证明受试者的GRN基因的任一个或两个等位基因中存在至少一个有害突变，已被诊断为在不进行治疗的情况下有可能出现此类体征或症状。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地治疗患有FTD、FTLD或PGRN缺乏症的受试者达施用本公开的AAV载体(包括但不限于本文描述为AAV801-PGRNΔ3的载体)或含有此类AAV载体的药物组合物之后的一段时间，在此期间，此受试者没有出现FTD、FTLD或PGRN缺乏症的任何症状或体征，或没有出现可能在治疗时存在的FTD、FTLD或PGRN缺乏症的症状或体征的任何恶化，或至多出现可能在治疗时存在的FTD、FTLD或PGRN缺乏症的症状或体征的轻微恶化，因此受试者的总体健康、功能、生活质量和/或寿命基本上或实质上不受影响。在一些实施方案中，该时间段(在本文中被称为治疗持久性时间段)可以是任何合适或期望的时间段，包括例如但不限于至少或约3、6、9、12、15、18、21、24个月或更多个月，或至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15年或更多年，或至少或约1、2、3、4、5、6、7个十年或更多个十年，或其间的任何整数值，或涵盖任何前述具体列举的时间的时间跨度，或甚至在一些实施方案中，在接受如本文所述的基因疗法后受试者的剩余寿命。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑脊液(CSF)中的PGRN蛋白或其变体(包括PGRNΔ3)的浓度增加至健康人的CSF中的内源PGRN蛋白的平均浓度的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，例如约2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0ng/mL或更高，或涵盖任何前述具体列举的值的范围，其他值也是可能的，具体取决于用于检测和定量PGRN蛋白水平的测定类型。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑脊液(CSF)中的PGRN蛋白或其变体(包括PGRNΔ3)的浓度增加到高于治疗前(诸如治疗前的1、2、3、4、5或6个月)此受试者的CSF中的内源PGRN蛋白的平均浓度至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％或更多。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的血清或血浆中的PGRN蛋白或其变体(包括PGRNΔ3)的浓度增加至健康人的血清或血浆中的内源PGRN蛋白的平均浓度的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，例如，约100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175ng/mL或更高，或涵盖任何前述具体列举的值的范围，其他值也是可能的，具体取决于用于检测和定量PGRN蛋白水平的测定类型。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的血清或血浆中的PGRN蛋白或其变体(包括PGRNΔ3)的浓度增加到高于治疗前(诸如治疗前的1、2、3、4、5或6个月)此受试者的血清或血浆中的内源PGRN蛋白的平均浓度至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％或更多。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑或脊髓中的PGRN蛋白或其变体(包括PGRNΔ3)的浓度增加至健康人的脑或脊髓中的内源PGRN蛋白的平均浓度的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑中的双(单酰甘油)磷酸酯(BMP)的浓度增加至健康人的脑中的内源BMP的平均浓度的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％。在一些实施方案中，升高的BMP的种类是BMP 18:1/18:1、BMP 22:6/22:6或BMP的一些其他种类。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑中的β-氨基己糖苷酶(HexA)酶活性水平降低至治疗前脑中的HexA酶活性的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑中的β-半乳糖苷酶(β-Gal)酶活性水平降低至治疗前脑中的β-Gal酶活性的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑中的TDP43片段化的范围或程度降低至治疗前脑中的TDP43片段化的范围或程度的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法有效地将需要治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的人类受试者的脑中的脂褐素的量降低至治疗前脑中的脂褐素的量的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
可使用本领域已知的任何方法，诸如但不限于ELISA、RIA或LCMS-MS或本领域已知的任何其他方法，检测和定量来自接受本公开的AAV载体治疗的受试者或者来自健康对照或其他对照的生物流体或组织样品中的PGRN蛋白或其变体(包括PGRNΔ3)的浓度以及BMP或脂褐素的浓度。可使用本领域已知的任何方法，诸如但不限于荧光底物酶促测定或本领域已知的其他方法，检测和定量来自接受本公开的AAV载体治疗的受试者或者健康对照或其他对照的生物流体或组织样品中的HexA或β-Gal的酶活性。可使用本领域已知的任何方法，诸如但不限于半定量蛋白质印迹分析或本领域已知的任何其他方法，检测和定量来自接受本公开的AAV载体治疗的受试者或者来自健康对照或其他对照的组织样品中的TDP43片段化。
预防方法
在其他实施方案中，本公开提供了用于通过向需要预防FTD、FTLD或PGRN缺乏症的受试者(诸如人类受试者)施用预防有效量的本公开的AAV载体(包括但不限于本文描述为AAV801-PGRNΔ3的载体)或含有此类AAV载体的药物组合物来预防FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法。还提供了本公开的AAV载体在制造用于本文所公开的预防方法的药剂中的用途。此外，提供了本公开的AAV载体或含有此类AAV载体的药物组合物，以用于本文所公开的预防方法。
在一些实施方案中，向需要预防FTD、FTLD或PGRN缺乏症的受试者施用预防有效量的本公开的AAV载体(包括但不限于本文描述为AAV801-PGRNΔ3的载体)或含有此类AAV载体的药物组合物有效地预防受试者中FTD或FTLD的起始或开始；有效地预防受试者中PGRN缺乏症的任何有害效应的起始或开始；有效地预防受试者中PGRN量减少的起始或开始；有效地预防受试者中与FTD、FTLD或PGRN缺乏症相关的至少一种症状或体征的起始或开始；有效地预防受试者中由FTD、FTLD或PGRN缺乏症引起的身体、器官、组织或细胞的至少一种障碍或功能紊乱的起始或开始；有效地预防受试者中由FTD、FTLD或PGRN缺乏症引起的生活质量的任何下降的起始或开始，在每种情况下，如果不采取预防措施，这种生活质量下降原本会发生。
根据本文所述的预防方法的一些实施方案，受试者是在GRN基因中具有纯合或杂合有害突变的人类受试者，这种突变的存在是通过在FTD或FTLD的任何可检测症状或体征或与PGRN缺乏症相关的其他症状或体征发作之前进行基因分型来确定的。用于基因分型的方法(诸如通过RFLP分析或者基因或基因组测序)是本领域普通技术人员熟悉的。
AAV载体组合物、制剂、施用方法、剂量
除了AAV载体之外，本公开还提供了包含此类载体和至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂的组合物。除了别的以外，此类载体还可用于也在本文中描述的预防和治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的方法。
包含本公开的AAV载体的组合物可作为水溶液或悬浮液、乳液和以其他形式(诸如冻干饼)提供。载体组合物可使用任何合适的稀释剂和赋形剂配制，这些稀释剂和赋形剂对于实现期望的特性(诸如pH、离子强度、张力、稳定性、货架期、对冻融循环的抗性和冷冻干燥的能力)以及考虑施用模式可能是必需的。示例性稀释剂和载剂包括但不限于无菌注射用水、乙醇和甘油。示例性赋形剂包括但不限于盐、缓冲剂、酸、碱、表面活性剂、糖类、糖醇和本领域已知的许多其他赋形剂。用于预防或治疗受试者的疾病或障碍(诸如FTD、FTLD或PGRN缺乏症)的包含本公开的AAV载体的组合物可以以任何合适的形式包装，诸如小瓶或预填充注射器。在一些实施方案中，试剂盒提供有多个小瓶，这些小瓶含有足够的载体总量，可基于相关变量(诸如此受试者的疾病严重度、体重、性别或其他变量)实现向特定受试者递送期望的总剂量。
包含本公开的AAV载体的组合物可通过任何合适的施用途径施用，该施用途径的非限制性示例包括全身施用、直接施用到组织或器官中、静脉内施用、动脉内施用、淋巴内施用、腹膜内施用、肌内施用、脑实质内施用、鞘内施用、脑室内施用或枕大池内施用，其中其他施用途径也是可能的。
包含本公开的AAV载体的组合物可单独施用，而无需任何其他种类的疗法，或者可与标准护理治疗或一些其他药剂、化合物、药物、治疗或治疗方案同时、同期或以任何合适的给药间隔施用。在一些实施方案中，包含本公开的AAV载体的组合物可在用免疫抑制剂(诸如类固醇或他克莫司)或其他免疫抑制剂药物预防之后施用，或者免疫抑制剂药物可在之后施用以控制对基因疗法的任何体液和/或细胞免疫反应。
载体组合物可含有任何合适量的AAV载体，该量经计算以将预防或治疗有效量的这种载体以一定体积递送至受试者，使得其易于处理或施用于受试者，和/或预期不会对受试者造成任何不适或不期望的副作用。
结合本公开提供的预防和治疗方法，AAV载体和包含此类载体的组合物可以以被预测或确定为有效地实现期望程度的预防或治疗的任何合适剂量施用。在一些实施方案中，用于预防或治疗FTD、FTLD或PGRN缺乏症的本公开的AAV载体的剂量可被定量并表示为每千克受试者体重的载体(vg)，缩写为“vg/kg”。在一些实施方案中，本公开的AAV载体(包括例如包含AAV801衣壳和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列或其反向互补序列的基因组的AAV载体)的示例性有效剂量包括但不限于至少或约1×109vg/kg、1×1010vg/kg、1×1011vg/kg、1×1012vg/kg、1×1013vg/kg、1×1014vg/kg或1×1015vg/kg，或在任何前述具体列举的剂量之间并包括任何前述具体列举的剂量的剂量范围，其他剂量也是可能的。
根据前面的详细描述，本公开的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解，以下详细描述和具体示例虽然指示了本公开的具体实施方案，但仅以例示的方式给出，因为根据详细描述和示例，本公开的精神和范围内的各种改变、修改和等同物对于本领域普通技术人员将是显而易见的，并且落入所附权利要求的范围内。
除非另外指明，否则在提及一组实施方案的一个或多个成员时使用术语“或”在含义上等同于“和/或”，并且不要求它们彼此互斥。除非另外指明，否则多个明确列举的数值范围还描述了这样的范围，其下限来源于任何一个明确列举的范围的下限或上限，并且其上限来源于任何其他明确列举的范围的下限或上限。因此，例如，一系列明确列举的范围“10-20、20-30、30-40、40-50、100-150、200-250、275-300”也描述了范围10-50、50-100、100-200和150-250等等。除非另外指明，否则在一系列数值或范围之前使用术语“约”旨在不仅修饰紧接其后出现的值或范围，而且修饰在同一系列中其后出现的每一个值或范围。因此，例如，短语“约1、2或3”等同于“约1、约2或约3”。
本文引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于文章、摘要、专利、专利申请(无论已发表还是未发表)以及生物序列(包括但不限于由特定数据库参考号标识的生物序列)，均据此全文以引用方式并入本文以用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或参考文献被具体和单独地指出以引用方式并入本文。本申请直接或间接地要求优先权的任何专利申请全文也以引用方式并入本文。
除非另外指明，否则以下实施例描述的是曾经或当前使用本领域普通技术人员熟知和常规的标准技术进行的实验。这些实施例是例示性的。
实施例
包括以下实施例以及附图是为了展示优选的实施方案。本领域技术人员将理解，在不脱离本文所述的精神和范围的情况下，可在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1
设计和产生表达前颗粒蛋白(PGRN)的AAV载体
设计、构建和产生了包含用于表达缺乏最后三个羧基末端氨基酸的人前颗粒蛋白(PGRNDel3或PGRNΔ3)的转基因的AAV载体，用于在体外和体内测试。在优化实验中，比较了编码截短的人PGRN蛋白(其他方面为野生型的氨基酸序列)的各种转基因在转染的Neuro-2A细胞中的表达。密码子优化的和CpG耗尽的转基因与野生型编码序列相比产生较少的前颗粒蛋白(数据未示出)，因此后者用于转基因。
AAV基因组(称为Syn-PGRNΔ3克隆249)按5'至3'顺序包含来自AAV2的5'ITR、来源于人突触素基因的启动子、来自灵长类动物突触素I基因转录物(NCBI参考序列XM_034950363.1)的5'非翻译区(UTR)、缺少3个羧基末端氨基酸的人前颗粒蛋白多肽(hGRNΔ3)的编码序列、终止密码子、牛生长激素(bGH)基因多聚腺苷酸化(多聚A)信号序列(即，转录终止子)、来源于人TATA盒结合蛋白(TBP)基因(NCBI参考序列NG_008165.1)的内含子和来自AAV2的3'ITR。对于克隆249的载体，其完整序列被报告为SEQ ID NO:17(包括两个ITR)，每个基因组组分的标称起始和终止核苷酸编号在下表1中列出。与本文所述的载体相关的附加多肽和核苷酸序列在序列表中列出。
表1
为了产生载体颗粒，使用经典的三重转染方法转染悬浮培养中的HEK 293细胞。HEK 293细胞从工作细胞库等分试样经过多次传代扩增，从摇瓶开始，经波浪袋，到250L规模的一次性使用生物反应器(SUB)。通过添加含有PEI和以下三种不同质粒的转染混合物来转染细胞：pHelper，用于表达AdV辅助因子；pRepCap，用于表达AAV衣壳蛋白(根据实验，不同地为AAV6、AAV9、AAVDJ、AAVPHP.B或AAV801)和AAV Rep蛋白；和转基因质粒。转染3.5小时后，通过添加CDM4培养基来淬灭转染，然后进行72小时温育期以允许细胞产生AAV载体。通过以下方式收获载体：用Triton X-100裂解细胞，添加溴化度米芬以使宿主细胞DNA絮凝，过滤上清液，然后在三个阶段(包括亲和色谱法、阴离子交换色谱法和切向流过滤)中纯化载体。收获和纯化后，通过定量PCR滴定载体，然后在体外和体内测试效力和毒性。如下所述，随后在体外和体内测试载体以确定修饰的前颗粒蛋白(PGRNΔ3)的表达是否可改善与引发人类的FTD的GRN单倍剂量不足相关的生物标志物。
实施例2
体外测试AAV GRN载体
报道表明，人PGRN蛋白的羧基末端截短体不能结合分拣蛋白，同时保留结合其他受体(诸如鞘脂激活蛋白原)的能力(Zheng,Y.等人,PLoS ONE,6:e21023,2011)。为了确认这一观察结果，表达了重组WT前颗粒蛋白(PGRNwt)和前颗粒蛋白Δ3(PGRNΔ3)，其中HIS标签融合至蛋白的N-末端部分，并且在体外评估与分拣蛋白和鞘脂激活蛋白原的结合(图1)。前颗粒蛋白与分拣蛋白的结合需要WT PGRN的末端三个氨基酸，但与鞘脂激活蛋白原的结合则不需要。WT PGRN与人分拣蛋白和鞘脂激活蛋白原重组蛋白两者结合。PGRNΔ3不与分拣蛋白结合，但保持与鞘脂激活蛋白原蛋白的结合，如两种不同来源的鞘脂激活蛋白原(Abcam和Mybiosource)所示。
设计实验以确定与从其他方面相同的载体表达的全长人PGRN相比，不同类型的神经元在利用用于在神经元限制性启动子的控制下表达GRN转基因的AAV载体转导后是否可在体外产生人PGRNΔ3。使用标准技术，从人诱导多能干细胞(iPSC)分化脊髓运动神经元和皮层谷氨酸能神经元，然后利用用于表达由SYN启动子控制的截短和全长人PGRN的AAV载体转导。在分化两周后，以1E5的感染复数(MOI)利用使用AAVDJ衣壳的载体转导运动神经元。由于AAVDJ对谷氨酸能神经元的转导效果不佳，因此在测试MOI 1E5和3E5两个剂量的那些实验中使用的是使用AAV6衣壳的AAV载体。如图2A所示，通过AAVDJ载体转导运动神经元，所产生的编码截短和全长PGRN的mRNA的水平相当。然而，在蛋白水平上，与利用用于表达全长蛋白的载体转导的神经元相比，利用用于表达PGRNΔ3的AAVDJ载体转导的运动神经元在细胞生长的条件培养基中产生更高水平的PGRN蛋白，如图2B所示。当用这两种类型的AAV6载体转导谷氨酸能神经元时，观察到类似的模式。如图3A所示，那些神经元产生的编码PGRNΔ3和全长PGRN的mRNA的水平相当，这是剂量反应性的，随着MOI增至三倍而增加。另外，与运动神经元的观察结果类似，在来自用于表达PGRNΔ3的AAV6载体转导的细胞的条件培养基中测量到比用于表达全长蛋白的类似载体显著更高水平的前颗粒蛋白，这也是剂量反应性的(图3B)。这些实验的结果显示，与全长相比，在来自培养的神经元细胞的条件培养基中mRNA的量类似但截短的前颗粒蛋白的量更高，这归因于截短的蛋白不能结合分拣蛋白，从而阻止了其在分泌后被吸收回细胞中。在另一个体外实验中，显示从获自人FTD患者的iPSC分化的皮层谷氨酸能神经元的转导也被用于表达PGRNΔ3的AAV6载体转导，并且在条件培养基中产生可检测水平的前颗粒蛋白，该水平超过来自健康人的类似神经元产生的水平(图3B)。
总的来说，来自测试AAVDJ和AAV6载体的体外实验的结果表明，在体内通过向脑施用用于表达PGRNΔ3的AAV载体来转导神经元可能比依赖于用于表达全长前颗粒蛋白的载体的先前尝试更有效。通过以下方式扩展这些研究：测试在体外利用使用能够跨越NHP中的血脑屏障的衣壳的载体转导神经元是否可与使用AAVDJ和AAV6的载体类似地有效。来自对照(WC-30)和FTD(ND50017)iPSC的晚期神经元祖细胞在培养14天内分化成谷氨酸能神经元，然后添加用于从克隆249载体表达人PGRNΔ3的AAV801载体或被设计成产生荧光素酶的对照AAV801载体(AAV801-Luc)。如图4所示，来自未处理的神经元和用对照载体AAV801-Luc(MOI 1E6细胞)处理的神经元的培养基中的平均内源人前颗粒蛋白水平分别为0.69(SD0.06)和0.61(SD 0.09)ng/mL，而来自用AAV801-PGRNΔ3载体(MOI 1E6细胞)转导的神经元的总可检测hPGRN的量大幅增加至2.39(SD 0.23)ng/mL(反映由转导的细胞产生的内源全长PGRN和变体PGRN)。
据报道，在来自GRN单倍剂量不足的FTD患者的神经元中，溶酶体酶β-氨基己糖苷酶(HexA)的水平较低，并且设计实验以确定经由载体转导在此类神经元中表达PGRN是否可提高该酶的水平。来自对照iPSC的神经元中β-氨基己糖苷酶的基础活性平均为1641.8(SD249.7)相对荧光单位(RFU)，并且正如预期的，在来自FTD iPSC的分化神经元中较低，平均为790.4(SD 88.8)RFU(图5)。当用AAV801-Luc(MOI 1E6细胞)转导对照和FTD神经元时，HexA活性与相同类型的未处理的对照细胞相当，在对照和FTD神经元中分别平均为1606.5(SD 225.4)RFU和956.5(SD 79.2)。然而，与对照AAV801-Luc载体相比，用AAV801-PGRNΔ3(MOI 1E6细胞)转导对照和FTD神经元均使HexA活性增加了约1.9倍，在对照神经元中增加至3055.1(SD 344.8)RFU，而在FTD神经元中增加至1825(SD 160.05)。用AAV801-PGRNΔ3转导后FTD神经元中的HexA活性与未处理的对照神经元相当(分别为1825RFU与1642RFU)，表明AAV801-PGRNΔ3载体可充分提高FTD神经元中的前颗粒蛋白水平，使HexA活性恢复到与正常神经元中普遍的水平相当的水平。
实施例3
体内测试表达全长和截短的PGRN的AAV载体
已经证明，与全长蛋白相比，前颗粒蛋白以更高水平存在于用于表达PGRNΔ3的AAV载体在体外转导的神经元的条件培养基中，并且PGRNΔ3是生物活性的，因此设计实验以测试是否可在体内证明类似的结果。产生表达截短和全长人PGRN的AAV载体，并通过不同的施用途径将这些AAV载体施用给小鼠，之后测量从转导细胞表达的人前颗粒蛋白水平。
在第一组实验中，在第P0天，通过脑室内途径(ICV)将在神经元特异性突触素(SYN)启动子控制下表达PGRNΔ3和全长PGRN的AAV9载体双侧施用到新生小鼠的脑中(1.5e10 vg/脑室)。4周后处死测试动物，并且取出脑组织、脑脊液(CSF)和血清样品并进行分析以测量载体转导以及PGRN表达的水平和模式。如图6A所示，两种载体以相当的水平转导小鼠脑组织，而被设计成在组成型CMV启动子的控制下表达人全长PGRN的第三AAV9载体也是如此。尽管转导水平类似，并且与上述体外实验一致，但与全长相比，在用表达截短的PGRNΔ3的载体转导的小鼠的CSF中检测到基本上更多的人PGRN蛋白(图6B)。当将表达的蛋白水平相对于存在于来自测试动物的CSF样品中的内源小鼠PGRN的量进行归一化时，获得了类似的结果(图6C)。与施用了含有由突触素启动子控制的编码全长人PGRN的转基因的载体的测试动物相反，在来自施用了其中转基因由CMV启动子控制的其他方面类似的载体的测试动物的CSF中检测到表达的蛋白的水平大大降低(图6D)。然而，在来自测试动物的血清中，该模式逆转，其中含有CMV启动子的载体产生更大量的全长人PGRN蛋白。在来自由用于表达GFP报告转基因的阴性对照载体转导的测试动物的样品中，仅检测到PGRN信号的背景水平。还使用对人前颗粒蛋白具有特异性的抗体通过免疫组织化学(IHC)分析了来自测试动物的脑切片。在来自用表达GFP的AAV9载体治疗的动物的脑切片中，通过IHC未检测到人PGRN信号(图7A)。相比之下，在来自施用了用于表达全长和截短的人PGRN的AAV9载体的动物的脑切片中检测到PGRN染色(分别为图7B和图7C)，但是与全长PGRN相比，截短的PGRNΔ3蛋白的表达似乎更强烈并弥漫分布于整个脑中。
在第二组实验中，通过ICV途径将表达由不同启动子控制的PGRNΔ3和全长PGRN的AAV1、AAVDJ和AAV9载体单侧施用到6月龄小鼠的脑中(5e10 vg/动物)。3或6个月后处死测试动物，并分析分泌到CSF中的前颗粒蛋白的水平。如图8A所示，所有载体都转导了注射部位对侧的半球的脑组织，但与AAV1和AAV9相比，采用AAVDJ衣壳的载体的转导效率要高约10倍。用于表达人前颗粒蛋白的所有载体，无论是截短的还是全长的，都在治疗3个月后在测试动物的CSF中产生了可检测水平的蛋白。尽管数据不尽相同，但与全长PGRN相比，PGRNΔ3的表达呈上升趋势，这种模式在用于包装表达盒的不同衣壳中是一致的，并且无论转基因是由神经元特异性突触素启动子还是由非特异性EF1a启动子驱动都是如此(图8B)。相比之下，另一个非特异性启动子CMV似乎在脑中无活性，即使含有它的AAV9载体成功转导了细胞。在施用了AAV9载体的测试动物的子组中证实了更长的表达持续时间，其中在治疗6个月后在CSF中检测到截短和全长前颗粒蛋白，其水平与3个月前测量的水平类似(图8C)。
上述实验证明，经ICV施用不同的AAV载体导致在经治疗的动物的CSF中可检测到截短和全长人前颗粒蛋白的表达。在第三系列实验中，向6周龄小鼠静脉内(眶后)施用AAVPHP.B载体(2e13 vg/kg)以在突触素启动子的控制下表达PGRNΔ3和全长PGRN。治疗四周后，处死测试动物，并收集组织进行分析，以测试全身施用的载体是否可导致神经系统中的蛋白表达。如图9A所示，两种载体同等地转导脑组织，并且与通过ICV途径施用载体的结果一致，与全长PGRN相比，截短的前颗粒蛋白在脑组织(图9B)和CSF(图9C)中均以更高水平存在。
来自上述体内实验的结果证明，在通过两种不同途径施用了使用不同衣壳的AAV载体的不同年龄的小鼠的脑中，PGRNΔ3以比全长PGRN更高的水平存在。由于表达两种不同形式的PGRN蛋白的载体转导脑组织的效率相同，对差异的最可能的解释可归因于以下事实：与全长前颗粒蛋白不同，截短的蛋白不与分拣蛋白结合，因此在分泌后保留在细胞外空间中而不是被吸收到细胞中。
实施例4
在野生型小鼠中测试AAV载体表达的PGRN神经毒性
如其他人所报道的，通过经ICV向Grn缺陷型小鼠脑中施用的AAV9载体来表达全长人PGRN蛋白，会导致选择性和显著的海马毒性和变性，从而影响神经元和神经胶质，据报道由T细胞应答介导(Amado D.等人,Mol.Ther.,27:465-78,2019)。尽管此类不需要的副作用在人类中可能是可控的，诸如施用免疫抑制剂，但设计实验以测试截短的PGRN的表达是否可能减少或消除全长蛋白所见的神经毒性。
将用于在SYN基因启动子控制下表达人全长PGRN和PGRNΔ3的AAV9载体(各自总计5e10 vg)经ICV施用到6月龄小鼠的脑中。治疗三个月后，处死测试动物，并且取出脑组织并进行分析。通过H&E染色评估冠状脑切片中海马区的组织结构和细胞构成，并通过免疫组织化学(IHC)检测人前颗粒蛋白和小鼠小胶质细胞标志物Iba-1的水平。在处死之前，在用表达PGRN的载体治疗的动物与施用了PBS或用于表达绿色荧光蛋白(GFP)的AAV9载体的阴性对照动物之间未观察到体重或存活率的显著差异(数据未示出)。在施用了表达GFP的AAV9载体的测试动物的海马区中，通过ICH检测到正常水平的小鼠Iba-1，但没有检测到人PGRN蛋白(图10，分别为左下和左上显微照片)。类似地，海马体表现出正常的神经元细胞构成(图10，右显微照片)。在接受了用于表达人全长PGRN的AAV9载体的测试动物中，前颗粒蛋白在海马体的CA3区中容易检测到(图11，左上显微照片)。然而，与阴性对照动物不同，相同区域表现出细胞构成减少(图11，右显微照片)，以及小胶质细胞标志物Iba-1的信号强度增加(图11，左下显微照片)，其与PGRN表达共定位。总之，这些结果表明，全长人PGRN蛋白的表达对海马体中的神经元具有毒性，并且刺激了强大的小胶质细胞应答，这与之前的报道类似。当从使用AAVDJ衣壳的载体表达全长人PGRN蛋白时，观察到类似的结果(现已示出结果)，证实毒性最可能归因于表达的蛋白而不是载体衣壳。
接受了用于表达人PGRNΔ3的AAV9载体的测试动物在海马体中也具有可检测水平的蛋白，但其表达模式与相同蛋白的全长形式相比更分散(图12，左上显微照片)。令人惊讶的是，与此形成鲜明对比，来自这些相同测试动物的海马CA3区具有表现正常的神经元细胞构成(图12，右显微照片)，以及正常至略微增加的Iba-1蛋白水平(图12，左下显微照片)，表明没有显著的小胶质细胞活化。重要的是，这些结果证明，AAV载体介导的截短PGRNΔ3蛋白在野生型小鼠脑中的表达不会像全长PGRN所见到的那样引起海马神经元毒性，表明通过基因疗法表达截短形式的蛋白可能更安全。
实施例5
在小鼠GRN敲除模型中测试AAV GRN载体
AAV801衣壳优于其他衣壳的潜在优点是，已经证明它可跨越非人灵长类动物的血脑屏障(BBB)。然而，AAV801在小鼠中并不具备这种功能，这限制了在人类疾病的小鼠模型中测试包被在该衣壳中的载体的能力。为了避免这种限制，设计了实验，其中将249克隆载体包装在替代AAV9(AAV9-PGRNΔ3)和AAVPHP.B(AAVPHP.B-PGRNΔ3)衣壳中，用于在内源鼠Grn被敲除(KO)的FTD小鼠模型中进行测试。如下文进一步描述的，Grn缺陷型小鼠表现出两种不同BMP种类(18:1/18:1、22:6/22:6)减少、HexA增加、β-gal活性增加并且TDP43片段化增加，以及脂褐素在多个脑区中积累，所有这些情况在用表达PGRNΔ3的载体治疗后得到了逆转。
通过脑室内途径(ICV)以1e11 vg向Grn-/-KO小鼠单侧注射AAV9-PGRNΔ3，并且向年龄匹配的Grn-/-KO和WT小鼠注射PBS作为对照。所有测试动物均存活至尸检，并且在治疗后没有注意到体重的显著差异。在注射后大约2个月时收获组织(脑和肝)和生物流体(CSF和血清)以进行分析。取出脑的一个半球进行生化处理，另一半进行免疫染色。从右侧脑室中经ICV注射的小鼠中取出八个右半球和六个左半球，以比较来自脑的注射部位和非注射部位的分布(右半球在图13B、图13C、图13E和图13G中以粉红点描绘)。注射了AAV9-PGRNΔ3的小鼠的肝和脑(左或右半球)中的载体基因组拷贝(VGC)分别平均为6.64e5和6.23e5 vg/μg gDNA(图13A和图13B)。右半球中的平均VGC为1.02e6 vg/μg gDNA，左半球中为9.38e4vg/μg gDNA，表明注射部位相对于非注射部位的分布更高(图13B)。肝中的VGC也很高，可能是由于测试动物接受ICV注射时渗入血液中。
PGRNΔ3转基因mRNA在脑中也可检测到，总体上平均比内源鼠前颗粒蛋白mRNA转录物高57倍，但在右半球(即，注射侧)中相对较高，为77倍，并且在左半球中相对较低，为31倍(图13C)。CSF中人前颗粒蛋白(PGRNΔ3)蛋白水平平均为156ng/mL，而内源鼠前颗粒蛋白的浓度为大约2ng/mL(图13D)。血清中PGRNΔ3蛋白水平较低(3.8ng/mL)，可能是由于使用了突触素启动子，而突触素启动子预计会将转基因表达限制于神经元(图13E)。在肝中未检测到PGRNΔ3(数据未示出)。在脑中，PGRNΔ3蛋白水平平均比内源鼠前颗粒蛋白高34倍，并且与mRNA类似，在右半球中较高，为51倍，而在左半球中为10倍(图13F)。
与年龄匹配的WT小鼠相比，Grn–/–KO小鼠脑表现出18:1/18:1和22:6/22:6双(单酰甘油)磷酸酯(BMP；也被称为溶血双磷脂酸)明显缺乏(图14A和图14B)。BMP是一种内溶酶体磷脂，其被鉴定为以pH依赖性方式与前颗粒蛋白相互作用，并且是溶酶体蛋白水解和脂解的氧化还原敏感性增强剂(Logan,T.等人,Cell,184:4651-68,2021)。BMP缺乏反映了前颗粒蛋白缺乏病症中的溶酶体缺陷。测试来自测试动物的组织以确定载体治疗是否影响BMP水平。在来自对照WT小鼠的脑组织中，BMP 18:1/18:1水平平均为433ng/g，并且正如预期的，在来自用媒介物治疗的Grn-/-KO小鼠的脑组织中较低，平均为215ng/g(图14A)。然而，当用AAV9-PGRNΔ3载体治疗Grn-/-KO小鼠时，脑中的BMP水平升高至平均583ng/g(图11A)。类似地，在WT小鼠中，BMP 22:6/22:6在脑中的浓度平均为3947ng/g，并且在用媒介物治疗的Grn-/-KO小鼠的脑中为2074ng/g，其在来自用AAV9-PGRNΔ3治疗的KO小鼠的脑组织中升高至5074ng/g(图14B)。
与年龄匹配的WT对照小鼠相比，Grn-/-KO小鼠脑表现出两种溶酶体酶β-氨基己糖苷酶(HexA)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)的水平升高(图15A和图15B)。测试来自测试动物的组织以确定载体治疗是否影响BMP水平。在来自对照WT小鼠的脑组织中，HexA活性平均为40309RFU(SD 5296)，并且β-Gal活性平均为38700RFU(SD 5624)，而在用媒介物治疗的Grn-/-KO小鼠的脑中，HexA活性平均为55430RFU(7681SD)，并且β-Gal活性平均为50078RFU(12403SD)。然而，当用AAV9-PGRNΔ3载体治疗Grn-/-KO小鼠时，HexA和β-Gal酶活性均下降至对照水平。在载体治疗的测试动物中，HexA活性下降至平均35300RFU(SD 7371)，这与40309RFU(SD 5296)的WT对照水平类似，并且β-Gal活性下降至平均41299RFU(SD 7095)，这与38700RFU(SD 5624)的WT对照水平类似(图15A和图15B)。
死后脑中由GRN单倍剂量不足引起的FTD的标志物是TDP43片段的聚集，并且设计实验以测试Grn-/-KO小鼠中此类片段的存在以及载体治疗是否会影响TDP43片段化。制备来自对照WT小鼠、用媒介物治疗的对照Grn-/-KO小鼠和用AAV9-PGRNΔ3载体治疗的Grn-/-KO小鼠的脑裂解物，并使用与全长TDP43和TDP43片段(分别在43kDa和20kDa处迁移)结合的抗体通过蛋白质印迹分析进行分析。定量这两个条带的染色强度，并计算43kDa条带与20kDa条带的染色强度的比率，比率越低表明片段化相对越多。如图16所示，蛋白质印迹分析证明，与年龄匹配的WT对照相比，用PBS治疗的Grn-/-KO小鼠具有较低的43kDa条带与20kDa条带染色比率，表明Grn-/-KO小鼠在不存在前颗粒蛋白表达的情况下出现了更大程度的TDP43片段化。然而，当用AAV9-PGRNΔ3载体治疗Grn-/-KO小鼠时，染色比率增加并且与在WT对照中观察到的染色比率相当，表明载体治疗和PGRN表达的恢复减少了TDP43片段化。
Grn-/-KO小鼠中FTD的另一种生物标志物是加速的脂褐素沉积，其特征在于如自发荧光染色所显现的，与WT小鼠相比，脂褐素在所有脑区中过度积累。在WT小鼠以及治疗和对照Grn-/-KO小鼠中定量脂褐素染色强度，以确定该生物标志物是否也会对AAV9-PGRNΔ3载体治疗作出应答。图17A中提供了来自用载体和媒介物治疗的Grn-/-KO小鼠的海马体和丘脑中的脂褐素染色的代表性图像(显示为红色)。图17C至图17F中提供了来自该分析的结果，其报告了跨一个半球横向向远端移动的不同脑区中的脂褐素水平。脂褐素水平在WT小鼠中较低，而在施用了PBS媒介物或AAV9-Luc阴性对照载体的Grn-/-KO小鼠中较高。与对照Grn-/-KO小鼠相反，当通过ICV将载体施用到右脑室中来用AAV9-PGRNΔ3治疗小鼠时，在所有治疗的测试动物中观察到减少的脂褐素积累，其具有趋于WT小鼠中的水平的趋势，如在整个脑(图17B)、海马区CA2/3(图17C)、整个海马体(图17D)、前额叶皮层(图17E)和丘脑(图17F)中测量的。该数据还反映了载体治疗降低右半球(施用了载体的脑侧)中脂褐素水平的效果大于对侧左半球。
上述结果表明，通过ICV途径施用被设计成表达PGRNΔ3的载体可有效校正与人类中FTD相关的生物标志物。设计实验以测试静脉内施用能够跨越小鼠中BBB的载体是否可实现类似的结果。将包装进AAV801衣壳中并如上所述进行测试的相同载体包装进AAVPHP.B衣壳中，与AAV801不同，AAVPHP.B衣壳能够跨越小鼠中的BBB(但不能跨越NHP中的BBB)。将AAVPHP.B-PGRNΔ3载体以5e12和1e13vg/kg的剂量静脉内(IV)施用到Grn缺陷型敲入(KI)小鼠中。如通过定量来自肝和脑的每微克基因组DNA的载体数量所检测的，这两种组织均表现出高水平的转导(分别为图18A和图18B)(在脑中，低剂量和高剂量时分别为6.9e5 vg/μg和8.2e5vg/μg gDNA)。在脑中，转导导致高水平的转基因mRNA和PGRNΔ3蛋白表达。在较低载体剂量下，从GRN转基因表达的mRNA比由内源鼠Grn基因产生的mRNA高约32倍(图18C)，并且PGRNΔ3蛋白水平比内源鼠PGRN蛋白水平高约57倍(图18F)。PGRNΔ3蛋白水平在脑脊液(CSF)中也升高(图18D)。在接受较高载体剂量的小鼠中，RNA和蛋白水平高大约2倍，表明治疗效果具有剂量反应性。PGRNΔ3蛋白水平在血清中较低(图18E)，可能是由于使用了突触素启动子，从而提供转基因在神经元中的限制性表达。
在两种剂量下，与WT对照相比，来自用AAVPHP.B-PGRNΔ3载体治疗的所有Grn缺陷型KI小鼠的脑组织表现出BMP 18:1/18:1(在5e12vg/kg剂量下的平均值为384.1ng/g)和BMP 22:6/22:6(在5e12vg/kg剂量下的平均值为427.8ng/g)水平升高(分别为图18G和图18H)，而HexA酶活性降低(图18I)。总的来说，这些结果表明，通过能够跨越血脑屏障的AAV衣壳经IV施用表达PGRNΔ3蛋白的转基因可转导脑细胞，并且以足够的水平表达PGRNΔ3蛋白，从而校正与人类中FTD相关的生物标志物。
实施例6
在非人灵长类动物中测试AAV GRN载体
进行一项研究，比较含有包装在AAV801和AAV9衣壳中的249克隆载体的AAV载体在食蟹猴中的生物分布。
以两个剂量5e12vg/kg和2e13vg/kg向食蟹猴静脉内施用AAV801-PGRNΔ3和AAV9-PGRNΔ3载体，每种载体均含有249克隆载体以表达hPGRNΔ3。在临给药前和给药后至多28天采集的血清和CSF样品中测量前颗粒蛋白浓度，同时还测试脑和其他组织的样品以定量载体拷贝(VGC)数量以及转基因RNA和蛋白表达。使用人配体结合测定(LBA)检测CSF和血清中的PGRNΔ3水平，该测定不检测内源猕猴前颗粒蛋白。
在第14天和第28天，在用AAV801-PGRNΔ3治疗的测试动物的CSF中检测到PGRNΔ3蛋白(图19A)。高剂量(2e13vg/kg)在两只测试动物中产生约50ng/mL和20ng/mL的PGRNΔ3蛋白水平，两者均高于在人类中天然存在的平均6ng/mL前颗粒蛋白。在接受较低5e12vg/kg剂量的两只测试动物中的一只中检测到较低但仍可检测水平的PGRNΔ3蛋白。相比之下，在接受2e13vg/kg剂量的AAV9-PGRNΔ3的两只测试动物中没有可检测的PGRNΔ3蛋白表达。这些结果表明，与AAV9相比，AAV801衣壳能更有效地通过BBB到达脑以转导那里的神经元。用AAV801-PGRNΔ3和AAV9-PGRNΔ3载体两者治疗的测试动物中PGRNΔ3蛋白的血清浓度是相当的(图19B)，并且大幅低于人血清中天然存在的大约200ng/mL。在接受由AAV801或AAV9衣壳递送的高载体剂量(2e13vg/kg)的测试动物中，在第7天首次检测到蛋白，并且在第14天上升到约5ng/mL的峰值。在施用了低剂量(5e12vg/kg)的AAV801-PGRNΔ3载体的测试动物中，PGRNΔ3蛋白水平低于2ng/mL。血清中PGRNΔ3蛋白的低水平可归因于使用神经元限制性启动子来驱动转基因在转导细胞中的表达。
收获脑和其他组织样品以研究转导效率。通过定量载体的存在，在所有测试的脑区中证实了AAV801-PGRNΔ3载体进行的转导，并且与相同剂量(2e13vg/kg)的AAV9-PGRNΔ3载体进行的转导相比，该转导要高得多，高出至少100倍(图20)，再次证明了与AAV9相比，AAV801在跨越BBB转导脑(包括深层脑结构)方面的优越性。AAV801-PGRNΔ3对脊髓的转导也比AAV9-PGRNΔ3高约10倍。AAV801-PGRNΔ3载体进行的转导是剂量反应性的，但两种剂量均导致载体在整个脑中广泛分布。在其他组织中，尤其是非神经组织中，AAV801-PGRNΔ3的VGC低于或等于AAV9-PGRNΔ3的VGC。例如，在肝(其倾向于被许多静脉内施用的衣壳高度转导)中，AAV801-PGRNΔ3的VGC约为AAV9-PGRNΔ3的VGC的一半。背根神经节(DRG)和三叉神经节的转导相对较低，甚至在测试的最高剂量(2e13vg/kg)下也是如此。
与VGC数据一致，与从接受AAV9-PGRNΔ3载体的测试动物中获取的脑组织样品中的RNA水平相比，用AAV801-PGRNΔ3治疗的测试动物中产生的PGRNΔ3RNA水平高100至1000倍(图21)。与其他脑区(诸如杏仁核或海马体)相比，PGRNΔ3RNA水平在额叶和颞叶皮层(至少比来自MfHPRT管家基因的水平高5倍)和丘脑中特别高，并且在脊髓中也很高。相比之下，在肝中，尽管通过定量载体而确定的转导相对较高(每个拷贝细胞MfHPRT基因约0.1拷贝载体)，但PGRNΔ3RNA水平较低，再次表明通过使用突触素启动子将转基因表达限制于神经元细胞的作用。在DRG和三叉神经节中，由AAV801-PGRNΔ3转导产生的PGRNΔ3RNA水平等同于来自AAV9-PGRNΔ3的水平，并且低于大多数脑区。PGRNΔ3RNA表达是剂量反应性的，但两种剂量均导致整个脑中类似的广泛转基因表达。
还通过原位杂交(ISH)分析了来自PGRNΔ3转基因的RNA表达。如图22A至图22G所示，在来自以2e13vg/kg剂量施用了AAV801-PGRNΔ3的测试动物的受FTD影响的多个脑区中检测到广泛且强大的RNA表达，包括运动皮层、内嗅皮层、海马锥体细胞、丘脑和齿状核。在接受较低5e12vg/kg剂量的测试动物中观察到类似的模式，尽管神经元染色的频率和强度降低。在脊髓中也观察到来自AAV801-PGRNΔ3载体的大量RNA表达。在接受2e13vg/kg剂量的AAV9-PGRNΔ3载体的测试动物中，通过ISH在DRG、脊髓和三叉神经节中观察到RNA表达，但在脑中未检测到阳性染色神经元。另外，通过ISH在外周交感神经节(例如，椎旁神经节或胃肠道神经元)中未检测到RNA表达。
PGRNΔ3蛋白在来自接受2e13vg/kg AAV801-PGRNΔ3载体的测试动物的多个脑区中高度表达，超过了测试动物的脑中天然存在的前颗粒蛋白的水平(图23)。例如，在额叶皮层中，PGRNΔ3蛋白水平为约500ng/g脑组织，这比内源猕猴前颗粒蛋白的浓度高约27倍。在颞叶皮层中，PGRNΔ3蛋白水平为约30ng/g脑组织，或比内源前颗粒蛋白高约2倍，并且比脊髓中的猕猴前颗粒蛋白的水平高约40倍。外周上，PGRNΔ3水平为约10ng/gDRG组织，这低于内源猕猴前颗粒蛋白(约50ng/g组织)。在一些脑区(包括额叶皮层、丘脑和脊髓)中，从以较低剂量(5e12vg/kg)施用的AAV801-PGRNΔ3载体中也可检测到PGRNΔ3蛋白，而即使在较高剂量(2e13vg/kg)下，从AAV9-PGRNΔ3载体中也未检测到蛋白。最后，尽管存在100ng/g组织的内源前颗粒蛋白，但在肝中未检测到来自AAV801-PGRNΔ3的PGRNΔ3蛋白，再次证实了在突触素启动子作用下的限制性组织表达。还通过免疫组织化学(ICH)在许多脑切片中分析了PGRNΔ3蛋白表达。染色模式与使用ISH确定的转基因mRNA的染色模式匹配，表明PGRNΔ3蛋白没有大量摄取到不表达载体mRNA的细胞中。
实施例7
在NHP样品中定量载体衍生的PGRN
开发了免疫亲和液相色谱质谱(LCMS)测定，以定量在来自利用用于表达PGRNΔ3的AAV载体治疗的食蟹猴的组织或生物流体样品中表达的人PGRN蛋白的量。在该方法中，将来自用PGRNΔ3载体治疗的NHP测试动物的组织或生物流体样品与裂解缓冲液混合以从细胞中释放蛋白。然后使用对PGRN具有特异性的多克隆抗体来免疫沉淀内源全长猴PGRN和作为载体治疗的结果而产生的截短的人PGRN(包括例如Δ3和翻译后修饰Δ4)。在去除未免疫沉淀的蛋白后，用金黄色葡萄球菌(S.aureus)V8GluC蛋白酶消化免疫沉淀的PGRN蛋白，该蛋白酶将蛋白裂解至天冬氨酸或谷氨酸残基的C末端。在全长人和食蟹猴PGRN中，GluC在氨基酸残基编号576(E)和577(A)之间裂解以释放17个氨基酸长的C-末端肽，而Δ3截短的PGRN的GluC裂解释放14个氨基酸长。然后使用质谱来区分较长的内源全长猴PGRN肽与较短的人PGRNΔ3肽的质量。
使用上述免疫亲和LCMS测定，定量来自用AAV801-PGRNΔ3载体治疗的NHP测试动物的汇集的CSF样品中的截短PGRN蛋白的量，如实施例6中所述。出乎意料地，样品中的主要截短C-末端肽不对应于通过用GluC消化人PGRNΔ3而产生的14个氨基酸长的肽(577-590)，而是对应于通过消化具有4氨基酸C-末端截短的人PGRN(即PGRNΔ4)而释放的13个氨基酸长的肽(577-589)。这一观察结果表明，在向NHP测试动物施用AAV801-PGRNΔ3载体后，转导的脑细胞表达了人PGRNΔ3蛋白，随后该蛋白可能在分泌前经过细胞内修饰，或在分泌后经过细胞外修饰，或两者兼有，去除了C-末端精氨酸(对应于全长人PGRN中的位置590)，产生了PGRNΔ4蛋白，成为样品中主要的人截短PGRN种类。
序列表

Claims (84)

1.一种重组腺相关病毒(AAV)载体，所述重组腺相关病毒(AAV)载体包含编码人前颗粒蛋白(PGRN)多肽或其变体的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述PGRN多肽变体是缺少原本存在于全长野生型人PGRN多肽中的一个或多个氨基酸的羧基末端截短变体，使得与全长野生型人PGRN多肽相比，所述变体PGRN多肽与人分拣蛋白受体(SORT1)蛋白的结合降低。
3.根据权利要求2所述的AAV载体，其中所述PGRN多肽变体缺少存在于全长野生型人PGRN多肽中的最后三个或四个羧基末端氨基酸。
4.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的AAV载体，其中所述PGRN多肽变体的氨基酸序列包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、或者去除了SEQ ID NO:17的氨基末端信号序列的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的AAV载体，其中所述PGRN多肽变体的氨基酸序列包含去除了羧基末端精氨酸并任选地去除了SEQ ID NO:17的氨基末端信号序列的SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至权利要求5中任一项所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列是密码子优化的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的AAV载体，其中与编码所述PGRN多肽或其变体的野生型核苷酸序列相比，所述密码子优化的核苷酸序列具有减少数量的CpG二核苷酸。
8.根据权利要求7所述的AAV载体，其中与编码所述PGRN多肽或其变体的野生型核苷酸序列相比，编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列具有少1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5个的CpG二核苷酸。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述野生型核苷酸序列由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的核苷酸序列构成。
10.根据权利要求7所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列不含任何CpG二核苷酸。
11.根据权利要求1至权利要求10所述的AAV载体，其中编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:8或SEQ ID
NO:15的核苷酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同。
12.根据权利要求1至权利要求5所述的AAV载体，其中编码所述PGRN
多肽或其变体的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的核苷酸序列相同。
13.根据权利要求1至权利要求12所述的AAV载体，其中所述载体包含至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。
14.根据权利要求13所述的AAV载体，其中所述核苷酸序列包含野生型或修饰的AAV反向末端重复序列(ITR)。
15.根据权利要求14所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰以降低或消除所述ITR进行末端解离的能力。
16.根据权利要求14所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰以降低或消除所述ITR支持包装进衣壳的能力。
17.根据权利要求14所述的AAV载体，其中所述ITR的所述核苷酸序列被修饰以改变D区的活性。
18.根据权利要求13所述的AAV载体，其中所述ITR是AAV2 ITR。
19.根据权利要求18所述的AAV载体，其中所述AAV2 ITR被截短。
20.根据权利要求13所述的AAV载体，其中所述ITR包含SEQ ID
NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20或SEQ ID
NO:21的核苷酸序列或者所述序列各自的互补序列或反向互补序列。
21.根据权利要求13所述的AAV载体，其中所述载体还包含第三AAV
ITR。
22.根据权利要求21所述的AAV载体，其中所述第三ITR被修饰以使末端解离位点失活。
23.根据权利要求1至权利要求22所述的AAV载体，其中所述载体还包含与编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列可操作地连接的转录控制区。
24.根据权利要求23所述的AAV载体，其中所述转录控制区是组织或细胞类型特异性的。
25.根据权利要求24所述的AAV载体，其中所述转录控制区是脑组织特异性的或神经元特异性的。
26.根据权利要求24所述的AAV载体，其中所述转录控制区在CNS神经元中比在肝细胞中更具转录活性。
27.根据权利要求23所述的AAV载体，其中所述转录控制区包含脑组织特异性或神经元细胞特异性的启动子序列和/或增强子序列。
28.根据权利要求23所述的AAV载体，其中所述启动子序列和/或所述增强子序列来源于突触素基因。
29.根据权利要求28所述的AAV载体，其中所述启动子序列和/或所述增强子序列包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或或其功能子序列、修饰或变体。
30.根据权利要求1至权利要求29所述的AAV载体，其中所述载体还包含5'非翻译区(UTR)序列。
31.根据权利要求30所述的载体，其中所述5'UTR序列来源于突触素基因。
32.根据权利要求30所述的AAV载体，其中所述5'UTR序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其功能子序列、修饰或变体。
33.根据权利要求1至权利要求32所述的AAV载体，其中所述载体还包含转录终止信号序列。
34.根据权利要求33所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列是多聚腺苷酸化(多聚(A))信号序列。
35.根据权利要求34所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列来源于牛生长激素(bGH)基因。
36.根据权利要求35所述的AAV载体，其中所述转录终止信号序列包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其功能子序列、修饰或变体。
37.根据权利要求1至权利要求36所述的AAV载体，其中所述载体还包含内含子序列。
38.根据权利要求1至权利要求37所述的AAV载体，其中所述载体还包含转录后调控元件(PRE)序列。
39.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述PRE序列是土拨鼠肝炎病毒PRE或乙型肝炎病毒PRE序列。
40.根据权利要求1至权利要求60所述的AAV载体，其中所述载体还包含微RNA(miRNA)的结合位点。
41.根据权利要求1至权利要求40所述的AAV载体，其中所述载体还包含足够长度的填塞或填充核苷酸序列，使得包含ITR在内的所述AAV载体的整个长度为大约3.5至5.0千碱基。
42.根据权利要求41所述的AAV载体，其中所述填塞或填充核苷酸序列来源于TATA结合蛋白(TBP)基因。
43.根据权利要求42所述的AAV载体，其中所述填塞或填充核苷酸序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
44.根据权利要求1至权利要求43所述的AAV载体，其中所述载体包含第一AAV ITR、与编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列可操作地连接的转录控制区、转录终止信号序列和第二AAV ITR。
45.根据权利要求1至权利要求5所述的AAV载体，其中所述载体按5'至3'顺序包含：
(a)第一AAV2 ITR，
(b)来自突触素基因的启动子序列，
(c)来自突触素基因的5'UTR序列，
(d)与所述启动子序列可操作地连接的编码人PGRN多肽或其变体的核苷酸序列，
(e)来自牛生长激素(bGH)基因的转录终止信号序列，
(f)来自TBP基因内含子的序列，以及
(g)第二AAV2 ITR。
46.根据权利要求45所述的AAV载体，其中来自突触素基因的所述启动子序列包含SEQID NO:6的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成；来自突触素基因的所述5'UTR序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列；编码所述PGRN多肽或其变体的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15的核苷酸序列；来自牛生长激素(bGH)基因的所述转录终止信号序列包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核苷酸序列；并且来自TBP基因内含子的所述序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的AAV载体，其中所述第一AAV2 ITR和所述第二AAV2 ITR各自包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21的核苷酸序列或者所述序列各自的互补序列或反向互补序列。
48.根据权利要求45至权利要求47所述的AAV载体，其中所述载体的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或其反向互补序列。
49.根据权利要求1至权利要求48所述的AAV载体，其中所述载体的长度等于或小于5千碱基或长度等于或小于4千碱基。
50.一种AAV载体，所述AAV载体包含AAV衣壳和根据权利要求1至权利要求49所述的AAV载体，其中所述载体被所述衣壳包裹。
51.根据权利要求50所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳至少部分地是亲神经元的。
52.根据权利要求51所述的AAV载体，其中与AAV9衣壳相比，所述AAV衣壳至少同样有效地或更有效地跨越BBB。
53.根据权利要求51或权利要求52所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳是AAV-801衣壳，其包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VP3蛋白。
54.根据权利要求53所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳还包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VP1蛋白和/或具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VP2蛋白。
55.一种AAV载体，所述AAV载体包含包裹AAV载体的AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是AAV-801衣壳，并且其中所述载体的所述核苷酸序列包含AAV-801的核苷酸序列或其反向互补序列。
56.一种预防或治疗人类受试者中由人PGRN多肽缺乏引起的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的根据权利要求1至权利要求55所述的AAV载体或组合物，以有效地增加所述受试者的至少一种生物流体、组织或细胞中PGRN多肽或其变体的量。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑脊液(CSF)中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的CSF中内源PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如6ng/mL。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的脑中PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脊髓中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的脊髓中PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的血清中PGRN多肽或其变体的量增加至健康人的血清中PGRN多肽的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中双(单酰甘油)磷酸酯(BMP)的量增加至健康人的脑中BMP的量的至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中所述BMP可以是任何种类的BMP，诸如BMP 18:1/18:1或BMP 22:6/22:6。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的β-氨基己糖苷酶(HexA)酶活性降低至治疗前所述HexA酶活性的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、
60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
63.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的β-半乳糖苷酶(β-Gal)酶活性降低至治疗前所述β-Gal酶活性的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
64.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的TDP43片段化降低至治疗前TDP43片段化的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、
45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
65.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法有效地将所述受试者的脑中的脂褐素水平降低至治疗前所述脂褐素水平的至多或小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、
45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
66.一种降低人类受试者中由人PGRN多肽缺乏引起的至少一种症状或体征的频率或严重度的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的根据权利要求1至权利要求55所述的AAV载体或组合物，以有效地降低此类症状或体征的频率或严重度。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述症状或体征是额颞叶变性(FTLD)的特征，包括例如FTLD-TDP A型。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述症状或体征是脑区萎缩，所述脑区选自由以下各项组成的组：额叶、前颞叶、内侧颞叶、后颞叶、眶额叶皮层、前扣带回、下顶叶、纹状体和丘脑。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述症状或体征是行为变异额颞叶痴呆(BV-FTD)的行为变化特征。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述症状或体征是非流利性变异型原发性进行性失语(NFV-PPA)的行为变化特征。
71.根据权利要求67所述的方法，其中所述症状或体征是帕金森综合征或皮质基底综合征(CBS)的特征。
72.根据权利要求56至权利要求71所述的方法，其中所述受试者被诊断患有额颞叶变性(FTLD)或额颞叶痴呆(FTD)。
73.根据权利要求56至权利要求71所述的方法，其中所述受试者中的PGRN多肽缺乏由编码PGRN多肽的GRN基因中的纯合或杂合突变引起，所述突变相对于健康人降低PGRN多肽的量或活性。
74.一种预防或治疗人类受试者的额颞叶痴呆的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的根据权利要求1至权利要求55所述的AAV载体或组合物，以有效地预防或治疗所述受试者的额颞叶痴呆。
75.根据权利要求56至权利要求74所述的方法，其中所述AAV载体的所述有效量是范围为1×1010至1×1015个载体基因组/千克(vg/kg)受试者体重的剂量。
76.根据权利要求1至权利要求55所述的AAV载体在制造用于治疗或预防人类受试者的额颞叶痴呆的药剂中的用途。
77.一种DNA质粒，所述DNA质粒包含根据权利要求1至权利要求49所述的AAV载体的所述核苷酸序列。
78.一种用于AAV载体产生的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求77所述的DNA质粒。
79.根据权利要求78所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是HEK293细胞。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码AAVRep蛋白的基因，诸如包含在DNA质粒中的基因。
81.根据权利要求78至权利要求80所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码AAVVP1衣壳蛋白的基因，诸如包含在DNA质粒中的基因。
82.根据权利要求78至权利要求81所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码病毒辅助因子的基因，诸如包含在DNA质粒中的基因。
83.一种制备AAV载体的方法，所述方法包括：在足以允许产生AAV载体的条件下温育根据权利要求82所述的宿主细胞，并纯化由此产生的所述AAV载体。
84.一种通过根据权利要求83所述的方法产生的AAV载体。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019354995B2 (en) 2018-10-02 2024-12-12 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of AAV capsids
KR20240113624A (ko) 2021-11-02 2024-07-22 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav 캡시드 변이체 및 이의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2256265T3 (es) 2000-06-01 2006-07-16 University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de parvovirus duplicados.
US7341847B2 (en) 2003-04-02 2008-03-11 Agency For Science, Technology And Research Promoter construct for gene expression in neuronal cells
EP3210632B1 (en) 2016-02-23 2022-09-28 EyeServ GmbH Gene therapy for the treatment of a retinal degeneration disease
DK3953377T3 (da) * 2019-04-10 2025-12-01 Prevail Therapeutics Inc Genterapier til lysosomale lidelser
CN115715327A (zh) * 2019-10-22 2023-02-24 应用遗传科技公司 用于治疗颗粒蛋白前体相关的神经退行性疾病或病症的腺伴随病毒(aav)系统
US20230203102A1 (en) 2020-05-13 2023-06-29 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
KR20230066360A (ko) * 2020-08-10 2023-05-15 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 신경퇴행성 장애를 위한 유전자 요법

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