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CN120603939A - 乙酰转移酶sb-atf的新突变体 - Google Patents

乙酰转移酶sb-atf的新突变体

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CN120603939A
CN120603939A CN202480009545.0A CN202480009545A CN120603939A CN 120603939 A CN120603939 A CN 120603939A CN 202480009545 A CN202480009545 A CN 202480009545A CN 120603939 A CN120603939 A CN 120603939A
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CN
China
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amino acid
seq
enzyme
retinol
acid residue
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CN202480009545.0A
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English (en)
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瓦尔米克·卡努拜·维亚斯
芮妮·马赛尔·德·钟
安娜·西姆博尔-纳格拉布斯卡
彼得·路易斯·休斯顿
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DSM IP Assets BV
Original Assignee
DSM IP Assets BV
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Publication date
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Abstract

本发明涉及将参与类视黄醇乙酰化的低活性酶转化为高活性酶的方法，特别是转化为对视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的高活性酶的方法。

Description

乙酰转移酶SB-ATF的新突变体
本发明涉及将参与类视黄醇乙酰化的低活性酶转化为高活性酶的方法，所述催化类视黄醇乙酰化的酶特别是对视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的高活性酶。
视黄醇乙酸酯是生产类视黄醇(retinoids)，特别是维生素A的重要中间体或前体。包括维生素A在内的类视黄醇是必须经由饮食提供的人类和动物非常重要和不可或缺的营养因子之一。类视黄醇促进健康，尤其是在视力、免疫系统和生长方面。
用于类视黄醇、特别是维生素A及其前体的当前的化学生产方法具有一些不期望的特性，例如高能量消耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了制造类视黄醇、特别是维生素A及其前体或中间体的其他方法，包括微生物转化步骤，这将更具有经济性和生态性。
通常，产生类视黄醇的生物系统在工业上是难以处理的和/或以如此低的水平产生化合物，以至于其在工业规模上的分离在经济利益方面是不可行的。对此存在几个原因，最重要的是中间体/类视黄醇的不稳定性问题和/或副产物的相对高的积聚。
处理不稳定性问题的一种方法是生产乙酰化产物形式。先前已经报道了类胡萝卜素(例如虾青素或玉米黄质)的乙酰化，例如通过来自巴氏酵母的Atf1(SbATF1)的作用(WO2014096992)，其中例如玉米黄质的乙酰化在高达90wt％的范围内。然而，当在类视黄醇的乙酰化中、特别是视黄醇的乙酰化中使用所述酶时，基于总类视黄醇，乙酰化的百分比仅在约最大10％的范围内(参见例如WO2019058001)，其太低而无法建立用于生物生产维生素A的可持续和经济上可行的工业方法。
因此，强烈需要改进用于类视黄醇的乙酰化的酶。
令人惊讶的是，我们现在可以认定了真菌乙酰转移酶(ATF)中的氨基酸位置，例如源自巴氏酵母(Saccharomyces bayanus)和其他酵母，其对于乙酰化类视黄醇的形成来说、特别是视黄醇转化为视黄醇乙酸酯来说至关重要。与相应的野生型酶相比，某些氨基酸的修饰导致视黄醇乙酸酯的形成增加，例如，当与使用相应的未经修饰的酶(例如如SEQ IDNO:1中所示的来自巴氏酵母的wt-ATF1)的视黄醇的乙酰化相比时，增加至少约10％。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及修饰参与/催化类视黄醇的乙酰化的酶、更特别是真菌ATF的方法，其包括在本文指定的位置上引入至少一个修饰(例如氨基酸取代)，例如包括1至9个、例如至少2个氨基酸取代。在引入指定的氨基酸取代后，所述未经修饰的ATF、特别是真菌ATF(例如源自酵母菌属的ATF1，例如根据SEQ ID NO:1的来自巴氏酵母的ATF1(SbATF))被修饰或转化为具有增加的活性的经修饰或突变的ATF，其中当在合适的表达系统(包括合适的宿主细胞，如本文中所指定的)中表达此类经修饰的酶时，与使用相应的未经修饰的或野生型酶的视黄醇乙酸酯的百分比相比，从视黄醇的乙酰化获得的视黄醇乙酸酯的百分比可以增加至少约10％，例如增加超过700％。
特别地，本发明涉及一种修饰催化类视黄醇的乙酰化的酶、特别是催化视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的酶、优选地真菌酶的方法，其包括在根据SEQ ID NO:1的多肽中选自氨基酸残基34、35、346、371、373、419、434、437、478及其组合的一个或多个位置处引入至少1个氨基酸取代，其中在引入所述一个或多个氨基酸取代后，与使用包括根据SEQ ID NO:1的酶的相应未经修饰的酶的活性相比，形成视黄醇乙酸酯的活性增加至少约10％，例如在10-760％范围内，优选地其中在本文指定的位置上的至少一个修饰、例如氨基酸取代、例如包含1至9个氨基酸取代，优选地在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于34、35、346、371、373、419、434、437、478和/或其组合的氨基酸残基不同于L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478及其组合，即对应于SEQ ID NO:1中的相应氨基酸残基。
更具体地，本发明涉及一种修饰催化类视黄醇的乙酰化的酶、特别是视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的酶、优选地真菌酶的方法，其包括在选自SEQ ID NO:1的多肽中氨基酸残基34和434的位置处引入至少2个氨基酸取代，其中在引入所述至少两个氨基酸取代后，与使用包括根据SEQ ID NO:1的酶的相应未经修饰的酶的活性相比，形成视黄醇乙酸酯的活性增加至少约10％，例如至少约25％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％、150％、180％、200％、230％、250％、280％、300％、330％、350％、380％、400％、430％、450％、480％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％，例如在10％至760％的范围内，优选地其中在对应于SEQID NO:1中氨基酸残基34和434的位置上的氨基酸残基不同于L34和M434，更优选地其中对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于L34和M434的位置上的氨基酸取代选自L34F和M434V。
如本文所用，对视黄醇的乙酰化具有“低活性”的如本文所限定的未经修饰的视黄醇乙酰化酶是指基于在表达所述未经修饰的酶的合适的产生类视黄醇的宿主细胞中产生的总类视黄醇，视黄醇乙酸酯的百分比在约10重量％或更低的范围内。对视黄醇乙酰化具有“增加的活性”的如本文所限定的经修饰的酶是指基于在表达所述经修饰的酶的合适的产生类视黄醇的宿主细胞中产生的总类视黄醇，约11重量％至86重量％的视黄醇乙酸酯百分比，即所述经修饰的酶是经由引入一个或多个如本文所限定的氨基酸取代将具有低(酶或乙酰化)活性的酶转化为如本文所限定的具有增加的(酶或乙酰化)活性的酶而产生的。如所示，视黄醇的乙酰化活性可以增加至少约10％，例如增加20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％或更多。
更具体地，本发明涉及一种生产视黄醇乙酰化酶的方法，所述视黄醇乙酰化酶酶对视黄醇乙酰化成视黄醇乙酸酯具有增加的活性，所述方法包括：
(a)提供参与视黄醇的乙酰化的真菌酶、特别是源自酵母菌属的ATF、优选地SbATF，其中在合适的宿主细胞中和在合适的培养条件下表达的所述未经修饰的酶能够产生基于总类视黄醇的10重量％或更少的视黄醇乙酸酯；
(b)在(a)的酶中进一步引入1个或多个氨基酸取代、例如至少1至9个、优选地至少2个氨基酸取代，以生成参与视黄醇乙酰化的经修饰的酶，其中当与步骤(a)的相应未经修饰的酶的乙酰化活性相比时，将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯的能力增加至少约10％，例如至少10至760％；
其中所述1个或多个(例如至少2个)氨基酸取代位于对应于选自在SEQ ID NO:1中的位置34、35、346、371、373、419、434、437、478及其组合的氨基酸残基的位置处，并且其中取代的(substitute)氨基酸不同于L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478和/或其组合，优选地其中所述至少2个氨基酸取代位于对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置34和434的位置。
在一个实施方式中，本发明涉及一种参与视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的经修饰的酶、特别是真菌酶，其包含一个或多个氨基酸取代，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸取代，例如至少2个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中选自位置34、35、346、371、373、419、437、478及其组合的氨基酸残基的位置处，并且其中取代的氨基酸残基不同于对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478及其组合的氨基酸，优选地其中待取代的氨基酸残基对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中选自L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478及其组合的残基，更优选地其中在对应于SEQ ID NO:1中的位置34、35或478的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为苯丙氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置346或419的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为亮氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置371的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为异亮氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置373的位置处待引入的取代氨基酸残基优选地为丙氨酸，和/或其中在对应于在SEQ IDNO:1中的位置434或437的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为缬氨酸。
具体地，根据本发明且如本文中所限定的经修饰的酶选自与SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的多肽，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，其包含在选自在SEQ ID NO:1中的34、35、346、371、373、419、434、437和/或478的位置上的不同于L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437或W478的一个或多个氨基酸取代，优选地其中所述一个或多个氨基酸取代选自L34F、Y35F、V371I、M434V、N419L、F346L、R437V、W478F、F373A及其组合。
在生产类视黄醇的方法中使用这种经修饰的酶，其中所述经修饰的酶在合适的宿主细胞、特别是能够产生视黄醇的真菌宿主细胞中表达(特别是异源表达)，导致与使用相同条件但使用各自或相应的野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的ATF酶)的方法相比，经由视黄醇乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％。特别地，使用这种经修饰的酶导致与使用滴度在基于总类视黄醇的最大10重量％视黄醇乙酸酯的范围内的各自的未经修饰的酶相比，基于总类视黄醇的高达86重量范围％的视黄醇乙酸酯的滴度。
术语“乙酰转移酶”、“视黄醇乙酰化酶”、“具有视黄醇乙酰化活性的酶”、“ATF”或“ATF1”在本文中可互换使用，并且是指能够催化视黄醇转化为视黄醇乙酸酯的EC类[EC2.3.1.84]的酶，包括天然存在的酶和借助人工智能合成产生的酶。术语“SbATF”和“SbATF1”在本文中可互换使用。这种酶的实例示于SEQ ID NO:1中。如本文所限定，能够催化视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯且视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比为约10％或更少的ATF在本文中被称为“未经修饰的”ATF或“野生型”ATF，例如根据SEQ ID NO:1的SbATF。
如本文所限定的“经修饰的”ATF、特别是基于“未经修饰的”ATF的“经修饰的”ATF，例如与如本文所限定的SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的酶，显示出基于总类视黄醇并且与使用相应/对应的野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯形成相比，从视黄醇转化形成视黄醇乙酸酯增加在至少10％范围内。
在一个实施方式中，与对应的野生型ATF相比，根据本发明的经修饰的ATF包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸取代，诸如例如至少2个氨基酸取代，其中对应于在根据SEQID NO:1的多肽中L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437和/或W478的一个或多个氨基酸被交换，导致与相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的ATF)相比，对视黄醇乙酸酯形成的酶活性增加至少约10％，特别是视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比从约10重量％增加至86重量％或甚至更多。
本发明包括将低活性酶(关于视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯)转化/转换为如本文所限定的对视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯具有增加的活性的经修饰的酶的方法，所述低活性酶在本文中也称为未经修饰的酶。这种未经修饰的酶的实例是与SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的酶，其显示出约10％的乙酰化活性，即当在合适的产生视黄醇的宿主细胞中表达时，从视黄醇的转化/乙酰化获得的视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比在10重量％或更低的范围内，特别是从巴氏酵母分离的ATF1(SbATF1)，包括由根据SEQ ID NO:2的多核苷酸编码的酶。
合适的未经修饰的酶(包括与SEQ ID NO:1具有至少约20％，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的酶，包括分离自/源自巴氏酵母的SbATF1)被定义为显示约10％乙酰化活性的酶，即当在合适的产生的视黄醇的宿主细胞中表达时，从视黄醇的转化/乙酰化获得的视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比在10重量％或更低的范围内，是能够从真菌酶获得的酶，特别是能够从酵母获得的酶，特别是包含至少7个选自[NSDEHC]-H-x(3)-D-[GA](以Prosite语法的基序，参见：https://prosite.expasy.org/scanprosite/scanprosite_doc.html)、优选地[N-H-x(3)-D-[GA]、更优选N-H-C-M-C-D-G的高度保守的部分氨基酸序列，其中“x”表示任意氨基酸并且中心组氨酸是酶的结合口袋的一部分，对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置N190至G196。
合适的未修饰的酶可以选自酵母，包括但不限于酵母菌属，例如巴氏酵母(S.bayanus)、酿酒酵母(S.cerevisia)、库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)、米卡塔酵母(S.mikatae)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、树状酵母(S.arboricola)，念珠菌，例如都柏林念珠菌(C.dubliniensis)、白色念珠菌(C.albicans)、中间念珠菌(C.intermedia)、耳念珠菌(C.auris)、卢西塔尼亚念珠菌(C.lusitaniae)，威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)，例如异常威克汉姆酵母属(W.anomalus)，曲霉属(Aspergillus)，例如椭圆曲霉(A.ellipticus)。
如本文所限定的经修饰的ATF能够将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯，特别是与使用相应/对应的未经修饰的酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯相比，转化率增加至少约10％，例如能够通过在合适的培养条件下表达经修饰的ATF获得，所述培养条件包括但不限于在葡萄糖、半乳糖、木糖上在与乙醇组合或不与乙醇组合的情况下培养。
如本文所限定的酶用于将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯，其中底物(即视黄醇)可以是顺式-、反式-或顺式-/反式-视黄醇的任何可能比例的混合物。优选地，用作底物的视黄醇混合物具有高百分比的反式视黄醇，例如基于宿主细胞中的总视黄醇，至少约65至98重量％的反式异构体。至少约65-98重量％反式视黄醇的所述视黄醇混合物的乙酰化将导致基于由宿主细胞产生的总视黄醇乙酸酯，反式与顺式视黄醇乙酸酯的比率大致相同的视黄醇乙酸酯。
在一个具体实施方式中，本发明涉及使用本文所限定的合适宿主细胞将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯，所述宿主细胞包含并表达如本文所限定的经修饰的酶，其中视黄醇是反式-和顺式-视黄醇的混合物，并且其中基于总视黄醇，反式-视黄醇的百分比在至少约65至98重量％的范围内。
与视黄醇的酶促催化相关的术语“转化”、“酶促转化”、“乙酰化”或“酶促乙酰化”在本文中可互换地使用，并指经修饰的或未经修饰的ATF在催化视黄醇转化为视黄醇乙酸酯中的作用，导致基于由合适的宿主细胞在表达所述ATF时存在/产生的总类视黄醇的一定百分比的视黄醇乙酸酯，其中可以使用如本文所限定的经修饰的ATF来实现基于总类视黄醇的视黄醇乙酸酯增加到86重量％或更多。
根据本发明的合适的宿主细胞包括真菌宿主细胞以及微生物宿主细胞，例如大肠杆菌。如本文所用，术语“真菌宿主细胞”特别包括酵母细胞，其中所述细胞是产生视黄醇的宿主细胞，特别是产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，例如产生视黄醇乙酸酯的真菌宿主细胞，包括但不限于耶氏酵母属或酵母菌属的宿主细胞，例如解脂耶氏酵母或酿酒酵母的宿主细胞。
经修饰的ATF酶可以以分离的形式使用(例如在无细胞系统中)或可以在合适的宿主细胞中表达，例如在产生视黄醇的宿主细胞中表达，特别是在如本文所限定的真菌宿主细胞中表达。酶可以表达为内源酶或异源酶。优选地，将如本文所描述的经修饰的酶作为异源酶引入并表达在合适的宿主细胞中，例如在产生视黄醇的宿主细胞中，特别是在如本文所限定的真菌宿主细胞中。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中残基34的位置处的氨基酸取代，其导致原始残基被除亮氨酸以外的任何氨基酸取代，特别是通过用苯丙氨酸交换原始氨基酸，例如特别是经由用苯丙氨酸取代亮氨酸(例如SEQ ID NO:1中的L34F)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的残基434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基35的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除酪氨酸之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用苯丙氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用苯丙氨酸取代酪氨酸(例如SEQ ID NO:1中的Y35F)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基34和434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代和在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基346的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除苯丙氨酸之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用亮氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用亮氨酸取代苯丙氨酸(例如SEQ ID NO:1中的F346L)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQID NO:1的多肽中的残基34和434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代和在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基371的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除缬氨酸之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用异亮氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用异亮氨酸取代缬氨酸(例如SEQ ID NO:1中的V371I)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQID NO:1的多肽中的残基34和434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代和在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基373的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除苯丙氨酸之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用丙氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用丙氨酸取代苯丙氨酸(例如SEQ ID NO:1中的F373A)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQID NO:1的多肽中的残基34和434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代和在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基419的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除天冬酰胺之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用亮氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用亮氨酸取代天冬酰胺(例如SEQ ID NO:1中的N419L)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQID NO:1的多肽中的残基34和434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代和在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基434的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除甲硫氨酸之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用缬氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用缬氨酸取代甲硫氨酸(例如SEQ ID NO:1中的M434V)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQID NO:1的多肽中的残基34的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基437的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除精氨酸之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用缬氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用缬氨酸取代精氨酸(例如SEQ ID NO:1中的R437V)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基34和434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代和在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
在一个实施方式中，如本文所限定的经修饰的ATF酶包含在对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的残基478的位置处的氨基酸取代，导致原始残基被除色氨酸之外的任何其他氨基酸取代，特别是通过用苯丙氨酸交换原始氨基酸，例如特别地经由用苯丙氨酸取代色氨酸(例如SEQ ID NO:1中的W478F)。所述待修饰的酶可以来源于与SEQ ID NO:1中所示的SbATF具有至少约20％同一性的ATF。优选地，这种经修饰的酶还包含在对应于根据SEQID NO:1的多肽中的残基34和434的位置处的氨基酸取代，特别是在对应于SEQ ID NO:1中的L34的位置处的亮氨酸被苯丙氨酸取代和在对应于SEQ ID NO:1中的M434的位置处的甲硫氨酸被缬氨酸取代。与使用相应野生型酶(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的相应方法相比，在使用合适碳源(例如葡萄糖)的发酵过程中使用包含所述突变的此类经修饰的酶导致从视黄醇的乙酰化产生的视黄醇乙酸酯增加至少约10％至超过700％。
如本文所用，术语“原始氨基酸”是指在野生型或未经修饰的ATF中存在的氨基酸残基，其将被另一个氨基酸残基取代，使得所述经修饰的酶对视黄醇乙酰化的活性如本文所定义地增加。
本发明涉及一种将至少约1至9个、例如至少2个氨基酸取代引入ATF(特别是真菌ATF，例如根据SEQ ID NO:1或与其具有至少约20％同一性的ATF)的方法，其中与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的ATF)在系统/宿主细胞中获得的至多约10重量％范围内的视黄醇乙酸酯的百分比相比，如本文所描述的所述未经修饰的ATF的活性增加至少约10％，即视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯增加至少约10％(导致基于总类视黄醇，产生高达86wt％的视黄醇乙酸酯)，其中如本文所描述的单个氨基酸取代可与一个或多个氨基酸取代组合，以增加酶对视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的活性。
因此，在一些实施方式中，如本文所述的修饰的酶包含2个氨基酸取代，特别是所述氨基酸取代位于对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置L34和M434的残基上，更特别地包括在根据SEQ ID NO:1的多肽中的对应于L34的位置上引入苯丙氨酸和在对应于M434的位置上引入缬氨酸，例如对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的L34F和M434V的氨基酸取代。与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯的百分比相比，使用此类经修饰的酶可以导致视黄醇乙酸酯增加至少约150％。
在一些实施方式中，如本文所描述的经修饰的酶包含3个氨基酸取代，特别是所述氨基酸取代位于对应于位置L34和M434的残基上，其与对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的F346、V371、N419、R437或W478的位置上的氨基酸取代组合，更特别地包括在对应于根据SEQID NO:1的多肽中L34的位置上引入苯丙氨酸和在对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中M434的位置上引入缬氨酸，并结合在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于F346的位置上引入亮氨酸、在对应于V371的位置上引入异亮氨酸、在对应于N419的位置上引入亮氨酸或在对应于R437的位置上引入缬氨酸，例如在对应于SEQ ID NO:1的多肽中L34F和M434V与F346L、V371I、N419L或R437V的氨基酸取代。与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯的百分比相比，使用此类经修饰的酶可以导致视黄醇乙酸酯增加至少约60至550％。
在一些实施方式中，如本文所描述的经修饰的酶包含4个氨基酸取代，特别是所述氨基酸取代位于对应于位置L34和M434的残基上，其与对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的Y35、F346、V371、N419、R437或W478的位置上的氨基酸取代组合，更特别地包括在根据SEQID NO:1的多肽中对应于L34的位置上引入苯丙氨酸和对应于M434的位置上引入缬氨酸，并结合在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于Y35的位置上引入苯丙氨酸、对应于F346的位置上引入亮氨酸、对应于V371的位置上引入异亮氨酸、对应于N419的位置上引入亮氨酸、对应于R437的位置上引入缬氨酸或对应于W478的位置上引入苯丙氨酸，例如对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的L34F和M434V与Y35F、F346L、V371I、N419L、R437V或W478F组合的氨基酸取代，包括但不限于氨基酸取代L34F_Y35F_V371I_M434V或L34F_V371I_M434V_N419L或L34F_V371I_M434V_F346L或L34F_M434V_N419L_F346L或L34F_V371I_M434V_F437V或L34F_M434V_N419L_R437V或L34F_M434V_N419L_W478F。与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯的百分比相比，使用此类经修饰的酶可以导致视黄醇乙酸酯增加至少约230至670％。
在一些实施方式中，如本文所描述的经修饰的酶包含5个氨基酸取代，特别是所述氨基酸取代位于对应于位置L34、M434和V371的残基上，其与对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的Y35、F346、N419、R437或W478的位置上的氨基酸取代组合，更特别地包括在对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中L34的位置上引入苯丙氨酸和在对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中M434的位置上引入缬氨酸，并结合在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于Y35的位置上引入苯丙氨酸、在对应于F346的位置上引入亮氨酸、在对应于N419的位置上引入亮氨酸、在对应于R437的位置上引入缬氨酸或在对应于W478的位置上引入苯丙氨酸，例如对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的L34F和M434V与Y35F、F346L、N419L、R437V或W478F组合的氨基酸取代，包括但不限于氨基酸取代L34F_Y35F_V371I_M434V_N419L或L34F_V371I_M434V_N419L_F436L或L34F_Y35F_V371I_M434V_R437V或L34F_V371I_M434V_N419L_R437V或L34F_Y35F_V371I_M434V_W478F或L34F_V371I_M434V_N419L_W478F。与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯的百分比相比，使用此类经修饰的酶可以导致视黄醇乙酸酯增加至少约300至760％。
在一些实施方式中，如本文所描述的经修饰的酶包含6个氨基酸取代，特别是所述氨基酸取代位于对应于位置L34、Y35、V371、M434和N419的残基上，其与对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的F34、R437或W478的位置上的氨基酸取代组合，更特别地包括在根据SEQ IDNO:1的多肽中对应于L34的位置上引入苯丙氨酸、对应于Y35的位置上引入苯丙氨酸、对应于V371的位置上引入异亮氨酸、对应于M434的位置上引入缬氨酸和对应于N419的位置上引入亮氨酸，并结合在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于F346的位置上引入亮氨酸、对应于R437的位置上引入缬氨酸或对应于W478的位置上引入苯丙氨酸，例如对应于根据SEQ IDNO:1的多肽中的L34F、Y35F、V371I、M434V和N419L与F346L、R437V或W478F组合的氨基酸取代，包括但不限于氨基酸取代L34F_Y35F_V371I_M434V_N419L_F346L或L34F_Y35F_V371I_M434V_N419L_R437V或L34F_Y35F_V371I_M434V_N419L_W478F。与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯的百分比相比，使用此类经修饰的酶可以导致视黄醇乙酸酯增加至少约130至600％。
在一些实施方式中，如本文所描述的经修饰的酶包含8个氨基酸取代，特别是所述氨基酸取代位于对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置L34、Y35、V371、M434、N419、F346、R437和W478的残基上，更特别地包括在对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中L34的位置上引入苯丙氨酸、在对应于Y35的位置上引入苯丙氨酸、在对应于V371的位置上引入异亮氨酸、在对应于M434的位置上引入缬氨酸、在对应于N419的位置上引入亮氨酸、对应于F346的位置上引入亮氨酸、在对应于R437的位置上引入缬氨酸和在对应于W478的位置上引入苯丙氨酸，例如对应于L34F_Y35F_V371I_M434V_N419L_F346L_R437V_W478F的氨基酸取代。与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯的百分比相比，使用此类经修饰的酶可以导致视黄醇乙酸酯增加至少约700％。
在一些实施方式中，如本文所描述的经修饰的酶包含9个氨基酸取代，特别是所述氨基酸取代位于对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的位置L34、Y35、V371、M434、N419、F346、R437、W478和F373的残基上，更特别地包括在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于L34的位置上引入苯丙氨酸、对应于Y35的位置上引入苯丙氨酸、对应于V371的位置上引入异亮氨酸、对应于M434的位置上引入缬氨酸、对应于N419的位置上引入亮氨酸、对应于F346的位置上引入亮氨酸、对应于R437的位置上引入缬氨酸、对应于W478的位置上引入苯丙氨酸和对应于F373的位置上引入丙氨酸，例如对应于L34F_Y35F_V371I_M434V_N419L_F346L_R437V_W478F_F373A的氨基酸取代。与使用相应的未经修饰的ATF(例如根据SEQ ID NO:1的酶)的视黄醇乙酸酯的百分比相比，使用此类经修饰的酶可以导致视黄醇乙酸酯增加至少约10％。
如本文所描述的经修饰的宿主细胞能够将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯，与经由相应的未经修饰的酶(例如根据SEQ ID NO:1的多肽)的转化相比，转化率增加至少约10％或更多，特别是视黄醇乙酸酯产量增加10％至760％或更多，更特别是视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比在高达86重量％的范围内，例如能够通过在合适的培养条件下经由表达经修饰的ATF来获得的，所述培养条件包括但不限于在存在或不存在乙醇的情况下在木糖、葡萄糖、半乳糖和合适的宿主细胞上培养，合适的宿主细胞例如选自真菌宿主细胞(包括耶氏酵母属或酵母菌属)或其他微生物宿主细胞(例如大肠杆菌)。合适的条件可以是在例如80、90、100、110、120、130小时的分批进料的发酵中培养。
如本文所限定的经修饰的宿主细胞包含如本文所限定的经修饰的ATF的一个或多个拷贝，优选地其中ATF在所述经修饰的宿主细胞中异源表达。为了使如本文所限定的宿主细胞产生更多基因和/或蛋白质的拷贝，例如如本文所限定的具有形成视黄醇乙酸酯的选择性的经修饰的ATF的更多拷贝，修饰(包括与使用相应的未经修饰ATF(例如根据SEQ IDNO:1(图1)的SbATF1)的方法相比，视黄醇向视黄醇乙酸酯的转化率增加至少约10％，例如能够在适当的培养条件下经由表达经修饰的ATF来获得的，适当的培养条件包括但不限于在存在或不存在乙醇的情况下在木糖、葡萄糖、半乳糖上培养)可以包括使用强启动子、合适的转录和/或翻译增强子，或引入一个或多个基因拷贝到产生视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，导致在给定时间内相应酶的积累增加。技术人员知道根据宿主细胞使用哪种技术。基因表达的增加或减少可以通过各种方法测量，例如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。
产生核酸或氨基酸的突变(即诱变)可以以不同的方式进行，例如通过随机或侧向诱变、由动因(agent)引起的物理损伤，动因例如辐射、化学处理或遗传元素的插入。技术人员知道如何引入突变。
因此，本发明涉及如本文所描述的产生视黄醇宿主细胞、特别是真菌宿主细胞，其包含如本文所描述的编码经修饰的ATF的表达载体或多核苷酸，其已经整合到宿主细胞的染色体DNA中。包含在表达载体上或整合到编码如本文所描述的经修饰的ATF的染色体DNA中的异源多核苷酸的此类产生视黄醇宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，被称为重组或经修饰的宿主细胞。产生视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，可以含有编码如本文所限定的修饰的ATF的基因的一个或多个拷贝，其包含如本文所限定的突变，导致编码如本文所限定的所述经修饰的ATF的此类基因的过表达。基因表达的增加可以通过各种方法测量，例如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。
本发明特别涉及这种新的经修饰的ATF酶在生产视黄醇乙酸酯的方法中的用途，特别是在其他视黄酯的量减少的条件下，特别是长链视黄酯的量减少的条件下。技术人员知道如何生成这样的条件(参见例如WO2021136689或WO2022090548)。通过(已知的)合适的化学机制或生物技术机制的作用可以进一步将视黄醇乙酸酯转化为维生素A。
术语“序列同一性”、“％同一性”在本文中可互换使用。为了本发明的目的，在此定义，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性百分比，为了最佳比较目的而比对序列。为了优化两个序列之间的比对，可以在所比较的两个序列中的任一个中引入间隙。这种比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。序列同一性是在所报告的比对区域上在两个序列之间相同匹配的百分比。在两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.MolBiol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE中实现。为了本发明的目的，使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,Longden andBleasby,Trends in Genetics 16,(6)pp276-277,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于置换矩阵(substitution matrix)。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的任选参数是10的间隙开放罚分和0.5的间隙延伸罚分。技术人员将理解，所有这些不同的参数将产生稍微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
在通过如上所述的程序NEEDLE比对之后，查询序列和本发明的序列之间的序列同一性百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中相应位置的数目除以在减去比对中的间隙的总数之后比对的总长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中被标记为“最长同一性”。如果比较的两个氨基酸序列在它们的任何氨基酸上没有差异，则它们是相同的或具有100％同一性。
如本文所限定的经修饰的ATF酶还包含携带不改变酶活性的另外的氨基酸取代的酶，即显示出与本文所限定的酶相同的性质并催化视黄醇转化为视黄醇乙酸酯的酶，形成基于类视黄醇总量约86重量％或更多(例如11-86重量％)的视黄醇乙酸酯。此类突变也称为“沉默突变”，其不改变根据本发明的酶的(酶促)活性。
编码如本文所限定的经修饰的酶之一的酶/多核苷酸的表达可以在任何宿主系统中实现，宿主系统包括(微生物)生物体，其适合于类视黄醇(包括视黄醇)生产并且允许表达编码如本文所描述的酶之一的核酸，包括如本文所描述的功能等同物或衍生物。合适的产生视黄醇的宿主(微生物)生物体的实例是细菌、藻类、真菌(包括酵母)、植物或动物细胞。优选的细菌是埃希氏菌属的那些，例如大肠杆菌、链霉菌属、泛菌属(欧文氏菌)、芽孢杆菌属、黄杆菌属、聚球藻属、乳杆菌属、棒状杆菌属、微球菌属、混合球菌属(Mixococcus)、短杆菌属、慢生根瘤菌属、戈登氏菌属、迪氏菌属、鼠尾菌属、鞘氨醇单胞菌属、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属，例如Paracoccus zeaxanthinifaciens。优选的真核微生物，特别是包括酵母的真菌，选自：酵母菌属，例如酿酒酵母；曲霉属，例如Aspergillus niger；毕赤酵母属，例如Pichia pastoris；汉逊酵母属，例如Hansenula polymorpha；克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母；须霉属(Phycomyces)，例如Phycomyces blakesleanus；毛霉属；红酵母属；掷孢酵母属；红法夫酵母属；法夫氏菌属；布莱克氏菌属，例如Blakesleatrispora；或耶氏酵母属，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。特别优选的是在真菌宿主细胞(例如耶氏酵母属或酵母菌属)中表达，或在埃希氏菌属(Escherichia)中表达，更优选在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。
取决于宿主细胞，如本文限定的用于视黄醇乙酰化的多核苷酸可以针对在相应宿主细胞中的表达进行优化。技术人员知道如何生成此类进一步修饰的多核苷酸。应理解，如本文所限定的多核苷酸还包括此类宿主优化的核酸分子，只要它们仍然表达具有如本文所限定的相应活性的多肽。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及产生视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其包含编码如本文所限定的经修饰的ATF酶的多核苷酸，其被优化用于在所述宿主细胞中表达。特别地，产生视黄醇的宿主细胞、特别是真菌宿主细胞选自酵母，例如耶氏酵母属或酵母菌属，例如酿酒酵母或解脂耶氏酵母，其中编码如本文所限定的经修饰的ATF酶的多核苷酸选自表达经修饰的多肽的多核苷酸，所述经修饰的多肽在与SEQ ID NO:1具有至少20％(例如25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、92、95、97、98、99％或至多100％)同一性的序列中包含一个或多个氨基酸取代，例如在如本文所限定的且对应于选自位置L34、Y35、V371、M434、N419、F346、R437、W478、F373及其组合的残基的位置处引入一个或多个氨基酸取代，并且优选地包含高度保守的部分氨基酸序列，即共同的活性位点或选自对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的N190至G196位的[NDEHCS]-H-x(3)-D-[GA]的至少7个氨基酸残基的“Prosite-基序”(所述基序以Prosite语法，如在https://prosite.expasy.org/scanprosite/scanprosite_doc.html中定义)且其中“x”表示任意氨基酸，所述宿主细胞产生的视黄醇乙酸酯，与表达相应的未经修饰的酶(例如根据SEQ IDNO:1的酶)的宿主细胞相比增加至少约10％，所述未经修饰的酶例如是能够在合适的培养条件下经由表达经修饰的ATF来获得的，所述培养条件包括但不限于在葡萄糖、半乳糖或木糖上培养。
关于本发明，应当理解，生物体(例如微生物、真菌、藻类或植物)还包括具有相同生理特性的此类物种的同义词或基本同义词，如由原核生物的国际命名法(InternationalCode of Nomenclature of Prokaryotes)或藻类、真菌和植物的国际命名法(墨尔本编码)(International Code of Nomenclature for algae,fungi,and plants(MelbourneCode))所定义的。因此，例如，菌株Lachancea mirantina是源自日本的菌株Zygosaccharomyces sp.IFO 11066的同义词。
本发明涉及一种生产视黄醇乙酸酯的方法，其中视黄醇乙酸酯通过如本文所公开的视黄醇(特别是至少65％为反式视黄醇)通过如本文所描述的经修饰的ATF酶的作用进行乙酰化来产生，其中乙酰化酶优选在如本文所述的合适条件下在合适的宿主细胞中异源表达。产生的视黄醇乙酸酯可以从培养基和/或宿主细胞中分离并任选地进一步纯化。本文中所限定的所述乙酰化类视黄醇可用作产生维生素A的多步法中的结构单元。如本领域中已知的，维生素A可以从培养基和/或宿主细胞中分离并任选地进一步纯化。
优选地，通过使用如本文所描述的经修饰的ATF对视黄醇进行乙酰化可以导致基于总类视黄醇视黄醇乙酸酯百分比在至少约11至86wt％的范围内(即存在于由宿主细胞产生的类视黄醇混合物中的视黄醇乙酸酯)，例如能够在合适的培养条件下经由表达经修饰的酶获得的，所述培养条件包括但不限于在葡萄糖、半乳糖或木糖上培养。在一个更优选的实施方式中，使用具有至少约65％反式视黄醇百分比的视黄醇混合物作为经由本文限定的经修饰的酶进行乙酰化的底物。
能够产生视黄醇的宿主细胞(即微生物、藻类、真菌、动物或植物细胞)可能还能够产生β-胡萝卜素，β-胡萝卜素可以进一步被酶促转化为视黄醛，视黄醛可以进一步转化为视黄醇。技术人员知道哪些基因用于/表达用于β-胡萝卜素的生物合成和/或β-胡萝卜素向视黄醇的生物转化。进一步能够表达如本文所限定的经修饰的ATF和/或维生素A生物合成所需的其他基因的此类宿主细胞可以在有氧或厌氧条件下在补充有适当营养物的水性培养基中培养，并且如本领域技术人员对于相应的产生视黄醇的宿主细胞所知的。任选地，如本领域已知的，这样的培养在涉及电子转移的蛋白质和/或辅因子的存在下进行。用于本发明目的的合适碳源可以选自葡萄糖、果糖、棉子糖、乳糖、半乳糖、甘油、木糖、阿拉伯糖、蔗糖或麦芽糖(在存在或不存在乙醇的情况下)，特别是选自葡萄糖、半乳糖或木糖。具体的培养条件可以包含分批和进料运行，在分批阶段中葡萄糖浓度为5％(w/v)且乙醇浓度为1％(w/v)，在进料阶段中浓度为100％(w/v)。宿主细胞的培养/生长可以在合适的培养条件下以分批、进料分批、半连续或连续模式进行，特别是以进料分批模式进行80、90、100、110、120、130小时。根据宿主细胞，优选地，如本领域技术人员已知的，类视黄醇(例如维生素A)、其前体和/或衍生物(例如视黄醛、视黄醇、视黄酯，特别是视黄醇乙酸酯)的产生可以变化。在例如WO2008042338中描述了选自耶氏酵母属和酵母菌属的产生β-胡萝卜素和类视黄醇的宿主细胞的培养和分离。关于在选自大肠杆菌的宿主细胞中产生β-胡萝卜素和类视黄醇的方法描述于例如US20070166782中。
特别地，使用如本文所限定的表达如本文所描述的经修饰的ATF的合适的产生类视黄醇的宿主菌株的发酵在两相系统中培养，其中类视黄醇(包括但不限于视黄醇乙酸酯)收集在合适的亲脂相中并随后从合适的亲脂相中分离。具体条件和亲脂性溶剂公开于WO2022090548或者WO2022090549中。
在一些实施方式中，本发明涉及使用亲脂性溶剂作为第二相的两相发酵，所述亲脂性溶剂除了包括硅酮或正十二烷的已知溶剂之外，例如isopars或玉米油(参见Jang等人，Microbial CellFactories 10:59，2011)。
如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”意指其催化活性，即其催化由给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内消耗的底物和/或产生的产物的量以及在限定温度下每限定量的蛋白质。典型地，比活性以每分钟每mg蛋白质形成的产物或消耗的μmol底物表示。典型地，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性的单位定义在本文件中可互换使用。如果酶在体内，即在如本文所限定的宿主细胞内或在合适的(无细胞)系统内在合适底物存在下发挥其催化活性，则该酶是活性的。技术人员知道如何测量酶活性，评估合适的ATF、特别是本文限定的Atf1的从视黄醇转化产生视黄醇乙酸酯的能力的分析方法是本领域已知的，例如在WO2014096992的实施例4中描述的。简言之，产物例如视黄醇乙酸酯、视黄醇、反式视黄醛、顺式视黄醛、β-胡萝卜素等的滴度可以通过HPLC测量。
关于包含参与β-胡萝卜素生物合成并且在体内表达并具有活性，导致产生类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)的特定酶的合适宿主细胞，产生产生类胡萝卜素的宿主细胞的基因和方法在本领域中是已知的，参见例如WO2006102342。根据要产生的类胡萝卜素，可能涉及不同的基因。
如本文所用，“产生视黄醇的宿主细胞”是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，导致通过β-胡萝卜素经由视黄醛酶促转化为视黄醇而产生类视黄醇，例如维生素A及其前体，包括视黄醇。这些多肽包括如本文所限定的经修饰的ATF。维生素A途径的基因和生成产生类视黄醇的宿主细胞的方法是本领域已知的。术语“类视黄醇”包括视黄醇，其用作本文限定的经修饰的乙酰化酶的底物。
本文所用的类视黄醇包括β-胡萝卜素裂解产物，也称为脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、视黄酸甲氧基化物(retinoicmethoxide)、视黄醇乙酸酯、视黄酯、4-酮-类视黄醇、3-羟基-类视黄醇或其组合。本文所用的长链视黄酯定义为视黄醇与脂肪酸的烃酯，其中脂肪酸由至少约8个，例如9、10、12、13、15或20个碳原子和至多约26个，例如25、22、21个或更少的碳原子组成，优选至多约6个不饱和键，例如0、1、2、4、5、6个不饱和键。长链视黄酯中的脂肪酸包括但不限于亚油酸、油酸或棕榈酸。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008042338中。
如本文所用，“视黄醛”以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯醛已知。其在本文中可互换地称为视黄醛或维生素A醛，并且包括顺式异构体和反式异构体，例如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。
如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域熟知的。它包括长的40个碳共轭类异戊二烯多烯，其在自然界中通过两个20个碳的香叶基香叶基焦磷酸酯分子的连接形成。这些包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，例如β-胡萝卜素，其可以在4-酮位或3-羟基位氧化以产生角黄质、玉米黄质或虾青素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006102342中。
如本文所用，“维生素A”可以是在水溶液、固体和制剂中发现的维生素A的任何化学形式，并且包括视黄醇、视黄醇乙酸酯和视黄酯。它还包括视黄酸，例如未解离的、处于其游离酸形式的或解离为阴离子的。
具体而言，本发明涉及以下的实施方式(1)至(14)：
(1)修饰催化类视黄醇(特别是视黄醇)乙酰化为视黄醇乙酸酯的酶(优选真菌酶)的方法，所述方法包括在根据SEQ ID NO：1的多肽中选自氨基酸残基34、35、346、371、373、419、434、437、478及其组合的一个或多个位置处引入至少1个氨基酸取代，其中在引入一个或多个氨基酸取代后，与使用包括根据SEQ ID NO：1的酶的相应未经修饰的酶的活性相比，形成视黄醇乙酸酯的活性增加至少约10％，例如10-760％的范围。
(2)根据实施方式(1)所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:1的位置34的位置上待取代的氨基酸残基不是亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置35的位置上待取代的氨基酸残基不是酪氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置346或373的位置上待取代的氨基酸残基不是苯丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置371的位置上待取代的氨基酸残基不是缬氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置419的位置上待取代的氨基酸残基不是天冬酰胺，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置434的位置上待取代的氨基酸残基不是甲硫氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置437的位置上待取代的氨基酸残基不是精氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置478的位置上待取代的氨基酸残基不是色氨酸。
(3)根据实施方式(1)或(2)所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:1的位置34、35或478的位置上待引入的氨基酸残基是苯丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置346或419的位置上待引入的氨基酸残基是亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置371的位置上待引入的氨基酸残基是异亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置373的位置上待引入的氨基酸残基是丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置434或437的位置上待引入的氨基酸残基是缬氨酸。
(4)根据实施方式(1)、(2)或(3)中任一项所述的方法，其中经由在对应于氨基酸残基L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478和/或其组合的位置上引入一个或多个氨基酸取代来修饰与SEQ ID NO:1具有至少20％同一性的酶，优选地，其中经修饰的酶包含选自L34F、Y35F、V371I、M434V、N419L、F346L、R437V、W478F、F373A及其组合的一个或多个氨基酸取代。
(5)根据实施方式(1)、(2)、(3)或(4)的方法，其中在引入一个或多个氨基酸取代后，与使用包括根据SEQ ID NO:1的酶的相应未经修饰的酶的百分比相比，在包括在合适的宿主细胞中表达所述经修饰的酶的方法中，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比增加至约86重量％。
(6)一种生产视黄醇乙酰化酶、优选地[EC 2.3.1.84]类的乙酰转移酶的方法，所述酶对视黄醇乙酰化成视黄醇乙酸酯具有增加的活性，所述方法包括：
(a)提供参与视黄醇的乙酰化的真菌酶、特别是源自酵母菌属的ATF，其中在合适的宿主细胞中和在合适的培养条件下表达的所述未经修饰的酶能够产生基于由所述宿主细胞产生的总类视黄醇高达10重量％的视黄醇乙酸酯；
(b)在(a)的酶中进一步引入1个或多个氨基酸取代、例如至少1至9个氨基酸取代，以生成参与视黄醇乙酰化的经修饰的酶，其中当与步骤(a)的相应未经修饰的酶的乙酰化相比时，将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯的能力增加至少约10％，例如至少10至760％；其中所述至少1个或多个氨基酸取代位于对应于选自在SEQ ID NO:1中的位置34、35、346、371、373、419、434、437、478的位置的氨基酸残基的位置，并且其中取代氨基酸不同于L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478和/或其组合，其中在对应于SEQ ID NO:1中的位置34、35或478的位置处待引入的氨基酸残基优选地是苯丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ IDNO:1的位置346或419的位置处待引入的氨基酸残基优选地是亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置371的位置处待引入的氨基酸残基选地是异亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置373的位置处待引入的氨基酸残基优选地是丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置434或437的位置处待引入的氨基酸残基优选地是缬氨酸。
(7)根据实施方式(6)所述的方法，其中步骤(a)的乙酰转移酶选自酵母ATF。
(8)一种参与视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的经修饰的酶，特别是真菌酶，其包含一个或多个修饰，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中或与SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的序列的多肽中，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或高达100％同一性的序列的多肽中的选自位置34、35、346、371、373、419、434、437、478及其组合的氨基酸残基的位置处，并且其中取代的氨基酸残基不同于对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478及其组合的氨基酸，优选地其中待取代的氨基酸残基对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中选自L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478及其组合的残基，特别是其中在对应于SEQ ID NO:1的位置34、35或478的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为苯丙氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置346或419的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为亮氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置371的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为异亮氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置373的位置处待引入的取代氨基酸残基优选地为丙氨酸，和/或其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置434或437的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为缬氨酸。
(9)根据实施方式(8)所述的经修饰的酶，其选自与SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的多肽，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，其包含在选自在SEQID NO:1中的34、35、346、371、373、419、434、437和/或478的位置上的不同于L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437或W478的一个或多个氨基酸取代，优选地其中所述一个或多个氨基酸取代选自L34F、Y35F、V371I、M434V、N419L、F346L、R437V、W478F、F373A及其组合。
(10)根据实施方式(8)或(9)所述的经修饰的酶，其中与相应的未经修饰的ATF相比、例如根据SEQ ID NO:1的ATF相比，形成视黄醇乙酸酯的酶活性增加至少约10％，特别是视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比增加至约86重量％。
(11)根据实施方式(8)、(9)或(10)所述的经修饰的酶，其包含对应于在SEQ IDNO:1中的位置34和434的氨基酸取代，优选地其中所述氨基酸取代对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中的L34F_M434V。
(12)一种生产视黄醇乙酸酯的方法，包括经由根据实施方式(8)、(9)、(10)或(11)的酶的作用使视黄醇乙酰化的步骤。
(13)根据实施方式(12)所述的方法，其中用根据实施方式(8)、(9)、(10)或(11)的酶转化并表达合适的产生视黄醇的宿主细胞，优选地选自耶氏酵母属、酵母菌属或大肠杆菌。
(14)根据实施方式(12)或(13)所述的方法，其中基于由所述宿主细胞产生的总类视黄醇，在合适的培养条件下产生的视黄醇乙酸酯的百分比为约86重量％。
附图
图1：巴氏酵母ATF1的氨基酸序列(SbATF；SEQ ID NO:1)，其中用于如本申请中所描述的氨基酸取代所选择的残基以粗体/下划线标记。
以下实施例仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。贯穿本申请引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容在此通过引用并入本文，特别是WO2014096992、WO2019058001、WO2021136689、WO2022090548、WO2008042338、US20070166782、WO2022090549、WO2006102342、WO2020141168和WO2016172282。
实施例
实施例1：一般方法、菌株和质粒
本文中描所述的所有基本分子生物学和DNA操作程序通常根据Sambrook等人(编辑),Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:New York(1989)或Ausubel等人(编辑).Current Protocols in MolecularBiology.Wiley:New York(1998)。
摇板测定(耶氏酵母)。为了测试突变体的转化活性，通常将200μl的0.25％酵母提取物、0.5％蛋白胨(0.25×YP)与10μl新鲜生长的耶氏酵母接种，并用200μl具有在矿物油相中2％油酸作为碳源的矿物油(Isopar M，Exxon Mobile)覆盖。将转化体在24孔板(Microplate Devices 24Deep Well Plates Whatman 7701-5102)中生长，用垫密封件(Analytical Sales and Services Inc.Plate Mats 24010cm)覆盖，用Qiagen Airpore胶带片(19571)无菌密封，并在Infors多板摇床(Multitron)中以30℃、800RPM摇动4天。从摇板孔中取出矿物油级分，并用光电二极管阵列检测器通过UPLC反相柱进行分析。该方法也用于实施例2中。
DNA转化。解脂耶氏酵母菌株在YPD板培养基上从过夜生长中转化。从板刮取50μl细胞，并通过在500μl中与1μg转化DNA(通常用于整合转化的线性DNA)、40％PEG 3550MW、100mM乙酸锂、50mM二硫苏糖醇、5mM Tris-Cl pH 8.0、0.5mM EDTA在40℃下孵育30分钟转化并直接铺板到选择性培养基上，或者在显性抗生素标记选择的情况下，细胞在30℃下在YPD液体培养基上生长4小时，然后铺板到选择性培养基上。使用乙酸锂方法从指数期YPD生长的细胞转化酵母菌株，所述细胞通过过夜YPD培养物的传代培养而生长。收获108个细胞/转化，并重新悬浮于含有40％PEG 3350(MW)、100mM乙酸锂、10mM Tris-Cl pH 8.0、1mMEDTA、5μg剪切鲑鱼精子DNA和2μg线性化转化DNA的混合物中，最终体积为500μL。将该混合物在30℃下孵育1小时，然后在42℃下孵育30分钟。然后将细胞沉淀并重悬于液体YPD培养基中，并使其在30℃下生长3小时或在22℃下生长过夜以允许HygR抗生素抗性基因的表达，然后铺板在含有100μg/ml潮霉素的选择性培养基上。本文使用的大多数DNA序列是密码子优化的，用于在相应的宿主系统中表达并且如序列表中所示。
DNA分子生物学。含有DrBCO、LmATF和FfRDH表达系统的质粒MB10362(SEQ ID NO:3)是在Genscript(Piscataway,NJ,USA)合成。质粒MB10362含有“URA3”和“HOM3”标记物，用于在解脂耶氏酵母转化中进行选择。为了通过基因和标记物的随机非同源末端连接进行干净的基因插入，通过凝胶电泳和Qiagen凝胶纯化柱纯化MB10362的SfiI质粒片段或表1中感兴趣的其它质粒。通过测序验证克隆。通常，基因在GenScript(Piscataway，NJ)合成，引入根据表1的氨基酸取代。针对高丝氨酸营养缺陷型筛选转化体，并随后使用位于HOM3序列两侧的引物测序，并选择干净的移码以向前移动。突变ATF在酿酒酵母中的表达描述于WO2020141168的实施例1中。
序列。表1和/或序列表中列出了用于表达野生型SbATF(根据SEQ ID NO:2的多核苷酸)以及包括特定氨基酸取代的经修饰的酶的质粒，其中特别指出了用于在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达的密码子优化的序列。图1示出了野生型SbATF氨基酸序列，其具有根据表1选择用于修饰的残基的特定指示。
表1：用于构建携带来自巴氏酵母的未修饰或修饰的异源解脂耶氏酵母密码子优化的ATF基因作为插入物的菌株的质粒列表。所有插入物均基于根据SEQ ID NO:1的SbATF。有关更多详细信息，请参见正文。
UPLC反相视黄醇法。对于快速筛选，该方法不分离顺式异构体，仅分离主要官能团。使用具有自动进样器的具有PDA检测(或类似物)的Waters Acquity UPLC来注射样品。使用Acquity UPLC HSS T3 1.8um P/N 186003539来分离类视黄醇。流动相由用于类视黄醇相关化合物的1000mL己烷、30mL异丙醇和0.1mL乙酸组成。每个的流速为0.6mL/分钟。柱温为20℃。进样体积为5μL。检测器是从210至600nm收集的光电二极管阵列检测器。根据表2检测分析物。
表2A：使用反相视黄醇方法的分析物列表。所有添加的中间体的加和给出类视黄醇的总量。β-胡萝卜素*可以在325nm处检测到，并且会干扰视黄酯定量，因此必须注意观察胡萝卜素峰，并且不要将它们包括在类视黄醇定量中。“N/A”表示“不可用”。有关更多详细信息，请参见正文。
表2B：UPLC方法梯度，溶剂A：水；溶剂B：乙腈；溶剂C：甲醇；溶剂D：叔丁基甲基醚。
时间[分钟] ％A ％B ％C ％D 流速[ml/min] 压强[psi/巴]
0 50 50 0 0 0.5 最大9500-14000
0.5 50 50 0 0 0.5
1.0 0 50 50 0 0.5
1.25 0 0 100 0 0.5
3.25 0 0 5 95 0.5
3.5 0 0 5 95 0.5
4.0 0 0 100 0 0.5
4.25 0 50 50 0 0.5
4.5 50 50 0 0 0.5
方法校准。方法在视黄醇乙酸酯上校准，使用指定的响应因子相对于视黄醇乙酸酯来定量视黄醇和视黄醛。使用容量瓶将视黄醇乙酸酯以～200μg/ml溶解于THF中作为储备溶液。使用容量瓶，制备在50/50甲醇/MTBE中的储备溶液的x20、x50和x100稀释液。视黄醇乙酸酯的UV吸收相当快地变为非线性，因此必须注意保持在线性范围内。因此，较低的浓度可能会更好。棕榈酸视黄酯也可用作视黄酯校准物。视黄醇乙酸酯的峰在约3分钟，并且视黄酯(长链视黄酯)的峰在约3.5分钟。
样品制备。根据条件通过各种方法制备样品。对于全发酵液或洗涤的发酵液样品，将发酵液置于管中，称重，并加入流动相。短暂地在2ml管中，加入25μl充分混合的发酵液和975μL THF。然后将样品在均质机(Bertin Corp，Rockville，MD，USA)中根据制造商的说明以最高设置3X进行处理，通常为3×15×7500TPMS。对于洗涤的沉淀，将样品在1.7ml管中的微量离心机中以10000rpm旋转1分钟，倾析发酵液，加入1ml水，混合，沉淀并倾析，并调至原始体积。将混合物再次造粒并置于适量流动相中并通过珠打处理。为了分析硅油级分，将样品以4000RPM下旋转10分钟，并通过正位移移液管(Eppendorf，Hauppauge，NY，USA)从顶部倾析油，并稀释到通过涡旋混合的流动相中，并通过UPLC分析测量类视黄醇浓度。
耶氏酵母的发酵条件。发酵与先前描述的条件相同，优选使用硅油覆盖层和搅拌罐，优选为在总体积0.5L至5L的台式反应器中的葡萄糖(参见WO2016172282)。通常，用具有增加的生产率的分批进料搅拌的罐反应器观察到相同的结果，证明了该系统用于生产类视黄醇的效用。优选地，用5％葡萄糖进行分批发酵，在溶解氧降至低于约20％后，并恢复进料以在整个进料程序中达到20％的溶解氧。
实施例2：在表达突变SbATF的解脂耶氏酵母中产生视黄醇乙酸酯
为了在作为宿主的解脂耶氏酵母中表达异源ATF，用质粒MB9287(参见WO2022090548中的实施例1)转化菌株ML15710(参见WO2016172282中的实施例5)，以分离lip2 lip3 lip8突变体衍生物。在5-氟乳清酸上选择该衍生物以分离尿嘧啶营养缺陷型菌株，命名为菌株ML18667-new。用上表1中列出的质粒转化该菌株，每个质粒由指定的ATF等位基因、DrBCO和FfRDH12组成。选择具有来自表1的SfiI线性化质粒的ML18667-new转化体用于尿嘧啶原养型。如实施例1所述，转化体在摇板中生长，并且相对于使用在质粒MB10362上表达的参考SbATF的视黄醇乙酸酯的百分比(设定为100％)，使用突变ATF的视黄醇乙酸酯的百分比(视黄醇乙酸酯/总类视黄醇)示于表3中。
表3A：视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯(“retAc”)，如通过经修饰的ATF的作用而增强的，所述经修饰的ATF在对应于根据SEQ ID NO:1的SbATF中的相应位置的位置上包含2个氨基酸取代。“纯度”是指基于由宿主生物体产生的总类视黄醇的视黄醇乙酸酯的重量％。有关更多详细信息，请参见正文或表1。
与使用根据SEQ ID NO:1的酶的方法相比，通过引入双突变体(参见表1)，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比可以增加到超过26重量％。
表3B：视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯(“retAc”)，如通过经修饰的ATF的作用而增强的，所述经修饰的ATF在对应于根据SEQ ID NO:1的SbATF中的相应位置的位置上包含3个氨基酸取代。有关更多详细信息，请参见正文或表1。
质粒 retAc[％] 纯度[％]
MB10362 100 10
MB10364 475 47.5
MB10366 290 29.0
MB10369 375 37.5
MB10381 161 16.1
MB10387 655 65.5
与使用根据SEQ ID NO:1的酶的方法相比，通过引入双突变体(参见表1)，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比可以增加到高达66重量％。
表3C：视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯(“retAc”)，如通过经修饰的ATF的作用而增强的，所述经修饰的ATF在对应于根据SEQ ID NO:1的SbATF中的相应位置的位置上包含4个氨基酸取代。有关更多详细信息，请参见正文或表1。
与使用根据SEQ ID NO:1的酶的方法相比，通过引入4个突变(参见表1)，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比可以提高到高达77重量％。
表3D：视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯(“retAc”)，如通过经修饰的ATF的作用而增强的，所述经修饰的ATF在对应于根据SEQ ID NO:1的SbATF中的相应位置的位置上包含5个氨基酸取代。有关更多详细信息，请参见正文或表1。
质粒 retAc[％] 纯度[％]
MB10362 100 10
MB10368 399 39.9
MB10373 316 31.6
MB10383 591 59.1
MB10385 776 72.6
MB10389 860 86.0
MB10391 784 78.4
与使用根据SEQ ID NO:1的酶的方法相比，通过引入4个突变(参见表1)，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比可以提高到高达86重量％。
表3E：视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯(“retAc”)，如通过经修饰的ATF的作用而增强的，所述经修饰的ATF在对应于根据SEQ ID NO:1的SbATF中的相应位置的位置上包含6个氨基酸取代。有关更多详细信息，请参见正文或表1。
与使用根据SEQ ID NO:1的酶的方法相比，通过引入6个突变(参见表1)，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比可以提高到高达80重量％。
表3F：视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯(“retAc”)，如通过经修饰的ATF的作用而增强的，所述经修饰的ATF在对应于根据SEQ ID NO:1的SbATF中的相应位置的位置上包含8个氨基酸取代。有关更多详细信息，请参见正文或表1。
质粒 retAc[％] 纯度[％]
MB10362 100 10
MB10393 802 80.2
与使用根据SEQ ID NO:1的酶的方法相比，通过引入4个突变(参见表1)，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比可以提高到高达80重量％。
表3G：视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯(“retAc”)，如通过经修饰的ATF的作用而增强的，所述经修饰的ATF在对应于根据SEQ ID NO:1的SbATF中的相应位置的位置上包含9个氨基酸取代。有关更多详细信息，请参见正文或表1。
质粒 retAc[％] 纯度[％]
MB10362 100 10
MB10394 112 11.2
与使用根据SEQ ID NO:1的酶的方法相比，通过引入4个突变(参见表1)，视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比可以提高到高达11重量％。

Claims (14)

1.一种修饰催化类视黄醇乙酰化的酶的方法，所述催化类视黄醇乙酰化的酶特别是修饰催化视黄醇乙酰化成视黄醇乙酸酯的酶、优选地真菌酶，所述方法包括在根据SEQ IDNO:1的多肽中选自氨基酸残基34和434的位置处引入至少2个氨基酸取代，其中在引入所述至少两个氨基酸取代后，与使用包括根据SEQ ID NO:1的酶的相应未经修饰的酶的活性相比，形成视黄醇乙酸酯的活性提高至少约10％，并且其中在对应于SEQ ID NO:1中氨基酸残基34和434的位置上的氨基酸残基不同于L34和M434。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在根据SEQ ID NO:1的多肽中选自氨基酸残基35、346、371、373、419、437、478及其组合的一个或多个位置处引入至少1个氨基酸取代，其中在引入一个或多个氨基酸取代后，与使用包括根据SEQ ID NO:1的酶的相应未经修饰的酶的活性相比，形成视黄醇乙酸酯的活性增加至少约10％，例如在10至760％的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:1的位置35的位置上待取代的氨基酸残基不是酪氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置346或373的位置上待取代的氨基酸残基不是苯丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置371的位置上待取代的氨基酸残基不是缬氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置419的位置上待取代的氨基酸残基不是天冬酰胺，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置437的位置上待取代的氨基酸残基不是精氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置478的位置上待取代的氨基酸残基不是色氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:1的位置34、35或478的位置上待引入的氨基酸残基是苯丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置346或419的位置上待引入的氨基酸残基是亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置371的位置上待引入的氨基酸残基是异亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置373的位置上待引入的氨基酸残基是丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置434或437的位置上待引入的氨基酸残基是缬氨酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中经由在对应于氨基酸残基Y35、F346、V371、F373、N419、R437、W478和/或其组合的位置上引入一个或多个氨基酸取代来修饰与SEQ ID NO:1具有至少20％同一性的酶，优选地，其中经修饰的酶包含选自Y35F、V371I、N419L、F346L、R437V、W478F、F373A及其组合的一个或多个氨基酸取代与氨基酸取代L34F和M434V组合。
6.一种生产视黄醇乙酰化酶、优选地[EC 2.3.1.84]类的乙酰转移酶的方法，所述酶对视黄醇乙酰化成视黄醇乙酸酯具有增加的活性，所述方法包括：
(a)提供参与视黄醇的乙酰化的真菌酶、特别是源自酵母菌属的ATF，其中在合适的宿主细胞中和在合适的培养条件下表达的所述未经修饰的酶能够产生基于由所述宿主细胞产生的总类视黄醇高达10重量％的视黄醇乙酸酯；
(b)在根据SEQ ID NO:1的多肽中对应于L34和M434的位置上引入至少2个氨基酸取代，在(a)的酶中进一步引入至少1至7个氨基酸取代以生成参与视黄醇乙酰化的经修饰的酶，其中当与步骤(a)的相应未经修饰的酶的乙酰化相比时，将视黄醇转化为视黄醇乙酸酯的能力增加至少约10％，例如至少10至760％；
其中所述至少1至7个氨基酸取代位于对应于选自在SEQ ID NO:1中的位置35、346、371、373、419、437、478的位置的氨基酸残基的位置，并且其中取代氨基酸不同于Y35、F346、V371、F373、N419、R437、W478和/或其组合，其中在对应于SEQ ID NO:1中的位置34、35或478的位置处待引入的氨基酸残基优选地是苯丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置346或419的位置处待引入的氨基酸残基优选地是亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置371的位置处待引入的氨基酸残基选地是异亮氨酸，和/或其中在对应于SEQ ID NO:1的位置373的位置处待引入的氨基酸残基优选地是丙氨酸，和/或其中在对应于SEQ IDNO:1的位置434或437的位置处待引入的氨基酸残基优选地是缬氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(a)的乙酰转移酶选自酵母ATF。
8.一种参与视黄醇乙酰化为视黄醇乙酸酯的经修饰的酶，特别是真菌酶，其包含至少2个修饰，例如位于对应于根据SEQ ID NO:1的多肽中氨基酸残基34和434的位置处的氨基酸取代，还包含至少1、2、3、4、5、6、7个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于在根据SEQ IDNO:1的多肽中或与SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的序列的多肽中，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或高达100％同一性的序列的多肽中的选自位置35、346、371、373、419、437、478及其组合的氨基酸残基的位置处，并且其中取代的氨基酸残基不同于对应于在根据SEQ IDNO:1的多肽中L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478及其组合的氨基酸，优选地其中待取代的氨基酸残基对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中选自L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437、W478及其组合的残基，特别是其中在对应于SEQ ID NO:1的位置34、35或478的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为苯丙氨酸，其中在对应于在SEQ IDNO:1中的位置346或419的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为亮氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置371的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为异亮氨酸，其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置373的位置处待引入的取代氨基酸残基优选地为丙氨酸，和/或其中在对应于在SEQ ID NO:1中的位置434或437的位置处待引入的取代的氨基酸残基优选地为缬氨酸。
9.根据权利要求8所述的经修饰的酶，其选自与SEQ ID NO:1具有至少约20％同一性的多肽，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽，其包含在选自在SEQ ID NO:1中的34、35、346、371、373、419、434、437和/或478的位置上的不同于L34、Y35、F346、V371、F373、N419、M434、R437或W478的一个或多个氨基酸取代，优选地其中所述一个或多个氨基酸取代选自L34F、Y35F、V371I、M434V、N419L、F346L、R437V、W478F、F373A及其组合。
10.根据权利要求8或9所述的经修饰的酶，其中与相应的未经修饰的ATF相比、例如根据SEQ ID NO:1的ATF相比，形成视黄醇乙酸酯的酶活性增加至少约10％，特别是视黄醇乙酸酯基于总类视黄醇的百分比增加至约86重量％。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的经修饰的酶，其包含对应于在根据SEQ ID NO:1的多肽中的L34F_M434V的氨基酸取代。
12.一种生产视黄醇乙酸酯的方法，包括经由根据权利要求8至11中任一项所述的酶的作用使视黄醇乙酰化的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中合适的产生视黄醇的宿主细胞，优选地选自耶氏酵母属、酵母菌属或大肠杆菌用根据权利要求8至11中任一项所述的酶转化并表达根据权利要求8至11中任一项所述的酶。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中基于由所述宿主细胞产生的总类视黄醇，在合适的培养条件下产生的视黄醇乙酸酯的百分比为约86重量％。
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