CN120648810A - 组合物、试剂盒、其用途及方法 - Google Patents

Abstract

一种组合物、试剂盒、其用途及方法。本申请提供了一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物、试剂盒和检测方法。与现有技术相比，本申请的技术方案解决了单步SNP检测反应中扩增特异性差的问题，即增加对单碱基的识别能力，大大降低非特异性扩增；解决了单步SNP检测反应中准确性差的问题，即增加对单碱基的识别是基于信号的有或无，而不是相对比值；解决了单步SNP检测反应的效率低的问题，即实现在单步SNP检测反应中检测多个SNP位点基因型。

Description

组合物、试剂盒、其用途及方法

技术领域

本文总体涉及基因检测技术，尤指一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物、试剂盒、其用途及检测单核苷酸多态性（SNP）的方法。

背景技术

生物体的遗传物质是链状的脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA），DNA或RNA由四种核苷酸构成，它们的主要特征结构是碱基(Base)，分别是：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶（T）。其中在RNA中胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶(U)取代。A、C、G、T(U)也可分别代表相应的核苷或核苷酸。物种细胞内的一整套遗传物质称基因组，其功能单位为基因。基因组或基因的性能决定于碱基序列。物种的个体之间的差异主要源于基因组或基因中碱基序列的变异。碱基序列的变异有多种机制，包括单个核苷酸置换，如转换、颠换、缺失和插入等。

单核苷酸(碱基)多态性（single nucleotide polymorphism或SNP）是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在群体中的发生频率不小于1%。包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等。转换是指同型碱基之间的转换，如嘌呤与嘌呤(G/A)、嘧啶与嘧啶(T/C)间的替换；颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A/T、A/C、C/G、G/T)之间的替换。依据排列组合原理，SNP一共可以有6种替换情况，即A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T，但事实上，转换的发生频率占多数，而且是C/T转换为主, 在DNA双链结构上C/T的转换也呈现为G/A的转换。

高通量的SNP检测涉及多步反应，缺点是流程复杂、时间长、成本高。如测序法、基因芯片法、高分辨率熔解曲线法、ARMS-PCR法、酶切扩增多态性序列法、荧光标记的单碱基延伸法、质谱法等。这些方法都首先需要对靶分子片段进行扩增，然后用相应技术对基因型进行检侧。

低通量的SNP检测涉及单步反应，但缺点是效率低、特异性和准确性差。如TaqMan探针法、分子信标法、KASP法。这些方法是在核酸的扩增过程中利用引物或分子探针与SNP位点的匹配程度而产生相应信号的强弱差异对SNP进行判定。由于常规核酸扩增对单碱基的识别能力有限(特异性差)，而且检测是基于信号的相对强度，所以准确性差。大多情况下，一个反应只能检测一个SNP位点的多态性(效率低)。

亟需一种高效、高特异性和高准确性的SNP检测方法。

发明内容

基于此，本申请提供了一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物，包括：

用于进行左侧扩增的左侧正向引物组、左侧逆向引物组和左侧探针组，其中左侧逆向引物组中引物的3’端位于SNP位点处的碱基为能够与SNP位点的碱基强配对的第一碱基类似物；和

用于进行右侧扩增的右侧正向引物组、右侧逆向引物组和右侧探针组，其中右侧正向引物组中引物的3’端位于SNP位点处的碱基为能够与SNP位点相应的互补链上的碱基强配对的第二碱基类似物。

在另一方面，本申请还提供了一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的试剂盒，其中，试剂盒包含本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物。

在另一方面，本申请还提供了本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物和本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的试剂盒在单核苷酸多态性（SNP）检测中的用途。

在另一方面，本申请还提供了本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物和本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的试剂盒在多重单核苷酸多态性（SNP）检测中的用途。

在另一方面，本申请还提供了一种用核酸扩增检测单核苷酸多态性（SNP）的方法，包括：

在温控仪上使用本文描述的组合物或本文描述的试剂盒对待测样品进行核酸扩增，根据左侧扩增产物信号的有无以及右侧扩增产物信号的有无来判定样品中SNP的类型。

在另一方面，本申请还提供了一种多重单核苷酸多态性（SNP）检测方法，包括：

在温控仪上使用本文描述的组合物或本文描述的试剂盒对待测样品进行多重核酸扩增，针对每种SNP采用一组用于左侧扩增和右侧扩增的引物组和探针，根据每组中左侧扩增产物信号的有无以及右侧扩增产物信号的有无来判定每种SNP的类型，进而判定样品的基因型。

本申请的技术方案在于同时提供左侧扩增引物对和探针，及右侧扩增引物对和探针；更重要的是引物中与待测SNP位点相对应的3’端碱基为除正常DNA碱基(A，C，G，T)之外的异常碱基。

与现有技术相比，本申请的技术方案解决了单步SNP检测反应中扩增特异性差的问题，即增加对单碱基的识别能力，大大降低非特异性扩增；解决了单步SNP检测反应中准确性差的问题，即增加对单碱基的识别是基于信号的有或无，而不是相对比值；解决了单步SNP检测反应的效率低的问题，即实现在单步SNP检测反应中检测多个SNP位点基因型。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得明显，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1示出了本申请的一种示意性实施方案。

图2示出了本申请的另一种示意性实施方案。

图3示出了本申请的另一种示意性实施方案。

图4示出了本申请的一种实施方案中用于识别A基因型的右侧扩增反应无扩增信号的情况。

图5示出了本申请的一种实施方案中用于识别A基因型的右侧扩增反应有扩增信号的情况。

图6示出了在本申请的一种实施方案中同一体系中左右两侧扩增反应互不干扰，特别是关键的RF与LR两个引物互不干扰。

图7示出了本申请实施例1中乙醛脱氢酶二重扩增检测的示意图。

图8示出了本申请实施例1中乙醛脱氢酶二重扩增检测的扩增结果。

图9示出了本申请实施例1中乙醇脱氢酶二重扩增检测的示意图。

图10示出了本申请实施例1中乙醇脱氢酶二重扩增检测的扩增结果。

图11示出了本申请实施例1中乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶四重扩增的结果。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的技术和科学术语具有与本申请所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及优选的数值下限的形式表述某个量、浓度或其他值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另有说明，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点和该范围内的所有整数和分数(小数)。

术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如在平均值95%的置信区间内)或在指定数值的±10%内，或更宽范围内。

表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制为指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。

表述“至少一种(个)”或“一种(个)或多种(个)”表示1、2、3、4、5、6、7、8、9种(个)或更多种(个)。

在本文中，“碱基类似物”可以与“异常碱基”互换使用。

本申请提供了一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物，包括：

用于进行左侧扩增的左侧正向引物组、左侧逆向引物组和左侧探针组，其中左侧逆向引物组中引物的3’端位于SNP位点处的碱基为能够与SNP位点的碱基强配对的第一碱基类似物；和

用于进行右侧扩增的右侧正向引物组、右侧逆向引物组和右侧探针组，其中右侧正向引物组中引物的3’端位于SNP位点处的碱基为能够与SNP位点相应的互补链上的碱基强配对的第二碱基类似物。

强配对的碱基类似物是指此类似物与A、C、G、和T四者之中的目标碱基有相对最大的配对能力。

在本文其他地方公开的各个方面，引物可以是脱氧核糖核酸，也可以是核糖核酸。引物可包含一个或多个非天然核苷酸。引物可以是正向引物。引物可以是逆向引物。引物的长度可以是约5个至约50个核苷酸。引物的长度可以是至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个或更多个碱基。引物的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或5个核苷酸。引物的长度可以是约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个碱基。

一引物对可包含正向引物(上游引物)和逆向引物(下游引物)。正向引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如，反义链3’端)杂交，而逆向引物可以被配置为与该核酸序列的第二区域(例如，正义链3’端)杂交，从而被配置为在足以进行核酸扩增的条件下扩增具该序列的核酸。不同引物对可以被配置为扩增具不同靶序列的核酸。

在一些实施方案中，提供k组左侧扩增引物对和探针，其中正向引物(LF)在SNP位点 N的左侧，且距SNP位点30碱基以上；提供k组右侧扩增引物对和探针，其中逆向引物(RR)在SNP位点 N的右侧，且距SNP位点30碱基以上。

在一些实施方案中，第一碱基类似物为与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物，第二碱基类似物为与胞嘧啶强配对的鸟嘌呤类似物；或

第一碱基类似物为与胞嘧啶强配对的鸟嘌呤类似物，第二碱基类似物为与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物。

在一些实施方案中，与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物包括尿嘧啶、尿嘧啶衍生物或胸腺嘧啶衍生物，与胞嘧啶强配对的鸟嘌呤类似物包括次黄嘌呤、6-硫鸟嘌呤、5-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或7-去氮杂次黄嘌呤；

优选地，与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物包括如下碱基或核苷的碱基:溴脱氧尿苷（BrdU）、S-香叶基-2-硫尿苷（S-Geranyl-2-thiouridine）、尿苷(U，1)、2-硫尿苷(s2U，2)、5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷(mnm5s2U，3)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷(cmnm5s2U，4)、5-氟尿嘧啶、替加氟（Tegafur）、卡莫氟（carmofur）或5-氟脱氧尿苷（floxuridine）。

在一些实施方案中，与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物(碱基或核苷的碱基)为选自下式的化合物：

。

在一些实施方案中，与胞嘧啶强配对的鸟嘌呤类似物为选自下式的化合物(碱基或核苷的碱基)：

。

在一些实施方案中，左侧扩增的产物和右侧扩增的产物的包含SNP位点且在SNP位点两侧共有30bp-60bp的相同序列（参见图1中RF和LR之间的共有片段）。在一些实施方案中，左侧扩增的产物和右侧扩增的产物的包含SNP位点且在SNP位点两侧共有30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、55bp或60bp的相同序列。

在一些实施方案中，左侧探针组中的探针的两端修饰有荧光报告基团和与荧光猝灭基团，并且右侧探针组中的探针修饰有另一种荧光报告基团和荧光猝灭基团；

优选地，荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX和CY5，荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB。

在本文中，“检测探针”、“探针”和“寡核苷酸探针”可互换使用。探针可以是核酸(例如，DNA、RNA等)。探针可包含与靶核酸的区域互补的区域。探针的浓度可以使其相对于检测混合物中的其他组分过量。探针可以是信号生成核酸探针。信号生成核酸探针可包含如本文所述的探针的特征，以及在施加刺激、修饰探针或水解探针后生成信号的特征。例如，探针可以被聚合酶的外切核酸酶活性水解，从而生成信号。信号生成核酸探针可以生成如本文其他地方所述的任何信号。例如，所述信号生成探针可以生成荧光信号。信号生成探针可包含信号标签。信号标签可以生成信号。信号标签可以响应于反应或刺激而生成信号。例如，信号标签可以在通过外切核酸酶活性降解后生成信号。

在一些实施方案中，可在探针与核酸区域杂交的同时生成信号。例如，探针(例如，分子信标)可以在与核酸杂交后生成信号(例如，荧光信号)。在一些情况下，可在探针与核酸区域杂交之后，在探针被核酸酶降解之后生成信号。在探针包含信号标签的情况下，该探针当与引物的区域结合时可以被降解，从而生成信号。例如，探针(例如，探针)可以在探针与核酸杂交并且随后被聚合酶降解(例如，在扩增如PCR扩增过程中)之后生成信号。探针可以被核酸酶的外切核酸酶活性降解。

在一些实施方案中，探针序列的两端修饰有荧光报告基团和与荧光报告基团对应的荧光猝灭基团。两端修饰有荧光报告基团和荧光猝灭基团的探针用于在qPCR中显示合成的DNA产物的相对的量。在无扩增时，探针序列两端的荧光报告基团和荧光猝灭基团在一起，荧光报告基团的荧光被荧光猝灭基团所猝灭，不发出荧光。当PCR合成开始时，探针序列与基因组DNA中的目的片段互补配对，能退火到一起。如果样品中存在目的微生物(即存在目的片段)，探针序列就能结合到目的片段。当PCR反应开始后，如果PCR反应能够发生，则具有外切酶活性的耐热DNA聚合酶，如Taq DNA 聚合酶或Pfu聚合酶就能将与目的片段结合的探针序列解离，进而使得荧光报告基团与荧光猝灭基团分离开，此时，就能检测到荧光报告基团所发出的荧光了。随着PCR反应的进行，合成的DNA扩增产物越多，被解离的荧光报告基团也就越多。通过检测荧光强度，就能精确定量DNA扩增产物的量。

在一些实施方案中，荧光报告基团和荧光猝灭基团可以选用本领域技术人员在进行qPCR常用的各种荧光报告基团和相应的荧光猝灭基团。在一些实施方案中，荧光报告基团可以选自FAM、VIC、HEX、ROX或CY5，与之相对应的，荧光猝灭基团可以选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB。

在另一方面，本申请还提供了一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的试剂盒，其中，试剂盒包含本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物。

在一些实施方案中，试剂盒还包含具有聚合酶活性的耐热酶和具有3’-5’外切酶活性的耐热酶，或包含具有3’-5’外切酶活性的耐热聚合酶。

在一些实施方案中，试剂盒还包含dNTP、金属阳离子、蛋白保护剂和缓冲液中的一种或更多种。

在一些实施方案中，试剂盒可包含如本文所述的引物。引物可以被配置为扩增与特定靶标相对应的核酸序列。例如，正向引物可以被配置为与核酸序列的第一区域(例如，反义链3’端)杂交，而逆向引物可以被配置为与该核酸序列的第二区域(例如，正义链3’端)杂交，从而被配置为扩增具该序列的核酸。被配置为扩增核酸分子的引物可以在进行所公开的方法中使用。在一些情况下，试剂盒中的所有引物都被冻干。在一些情况下，试剂盒中的所有成分都被冻干(全组分冻干)。

试剂盒可包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以是核酸聚合酶。核酸聚合酶可以是脱氧核糖核酸聚合酶(DNA酶)。DNA酶可以是Taq聚合酶或其变体, 可以是Pfu聚合酶或其变体。核酸酶可以是核糖核酸聚合酶(RNA酶)。RNA酶可以是RNA酶III。核酸酶可以是外切核酸酶。外切核酸酶可以是核酸外切酶I, 核酸外切酶III, 核酸外切酶V, 核酸外切酶VII, 核酸外切酶VIII, 核酸外切酶P1, 核酸外切酶T。核酸酶可能能够降解包含非天然核苷酸的核酸。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Phusion聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。DNA聚合酶可以具有5’-3’外切酶活性或具有3’-5’外切酶活性。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热曲线。核酸酶在适当条件下能够降解探针。例如，核酸酶可以是聚合酶，并且具有外切活性并降解探针，从而产生可检测的信号。核酸酶在适当条件下可能能够从探针释放猝灭剂。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包含关于在本文所述的方法中使用任何前述物质的说明书。试剂盒中可以提供检测试剂，包括引物、探针、带有结合探针的固相支持物、以及其它检测试剂，和适当的说明书和其它需要的试剂，以便进行如本文描述的检测。通常，试剂盒在单独的容器中包含：引物和探针的组合(或是已经结合到固相支持物；或是单独地，带有将它们结合到基质的试剂)、对照配制物(阳性和/或阴性)、标记试剂—当检测形式需要时、和信号产生试剂(例如酶底物)—如果标记不直接产生信号。进行检测的说明书(例如，书写的、磁带、VCR、CD-ROM等)通常包含在试剂盒中。根据所应用的具体检测，试剂盒也可以包含其它的包装试剂和材料(即，洗脱缓冲液等)。用这些试剂盒可以进行标准的检测，如本文描述的检测。说明书一般记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以被印刷在基底如纸或者塑料等上。同样地，说明书可以作为包装插页(package insert)存在于试剂盒中、在试剂盒或其组分的容器的标签(例如，与包装或者分包装相连)中等。在其它的实施方式中，说明书作为合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，介质例如CD-ROM、磁盘等，包括其上存在程序的相同介质。试剂盒也可以含有说明书，用于使用试剂盒。本试剂盒中也可以包括缓冲液、dNTPs和对照(例如，阳性和阴性对照核酸)，用于实施本方法。本试剂中的引物可以被可检测地标记或者不标记。

在另一方面，本申请还提供了本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物和本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的试剂盒在单核苷酸多态性（SNP）检测中的用途。

在另一方面，本申请还提供了本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物和本文描述的用于检测单核苷酸多态性（SNP）的试剂盒在多重单核苷酸多态性（SNP）检测中的用途。

在另一方面，本申请还提供了一种用qPCR检测单核苷酸多态性（SNP）的方法，包括：

在温控仪上使用本文描述的组合物或本文描述的试剂盒对待测样品进行qPCR，根据左侧扩增产物信号的有无以及右侧扩增产物信号的有无来判定样品中SNP的类型。

在另一方面，本申请还提供了一种多重单核苷酸多态性（SNP）检测方法，包括：

在温控仪上使用本文描述的组合物或本文描述的试剂盒对待测样品进行多重qPCR，针对每种SNP采用一组用于左侧扩增和右侧扩增的引物组和探针，根据每组中左侧扩增产物信号的有无以及右侧扩增产物信号的有无来判定每种SNP的类型，进而判定样品的基因型。

温控仪为可以自动控制温度且用于生物化学反应的仪器。它可包括恒温核酸扩增仪，非热循环温控仪(如产生热对流的多温区核酸扩增仪)以及热循环PCR扩增仪。

核酸扩增指随着时间的变化，核酸分子数量増加的反应过程。如聚合酶链反应(PCR，qPCR)，环介导等温扩增(LAMP)，重组酶聚合酶扩增(RPA)，滚环扩增(RCA)，交叉引物扩增(CPA)，链置换扩增(SDA)，解旋酶依赖性扩增(HAD)。

核酸扩增还包括用非热循环温控仪使反应体系进行热对流而实现的类似PCR的非同步扩增反应(热对流PCR)。与qPCR相似，当使用分子探针时，热对流PCR也可作相对定量。为方便描述起见，本申请中PCR或qPCR包括热对流PCR或热对流qPCR。

扩增产物信号可以是核酸扩增反应中分子探针产生的荧光信号。信号的有无是相对所设定的阈值，无信号是指信号小于阈值，有信号是指大于阈值。在一些实施方案中，待测样品可以是生物样品。样品可以来源于生物样品。生物样品可以是，例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便或泪液。生物样品可以是流体样品。流体样品可以是血液或血浆。

图1示出了本申请的一种示例性实施方案，在该实施方案中，建立一个反应体系，包括：提供一个核酸样本，包括k个待测SNP位点，其中k=1至100；提供k组左侧扩增引物对和探针，其中正向引物(LF)在SNP位点N的左侧，且距N位点30碱基以上，逆向引物(LR)在N的右侧，且有一与N位点相对应的3’端碱基n’；任选地，探针LP位于二引物之间，且具有一猝灭基团和一荧光基团；提供k组右侧扩增引物对和探针，其中逆向引物(RR)在SNP位点N的右侧，且距N位点30碱基以上，正向引物(RF)在N的左侧，且有一与N位点相对应的3’端碱基n；任选地，探针RP位于二引物之间，且具有一猝灭基团和一荧光基团；提供一个具聚合酶活性的耐热性酶；提供一个具3’-5’外切酶活性耐热性酶。在同一反应体系中同时进行左侧和右侧扩增，检测2xk个信号，判断3xk个基因型。其中：N和N’为正常DNA核苷酸碱基A、C、G、T，且N与N’互补。当N为嘌呤(A或G)时，n=嘌呤类异常碱基，n’=嘧啶类异常碱基，仅左侧扩增阳性（即存在左侧扩增的产物）时为GG基因型，仅右侧扩增阳性（即存在右侧扩增的产物）时为AA基因型，两侧扩增阳性时为AG基因型；当N为嘧啶(C或T)时，n=嘧啶类异常碱基，n’=嘌呤类异常碱基，仅左侧扩增阳性时为CC基因型，仅右侧扩增阳性时为TT基因型，两侧扩增阳性时为CT基因型。

图2示出了本申请的另一种示例性实施方案，该实施方案示出了对A/G转换型SNP的检测。其中，左侧扩增引物对的逆向引物(LR)在SNP的右侧，与SNP位点相对应的3’端的异常碱基为与A强配对的胸腺嘧啶(T)类似物(m’)，用于检测的SNP位点为G碱基。右侧扩增引物对的正向引物(RF)在SNP的左侧，与SNP位点相对应的3’端的异常碱基为与C强配对的鸟嘌呤(G)类似物(p’)，用于检测的SNP位点为A碱基。

图3示出了本申请的另一种示例性实施方案，该实施方案示出了对C/T转换型SNP的检测。其中，左侧扩增引物对的逆向引物(LR)在SNP的右侧，与SNP位点相对应的3’端的异常碱基为与C强配对的鸟嘌呤(G)类似物(p’)，用于检测的SNP位点为T碱基。右侧扩增引物对的正向引物(RF)在SNP的左侧，与SNP位点相对应的3’端的异常碱基为与A强配对的胸腺嘧啶(T)类似物(m’)，用于检测的SNP位点为C碱基。

图4和图5示出了本申请的一种实施方案中用于识别A基因型的右侧扩增反应。基于同一原理，左侧扩增反应可识别G基因型。如图4所示，在PCR扩增中，作为引物末端的一部分，当异常碱基与模板中相应SNP碱基有(强)配对时，异常碱基可被延伸而被保留在新的DNA链中；在下轮的扩增中此链将作为模板被复制，但当聚合酶遇到模板中的异常碱基时，核苷酸掺入速度减慢甚至停止，导致扩增效率低下或不扩增。如图5所示，同样在PCR扩增中，作为引物末端的一部分，当异常碱基与模板中相应SNP碱基不(弱)配对时，异常碱基可被体系中的外切酶除去(校对作用），然后引物延伸形成新DNA链；在下轮的扩增中此链将作为模板被复制，因模板中不存在异常碱基，核苷酸掺入速度不会减慢或停止，所以扩增效率正常。

从图1-图5中技术方案可以看到，通过本申请的示意性方案，解决了单步SNP检测反应中扩增特异性差问题，即增加对单碱基的识别能力，大大降低非特异性扩增；同时解决了单步SNP检测反应中准确性差问题，即增加对单碱基的识别是基于信号的有或无，而不是相对比值。

图6示出了在本申请的一种实施方案中同一体系中左右两侧扩增反应互不干扰，特别是关键的RF与LR两个引物互不干扰。当反应体系中存在多个具末端异常碱基的引物时，它们之间不会形成引物二聚体(见图6)，因而可实现在单步SNP检测反应中检测多个SNP位点基因型，这样也解决了单步SNP检测反应的效率低问题。

本申请描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说明显的是，在本申请所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征或元件可以与任何其它实施例中的任何其他特征或元件结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征或元件。

本申请包括并设想了与本领域普通技术人员已知的特征和元件的组合。本申请已经公开的实施例、特征和元件也可以与任何常规特征或元件组合，以形成独特的发明方案。任何实施例的任何特征或元件也可以与来自其它发明方案的特征或元件组合，以形成另一个独特的发明方案。因此，应当理解，在本申请中示出和/或讨论的任何特征可以单独地或以任何适当的组合来实现。因此，除了根据所附权利要求及其等同替换所做的限制以外，实施例不受其它限制。此外，可以在所附权利要求的保护范围内进行各种修改和改变。

此外，在描述具有代表性的实施例时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤序列。然而，在该方法或过程不依赖于本文所述步骤的特定顺序的程度上，该方法或过程不应限于所述的特定顺序的步骤。如本领域普通技术人员将理解的，其它的步骤顺序也是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对该方法和/或过程的权利要求不应限于按照所写顺序执行它们的步骤，本领域技术人员可以容易地理解，这些顺序可以变化，并且仍然保持在本申请实施例的精神和范围内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另有定义或说明，本申请中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。

实施例

实施例1.乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶SNP基因型的检测

酒精代谢主要测乙醇脱氢酶上的rs1229984位点和乙醛脱氢酶上的rs671位点，每个位点各有三种基因型：

针对这两个位点，分别设计了如下表所示的引物和探针：

采样方法：

取1mL保存液置于EP管中，使用牙签轻轻刮取口腔内壁，将牙签刮取口腔内壁的一端在保存液中涮几次，最后丢弃牙签。得到的样本不加热不离心直接上样。

乙醛脱氢酶二重扩增检测的示意图如图7所示，扩增结果如图8所示。可以看到，通过qPCR可以很好地区分出乙醛脱氢酶Rs761位点的AA、GG、GA基因型。

乙醇脱氢酶二重扩增检测的示意图如图9所示，扩增结果如图10所示。可以看到，通过qPCR可以很好地区分出乙醇脱氢酶Rs1229984位点的TT、CT、CC基因型。

乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶四重扩增的结果如图11所示。可以看到，通过qPCR可以很好地区分出乙醛脱氢酶Rs761位点和乙醇脱氢酶Rs1229984位点的各种基因型的组合。

尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的组合物，包括：

用于进行左侧扩增的左侧正向引物组、左侧逆向引物组和左侧探针组，其中所述左侧逆向引物组中引物的3’端位于所述SNP位点处的碱基为能够与所述SNP位点的碱基强配对的第一碱基类似物；和

用于进行右侧扩增的右侧正向引物组、右侧逆向引物组和右侧探针组，其中所述右侧正向引物组中引物的3’端位于所述SNP位点处的碱基为能够与所述SNP位点相应的互补链上的碱基强配对的第二碱基类似物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一碱基类似物为与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物，所述第二碱基类似物为与胞嘧啶强配对的鸟嘌呤类似物；或

所述第一碱基类似物为与胞嘧啶强配对的鸟嘌呤类似物，所述第二碱基类似物为与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物包括尿嘧啶、尿嘧啶衍生物或胸腺嘧啶衍生物，所述与胞嘧啶强配对的鸟嘌呤类似物包括次黄嘌呤、6-硫鸟嘌呤、5-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或7-去氮杂次黄嘌呤；

优选地，所述与腺嘌呤强配对的胸腺嘧啶类似物包括如下碱基或核苷的碱基：溴脱氧尿苷（BrdU）、S-香叶基-2-硫尿苷（S-Geranyl-2-thiouridine）、尿苷(U，1)、2-硫尿苷(s2U，2)、5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷(mnm5s2U，3)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷(cmnm5s2U，4)、5-氟尿嘧啶、替加氟（Tegafur）、卡莫氟（carmofur）或5-氟脱氧尿苷（floxuridine）。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述左侧扩增的产物和所述右侧扩增的产物包含SNP位点且在SNP位点两侧共有30bp-60bp的相同序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述左侧探针组中的探针的两端修饰有荧光报告基团和与荧光猝灭基团，并且所述右侧探针组中的探针修饰有另一种荧光报告基团和荧光猝灭基团；

优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX和CY5，所述荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB。

6.一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求1-5中任一项所述的组合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含具有聚合酶活性的耐热酶和具有3’-5’外切酶活性的耐热酶，或包含具有3’-5’外切酶活性的耐热聚合酶。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含dNTP、金属阳离子、蛋白保护剂和缓冲液中的一种或更多种。

9.权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6-8中任一项所述的试剂盒在单核苷酸多态性（SNP）检测中的用途。

10.权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6-8中任一项所述的试剂盒在多重单核苷酸多态性（SNP）检测中的用途。

11.一种用核酸扩增方法检测单核苷酸多态性（SNP）的方法，包括：

在温控仪上使用权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6-8中任一项所述的试剂盒对待测样品进行核酸扩增，根据左侧扩增产物信号的有无以及右侧扩增产物信号的有无来判定样品中SNP的类型。

12.一种多重单核苷酸多态性（SNP）检测方法，包括：

在温控仪上使用权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6-8中任一项所述的试剂盒对待测样品进行多重核酸扩增，针对每种SNP采用一组用于左侧扩增和右侧扩增的引物组和探针，根据每组中左侧扩增产物信号的有无以及右侧扩增产物信号的有无来判定每种SNP的类型，进而判定样品中的基因型。