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CN120603950A - Carrp酶变体及其在生产类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素中的用途 - Google Patents

Carrp酶变体及其在生产类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素中的用途

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CN120603950A
CN120603950A CN202480009554.XA CN202480009554A CN120603950A CN 120603950 A CN120603950 A CN 120603950A CN 202480009554 A CN202480009554 A CN 202480009554A CN 120603950 A CN120603950 A CN 120603950A
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seq
carrp
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amino acid
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CN202480009554.XA
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瓦尔米克·卡努拜·维亚斯
芮妮·马赛尔·德·钟
瑞内·维尔瓦尔
彼得·路易斯·休斯顿
玛丽亚·埃琳娜·马约加
约翰·罗伊
安娜·西姆博尔-纳格拉布斯卡
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DSM IP Assets BV
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Abstract

本发明涉及经由操控和异源表达来源于Mucor circinelloides的CarRP来增加类胡萝卜素及其衍生物的积累。

Description

CARRP酶变体及其在生产类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素中 的用途
本发明涉及经由操控和异源表达来源于Mucor circinelloides的CarRP来增加类胡萝卜素及其衍生物的积累。
类胡萝卜素包括C-40类异戊二烯化合物(例如胡萝卜素和叶黄素类)以及裂解产物(例如脱辅基类胡萝卜素)，类胡萝卜素是胡萝卜的橙色、以及火烈鸟和鲑鱼中的粉红色、龙虾或小虾中的红色的原因，并且用于在食品、饲料、化妆品或制药工业中的进一步重要应用。此外，β-胡萝卜素是合成维生素A的关键前体或中间体。
类视黄醇(属于一类脱辅基类胡萝卜素)是必须经由饮食提供的人类和动物非常重要和不可或缺的营养因子之一。类视黄醇促进人类/动物的健康，尤其是在视力、免疫系统和生长方面。
由于类胡萝卜素或类视黄醇的化学合成具有一些主要缺点，即消耗能量和/或水、有机和/或无机溶剂、合成不需要的副产物，并且全世界对用作例如着色剂或营养补充剂的天然产物的需求不断增加，因此强烈需要生物技术生产此类化合物。
类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素类)以及脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoid)(包括类视黄醇和紫罗兰酮)是由某些生物体天然地产生的，包括光合生物体(例如植物、藻类、蓝细菌，特别是关于类胡萝卜素的产生)和一些真菌(例如Mucor circinelloides、耶氏酵母属(Yarrowia)、酵母菌属(Saccharomyces)(两者都用于产生类胡萝卜素和类视黄醇)以及细菌(例如大肠杆菌或Paraccocus)。然而，这些体系在工业上是难以处理的和/或以如此低的水平产生化合物，以至于商业规模的分离是不可行的。
在类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素二者的生物合成中的关键酶是双功能酶CarRP，其一方面催化香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)转化为八氢番茄红素(即充当八氢番茄红素合酶)，另外催化番茄红素转化为β-胡萝卜素(即充当番茄红素环化酶)。一种广泛使用的具有良好性能的酶来源于Mucor circinelloides(McCarRP)，然而，番茄红素的积累会导致CarRP的反馈抑制，从而减少β-胡萝卜素和叶黄素类的产生。
因此，强烈需要类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素(包括但不限于视黄醛或视黄醇)的更有效的生物生产，其中相应的基因在通常被认为是安全的(GRAS)宿主细胞(例如oleagenous酵母)中(过)表达，同时减少或消除了此类生产过程中的已知瓶颈。
令人惊讶的是，我们现在已经确认了源自Mucor circinelloides的CarRP(McCarRP)中的氨基酸残基，其对于八氢番茄红素和/或β-胡萝卜素的形成至关重要，因此对于类胡萝卜素或脱辅基胡萝卜素的生产至关重要，由此已知的反馈抑制被降低。与图1所示或根据SEQ ID NO:1的野生型(未经修饰的)McCarRP相比，引入位于所述酶的番茄红素环化酶(R)-和八氢番茄红素合酶(P)-结构域两者中的一个或多个氨基酸取代导致所述类胡萝卜素化合物的形成增加至少约5％，例如在20-75％和更多的范围内。
尤其是，本发明涉及一种参与八氢番茄红素的合成并充当番茄红素环化酶的经修饰的双功能酶，以及涉及产生这种经修饰的酶的方法，所述经修饰的双功能酶是催化香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)转化为八氢番茄红素和/或催化番茄红素转化为β-胡萝卜素的酶，特别是包含一个或多个修饰的CarRP，所述修饰是例如引入到与图1中所示序列或SEQ IDNO:1具有至少约20％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或高达100％同一性的序列中的氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代被引入到对应于在图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中选自位置7、33、153、159、167、194、305、330、430、431、432、476、547、579及其组合的氨基酸残基的位置处。
更具体地，本发明涉及如本文所限定的经修饰的CarRP，其包含在如本文所限定的位置上的一个或多个氨基酸取代，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置7的位置上的氨基酸残基不同于谷氨酸或谷氨酰胺，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置33的位置上的氨基酸残基不同于丙氨酸或色氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置153的位置上的氨基酸残基不同于丙氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置159的位置上的氨基酸残基不同于亮氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置167的位置上的氨基酸残基不同于酪氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置194或476的位置上的氨基酸残基不同于异亮氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQID NO:1中位置305的位置上的氨基酸残基不同于苏氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQID NO:1中位置330的位置上的氨基酸残基不同于天冬氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQID NO:1中位置430或431的位置上的氨基酸残基不同于丝氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置432或547的位置上的氨基酸残基不同于缬氨酸，和/或其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置579的位置上的氨基酸残基不同于精氨酸。
在一些实施方式中，所述经修饰的酶在生产类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素(包括胡萝卜素、叶黄素类、类视黄醇和紫罗兰酮)的方法中的用途，其中所述经修饰的酶在合适的宿主细胞(特别是产生真菌类胡萝卜素和/或类视黄醇的宿主细胞，更特别是产生β-胡萝卜素宿主细胞)中表达、特别是异源表达，所述用途导致与使用相同条件但使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP酶的方法相比，基于在所述经修饰的宿主细胞中存在/由所述经修饰的宿主细胞产生的总类胡萝卜素/脱辅基类胡萝卜素/类视黄醇，所述产物的滴度增加在至少约5％，例如5至20％或甚至5至75％的范围内。
术语“CarRP”、“八氢番茄红素合酶”、“番茄红素环化酶”、“CrtYB”在本文中可互换使用，并且是指参与从GGPP到β-胡萝卜素的生物合成途径的双功能酶，其能够催化GGPP转化为八氢番茄红素(即起到八氢番茄红素合酶[EC 2.5.1.32]的作用)和/或催化番茄红素转化为β-胡萝卜素(即起番茄红素β-环化酶[EC 5.5.1.19]的作用)。可用于产生根据本发明的经修饰的酶的示例性和合适的酶是如图1中所示或SEQ ID NO:1中所示的McCarRP或与图1中所示序列或SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的酶，包括由根据SEQ ID NO:2的多核苷酸编码的酶。
基于未经修饰的CarRP、特别是基于与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶的如本文所限定的“经修饰的”CarRP显示出增加的酶活性，即与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的酶形成所述产物相比，对八氢番茄红素和/或β-胡萝卜素的形成的活性增加，从而增加如本文所限定的脱辅基类胡萝卜素(包括类视黄醇)和/或类胡萝卜素(包括叶黄素类)的形成，特别是增加至少约5％、例如在5-75％的范围内、特别是20-75％和更多(特别是关于类视黄醇产生)。
如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域熟知的。它包括长的40个碳共轭的类异戊二烯多烯(C-40类异戊二烯)，所述类异戊二烯多烯在自然界中是通过两个20个碳的GGPP分子的连接形成的。这些包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、花黄质、角黄质、玉米黄质、虾青素、β-隐黄质或叶黄素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006102342中。术语“类胡萝卜素”还包括“叶黄素类”的组，即氧化的类胡萝卜素衍生物，例如叶黄素、玉米黄质或β-隐黄质。
如本文所用，“脱辅基类胡萝卜素”是类胡萝卜素的裂解产物，因此定义为<C40-类胡萝卜素，包括但不限于类视黄醇或紫罗兰酮，例如视黄醛、视黄醇、视黄醇乙酸酯、β-紫罗兰酮或α-紫罗兰酮。
本文所用的类视黄醇包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、视黄酸甲氧基化物(retinoic methoxide)、视黄醇乙酸酯、视黄酯、4-酮-类视黄醇、3-羟基-类视黄醇或其组合。本文所用的长链视黄酯定义为视黄醇与脂肪酸的烃酯，其中脂肪酸由至少约8个，例如9、10、12、13、15或20个碳原子和至多约26个，例如25、22、21个或更少的碳原子组成，优选至多约6个不饱和键，例如0、1、2、4、5、6个不饱和键。长链视黄酯中的脂肪酸包括但不限于亚油酸、油酸或棕榈酸。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008042338或WO2019058000中，其中公开了在表达相应异源基因的解脂耶氏酵母菌株中β-胡萝卜素酶促转化为视黄醛，转化为视黄醇，转化为视黄醇乙酸酯。
与GGPP和/或番茄红素的酶促催化相关联的术语“转化”、“酶促转化”在本文中可互换使用，并且是指如本文所限定的在将GGPP转化为八氢番茄红素或番茄红素转化为β-胡萝卜素中用作生物催化剂的经修饰或未经修饰的CarRP的作用，因此包括如本文所描述的CarRP的合酶或环化酶活性。
根据本发明的合适的宿主细胞包括真菌宿主细胞。如本文所用，术语“真菌宿主细胞”特别地包括GRAS宿主细胞(例如酵母细胞)，其中所述细胞是产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞，特别是产生β-胡萝卜素和/或视黄醇的真菌宿主细胞，包括但不限于耶氏酵母属或酵母菌属的宿主细胞，例如解脂耶氏酵母或酿酒酵母的宿主细胞。
经修饰的酶可以以分离的形式使用(例如在无细胞系统中)或可以在合适的宿主细胞中表达，例如在产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞中表达，特别是在如本文所限定的真菌宿主细胞中表达。酶可以表达为内源酶或异源酶。优选地，将如本文所描述的经修饰的酶作为异源酶引入并表达在合适的宿主细胞中，例如在产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞，优选地产生胡萝卜素和/或视黄醇的宿主细胞中，特别是在如本文所限定的真菌宿主细胞中。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基7的位置处的氨基酸取代，特别是引入天冬氨酸，例如经由取代谷氨酸引入天冬氨酸(E7D)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用根据图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP(包括图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP但在图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置7上具有谷氨酰胺)的相应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，例如10％、15％、20％、25％、30％或更多，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约5-67％，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基33的位置处的氨基酸取代，特别是引入天冬酰胺，例如经由取代丙氨酸引入天冬酰胺(A33N)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP(包括图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP但在图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置33上具有色氨酸)的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，例如10％、15％、20％、25％、30％或更多，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-46％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
在一些实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基153的位置处的氨基酸取代，特别是引入丝氨酸，例如经由取代丙氨酸引入丝氨酸(A153S)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，例如10％、15％、20％、25％、30％或更多，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-43％，例如25％、30％、35％、40％、45％或更多。
在一些实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基159的位置处的氨基酸取代，特别是引入缬氨酸，例如经由取代亮氨酸引入缬氨酸(L159V)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，例如10％、15％、20％、25％、30％或更多，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-41％，例如25％、30％、35％、40％、45％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基167的位置处的氨基酸取代，特别是引入苯丙氨酸，例如经由取代酪氨酸引入苯丙氨酸(Y167F)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ IDNO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，例如10％、15％、20％、25％、30％或更多，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-24％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基194的位置处的氨基酸取代，特别是引入亮氨酸，例如经由取代异亮氨酸引入亮氨酸(I194L)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，例如10％、15％、20％、25％、30％或更多，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-35％，例如25％、30％、35％、40％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基305的位置处的氨基酸取代，特别是引入丙氨酸，例如经由取代酪氨酸引入丙氨酸(T305A)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-23％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基330的位置处的氨基酸取代，特别是引入谷氨酸或天冬酰胺，例如经由取代天冬氨酸引入谷氨酸或天冬酰胺(D330E或D330N)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约5-27％，例如10％、15％、20％、25％、30％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基430的位置处的氨基酸取代，特别是引入丙氨酸，例如经由取代丝氨酸引入丙氨酸(S430A)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约16-26％，例如20％、25％、30％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基431的位置处的氨基酸取代，特别是引入苏氨酸，例如经由取代丝氨酸引入苏氨酸(S431T)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-42％，例如25％、30％、35％、40％、45％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基432的位置处的氨基酸取代，特别是引入异亮氨酸，例如经由取代缬氨酸引入异亮氨酸(V432I)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ IDNO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-65％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基476的位置处的氨基酸取代，特别是引入丙氨酸，例如经由取代异亮氨酸引入丙氨酸(I476A)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-25％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基547的位置处的氨基酸取代，特别是引入异亮氨酸，例如经由取代缬氨酸引入异亮氨酸(V547I)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ IDNO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-35％，例如25％、30％、35％、40％或更多。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的CarRP酶包含在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中残基579的位置处的氨基酸取代，特别是引入赖氨酸，例如经由取代精氨酸引入赖氨酸(R579K)，其中经修饰的酶衍生自与图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP具有至少约20％同一性的酶。在发酵过程中使用包含所述突变的这种经修饰的酶，其中在合适的条件下使用本文所指定的产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞引入和表达所述经修饰的酶，与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的未经修饰的CarRP的对应方法相比，类胡萝卜素的形成可以增加至少约5-30％，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的形成可以增加至少约20-38％，例如25％、30％、35％、40％或更多。
因此，在一些实施方式中，经修饰的酶包含两个或更多个突变，即氨基酸取代，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个突变，所述突变选自在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的7、33、153、159、167、194、305、330、430、431、432、476、547或579的位置上的至少2至14个突变，并且其中在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的所述基因座(loci)的位置上引入的所述至少2至14个氨基酸不同于以任何组合的E7、Q7、A33、W33、A153、L159、Y167、I194、T305、D330、S430、S431、V432、I476、V547、R579。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及从图1中所示或SEQ ID NO:1中所示的McCarRP衍生的经修饰的CarRP和制备本文所描述的所述经修饰的CarRP的方法，所述经修饰的CarRP包含选自E7D、A33N、A135S、L159V、Y167F、I194L、T305A、D330E或D330N、S430A、S431T、V432I、I476A、V547I、R579K及其组合的1至14个氨基酸取代。在合适的产生类视黄醇的宿主细胞中表达此类经修饰的酶，与其中产生类视黄醇的宿主细胞表达图1中所示或根据SEQ ID NO:1的CarRP的方法相比，类视黄醇的百分比可以增加5至75％以及更多，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。如本文所用，术语“至少两个突变”意指本文中所描述的经修饰的酶在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中指定位置的位置上包含2个或更多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个突变。特别地，所述经修饰的CarRP酶在产生脱辅基类胡萝卜素(例如类视黄醇)和/或类胡萝卜素的宿主细胞中表达，所述宿主细胞例如优选地选自耶氏酵母属(Yarrowia)、酵母菌属(Saccharomyces)或埃希氏菌(Escherichia)，最优选所述经修饰的CarRP酶在本领域已知的产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素(例如类视黄醇)的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达。最优选地，如本文所限定的所述经修饰的CarRP被密码子优化，以在相应宿主细胞中表达。
特别地，本发明涉及衍生自图1中所示或SEQ ID NO:1中所示的McCarRP的经修饰的CarRP，包括具有至少约20％同一性的蛋白质，并且涉及用于产生如本文中所描述的所述经修饰的CarRP的方法，所述经修饰的CarRP包含至少1、2、3、4、5个氨基酸取代，优选地5个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自以任意组合的E7D、A33N、A135S、L159V、Y167F、I194L、T305A、D330E或D330N、S430A、S431T、V432I、I476A、V547I和R579K，更特别地，其中包含E7D与A33N、Y167F、V547I和R579K的组合，或E7D与A33N、Y167F、D330N和V432I的组合，或E7D与D330N、S430A、V547I和R579K的组合，或E7D与A33N、Y167F、T305A和R579K的组合，或E7D与A33N、Y167F、S431T和R579K的组合，或E7D与A33N、Y167F、S430A和R579K的组合，或E7D与A33N、Y167F、S430A和V547I的组合，或E7D与A33N、Y167F、T305A和S430A的组合，或E7D与A33N、S430A、V547I和R579K的组合，或E7D与A33N、Y167F、T305A和D330N的组合，或A33N与Y167F、S430A、V547I和R579K的组合，或E7D与Y167F、S430A、V547I和R579K的组合，或E7D与Y167F、S431T、V547I和R579K的组合，或E7D与A33N、Y167F、V431I和V547I的组合。
在一些优选的实施方式中，本发明涉及衍生自图1中所示或SEQ ID NO:1中所示的McCarRP的经修饰的CarRP，包括具有至少约20％同一性的蛋白质，并且涉及用于产生如本文中所描述的所述经修饰的CarRP的方法，所述经修饰的CarRP包含至少一个突变(例如V432I)或至少5个突变的组合(包括E7D与A33N或Y167F、S430I、V547I和R579K的组合)，其中通过在合适的产生脱辅基类胡萝卜素(例如类视黄醇)和/或产生类胡萝卜素的宿主细胞中引入所述氨基酸取代并表达所述经修饰的酶，与表达本文中限定的未经修饰的CarRP(例如图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP)的宿主细胞相比，例如类视黄醇的百分比可以增加约60-70％以及更多。
根据本发明的所有实施方式，在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的指定位置的氨基酸中的修饰(例如在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的残基7、33、153、159、167、194、305、330、430、431、432、476、547或579的位置上的氨基酸取代，其中一个或多个所述氨基酸被修饰，例如特别是至少1、2、3、4、5个氨基酸被修饰)导致当用于相应的宿主细胞(即如本文所限定的产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞)中时，类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素、优选地类视黄醇的形成增加，其中与相应的宿主细胞(其中所指定的氨基酸没有以本文中所限定的方式被取代)相比，类胡萝卜素或类视黄醇的滴度可以增加至少约5％。特别地，脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的滴度可以增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多，其中基于总类视黄醇，通过在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的V432I、A33N、L159V、A153S的位置上的单突变实现了类视黄醇增加至少约40至70％，其中与表达图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽的相应宿主细胞相比，使用包含如本文所限定的五重突变的经修饰的CarRP(例如包含对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中E7D、A33N、S430A、V547I、R579K、Y167F的一个或多个氨基酸取代)，可以实现至少约25％至75％的增加，例如约40％至75％甚至更多。特别地，特定类胡萝卜素(例如玉米黄质、角黄质、虾青素、花黄质、β-隐黄质)的滴度可以增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多，其中在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的V432I、V547I、S431T、D330E、T305的位置上的单突变实现了总类胡萝卜素增加至少约5％至35％，其中与表达图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽的相应宿主细胞相比，使用在对应于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的V432I、V547I、S431T、D330E、T305的位置上的单突变实现了角黄质增加至少约5％至40％。
如本文所限定的经修饰的宿主细胞包含如本文所限定的经修饰的酶的一个或多个拷贝，优选地其中经修饰的酶在所述经修饰的宿主细胞中异源表达。为了使如本文所限定的宿主细胞产生更多的基因和/或蛋白质的拷贝，例如经修饰的CarRP的更多拷贝的修饰可以包括使用强启动子、合适的转录增强子和/或翻译增强子，或将一个或多个基因拷贝引入到产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞、特别是真菌宿主细胞中，导致在给定时间内相应酶的累积增加。技术人员知道根据宿主细胞使用哪种技术。基因表达的增加或减少可以通过各种方法测量，例如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。
产生核酸或氨基酸的突变(即诱变)可以以不同的方式进行，例如通过随机或侧向诱变、由动因(agent)引起的物理损伤，动因例如辐射、化学处理或遗传元素的插入。技术人员知道如何引入突变。
因此，本发明涉及如本文所描述的产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞和生产所述宿主细胞的方法，宿主细胞特别是真菌宿主细胞，其包含编码本文中所描述的经修饰的CarRP的表达载体或多核苷酸(也参见WO2009126890，特别是Ex.1A)，其已经整合到所述宿主细胞的染色体DNA中。包含在表达载体上或整合到编码如本文所描述的经修饰的CarRP的染色体DNA中的异源多核苷酸的此类经修饰的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，被称为重组或经修饰的宿主细胞。产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，可以含有编码如本文所限定的修饰的CarRP的基因的一个或多个拷贝，其包含如本文所限定的突变，导致编码如本文所限定的所述经修饰的CarRP的此类基因的过表达。基因表达的增加可以通过各种方法测量，例如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术、转录组学、基因组测序或蛋白质组学。
本发明特别涉及这种新型经修饰的CarRP在生产类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的方法中的用途，所述方法包括其中类视黄醇包含视黄醇、视黄醛和视黄醇乙酸酯的混合物的方法，特别是视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比是至少约40重量％，并且其中特别地减少了长链视黄酯的形成。技术人员知道如何生成这样的条件(参见例如WO2021136689或WO2022090548)。
术语“序列同一性”、“％同一性”在本文中可互换使用。为了本发明的目的，在此定义，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性百分比，为了最佳比较目的而比对序列。为了优化两个序列之间的比对，可以在所比较的两个序列中的任一个中引入间隙。这种比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。序列同一性是在所报告的比对区域上在两个序列之间相同匹配的百分比。在两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.MolBiol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE中实现。为了本发明的目的，使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,Longden andBleasby,Trends in Genetics 16,(6)pp276—277,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于置换矩阵(substitutionmatrix)。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的任选参数是10的间隙开放罚分和0.5的间隙延伸罚分。技术人员将理解，所有这些不同的参数将产生稍微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
在通过如上所述的程序NEEDLE比对之后，查询序列和本发明的序列之间的序列同一性百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中相应位置的数目除以在减去比对中的间隙的总数之后比对的总长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中被标记为“最长同一性”。如果比较的两个氨基酸序列在它们的任何氨基酸上没有差异，则它们是相同的或具有100％同一性。
如本文所限定的经修饰的酶可以包含不改变酶活性的另外的氨基酸取代，即相对于本文所限定的酶，其显示出与八氢番茄红素合酶和/或番茄红素β环化酶相同的性质，并且在与仅携带如本文所描述的一个或多个氨基酸取代的经修饰的酶相同的范围内催化GGPP转化为八氢番茄红素和/或催化番茄红素转化为β-胡萝卜素。此类突变也称为“沉默突变”，其不改变根据本发明的酶的(酶促)活性。
编码如本文所限定的经修饰的CarRP之一的酶/多核苷酸的表达可以在任何宿主系统中完成，宿主系统包括(微生物)生物体，其适合于类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素生产并且允许表达编码如本文所描述的酶之一的核酸，包括如本文所描述的功能等同物或衍生物。合适的产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主(微生物)生物体的实例是细菌、藻类、真菌(包括酵母)、植物或动物细胞。优选的细菌是埃希氏菌属的那些，例如大肠杆菌、链霉菌属、泛菌属(欧文氏菌)、芽孢杆菌属、黄杆菌属、聚球藻属、乳杆菌属、棒状杆菌属、微球菌属、混合球菌属(Mixococcus)、短杆菌属、慢生根瘤菌属、戈登氏菌属、迪氏菌属、鼠尾菌属、鞘氨醇单胞菌属、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属，例如Paracoccuszeaxanthinifaciens。优选的真核微生物，特别是包括酵母的真菌，选自：酵母菌属，例如酿酒酵母；曲霉属，例如Aspergillus niger；毕赤酵母属，例如Pichia pastoris；汉逊酵母属，例如Hansenula polymorpha；克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母；须霉属(Phycomyces)，例如Phycomyces blakesleanus；毛霉属；红酵母属；掷孢酵母属；红法夫酵母属；法夫氏菌属；布莱克氏菌属，例如Blakeslea trispora；或耶氏酵母属，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。特别优选的是在真菌宿主细胞(例如耶氏酵母属或酵母菌属)中表达，或在埃希氏菌属(Escherichia)中表达，更优选在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。
关于本发明，应当理解，生物体(例如微生物、真菌、藻类或植物)还包括具有相同生理特性的此类物种的同义词或基本同义词，如由原核生物的国际命名法(InternationalCode of Nomenclature of Prokaryotes)或藻类、真菌和植物的国际命名法(墨尔本编码)(International Code of Nomenclature for algae,fungi,and plants(MelbourneCode))所定义的。因此，例如，菌株Lachancea mirantina是源自日本的菌株Zygosaccharomyces sp.IFO 11066的同义词。
在一些实施方式中，本发明涉及使用表达如本文所描述的经修饰的CarRP酶的宿主细胞生产类视黄醇，包括但不限于生产如例如WO2019058001中所描述的视黄醛、视黄醇、视黄醇乙酸酯，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比为至少约40-80重量％，并且其中与使用图1中所示或根据SEQ ID NO:1的对应的未经修饰的CarRP酶的方法相比，类视黄醇的生产增加至少约5％，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多。产生的视黄醇乙酸酯可以从培养基和/或宿主细胞中分离并任选地进一步纯化。本文中所限定的所述乙酰化类视黄醇可用作产生维生素A的结构单元。
如本领域技术人员对于相应的产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞所已知的，如本文所限定的经修饰的宿主细胞可以在需氧或厌氧条件下在补充有适当营养物的水性培养基中培养。任选地，如本领域已知的，这样的培养在涉及电子转移的蛋白质和/或辅因子的存在下进行。用于本发明目的的合适碳源可以选自葡萄糖、果糖、棉子糖、乳糖、半乳糖、甘油、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、植物油(包括但不限于油酸或亚油酸)(在存在或不存在乙醇的情况下)，特别是选自葡萄糖、半乳糖或木糖。用于生产脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的具体的培养条件可以包含分批和进料运行，在分批阶段中葡萄糖浓度为5％(w/v)且乙醇浓度为1％(w/v)，在进料阶段中浓度为100％(w/v)。宿主细胞的培养/生长可以在合适的培养条件下以分批、进料分批、半连续或连续模式进行，特别是以进料分批模式进行80、90、100、110、120、130小时。根据宿主细胞和待产生的类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素，可以如本领域技术人员已知的那样调整条件。在例如WO2008042338中描述了产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞(例如选自耶氏酵母属和酵母菌属)的培养和分离。关于在选自大肠杆菌的宿主细胞中产生β-胡萝卜素和类视黄醇的方法描述于例如US20070166782中。
在一些实施方式中，在两相系统中培养表达如本文所限定的经修饰的CarRP的产生脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞，其中在合适的亲脂相中收集脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇(包括但不限于视黄醇和/或视黄醇乙酸酯)，然后从中分离出来，优选地视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比为至少约40-80重量％。具体条件和亲脂性溶剂公开于WO2022090548或者WO2022090549中。
在一些实施方式中，本发明涉及使用亲脂性溶剂作为第二相并使用表达本文所限定的经修饰的CarRP的产生类视黄醇的菌株的两相发酵，所述亲脂性溶剂除了包括硅酮或正十二烷的已知溶剂之外，例如isopars或玉米油(参见Jang等人，Microbial Cell Factories 10:59，2011)。
如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”意指其催化活性，即其催化由给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内消耗的底物和/或产生的产物的量以及在限定温度下每限定量的蛋白质。典型地，比活性以每分钟每mg蛋白质形成的产物或消耗的μmol底物表示。典型地，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性的单位定义在本文件中可互换使用。如果酶在体内，即在如本文所限定的宿主细胞内或在合适的(无细胞)系统内在合适底物存在下发挥其催化活性，则该酶是活性的。技术人员知道如何测定酶活性。评估如本文所限定的合适的双功能CarRP的能力的分析方法是本领域已知的，例如在Ma等人(Nature Communications,2022,13:572,https://doi.org/10.1038/s41467-022-28277-w)中描述。可以通过HPLC测量包括脱辅基类胡萝卜素或类胡萝卜素(例如视黄醇乙酸酯、视黄醇、反式-视黄醛、顺式-视黄醛、β-胡萝卜素、角黄质、玉米黄质、虾青素、花黄质、番茄红素、八氢番茄红素、β-紫罗兰酮等)的产物的滴度。
产生类胡萝卜素的宿主细胞、特别是产生β-胡萝卜素的宿主细胞的一般构建是本领域已知的，例如描述于WO2006102342中。
如本文所用，“产生视黄醇的宿主细胞”是一种特定的产生脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，导致通过β-胡萝卜素经视黄醛酶促转化为视黄醇并任选地进一步转化为视黄醇乙酸酯来产生本文所限定的类视黄醇(例如包括视黄醛、视黄醇和/或乙酸视黄醇)。这些多肽包括催化β-胡萝卜素转化为视黄醛的酶(参见例如WO2019057999)、催化视黄醛转化为视黄醇的酶(参见例如WO2019057998)和任选地催化视黄醇转化为视黄醇乙酸酯的酶(参见例如WO2019058001)。
如本文所用，“维生素A”可以是在水溶液、固体和制剂中发现的维生素A的任何化学形式，并且包括视黄醇、视黄醇乙酸酯和视黄酯。它还包括视黄酸，例如未解离的、处于其游离酸形式的或解离为阴离子的。
如本文所用，“视黄醛”以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)-壬-2,4,6,8-四烯醛已知，并且包括顺式和反式异构体，例如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。
附图
图1：M.circinelloides CarRP(McCarRP；SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中选择用于如本申请中所描述的氨基酸取代的氨基酸残基以粗体/下划线标记，并且其中替换如SEQ ID NO:1中所示的原始氨基酸的氨基酸以斜体标记并显示在相应原始氨基酸的顶部。
以下实施例仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。贯穿本申请引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容在此通过引用并入本文，特别是WO2014096992、WO2019058001、WO2021136689、WO2022090548、WO2008042338、US20070166782、WO2022090549、WO2006102342、WO2016172282、WO2019058000、WO2019057999、WO2019057998和US20180148697。
实施例
实施例1：一般方法、菌株和质粒
本文中描所述的所有基本分子生物学和DNA操作程序通常根据Sambrook等人(编辑),Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:New York(1989)或Ausubel等人(编辑).Current Protocols in MolecularBiology.Wiley:New York(1998)。
菌株、质粒和序列。用作宿主细胞的菌株和用于表达CarRP和下文指定的其他酶或构建体的相应质粒列于表1、2和4中以及序列表中。图1示出了野生型CarRP(McCarRP)氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其具有选择用于如本文中所限定的修饰的残基的特定指示。
表1：用于生产携带异源(未经修饰的或经修饰的)CarRP基因的类胡萝卜素和/或类视黄醇的耶氏酵母菌株(用“ML”表示)的列表。有关更多详细信息，请参见正文。
表2：用于构建携带表达如指定的插入物(“Insert”)的异源基因的菌株的质粒列表，所述插入物包括表达根据SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:2)的McCarRP的多核苷酸序列和用于产生类视黄醇和/或类胡萝卜素的其他基因。所有经修饰的CarRP均基于图1中所示或根据SEQ ID NO:1的McCarRP。有关更多详细信息，请参见正文。
质粒 插入物 标记物
MB10157 MccarRP URA3+ARG4
MB10866 Cas9+sgCarRP HygR
MB9282 Cas9+sgKu70 HygR
MB6128 CRE-重组酶 G418/遗传霉素
MB7076 crtW HygR
MB7190 crtZ NatR
MB7082 crtW NatR
MB9930 crtZ HygR
MB7522 Cas9+sgcarB HygR
MB9931 Lfreq-crtZ HygR
MB7918 bhy-21 HygR
MB6806 cCD1 HygR
UPLC反相法。对于快速筛选，该方法不分离顺式异构体，仅分离主要官能团。使用具有自动进样器的具有PDA检测(或类似物)的Waters Acquity UPLC来注射样品。使用Acquity UPLC HSS T31.8um P/N 186003539来分离类视黄醇和/或类胡萝卜素。流动相由用于类视黄醇相关化合物(包括类胡萝卜素)的1000mL己烷、30mL异丙醇和0.1mL乙酸组成。每个的流速为0.6mL/分钟。柱温为20℃。进样体积为5μL。检测器是从210至600nm收集的光电二极管阵列检测器。根据表3检测分析物。花黄质、虾青素、玉米黄质和紫罗兰酮可以分别如以下参考文献中那样定量：Royer等人(Sci.Adv.2020；第6卷，第17期)、WO2014096992和US20180148697。
表3A：使用反相方法的分析物列表。根据测量结果，所有添加的中间体的加和给出类视黄醇或类胡萝卜素的总量。β-胡萝卜素*可以在325nm处检测到，并且会干扰视黄酯定量，因此必须注意观察胡萝卜素峰，并且不要将它们包括在类视黄醇定量中。“N/A”表示“不可用”。有关更多详细信息，请参见正文。
中间体 保留时间[min] λ最大值[nm] 响应因子
视黄醇乙酸酯 2.93 325 1.00
视黄酯类 3.2-3.8 325 1.68
视黄醛 2.77 325 0.87
视黄醇 2.73 325 0.87
β-胡萝卜素* 3.56 450 N/A
角黄素 3.12 470 N/A
表3B：UPLC方法梯度，溶剂A：水；溶剂B：乙腈；溶剂C：甲醇；溶剂D：叔丁基甲基醚。
方法校准。方法在类胡萝卜素、视黄醇乙酸酯、视黄醇和视黄醛上校准，并且使用指定的响应因子相对于视黄醇乙酸酯来定量。使用容量瓶将视黄醇乙酸酯以～200μg/ml溶解于THF中作为储备溶液。使用容量瓶，制备在50/50甲醇/MTBE中的储备溶液的x20、x50和x100稀释液。视黄醇乙酸酯的UV吸收相当快地变为非线性，因此必须注意保持在线性范围内。因此，较低的浓度可能会更好。棕榈酸视黄酯也可用作视黄酯校准物。视黄醇乙酸酯的峰在约3分钟，并且视黄酯(长链视黄酯)的峰在约3.5分钟。对于其它类胡萝卜素或类胡萝卜素的测量，这可以相应地进行调整。
样品制备。根据条件通过各种方法制备样品。对于全发酵液或洗涤的发酵液样品，将发酵液置于管中，称重，并加入流动相。短暂地在2ml管中，加入25μl充分混合的发酵液和975μL THF。然后将样品在均质机(Bertin Corp，Rockville，MD，USA)中根据制造商的说明以最高设置3X进行处理，通常为3×15×7500TPMS。对于洗涤的沉淀，将样品在1.7ml管中的微量离心机中以10000rpm旋转1分钟，倾析发酵液，加入1ml水，混合，沉淀并倾析，并调至原始体积。将混合物再次造粒并置于适量流动相中并通过珠打处理。为了分析硅油级分，将样品以4000RPM下旋转10分钟，并通过正位移移液管(Eppendorf，Hauppauge，NY，USA)从顶部倾析油，并稀释到通过涡旋混合的流动相中，并通过UPLC分析测量类视黄醇(或其他待测化合物)浓度。
实施例2：在表达突变carRP的解脂耶氏酵母中产生类视黄醇
为了评估carRP等位基因，用质粒MB10866(SEQ ID NO:4)来转化菌株ML18743，其编码合成指导RNA(sgRNA)和SpCas9蛋白以指导基因组中存在的carRP序列的诱变。菌株ML19637是carRP的突变体，通过其白色进行确认。将菌株ML19637传代到非选择性培养基上，确认潮霉素敏感的分离株。一种这样的分离株通过质粒MB9282(SEQ ID NO:5)进一步诱变，所述质粒MB9282编码sgRNA和SpCas9蛋白以指导Ku70基因座处的诱变，以产生ML19836。通过在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上选择，从ML19836中分离尿嘧啶营养缺陷型菌株ML19836-ura。菌株ML19836-ura用来自质粒MB10157(SEQ ID NO:3)的SfiI线性化DNA来转化，所述质粒MB10157表达表4A和4B中所示并且在如图1中所示的多肽序列中以粗体/下划线突出显示的野生型McCarRP和突变衍生物MB10157-1至MB10157-29，并选择用于尿嘧啶原养型。
如别处所描述，转化体在振荡板中生长，参见例如WO2022090549。通常，将200μl的0.075％酵母提取物、0.25％蛋白胨(0.25x YP)接种10μL新鲜生长的耶氏酵母，并覆盖200μL Drakeol 5(Penreco，Karns City，PA，USA)矿物油、硅油或玉米油，其中2％油酸或2％葡萄糖作为碳源。将转化体的克隆分离株在24孔板(Multitron，30℃，800RPM)中在YPD培养基中生长4天，所述YPD培养基具有先前指示的覆盖物之一。从摇板孔中取出覆盖物级分，并用光电二极管阵列检测器通过HPLC在正相柱上进行分析。测量类视黄醇产生(表4)，其中使用在质粒MB10157上表达的表达根据SEQ ID NO:1或图1的参考MccarRP的多核苷酸，将类视黄醇的百分比(来自上述摇板测定的总类视黄醇的滴度)设定为100％。
表4A：carRP等位基因对类视黄醇输出的影响，所述类视黄醇输出为与如“插入物”所示的CarRP的单个突变(例如E7D、A33N等；携带突变的carRP基因的质粒MB10157-1至MB10157-15)相比，使用根据SEQ ID NO:2的野生型carRP(表达根据SEQ ID NO:1或图1的wtCarRP的质粒MB10157)获得的输出或滴度的分数。
有关更多详细信息，请参见正文。
质粒 插入物 类视黄醇[％]
MB10157 MccarRP 100
MB10157-1 MccarRP_E7D 105
MB10157-2 MccarRP_A33N 146
MB10157-3 MccarRP_A153S 143
MB10157-4 MccarRP_L159V 141
MB10157-5 MccarRP_Y167F 124
MB10157-6 MccarRP_I194L 135
MB10157-7 MccarRP_T305A 123
MB10157-8 MccarRP_D330E 136
MB10157-9 MccarRP_D330N 105
MB10157-10 MccarRP_S430A 116
MB10157-11 MccarRP_S431T 130
MB10157-12 MccarRP_V432I 165
MB10157-13 MccarRP_I476A 125
MB10157-14 MccarRP_V547I 135
MB10157-15 MccarRP_R579K 138
表4B：carRP等位基因对类视黄醇输出的影响，所述类视黄醇输出为与如"插入物”所示的carRP的五重突变(携带五重突变的carRP基因的质粒MB10157-16至MB10157-29)相比，使用根据SEQ ID NO:2的野生型carRP(表达根据SEQ ID NO:1或图1的wt CarRP的质粒MB10157)获得的滴度的输出的分数。有关更多详细信息，请参见正文。
质粒 插入物 类视黄醇[％]
MB10157 MccarRP 100
MB10157-16 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_V547I_R579K 159
MB10157-17 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_D330N_V432I 149
MB10157-18 MccarRP_E7D_D330N_S430A_V547I_R579K 147
MB10157-19 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_T305A_R579K 125
MB10157-20 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_S431T_R579K 148
MB10157-21 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_S430A_R579K 146
MB10157-22 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_S430A_V547I 138
MB10157-23 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_T305A_S430A 135
MB10157-24 MccarRP_E7D_A33N_S430A_V547I_R579K 175
MB10157-25 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_T305A_D330N 128
MB10157-26 MccarRP_A33N_Y167F_S430A_V547I_R579K 155
MB10157-27 MccarRP_E7D_Y167F_S430A_V547I_R579K 172
MB10157-28 MccarRP_E7D_Y167F_S431T_V547I_R579K 151
MB10157-29 MccarRP_E7D_A33N_Y167F_V432I_V547I 136
实施例3：在表达突变体carRP的解脂耶氏酵母中产生各种类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素
以如下方式构建表达突变体CarRP以及用于产生角黄质、玉米黄质、β-隐黄质、花黄质或β-紫罗兰酮的特定基因的菌株：
用含有CRE重组酶的质粒MB6128(SEQ ID NO:6)转化产生β-胡萝卜素的菌株ML15710，并在含有遗传霉素(geneticin)的培养基上选择。通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上，在转化体中确认潮霉素敏感型分离株。将一种潮霉素敏感型分离株进一步在非选择性培养基上繁殖，通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认遗传霉素敏感型分离株。用以下PvuII线性化质粒之一转化一种这样的分离株：MB7076(用于产生角黄质；SEQ ID NO:7)、MB7190(用于产生玉米黄质；SEQ ID NO:8)、MB9931(用于产生β-隐黄质；SEQ ID NO:9)、MB7918(用于产生花黄质；SEQ ID NO:10)或MB6806(用于产生β-紫罗兰酮；SEQ ID NO:11)，并在含潮霉素的培养基上选择以生成产生角黄质的菌株ML15710+crtW、产生玉米黄质的菌株ML15710+crtZ、产生β-隐黄质的菌株ML15710+Lfreq-CrtZ、产生花黄质的菌株ML15710+bhy-21或产生β-紫罗兰酮的菌株ML15710+CCD1。用含有CRE重组酶的质粒MB6128转化这些菌株，并在含有遗传霉素的培养基上选择。通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上，在转化体中确认潮霉素敏感型分离株。将一种潮霉素敏感型分离株(如上文指出，用于每种脱辅基类胡萝卜素/类胡萝卜素)进一步在非选择性培养基上繁殖，通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认遗传霉素敏感型分离株。然后如实施例1所述用MB10866转化这些菌株，以产生白色carRP突变菌株ML15710+crtW+carRP-(用于角黄质生产)、ML15710+crtZ+carRP-(用于玉米黄质生产)、ML15710+Lfreq-CrtZ+carRP-(用于β-隐黄质生产)、ML15710+bhy-21+carRP-(用于花黄质生产)或ML15710+CCD1+carRP-(用于β-紫罗兰酮生产)。通过在非选择性培养基上传代并复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认潮霉素敏感型分离株。然后如实施例1中用质粒MB9282转化这些菌株，以产生ku70-突变菌株ML15710+crtW+carRP-+ku70-(用于角黄质生产)、ML15710+crtZ+carRP-+ku70-(用于玉米黄质生产)、ML15710+Lfreq-CrtZ+carRP-+ku70-(用于β-隐黄质生产)、ML15710+bhy-21+carRP-+ku70-(用于花黄质生产)或ML15710+CCD1+carRP-+ku70-(用于β-紫罗兰酮生产)。通过在5-FOA上的选择从这些菌株中分离尿嘧啶营养缺陷型菌株，并称为ML15710+xx+carRP-+ku70-+ura3-，其中“xx”代表相应的类胡萝卜素/脱辅基类胡萝卜素特异性基因。然后，用表达野生型McCarRP的质粒MB10157以及用表达表4中列出的突变形式的McCarRP的相应质粒(参见实施例2)转化该白色尿嘧啶营养缺陷型菌株，以生成进一步表达异源CarRP(野生型或突变型)的角黄质、玉米黄质、β-隐黄质、花黄质或β-紫罗兰酮的菌株。菌株在微量滴定板或发酵中培养，如下文对产生角黄质的菌株更详细描述的，但作必要的修改适用于产生其他类胡萝卜素，例如玉米黄质、β-隐黄质、花黄质或β-紫罗兰酮：
如WO2022090549或上文实施例2中所描述，将来自菌株ML15710+crtW+CarRP-+ku70-+ura3-的转化体与质粒MB101570或表5中所示的质粒一起在微量滴定板中生长，除了使用第二相和使用葡萄糖作为唯一碳源。根据先前描述的方法(参见例如US7851199实施例2-4)进行发酵和类胡萝卜素分析。质粒MB101570-7、MB10157-11和MB10157-14的引入导致总类胡萝卜素的百分比(总类胡萝卜素的滴度)增加，如通过上述摇板测定所测量的，并且导致总类胡萝卜素产率和角黄质的产率，即针对碳的产率(分别为g总类胡萝卜素/g碳源和g角黄质/g碳源)增加，其中使用在质粒MB10157上表达的表达根据SEQ ID NO:1或图1的参考MccarRP的多核苷酸的百分比设定为100％。
表5：CarRP等位基因对胡萝卜素输出的影响，所述类胡萝卜素输出为与如"插入物”所示的carRP的单个突变相比，使用根据SEQ ID NO:2的野生型carRP(表达根据SEQ IDNO:1或图1的wt CarRP的质粒MB10157)的滴度的输出的分数。“CXN”是指角黄素。“类胡萝卜素[％]”反映从微量滴定板测量的类胡萝卜素滴度(总类胡萝卜素)。“类胡萝卜素产率[％]”和“CXN产率[％]”意指在发酵中测量的针对碳的产率(g产物/g碳源)。有关更多详细信息，请参见正文。
实施例4：在表达突变carRP的解脂耶氏酵母中产生虾青素
用含有CRE重组酶的质粒MB6128转化产生β-胡萝卜素的菌株ML15710，并在含有遗传霉素(geneticin)的培养基上选择。通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上，在转化体中确认潮霉素敏感型分离株。将一种潮霉素敏感型分离株进一步在非选择性培养基上繁殖，通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认遗传霉素敏感型分离株。用PvuII线性化质粒MB7082(SEQ ID NO:12)转化一种这样的分离株，并在含有诺丝菌素的培养基上选择，以生成产生虾青素的菌株ML15710+crtW。然后，用PvuII线性化的MB9930(SEQ ID NO:13)转化该菌株并在潮霉素培养基上选择以生成ML15710+crtW+crtZ。用含有CRE重组酶的质粒MB6128转化该菌株，并在含有遗传霉素的培养基上选择。通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上，在转化体中确认对潮霉素和诺屈霉素敏感的分离株。将一种对对潮霉素和诺屈霉素敏感的分离株进一步在非选择性培养基上繁殖，通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认遗传霉素敏感型分离株。然后，如实施例1所述用MB10866转化该菌株，以生成白色carRP突变菌株ML15710+crtW+crtZ+carRP-。通过在非选择性培养基上传代并复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认潮霉素敏感型分离株。然后，如实施例1中那样用MB9282转化该菌株，以产生ku70-突变菌株ML15710+crtW+crtZ+carRP-+ku70-。通过在5-FOA上的选择从该菌株中分离出尿嘧啶营养缺陷型菌株，并称为ML15710+crtW+crtZ+carRP-+ku70-+ura3-。然后，用表4中列出的表达异源wt CarRP或突变体的质粒(实施例2)转化该白色尿嘧啶营养缺陷型菌株，以生成进一步表达突变的CarRP的产生虾青素的菌株。与表达根据SEQ ID NO:1或图1的wt McCarRP的产生虾青素的菌株相比，在表达CarRP突变体的菌株中，虾青素的滴度可以增加至少约5％(未显示)。
实施例5：在表达突变carRP的解脂耶氏酵母中产生番茄红素
通过DNA-synthesis provider(Genscript)将表2中描述的表达CarRP突变体的DNA与突变E78G组合。该E78G突变使CarRP的番茄红素环化酶结构域失活(参见例如WO2014151748)。用含有CRE重组酶的质粒MB6128转化产生β-胡萝卜素的菌株ML15710，并在含有遗传霉素(geneticin)的培养基上选择。通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上，在转化体中确认潮霉素敏感型分离株。将一种潮霉素敏感型分离株进一步在非选择性培养基上繁殖，通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认遗传霉素敏感型分离株。然后，如实施例1所述用MB10866转化一种这样的分离株，以生成白色carRP突变菌株ML15710+carRP-。通过在非选择性培养基上传代并复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认潮霉素敏感型分离株。然后，如实施例1中那样用MB9282转化该菌株，以产生ku70-突变菌株ML15710+carRP-+ku70-。通过在5-FOA上的选择从该菌株中分离出尿嘧啶营养缺陷型菌株，并称为ML15710+carRP-+ku70-+ura3-。用含有表2中的突变与E78G突变组合的SfiI线性化DNA转化该菌株，以生成进一步表达突变的CarRP的产生番茄红素的菌株。然后，用表4中列出的表达异源wt CarRP或突变体与E78G突变组合的质粒(实施例2)转化该菌株，以生成进一步表达突变的CarRP的产生番茄红素的菌株。与表达根据SEQ ID NO:1或图1的wtMcCarRP的产生番茄红素的菌株相比，在表达CarRP突变体的菌株中，番茄红素的滴度可以增加至少约5％(未显示)。
实施例7：在表达突变carRP的解脂耶氏酵母中产生八氢番茄红素
用含有CRE重组酶的质粒MB6128转化产生β-胡萝卜素的菌株ML15710，并在含有遗传霉素(geneticin)的培养基上选择。通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上，在转化体中确认潮霉素敏感型分离株。将一种潮霉素敏感型分离株进一步在非选择性培养基上繁殖，通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认遗传霉素敏感型分离株。然后，如实施例1所述用MB10866转化一种这样的分离株，以生成白色carRP突变菌株ML15710+carRP-。通过在非选择性培养基上传代并复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认潮霉素敏感型分离株。然后，用MB7522(SEQ ID NO:14)转化一种这样的分离株，以生成carB突变菌株ML15710+carRP-+carB-。通过在非选择性培养基上传代并复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认潮霉素敏感型分离株。然后，如实施例1中那样用MB9282转化该菌株，以产生ku70-突变菌株ML15710+carRP-+carB-+ku70-。通过在5-FOA上的选择从该菌株中分离出尿嘧啶营养缺陷型菌株，并称为ML15710+carRP-+carB-+ku70-+ura3-。然后，用表4中列出的表达异源wt CarRP或突变体的质粒(实施例2)转化该白色尿嘧啶营养缺陷型菌株，以生成进一步表达突变的CarRP的产生八氢番茄红素的菌株。与表达根据SEQ ID NO:1或图1的wtMcCarRP的产生八氢番茄红素的菌株相比，在表达CarRP突变体的菌株中，八氢番茄红素的滴度可以增加至少约8％(未显示)。
实施例8：在表达突变carRP的解脂耶氏酵母中产生β-胡萝卜素
用含有CRE重组酶的质粒MB6128转化产生β-胡萝卜素的菌株ML15710，并在含有遗传霉素(geneticin)的培养基上选择。通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上，在转化体中确认潮霉素敏感型分离株。将一种潮霉素敏感型分离株进一步在非选择性培养基上繁殖，通过复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认遗传霉素敏感型分离株。然后，如实施例1所述用MB10866转化一种这样的分离株，以生成白色carRP突变菌株ML15710+carRP-。通过在非选择性培养基上传代并复制铺板到选择性和非选择性培养基上来确认潮霉素敏感型分离株。然后，如实施例1中那样用MB9282转化一种这样的分离株，以产生ku70-突变菌株ML15710+carRP-+ku70-。通过在5-FOA上的选择从该菌株中分离出尿嘧啶营养缺陷型菌株，并称为ML15710+carRP-+ku70-+ura3-。然后，用表4中列出的表达异源wt CarRP或突变体的质粒(实施例2)转化该白色尿嘧啶营养缺陷型菌株，以生成进一步表达突变的CarRP的产生β-胡萝卜素的菌株。与表达根据SEQ ID NO:1或图1的wt McCarRP的产生β-胡萝卜素的菌株相比，在表达CarRP突变体的菌株中，β-胡萝卜素的滴度可以增加至少约5％(未显示)。

Claims (14)

1.一种经修饰的双功能酶，所述经修饰的双功能酶催化香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)转化为八氢番茄红素和/或催化番茄红素转化为β-胡萝卜素，所述酶包含一个或多个氨基酸取代，例如引入到与图1中所示序列或SEQ ID NO:1具有至少约20％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或高达100％同一性的序列中的氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代被引入到对应于在图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中选自位置7、33、153、159、167、194、305、330、430、431、432、476、547、579及其组合的氨基酸残基的位置处。
2.根据权利要求1所述的经修饰的酶，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置7的位置上的氨基酸残基不同于谷氨酸或谷氨酰胺，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置33的位置上的氨基酸残基不同于丙氨酸或色氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQID NO:1中位置153的位置上的氨基酸残基不同于丙氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQID NO:1中位置159的位置上的氨基酸残基不同于亮氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQID NO:1中位置167的位置上的氨基酸残基不同于酪氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQID NO:1中位置194或476的位置上的氨基酸残基不同于异亮氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置305的位置上的氨基酸残基不同于苏氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置330的位置上的氨基酸残基不同于天冬氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置430或431的位置上的氨基酸残基不同于丝氨酸，其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置432或547的位置上的氨基酸残基不同于缬氨酸，和/或其中在对应于图1中所示或SEQ ID NO:1中位置579的位置上的氨基酸残基不同于精氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的经修饰的酶，其中对应于在图1中所示或根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置7、33、153、159、167、194、305、330、430、431、432、476、547、579和/或其组合的氨基酸残基选自D7、N33、S153、V159、F167、L194、A305、E330、N330、A430、T431、I432、A476、I547和/或K579。
4.根据权利要求3所述的经修饰的酶，其包含选自E7D、A33N、A153S、L159V、Y167F、I194L、T305A、D330E、D330N、S430A、S431T、V432I、I476A、V547I、R579K及其组合的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代被引入与图1中所示或SEQ ID NO:1具有至少约20％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的序列中。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经修饰的酶，其衍生自Mucor circinelloidesCarRP。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经修饰的酶，所述酶被引入合适的产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞、特别是产生类视黄醇的宿主细胞中并在其中表达。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经修饰的酶，其中当在合适的产生脱辅基类胡萝卜素/类视黄醇的宿主细胞中表达时，与表达图1中所示或根据SEQ ID NO:1的CarRP的对应宿主细胞相比，对产生脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的催化活性增加至少约5％，例如在20-65％或更多的范围内。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的经修饰的酶，其中当在合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞中表达时，与表达图1中所示或根据SEQ ID NO:1的CarRP的对应宿主细胞相比，对产生类胡萝卜素的催化活性增加至少约5％，例如在5-30％的范围内。
9.一种异源表达根据权利要求1至8中任一项所述的经修饰的酶的产生类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其为真菌宿主细胞或选自大肠杆菌，优选地选自耶氏酵母属或酵母菌属的真菌宿主细胞。
11.根据权利要求9或10所述的宿主细胞，其异源表达参与类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素的生物合成的基因，所述类胡萝卜素和/或脱辅基类胡萝卜素选自β-胡萝卜素、番茄红素、八氢番茄红素、β-紫罗兰酮、β-隐黄质、角黄质、虾青素、玉米黄质、花黄质、视黄醛、视黄醇、视黄醇乙酸酯及其混合物。
12.一种在合适的宿主细胞中产生类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的方法，包括：
(a)在合适的培养条件下培养权利要求9至11中任一项所述的宿主细胞，表达权利要求1至8中任一项所述的经修饰的酶，
(b)从培养基中分离和任选地纯化所述类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素，
其中与使用表达图1中所示或根据SEQ ID NO:1的CarRP的宿主细胞代替所述经修饰的酶的方法相比，类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素的百分比增加至少约5％。
13.根据权利要求12所述的方法，其中类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素选自β-胡萝卜素、番茄红素、八氢番茄红素、β-紫罗兰酮、β-隐黄质、角黄质、虾青素、玉米黄质、花黄质、视黄醛、视黄醇、视黄醇乙酸酯及其混合物。
14.一种提高产生脱辅基类胡萝卜素的宿主细胞、特别是产生类视黄醇的宿主细胞的生产率的方法，包括：
(a)提供表达参与脱辅基类胡萝卜素、特别是类视黄醇的生物合成的基因的宿主细胞，所述生物合成包括但不限于视黄醛、视黄醇和/或视黄醇乙酸酯的生物合成；
(b)用表达根据权利要求1至8中任一项所述的经修饰的酶的多核苷酸转化所述宿主细胞，
(c)从所述宿主细胞分离和任选地纯化脱辅基类胡萝卜素，特别是类视黄醇，包括但不限于视黄醛、视黄醇和/或视黄醇乙酸酯，
其中与用根据SEQ ID NO:2的多核苷酸代替表达所述经修饰的酶的多核苷酸转化的步骤(b)的宿主细胞相比，生产率提高至少约20％至75％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US10385308B2 (en) 2013-03-15 2019-08-20 Dsm Ip Assets B.V. Use of thermophilic nucleases for degrading nucleic acids
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CN111108194A (zh) 2017-09-25 2020-05-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 视黄醇的生产
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EP4237570A1 (en) 2020-10-30 2023-09-06 DSM IP Assets B.V. Fermentative production of isoprenoids
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