CN120617139A - 一种针对敏感肌损伤修复的护肤油组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对敏感肌损伤修复的护肤油组合物及其应用，所述护肤油组合物包含微生物油脂与基础油脂，所述微生物油脂以紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物为底物，利用裂殖壶菌与植物乳杆菌对底物进行发酵，发酵得到的微生物油脂具有良好的修复皮肤损伤的效果。

Description

一种针对敏感肌损伤修复的护肤油组合物及其应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种针对敏感肌损伤修复的护肤油组合物及其应用。

背景技术

敏感肌肤由于角质层薄弱、屏障功能受损，易受外界刺激引发红肿、瘙痒等问题。现有的修复产品多采用天然植物油脂（如霍霍巴油、橄榄油）或化学合成成分，存在修复效果有限、致敏风险较高的问题。近年来，微生物发酵技术因其产物天然、活性成分丰富的特点受到关注，但现有技术中仍存在以下局限性：（1）单一菌种发酵产油效率低，代谢产物单一；（2）传统培养基多采用单一碳源（如葡萄糖），缺乏对菌种代谢途径的协同激活作用；（3）发酵产物中活性成分与皮肤修复需求的匹配度不足，功效验证体系不完善。因此，亟需开发一种通过多菌协同发酵、复合植物底物定向调控代谢的新型微生物油脂，以实现敏感肌的高效修复。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种针对敏感肌损伤修复的护肤油组合物及其应用，所述护肤油组合物包含微生物油脂与基础油脂，所述微生物油脂以紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物为底物，利用裂殖壶菌与植物乳杆菌对底物进行发酵，发酵得到的微生物油脂具有良好的修复皮肤损伤的效果。

为实现上述目的，本发明公开了以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种微生物油脂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：使用GYP培养基将裂殖壶菌培养至1×10⁸-1×10¹⁰CFU/mL，使用MRS培养基将植物乳杆菌培养至1×10⁸-1×10¹⁰CFU/mL，将培养后的裂殖壶菌、植物乳杆菌混合得到混合菌液；

步骤2：将混合菌液接种至特定培养基中进行发酵，待发酵结束后，滤去不溶物，得到发酵滤液；

步骤3：向发酵滤液中添加溶壁酶，在50±5℃下搅拌1-3h使菌裂解；按1：1：1(发酵液：乙醇：正己烷)(v/v)比例分别添加乙醇、正己烷，搅拌、分层、萃取，连续萃取2-3次，取正己烷相，真空旋转蒸干溶剂，获取油脂。将得到的油脂放在烘箱中105℃烘至恒重后得到微生物油脂；

所述裂殖壶菌保藏编号为CGMCC No.14574；所述植物乳杆菌保藏编号为GDMCCNo.62633；

所述步骤1混合菌液中裂殖壶菌与植物乳杆菌活菌数比为1：（0.5-0.7）；

所述特定培养基包括紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水；

所述步骤2中混合菌液的接种量为特定培养基的8-10v/v%；

所述步骤3中溶壁酶占发酵滤液的1-3wt%。

优选地，所述特定培养基中紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水的质量比为1：（0.4-0.6）：（0.5-1.5）：（2-4）：（1-3）：（0.5-1.5）：（0.07-0.08）：（0.04-0.06）：（0.05-0.15）：（0.5-1.5）：（40-43）。

优选地，所述步骤2中发酵时间为48-96h、温度为28-35℃、pH为6.5±0.2、通气量为0.5-0.8vvm。

优选地，所述步骤3中搅拌使菌裂解的转速为2000-3000r/min，pH为7±0.5，温度为30±5℃，时间为1-3h。

第二方面，本发明提供第一方面所述制备方法所制备的微生物油脂在制备护肤品的应用。

第三方面，本发明提供一种具有损伤修复功效的护肤油组合物，所述护肤油组合物包括以下质量份组分：

第一方面所述制备方法所制备的微生物油脂：1-5wt%；

基础油脂补至100wt%。

优选地，所述基础油脂为霍霍巴油、椰子油、鳄梨油、菜籽油、花生油、橄榄油、大豆油中的至少一种。

有益效果

本申请所述特定培养基中包含紫苏籽粉、杏仁粉和山茶籽粉，上述组合可提供多元不饱和脂肪酸（α-亚麻酸、油酸）及黄酮类物质，协同促进微生物合成如DHA等长链多不饱和脂肪酸。实验显示，采用常规底物进行发酵，所得到的发酵产物其皮肤修复功效低于采用本发明所限定的底物得到的发酵产物，其可能的原因是因为底物成分的多样化从而导致微生物代谢产生更加丰富的代谢产物，而代谢产物中的活性物质(如黄酮类、脂肪酸类活性物质)影响其修复皮肤屏障功效。

本发明的混合菌液中包括裂殖壶菌（CGMCC No.14574）与植物乳杆菌（CGMCCNo.5494），上述菌种混合培养可显著提升产油率。实验显示，裂殖壶菌（CGMCC No.14574）与植物乳杆菌（CGMCC No.5494）以活菌比1：(0.5-0.7)混合发酵，产油量达46.74 g/L，较单裂殖壶菌发酵（38.2 g/L）提升8.54 g/L。其可能的原因是，植物乳杆菌通过分泌乳酸优化发酵环境，抑制杂菌生长，同时植物乳杆菌发酵后产生的丰富酶系促进了紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉等底物产生更多的可溶性糖类，提高碳源利用率。

人体试验表明，含3wt%本发明制备微生物油脂的护肤组合物在4小时内使受损皮肤经皮水分流失改善率达20.37%-21.19%。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中部分原料来源如下：

裂殖壶菌的保藏编号为CGMCC No.14574。

植物乳杆菌的保藏编号为GDMCC No.62633。

紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉购自：亳州市永正药业有限公司，各原料购买后分别打粉，过80目筛，分别密封避光保存。

葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物购自阿拉丁。

溶壁酶购自：广东大小化工有限公司，酶活200U/mg。

市售裂殖壶菌，购自：武汉睿辰标物科技有限公司，货号：BNCC336882。

市售植物乳杆菌，购自：肽爱生物科技有限公司，货号：TA-2022082904。

菌种活化：

裂殖壶菌在制备微生物油脂前先使用GYP培养基将裂殖壶菌培养至活菌数为1×10⁸CFU/mL，待用。

植物乳杆菌在制备微生物油脂前先使用MRS培养基将植物乳杆菌培养至活菌数为1×10⁸CFU/mL，待用。

下述制备方法中所述裂殖壶菌、植物乳杆菌均为活化后的裂殖壶菌与植物乳杆菌。

微生物油脂的制备方法，具体如下：

微生物油脂1：

步骤1：将裂殖壶菌与植物乳杆菌以活菌比为1：0.6混合，得到混合菌液；

步骤2：将混合菌液以9v/v%接种至灭菌后的特定培养基中进行发酵，待发酵结束后，滤去不溶物，得到发酵滤液，其中特定培养基由质量比为1：0.5：1.3：3：2：1：0.075：0.05：0.1：1：42的紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，发酵时间为72h，发酵温度为30℃，发酵pH为6.5，发酵通气量为0.7vvm。

步骤3：向发酵滤液中添加溶壁酶，在50℃下搅拌2h使菌裂解；按1：1：1(发酵液：乙醇：正己烷)(v/v)比例分别添加乙醇、正己烷，搅拌、分层、萃取，连续萃取3次，取正己烷相，真空旋转蒸干溶剂，获取油脂。将得到的油脂放在烘箱中105℃烘至恒重后得到微生物油脂，其中溶壁酶的添加量占发酵滤液的2wt%,搅拌使菌裂解转速为3000r/min，裂解pH为7。

微生物油脂2：

步骤1：将裂殖壶菌与植物乳杆菌以活菌比为1：0.5混合，得到混合菌液；

步骤2：将混合菌液以9v/v%接种至灭菌后的特定培养基中进行发酵，待发酵结束后，滤去不溶物，得到发酵滤液，其中特定培养基由质量比为1：0.4：1.5：2：1：0.5：0.08：0.04：0.05：1.5：41的紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，发酵时间为48h，发酵温度为28℃，发酵pH为6.7，发酵通气量为0.8vvm。

步骤3：向发酵滤液中添加溶壁酶，在45℃下搅拌1h使菌裂解；按1：1：1(发酵液：无水乙醇：正己烷)(v/v)比例分别添加无水乙醇、正己烷，搅拌、分层、萃取，连续萃取2次，取正己烷相，真空旋转蒸干溶剂，获取油脂。将得到的油脂放在烘箱中105℃烘至恒重后得到微生物油脂，其中溶壁酶的添加量占发酵滤液的3wt%,搅拌使菌裂解转速为3000r/min，裂解pH为7.5。

微生物油脂3：

步骤1：将裂殖壶菌与植物乳杆菌以活菌比为1：0.7混合，得到混合菌液；

步骤2：将混合菌液以9v/v%接种至灭菌后的特定培养基中进行发酵，待发酵结束后，滤去不溶物，得到发酵滤液，其中特定培养基由质量比为1：0.6：0.5：4：3：1.5：0.07：0.06：0.15：0.5：43的紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，发酵时间为96h，发酵温度为35℃，发酵pH为6.3，发酵通气量为0.5vvm。

步骤3：向发酵滤液中添加溶壁酶，在55℃下搅拌3h使菌裂解；按1：1：1(发酵液：无水乙醇：正己烷)(v/v)比例分别添加无水乙醇、正己烷，搅拌、分层、萃取，连续萃取2次，取正己烷相，真空旋转蒸干溶剂，获取油脂。将得到的油脂放在烘箱中105℃烘至恒重后得到微生物油脂其中溶壁酶的添加量占发酵滤液的1wt%,搅拌使菌裂解转速为2000r/min，裂解pH为6.5。

微生物油脂①：

与微生物油脂1不同的是，使用等量的裂殖壶菌替换混合菌液中的植物乳杆菌，即仅使用裂殖壶菌进行单一菌种发酵，其余步骤及参数同微生物油脂1。

微生物油脂②：

与微生物油脂1不同的是，使用等量的市售裂殖壶菌替换混合菌液中特定保藏号的裂殖壶菌，其余步骤及参数同微生物油脂1。

微生物油脂③：

与微生物油脂1不同的是，使用等量的市售植物乳杆菌替换混合菌液中特定保藏号的植物乳杆菌，其余步骤及参数同微生物油脂1。

微生物油脂④：

与微生物油脂1不同的是，混合菌液中裂殖壶菌与植物乳杆菌活菌数比为1：0.8，其余步骤及参数同微生物油脂1。

微生物油脂A：

与微生物油脂1不同的是，所述培养基由质量比为3：2：1：0.075：0.05：0.1：1：42的葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，且培养基的总质量、其余步骤及参数同微生物油脂1。

微生物油脂B：

与微生物油脂1不同的是，所述培养基由质量比为0.5：1.3：3：2：1：0.075：0.05：0.1：1：42的杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，且培养基的总质量、其余步骤及参数同微生物油脂1。

微生物油脂C：

与微生物油脂1不同的是，所述培养基由质量比为1：1.3：3：2：1：0.075：0.05：0.1：1：42的紫苏籽粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，其余参数同微生物油脂1。

微生物油脂D：

与微生物油脂1不同的是，所述培养基由质量比为1：0.5：3：2：1：0.075：0.05：0.1：1：42的紫苏籽粉、杏仁粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，其余参数同微生物油脂1。

微生物油脂E：

与微生物油脂1不同的是，所述培养基由质量比为1：1.3：0.5：3：2：1：0.075：0.05：0.1：1：42的紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水组成，其余参数同微生物油脂1。

对微生物油脂1、微生物油脂①-④、微生物油脂A-E所述制备方法所制备的微生物油脂产量进行称量，记录数据，每组试验平行3次取均值，表1结果以平均值表示。

表 1 微生物对产油量的影响

试验组	产油量g/L
		微生物油脂1	46.74
微生物油脂①	38.2
		微生物油脂②	37.82
微生物油脂③	41.37
		微生物油脂④	43.61

表 2底物对产油量的影响

试验组	产油量g/L
		微生物油脂1	46.74
微生物油脂A	35.55
		微生物油脂B	31.68
微生物油脂C	32.26
		微生物油脂D	33.52
微生物油脂E	38.94

表1结果中：

对比微生物油脂1与微生物油脂①结果可知，植物乳杆菌可有效促进裂殖壶菌产生微生物油脂，其原理可能为植物乳杆菌生长过程中所产生的乳酸、乙酸等短链脂肪酸为裂殖壶菌提供辅助碳源，且通过产酸降低生长环境pH，抑制其他微生物生长，间接优化裂殖壶菌的生长环境，此外，植物乳杆菌可以将复杂有机物分解为可溶性糖类，提高裂殖壶菌对碳源的利用率，再者植物乳杆菌分泌的维生素或生长因子可能弥补裂殖壶菌的营养需求。

对比微生物油脂1与微生物油脂②-③结果可知，使用本发明所限定的植物乳杆菌和裂殖壶菌制备微生物油脂，二者具有协同增产效果。

对比微生物油脂1与微生物油脂④结果可知，植物乳杆菌与裂殖壶菌在本发明所限定的活菌数配比范围内存在较好的协同增产效果，超过本发明所限定活菌数配比后，可能因为植物乳杆菌生长优势过快，从而快速消耗环境资源，且其产酸效果明显会导致环境pH过度下降，从而降低裂殖壶菌产油率。

表2结果中：

对比微生物油脂1与微生物油脂A-D结果可知，紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉可有效提升复合菌种产油率，其原理可能为：紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽油为菌种提供油酸、氮源、维生素形成全面营养支持，此外因为三种原料中提供不同的脂肪酸类型，可能会激活多条脂质合成途径，从而增加油脂的多样性及产量，再者又因植物中所蕴含的黄酮类、多酚类抗氧化成分可以减少氧化损伤。

对比微生物油脂1与微生物油脂E结果可知，紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉可有效提升复合菌种的产油率，在本发明所限定的质量比范围内，其促进效率更优。

功效检测：

对微生物油脂1-3、微生物油脂①-④、微生物油脂A-E所述制备方法所制备的微生物油脂进行功效检测，检测其致敏性及修复功效。

皮肤屏障修复功效检测：

实验方法：

测试样品：微生物油脂1-3、微生物油脂①-④、微生物油脂A-E。

测试样品配制：使用基础油脂将微生物油脂稀释为3wt%，所述基础油脂为霍霍巴油。

测试对象：选择28-45岁、皮肤状况接近的敏感肌志愿者，性别随机，将所有志愿者随机分组，每组10人。

测试方法：

志愿者到访当天，静坐20min，在左或右前臂上选择2个2.5cm×4cm大小的区域，建立两个测试区域，测试前使用皮肤水分流失测试探头测量每个区域的初始经皮水分流失值TEWL(T0），然后进行胶带剥离30次，十分钟后测量TEWL(T0'）计算T0与T0'之间的数值判断是否建模成功，待建模成功后，将样品随机涂抹与一个测试区域，另一个区域涂抹安慰剂，在4h后测试各个区域的TEWL值（T1）。每组志愿者测试1个样品和1个安慰剂组（仅使用霍霍巴油）。

皮肤经皮失水变化率V=（T0'-T1）/（T0'-T0）*100%；

皮肤经皮失水改善率=（V样品-V安慰剂）/V安慰剂*100%。

经皮水分流失TEWL值是反应角质层屏障功能的常用指标，TEWL值越低代表皮肤屏障功能越好。在手臂进行胶带撕拉后皮肤角质层受损，TEWL值升高，随后皮肤进行自发修复，TEWL值随着时间增加而降低，具有修护功效的产品可以加速这一过程。

实验结果与表3所示。

表 3皮肤屏障改善率

试验组	4h改善率平均值/%
		微生物油脂1	23.19
微生物油脂2	22.62
		微生物油脂3	22.37
微生物油脂①	17.34*
		微生物油脂②	19.27*
微生物油脂③	18.15*
		微生物油脂④	20.33*
微生物油脂A	7.51*
		微生物油脂B	16.24*
微生物油脂C	14.29*
		微生物油脂D	13.16*
微生物油脂E	18.03*

注：“*”表示与微生物油脂1相比，p＜0.05。

据表3结果可知，对比微生物油脂1-3、微生物油脂①-④及微生物油脂A-E结果，底物的改变对其功效影响较大，对比结果得出，底物中紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉对其产物的功效影响较大，可能是因为底物成分的多样化从而导致微生物代谢产物更加丰富，代谢产物中的活性物质可能影响其修复皮肤屏障功效。

安全性试验：

敏感肌肤人体试验

受试物：微生物油脂1-3。

受试物配制：使用霍霍巴油将受试物稀释为3wt%。

受试者选择：选取年龄在21-44周岁的健康志愿者，符合乳酸刺痛试验阳性（敏感肌），自愿参加并签署知情同意书，能在测试期间按要求完成试验，随机分组，每组设置30名受试者。

测试方法：将受试物放入斑试器中，用量为0.020-0.025g，将加有受试物的斑试器用无刺激布基胶带覆于受试者背部或前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀贴附在皮肤表面，持续24小时，去除受试斑试器后30分钟，待压痕消失后观察皮肤反应。若结果为阴性，于斑贴试验后24小时和48小时分别再次进行观察。

结果评价：皮肤不良反应分级按照《化妆品安全技术规范》（2015版）中规定的人体试用试验皮肤不良反应分级来判断，分级标准见表4，结果见表5。

表 4皮肤不良反应分级标准

等级分类	现象
		0级	皮肤无反应
1级	皮肤出现淡红斑
		2级	皮肤出现红斑、浸润和丘疹
3级	皮肤出现红斑、水肿、丘疹和水疱
		4级	皮肤出现红斑、水肿和大疱

表 5人体试用试验结果

人体安全性测试结果：

从敏感肌适用测试的结果来看，在测试周期内，微生物油脂1-3均无受试者出现皮肤不良反应，说明微生物油脂1-3的安全性良好，温和不刺激，且适用于敏感肌肤人群。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种微生物油脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将活化后的裂殖壶菌、植物乳杆菌混合得到混合菌液；

步骤2：将混合菌液接种至特定培养基中进行发酵，待发酵结束后，滤去不溶物，得到发酵滤液；

步骤3：向发酵滤液中添加溶壁酶搅拌使菌裂解，裂解后添加乙醇和正己烷进行萃取，取正己烷相，蒸干溶剂后再烘干至恒重，得微生物油脂；

所述裂殖壶菌的保藏编号为CGMCC No.14574；所述植物乳杆菌的保藏编号为GDMCCNo.62633；

所述步骤1混合菌液中裂殖壶菌与植物乳杆菌活菌数比为1：（0.5-0.7），混合菌液中总活菌数为1×10⁸-1×10¹⁰CFU/mL；

所述特定培养基包括紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水；

所述步骤2中混合菌液的接种量为特定培养基的8-10v/v%；

所述步骤3中溶壁酶占发酵滤液的1-3wt%。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂殖壶菌的活化为使用GYP培养基将裂殖壶菌培养至1×10⁸-1×10¹⁰CFU/mL，所述植物乳杆菌活化为使用MRS培养基将植物乳杆菌培养至1×10⁸-1×10¹⁰CFU/mL。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述特定培养基中紫苏籽粉、杏仁粉、山茶籽粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化铵、磷酸二氢钾、氯化钠、去离子水的质量比为1：（0.4-0.6）：（0.5-1.5）：（2-4）：（1-3）：（0.5-1.5）：（0.07-0.08）：（0.04-0.06）：（0.05-0.15）：（0.5-1.5）：（40-43）。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤2中发酵时间为48-96h、温度为28-35℃、pH为6.5±0.2、通气量为0.5-0.8vvm。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤3中搅拌使菌裂解的转速为2000-3000r/min，pH为7±0.5，温度为50±5℃，时间为1-3h。

6.一种微生物油脂，其特征在于，所述油脂由权利要求1-5中任一项所述制备方法制得。

7.根据权利要求6的微生物油脂在制备护肤品中的应用。

8.一种具有损伤修复功效的护肤油组合物，其特征在于，含有1-5wt%权利要求6所述的微生物油脂。

9.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，还包括基础油脂。

10.根据权利要求9所述组合物，其特征在于，所述基础油脂为霍霍巴油、椰子油、鳄梨油、菜籽油、花生油、橄榄油、大豆油中的至少一种。