CN120574767A - 人胎盘源促血管干细胞hPASCs及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了人胎盘源促血管干细胞hPASCs及其应用。本公开的人胎盘源促血管干细胞hPASCs保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2025年4月2日；保藏编号：CCTCC NO:C202592。本公开的hPASCs含有血管生成细胞亚群且具有干细胞“干性”，在体内外均具有血管生成作用，可用于心血管疾病等疾病的治疗以及人工器官和组织血管化构建。

Description

人胎盘源促血管干细胞hPASCs及其应用

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种人胎盘源促血管干细胞hPASCs及其应用。

背景技术

终末期肾病（End-stage Kidney Disease，ESKD）为慢性肾脏疾病（Chronickidney disease，CKD）肾功能不可逆丧失进展至终末阶段。ESKD主要通过透析及肾移植治疗，患者透析承受经济负担及感染风险，肾移植需终身服用免疫抑制药物且肾源严重短缺，2010年报告全球490.2-708.3万ESKD患者需肾移植治疗（Adv Exp Med Biol 2019, 1165:3-15），但等待肾移植患者数量远超器官捐赠者，每年数百万人因缺乏肾源而死于肾衰（Lancet 2015, 385(9981):1975-1982）。生物工程肾脏器官旨在利用患者自体或异体细胞与工程仿生支架体外构建替代组织并植入以替换、恢复或增强受损肾脏功能，为解决器官来源短缺问题的策略之一。

目前广泛研究的肾脏组织工程支架材料包括合成聚合物如聚己内酯（PCL）、聚乳酸（PLA）和聚乙烯醇（PVA）与天然脱细胞支架等（Bioengineering (Basel) 2022, 9(10)）。合成支架材料难以模拟生物体内微环境与天然组织的机械或生化特性，及克服免疫原性，修复能力有限（Bioact Mater 2022,10:15-31）。肾脏脱细胞支架去除免疫原性细胞成分，具有良好生物相容性与低排异率（Biomater Res 2023,27(1):10），且保留血管、肾小球与小管3D超微结构、部分信号及生长因子蛋白，为植入细胞提供粘附、增殖、迁移、分化、定植及生长微环境（Biomaterials 2013, 34(28):6670-6682.）。此外，大鼠肾脱细胞支架材料原位移植后裸露的细胞外基质致血栓形成（Curr Opin Hematol 2016, 23(3):280-287），缺乏实质细胞浸润填充支架，炎症细胞浸润或蛋白酶水解致细胞外基质被吸收（Sci Rep2017, 7:43502.）。单纯移植肾脏脱细胞支架材料不能有效实现器官再生，脱细胞支架材料移植物早期缺少血液、氧气及营养供应，而受体血管网络向移植物组织内生长需要时间。血管网对于发挥皮质肾小球滤过功能及供应氧气与营养维持髓质肾小管重吸收、分泌功能发挥重要作用，血管化为构建完整工程化肾脏器官的必需成分。因此，构建血管化组织工程肾脏才从根本上解决移植物存活问题（Tissue Eng Part B Rev 2022, 28(1):1-21）。

血管系统由具有不同大小、解剖学、生理学和细胞排列的血管组成，毛细血管具有内皮祖细胞，内皮细胞，血管周细胞，平滑肌细胞, 血管巨噬细胞、血管壁干细胞等。因此用于血管化的细胞分为内皮细胞和支持细胞两大类（Front Bioeng Biotechnol 2023, 11:1103727.）。目前广泛应用于组织工程血管化的种子细胞为人脐静脉内皮细胞hUVECs（human Umbilical Vein Endothelial Cells），简称ECs。hUVECs已应用于肾脏（Nat Med2013, 19(5):646-651；Front Bioeng Biotechnol 2023, 11:1184408.）、肝脏（NatBiomed Eng 2020, 4(4):437-445）、心脏（Biomaterials 2015, 61:279-289）、肺（AnnSurg 2018, 267(3):590-598）等器官脱细胞支架血管化。但植入外源性ECs不能进一步发育为器官特异性血管表型，非器官特异性ECs影响血管化质量，无法与宿主特异性血管连通形成支持血液循环的功能性血管网络且阻碍器官内实质细胞再生（Trends Biotechnol2018, 36(8):834-849）；此外，hUVECs与脱细胞支架材料黏附不牢随血流易脱落致血栓形成（Bioact Mater 2021, 6(8):2557-2568.）。血管内皮细胞作为异体抗原是异体组织或器官移植中自身抗体的首选靶点（Front Immunol 2022, 13:），同种异体人源内皮细胞不仅表达MHCⅠ与MHCⅡ且组成性表达PD-L1等共刺激因子，通过直接异体识别提供共刺激信号激活T细胞及抗体介导排斥反应使异体来源内皮细胞附近补体级联反应激活形成攻膜复合物（MAC）及局部炎症介质，增强内皮细胞与T细胞的直接异体反应，最终导致强烈的免疫排斥反应（Trends Biotechnol 2018, 36(8):834-849.）。因此直接将ECs植入肾脏脱细胞支架材料构建血管化组织工程肾脏不能够有效实现血管化及移植物存活，EC构建血管化组织工程肾脏具有一定局限性。

为了提高ECs在脱细胞支架材料中植入效率及功能，间充质干细胞（Mesenchymalstem cells, MSCs）与ECs联合移植。大鼠肾小球内皮细胞与大鼠骨髓间充质干细胞在肾脏脱细胞支架中体外共培养实现微血管化, MSCs降低内皮细胞炎症损伤、减少细胞凋亡、支持血管稳定、提高细胞活力、细胞增殖、细胞迁移和血管化，制成ECM衍生的可植入肾支架，但本研究缺乏体内实验验证其是否成功构建功能性血管网（Mater Today Bio 2022, 17:100464）。MSCs体内无法自发分化为支持血流的内皮导管（Blood 2008, 111(9):4551-4558）。且MSCs来源广泛，如脂肪、骨髓，其多系谱分化潜能与其组织来源有关，即存在组织异质性（Proc Natl Acad Sci USA 2014, 111(28):10137-10142.）。尽管MSCs与ECs联合移植构建血管化脱细胞支架材料取得一定进展，但未能体内构建出具有完整血管网状结构与功能，体内移植形成的组织工程器官与再体组织具有较大差异。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本公开提供一种新型的人胎盘来源的血管生成干细胞及其在生物工程器官构建中的应用。

本发明第一方面提供了一种人胎盘源促血管干细胞hPASCs Homo sapiens，所述hPASCs保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2025年4月2日；保藏编号：CCTCC NO:C202592。

本发明第二方面提供了一种人胎盘源促血管干细胞hPASCs，所述hPASCs表达标志物PAI-1，MECOM，CD201，CD44，CD73及HLA-ABC，不表达标志物CD34、CD146、CD31和CD326；优选地，所述hPASCs来源于胎盘血管组织巨噬细胞和/或血管壁干细胞。

本发明第三方面提供了一种人胎盘源促血管干细胞hPASCs的分离方法，包括如下步骤：1）人胎盘组织消化；2）消化产物沉降获取上清；3）滤网过滤上清，反冲滤网获得胎盘微血管组织；4）在hPASC培养基中培养胎盘微血管组织；5）原代细胞传代培养；6）hPASC鉴定。

在一些实施方式中，所述胎盘微血管组织的直径为20μm -100μm；优选为40μm-70μm。

在一些实施方式中，所述hPASC培养基以周边细胞培养基作为基础培养基，并添加青霉素/链霉素双抗。

在一些实施方式中，所述周边细胞培养基为Pericyte Medium，货号1201，购买自ScienCell。

在一些实施方式中，所述Pericyte Medium中的血清被Platelet Lysate替换。

在一些实施方式中，所述步骤6）中所述鉴定包括将具有选自以下的一种或多种特征的细胞定义为hPASCs：a)含有4个血管生成干细胞亚群且具有干细胞“干性”；b)体外或体内培养中能够形成血管结构;c)表面标志物呈PAI-1阳性，MECOM阳性，CD201阳性，CD44阳性，CD73阳性，HLA-ABC阳性，CD34阴性，CD146阴性，CD31阴性和CD326阴性。

在一些实施方式中，所述血管生成干细胞亚群通过单细胞测序分析获得。

在一些实施方式中，所述干细胞“干性”通过CytoTRACE分析获得。

在一些实施方式中，所述体外形成血管结构的能力通过体外3D Matrigel或3D“sandwich”培养进行评估。

本发明第四方面提供了根据本发明第三方面所述的分离方法分离获得的人胎盘源促血管干细胞hPASCs。

本发明第五方面提供了组合物，其包含本发明第一、第二或第四方面所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs。

本发明第六方面提供了本发明第一、第二或第四方面所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或第五方面所述的组合物在制备病症缓解或疾病治疗的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述疾病或病症选自心血管疾病、糖尿病并发症、神经系统疾病、眼科疾病、慢性创口和溃疡。

在一些实施方式中，所述心血管疾病选自心肌梗死、慢性缺血性心脏病、外周动脉疾病、冠状动脉再狭窄和心力衰竭。

在一些实施方式中，所述糖尿病并发症选自糖尿病足溃疡、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病和糖尿病周围神经病变。

在一些实施方式中，所述神经系统疾病选自缺血性脑卒中、脊髓损伤、阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症。

在一些实施方式中，所述眼科疾病选自年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、角膜新生血管性疾病和青光眼视神经病变。

在一些实施方式中，所述慢性创口选自烧伤创面、术后难愈性创口和压疮。

在一些实施方式中，所述溃疡选自静脉性溃疡、动脉性溃疡和放射性溃疡。

本发明第七方面提供了本发明第一、第二或第四方面所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或第五方面所述的组合物在组织工程与再生医学中的应用。其中，所述应用包括促进人工器官的血管化、皮肤再生、骨与软骨再生、神经组织修复和复杂组织结构重建。在一些实施方式中，所述应用在体外进行；在一些实施方式中，所述应用是非直接治疗目的的。

本发明第八方面提供了本发明第一、第二或第四方面所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或第五方面所述的组合物在制备生物工程人工器官中的应用。

在一些实施方式中，所述人工器官包括工程肾、工程血管、工程肝脏、心脏补片、人工皮肤、人工气管、人工膀胱和人工角膜；优选地，所述生物工程人工器官为生物工程肾。

本发明第九方面提供了一种制备生物工程器官的方法，所述方法包括将本发明第一、第二或第四方面所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs和类器官植入脱细胞支架的步骤。

在一些实施方式中，所述生物工程器官选自工程肾、工程血管、工程肝脏、心脏补片、人工皮肤、人工气管、人工膀胱和人工角膜；优选地，所述生物工程人工器官为生物工程肾。

在一些实施方式中，所述生物工程器官为生物工程肾。

在一些实施方式中，所述类器官为肾脏类器官。

在一些实施方式中，所述脱细胞支架为肾脏脱细胞支架。

在一些实施方式中，其中所述脱细胞支架由离体器官经脱细胞处理获得。

在一些实施方式中，其中所述脱细胞处理包括给予离体器官脱细胞灌注液的灌注步骤；优选地，所述灌注采用蠕动泵进行；优选地，所述灌注步骤进行一次或以上；优选地，所述灌注液选自肝素钠溶液、TritonX-100和SDS溶液中一种或多种；任选地，进一步包括灌注后的清洗步骤。

本发明第十方面提供了生物工程器官，其包含本发明第一、第二或第四方面所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或本发明第五方面所述的组合物。

在一些实施方式中，所述生物工程器官根据本发明第八方面所述的方法获得；优选地，所述生物工程器官为生物工程肾。

本发明第十一方面提供了本发明第九方面所述的生物工程器官在制备用于治疗疾病的药物或医疗器械中的用途；优选地，所述生物工程器官为生物工程肾，所述用于药物或医疗器械治疗肾病。

本发明相对与现有技术的优势在于：

1）本发明从胎盘分离获得一种新型干细胞系hPASCs，该细胞系含有4个血管生成细胞亚群，具有干细胞“干性”，具有促血管生成功能。hPASCs阳性表达PAI-1，MECOM，CD201，CD44，CD73及HLA-ABC；不表达造血干细胞及内皮祖细胞标志物（CD34）、不表达周细胞标志物（CD146）、不表达内皮细胞标志物CD31及上皮细胞标志物CD326。hPASCs单细胞与胎盘微血管组织单细胞进行关联分析溯源，hPASCs由胎盘血管组织巨噬细胞和/或血管壁干细胞/或血管内皮祖细胞（EPCs）发育而来。

2）hPASCs的生物力学特征与hUVECs及hUCMSCs不同，其牵引力介于二者之间。

3）hPASCs在3D Matrigel上培养能够形成血管结构，而hUCMSCs形成聚集体不能形成血管结构；hPASCs在3D“sandwich”培养中能够形成血管结构，而hUVECs及hUCMSCs均仅形成聚集体，不能形成血管结构。

4）hPASCs复合脱细胞支架材料体外培养后体外能够形成血管结构，且较hUVECs及hUCMSCs对材料的粘附能力强。

5）hPASCs复合脱细胞支架材料体内肾被膜移植及体内肾切除移植中较hUVECs及hUCMSCs形成较多血管结构，相对于二者具有更强的促血管生成作用及功能。

6）hPASCs复合脱细胞支架材料体内肾被膜移植及体内肾切除移植参与宿主血管形成，分化形成血管细胞。

附图说明

图1显示hPASCs具有干细胞“干性”潜能及血管生成分子特征。A, hPASCs分离及单细胞测序流程；B，hPASCs细胞形态特征，比例尺100 µm；C，hPASCs单细胞RNA测序（ScRNA-seq）分析hPASCs细胞类型；D，ScRNA-seq 分析hPASCs marker基因；E，ScRNA-seq GO富集分析；F，hPASCs干细胞特征分析功能表型富集；G，hPASCs CytoTRACE“干性”分析；H，hPASCs“干性”潜能分析；I，hPASCs “干性”相对系数；J，hPASCs免疫荧光鉴定，比例尺20 µm；K，hPASCs流式分析。

图2显示人胎盘血管组织单细胞测序及hPASCs细胞微血管组织定位来源。A，人胎盘源血管组织单细胞测序分析细胞类型。B-C， hPASCs单细胞与人胎盘血管组织单细胞相关性分析。D，hPASCs与人胎盘微血管组织细胞类型相关性拟时针发育分析。

图3显示hPASCs 3D或3D“sandwich”培养血管生成潜能。A，单细胞牵引力（TFM）成像；B，单细胞均方根（RMS）及总应变能（pJ）；n=17，P<0.05；C，3D培养模型；D，hPASCs 3D培养具有血管生成潜能；E，hUVECs与hUCMSCs或hPASCs不同比例3D培养；F，连续动态3D培养hPASCs活细胞成像具有血管生成潜能；G，3D “sandwich” 培养模型；H-I，hPASCs在3D“sandwich”培养72 h形成血管网络；比例尺50 µm。

图4 显示hPASCs体外注入肾脏脱细胞支架材料灌流培养后血管结构形成。A-B，CD31与α-SMA免疫荧光显示hPASCs重建血管结构（箭头指示），比例尺 100 µm，200 µm。C，血管化生物工程化肾脏超微结构：SEM显示hPASCs在细胞之间形成连接结构（箭头指示），比例尺 100 µm，20 µm；D，TEM显示hPASCs形成连接结构并黏附于支架材料,其它组形成坏死结构（箭头指示），比例尺1 µm，2 µm。

图5显示hPASCs注入脱细胞支架材料培养后肾被膜膜移植促进血管新生。A，HE染色；比例尺 50 µm，100 µm。B，CD31免疫荧光；比例尺 200 µm。C，血管密度统计分析：DKS和DKS+KIO组（n=3），其它组（n=5）；P < 0.05。D， mCherry-hPASCs与血管标志物EDH3，CD31，α-SMA共表达参与宿主血管形成，比例尺20µm。

图6显示hPASCs注入脱细胞支架材料培养后肾切除移植促进血管新生。A，植入物中的超声3D血管建模。B，CD31免疫荧光染色，比例尺200µm。C，血管密度统计分析：DKS组和DKS+KIO组（n=4）；其它组（n=5），P<0.05。D，hPASCs荧光mCherry标记追踪结果显示hPASCs与血管标志物EDH3，CD31，α-SMA共表达说明hPASCs参与宿主血管形成，比例尺20 µm。

图7 显示hPASCs体内促进血管新生机制。A, RNA-seq 测序分析： GO enrichmentanalysis; B，KEGG enrichment analysis; n=3, P<0.05。C,肾被膜下移植物Westernblotting 检测 pAKT及VEGFA蛋白，n=3, P<0.05; D,肾切除模型移植物Western blotting检测 pAKT 及VEGFA 蛋白, n=3, P<0.05。

发明详述

下文将更全面地描述根据本公开的一些实施方案。然而，本公开的各方面可以以不同的形式来体现，并且不应被解释为限于本文所阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开透彻和完整，并且将向本领域技术人员充分传达本公开的范围。在本文的描述中使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制。

除非另有定义，否则本文所用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。还应当理解，诸如在常用词典中定义的那些术语应当被解释为具有与它们在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过于正式的意义来解释，除非在此明确地定义。

除非明确地指出，否则在本文所述的本公开的各种特征可以以任何组合使用。此外，本公开还预期在实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。

除非明确地指出，否则所有指定的一些实施方案、特征和术语旨在包括所叙述的实施方案、特征或术语以及它们的生物学等同物。

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利公布和专利申请出于所有目的以引用方式整体并入。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利公布和专利申请的提及不得且不应被视为承认或以任何形式表明它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家公知常识的一部分。

本文中描述和说明的实施方案中的每一个具有各别的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以容易地与其他若干实施方案中任一个的特征分离或组合，而不脱离本公开的范围或精神。任何所叙述的方法均可以按照所叙述的事件的顺序或者以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。

本公开下列实施例中未注明的具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学生物试剂，均为市售产品。除非另有说明，否则本公开不限于特定的材料、试剂、工具等。

除非另有说明，本公开的实施将采用有机化学、药理学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。

定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，术语“约”或“大约”意在涵盖在一些情况下偏离指定值±20%，±10%，±5%，±1%，或±0.1%的变化。

本公开的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本公开。在本公开中也有可能的是，步骤可以在逻辑上可行的情况下以不同的顺序执行。

如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。

在提供数值范围的情况下，应当理解，每个中间值，到下限单位的十分之一(除非上下文明确指出)，该范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在该陈述范围内的中间值均涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该较小范围内并且也涵盖在本公开内，但受到所陈述范围中任何具体排除的限制的约束。当所陈述范围包括一个或两个限制时，排除这些所包括的限制中的任一个或两者的范围也包括在本公开中。

本公开的术语“有”、“含有”、“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。本公开还设想构思了“包括”、“由......组成”和“基本上由......组成”本文呈现的实施例或元件组成的其他实施例，无论是否明确阐述。

在本公开中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

关于本文中数值范围的叙述，已明确考虑了其间具有相同精度的每个中间数值。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还考虑了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，已明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

如本文所用，术语“或”意指其中之一、两者或备选方案的任何组合，并且可与术语“和/或”互换使用，除非上下文清楚地另有说明。

如本文所用，术语“干细胞”是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。多数认为干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。

如本文所用，术语“人胎盘源促血管干细胞hPASCs”或“hPASCs”或“人胎盘源促血管干细胞”是指人胎盘分离培养获得的干细胞。该细胞具有干细胞特性，具有向血管内皮细胞、平滑肌细胞分化潜能；经体外空间培养具有成血管功能。本发明具体使用的人胎盘源促血管干细胞hPASCs已于2025年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2025年4月2日；保藏编号：CCTCC NO:C202592。本发明分离的hPASCs来源于胎盘血管组织巨噬细胞、血管壁干细胞和/或血管内皮祖细胞，hPASCs阳性表达PAI-1，MECOM，CD201，CD44，CD73及HLA-ABC；不表达造血干细胞及内皮祖细胞标志物（CD34）、不表达周细胞标志物（CD146）、不表达内皮细胞标志物CD31及上皮细胞标志物CD326。

如本文所述，术语“MSCs”，Mesenchymal Stem Cells或Mesenchymal StromalCells，间充质干细胞/间充质基质细胞，是一类具有自我更新能力和免疫调节功能的成体干细胞/基质细胞，广泛存在于多种组织中，通过分化为特定细胞类型或分泌生物活性分子参与组织修复、免疫调控及微环境稳态维持。MSCs来源于骨髓、脂肪组织、脐带华通氏胶、胎盘、牙髓、滑膜等。可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞（“金标准”定义），部分条件下可分化为神经样细胞、血管内皮细胞等。

如本文所述，术语“hUCMSCs”，Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，人脐带间充质干细胞，是从新生儿脐带组织（如华通氏胶，Wharton’s jelly）中分离提取的一类多能间充质干细胞，具有自我更新能力、多向分化潜能及免疫调节特性，是再生医学和细胞治疗的重要细胞来源。hUCMSCs表达间充质干细胞标志物（CD73、CD90、CD105），不表达造血系标志物（CD34、CD45）及HLA-DR，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。hUCMSCs可用于组织修复与再生，免疫调节治疗及抗纤维化与抗衰老等。

如本文所述，术语“hUVECs”，Human Umbilical Vein Endothelial Cells，人脐静脉内皮细胞是从新生儿脐带静脉内壁分离的原代内皮细胞，具有典型的血管内皮特性，广泛用于血管生物学研究、药物筛选及组织工程中的血管化模型构建。

如本文所用，术语“生物工程器官”又称生物性人造器官，是利用动物身上的细胞或组织，培养形成具有生物活性的器官或组织。“生物工程器官”又分为异体人造器官和自体人造器官。异体人造器官是指在非人动物（如猪或基因编辑猪、兔、鼠、狗等）身上培育的人体器官；而自体人造器官是利用患者自身的细胞或组织来培育人体器官。

如本文所用，术语“脱细胞支架”或“DKS”，是指从组织中去除了引起免疫排斥反应的细胞和部分抗原成分的脱细胞基质支架，其特点是降低了在体内植入时导致免疫排斥的能力。脱细胞后组织器官原有的细胞外基质结构、一些非抗原活性成分如多糖、胶原蛋白、糖蛋白和纤维连接蛋白等得到保留，许多天然的细胞结合位点被保存在支架中，有助于再生过程中细胞的粘附、增殖和分化。目前脱细胞支架已经广泛应用于全器官工程中器官再生、组织修复和重建、生物打印、疾病模型和药物筛选以及细胞培养等方面。

如本文所用，术语“类器官”指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，最大程度地模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。类器官在器官发育、再生医学、药物筛选、精准医疗、基因编辑、疾病建模等领域都有广泛。

如本文所用，术语“流体循环灌注培养”或“细胞灌流培养”或“流体灌注培养”是一种在生物工程器官构建中模拟体内生理流体动态环境的体外培养技术，通过持续或周期性向三维生物材料-细胞复合体中灌注培养液，提供机械刺激（如剪切应力）、改善物质交换（氧、营养、代谢废物），并促进血管网络形成及组织功能成熟。“流体循环灌注培养”可用于血管化器官构建、骨与软骨再生和药物测试模型。

如本文所述，术语“原代细胞”是指从机体取出后立即培养的细胞。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。最常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养为将动物组织从机体中取出离散成单个细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

如本文所用，术语“受试者”旨在包括人类和非人类动物。在一些实施方案中，受试者是人类受试者，例如患有本文所述的病症或处于患有本文所述的病症的风险中的人类患者。术语“非人类动物”包括哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物。本文所述的细胞和组合物适合于治疗患有本文所述的病症的人类患者。患有本文所述的病症的患者包括例如已发展本文所述的病症但(至少暂时)无症状的患者、已表现出本文所述的症状的患者、以及患有与所述病症相关的病症的患者。

如本文所用，术语“治疗”是指患有病症和/或经历病症症状的受试者（例如，人）在一些实施方案中将遭受较轻的严重症状和/或进行治疗时比从未进行治疗时恢复得更快。治疗可以部分或完全减轻、改善、缓解、抑制效果或症状、特征和/或原因的一种或多种表现，或降低其严重性，和/或降低发病率，和任选地延迟其发作一种疾病。在一些实施方案中，治疗是针对未表现出某种病症的某些体征的受试者和/或仅表现出某种病症的早期体征的受试者。在一些实施方案中，治疗对象是表现出一种或多种已确定的病症体征的受试者。在一些实施方案中，治疗是对诊断为患有病症的受试者进行的。

在本公开中使用的术语“基因”指包括用于产生具有非编码功能的RNA(例如，核糖体RNA或转运RNA)、多肽或任何前述物质的前体的控制序列和编码序列的DNA序列。RNA或多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留所需的活性或功能即可。因此，“基因”是指编码在生物体中发挥功能作用的多肽或RNA链的DNA或RNA或其部分。出于本公开的目的，可以认为基因包括调节基因产物产生的区域，无论此类调控序列是否邻近编码序列和/或转录序列。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。

当指基因产物时，例如，由编码序列编码时，术语“蛋白质”(如果是单链)、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。“蛋白质”还可以指一种或多种多肽的缔合。“基因产物”是指由于基因转录而产生的分子。基因产物包括从基因转录的RNA分子，以及从此类转录物翻译来的蛋白质。本文中的“目标产物”即感兴趣的基因的产物。

具体实施方式

下面通过具体实施例的方式来进一步说明本公开的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本公开，不应视为对本公开的具体限制。

实施例1 hPASCs的分离、鉴定

1.1 hPASCs分离培养

hPASCs从人胎盘组织中分离，人胎盘组织消化，消化产物沉降获取上清，上清经一次性无菌滤网过滤后收集滤膜并反冲滤膜获得胎盘微血管组织（直径为40μm-70μm），胎盘微血管组织在专用培养基（hPASCs培养基）中培养获得原代细胞。hPASCs培养基以周边细胞培养基（ScienCell^TM, Cat.1201）作为基础培养基，并添加青霉素/链霉素双抗。hPASCs传代至第5代进行相关分析鉴定。hPASCs接种于无菌培养皿 (Jet Biofil，TCD000100)，37.5℃，置于5% CO₂恒温箱培养。每隔2天换液，每4-5天传代。

1.2 hPASCs单细胞测序

收集传代3次融合度75%的干细胞。其存活率大于85%，40微米孔径筛网过滤；单细胞悬浮液装载到单细胞微流体芯片上，捕获不少于10000个细胞。将捕获的mRNA与预热的逆转录混合物在42℃和1000 rpm的条件下在热混匀仪中孵育90min。使用PCR扩增捕获的全长cDNA，纯化并断裂，添加接头。纯化的cDNA用于文库构建。使用Illumina NovaSeq平台上进行150 bp的配对末端测序。

1.3 人胎盘血管组织单细胞测序

人胎盘组织消化，消化产物沉降获取上清，上清经一次性无菌滤网过滤后收集滤膜并反冲滤膜获得胎盘微血管组织（直径为40μm-70μm）；并将胎盘微血管组织消化为单细胞，经过40微米孔径筛网过滤；上机捕获大于10000个细胞进行单细胞测序，方法同1.2。

1.4 单细胞分析

使用CeleScope（版本2.0.4）（https://github.com/ singleron-RD/CeleScope.Github）对单细胞转录组数据进行处理，并将其与人参考基因组组装hg38进行比对。通过Seurat（版本4.4.0）对细胞进行质量控制筛选，剔除可检测基因数少于200个、基因计数低于500或线粒体基因占比超过10%的细胞。采用Seurat工作流程对高质量细胞进行对数标准化和缩放处理，并通过FindVariableFeatures功能筛选出前2000个高变基因（HVGs）。基于这些高变基因进行主成分分析（PCA），提取能解释最大变异的30个主成分（PCs），随后使用均匀流形近似与投影（UMAP）方法在二维空间中可视化高质量细胞。通过Seurat中的Wilcoxon秩和检验函数FindMarker，鉴定某一细胞簇相较于其他细胞簇的差异表达基因（DEGs）。结合肾脏基因表达谱对细胞类型进行注释。在不预先设定分化时间或方向的条件下，采用Monocle3（版本1.3.1）进行轨迹分析以预测各胎儿肾脏类器官细胞类型间的分化路径。虽然缺乏先验知识难以确定分化起始点，但CytoTRACE软件包（版本0.3.3）可辅助预测细胞分化状态顺序及细胞干性。CellphoneDB（版本3.0.0）作为开源数据库，通过整合UniProt、Ensembl、PDB、IUPHAR等数据库中的受体、配体及其相互作用信息，支持对细胞间通讯分子的全面系统分析，从而研究不同细胞类型间的互作与通讯机制。通过调用CellphoneDB软件包的统计分析功能，对单细胞表达谱中表征的配体-受体关系进行了解析

1.5 活细胞工作站

将第3代hPASCs培养于3D Matrigel中，并在37℃、5%CO₂条件下使用活细胞工作站CT（Nikon）进行实时成像。每2小时采集一次细胞图像，连续记录96小时。随后，将图像导出至计算机进行分析，并整合成动态视频。

1.6 hPASCs流式鉴定分析

采用流式细胞仪（BD，Canto II）对抗体标记的hPASCs）进行分析，并使用Flow Jo-V10（版本14.0.0.0）软件进行细胞数据解析。 流式抗体如下：APC Mouse Anti-HumanCD201 (EPCR) (eBioscience™, 17-2018-42), PE-Cyanine7 Human/Mouse CD44(eBioscience™, 25-0441-81)，PE Mouse Anti-Human CD73 (BD Pharmingen™,550257), PE Mouse Anti-Human HLA-ABC (BD Pharmingen™, 555553), PE MouseAnti-Human CD34 (BD Pharmingen™, 550761), PerCP-Cy™ 5.5 Mouse Anti-HumanCD146 (BD Pharmingen™, 562134), PE Mouse anti-Human CD31 (BioLegend,102418), APC Mouse Anti-Human CD326 (BioLegend, 118214)。

1.7细胞免疫荧光染色

将P3（第3代）hPASCs接种于24孔板中（细胞接种前将载玻片植入孔板中），细胞达到70%融合度，用4%多聚甲醛固定15分钟，用PBS（Solarbio，T8220，PBST）洗涤3次行染色分析。用5%驴血清（Solarbio，SL050）封闭30-60分钟。将一抗用2.5%驴血清稀释后4℃孵育过夜。PBST洗涤后，用2.5%驴血清稀释的二抗孵育1小时。PBST洗涤后，加入DAPI染液（Solarbio，S2110），封片后使用激光共聚焦显微镜（Zeiss，LSM 900）观察。采用ZEN 2.6软件分析数据。一抗信息：MECOM（ATLAS ANTIBODIES，HPA046537，diluted 1:500），PAI-1（Abcam，ab222754，diluted 1:1000）。二抗信息：Goat anti-Rabbit, FITC(ThermoFisher,F-2765,diluted 1:400)。

1.8 结果

hPASCs的分离及单细胞测序流程如图1A所示,hPASCs细胞呈血管腔样结构增殖，细胞形态间于成纤维样与上皮样之间（图1B）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，第三代hPASCs可被分为8个功能富集的亚群，包括4个促血管生成亚群、1个增殖亚群和3个免疫调节亚群（图1C和图1D）。促血管生成亚群特征：Cluster 1（血管生成1）：高表达SERPINE1、ACTG1、ANXA2和MYL6，与巨噬细胞功能及血管生成相关；Cluster 2（血管生成2）：富含HTRA3、SPON2、TFPI2和AKR1B1，促进血管周围迁移和侵袭；Cluster 3（血管生成3）：特异性表达CXCL1、CXCL3、CXCL8和CCL2等促血管生成趋化因子；Cluster 5（血管生成4）：包含基质金属蛋白酶（MMP1和MMP14）、STC1和G0S2，参与侵袭和血管生成过程；增殖亚群特征（Cluster 4）高表达MT-RNR2、MALAT1、NEAT1和CALD1，具有抑制细胞凋亡、促进增殖的作用。免疫调节亚群特征：Cluster 6（免疫调节1）：以干扰素刺激基因（ISG15和ISG20）、OASL和IFIT1为标志，具有先天免疫调节及抗病毒功能；Cluster 7（免疫调节2）：富含DIO2和COL12A1，参与细胞迁移过程；Cluster 8（免疫调节3）：表达IL1RL1和CCL20，与免疫调节及炎症反应相关。GO富集分析进一步证实了这些功能亚群在血管生成、增殖和免疫调节方面的分子特征（图1E）。

为验证hPASCs的干性特征，首先将hPASCs依据功能分为三大亚群促血管亚群、免疫调节亚群及增殖亚群（图1F）；通过基因计数与表达的细胞轨迹重建分析（CytoTRACE）发现，hPASCs具有干细胞“干性”即“干性”多潜能性与单潜能性之间（图1G）；CytoTRACE的潜能评分与相对排序结果进一步证实hPASCs具有干细胞潜能特性（图1H，图1I）。

进一步建立了hPASCs的特征性表面分子标志谱系：hPASCs阳性表达PAI-1，MECOM（图1J）；同时经流式分析hPASCs阳性表达CD201，CD44，CD73及HLA-ABC）；不表达造血干细胞及内皮祖细胞标志物（CD34）、不表达周细胞标志物（CD146）、不表达内皮细胞标志物CD31及阴性表达上皮细胞标志物CD326（图1K）。

为了进一步溯源hPASCs, 对人胎盘血管组织进行单细胞测序分析，结果表明人胎盘血管组织含有血管内皮祖细胞（Edothelial progenitor stem cells, EPCs）；血管壁干细胞（Capillary stem cells, CSCs）；周细胞（Pericyte）/血管平滑肌细胞(vascularSmooth musle cells,vSMCs) /间充质干细胞（MSC）；血管2型巨噬细胞（vascularMacrophage 2, vM2）；红细胞（Erythrocyte）；胎盘外滋养层祖细胞（extravilloustrophoblast progenitor,EVT progenitors）；T细胞（T cells）；自然杀伤细胞（Naturekiller cells, NK）；单个核细胞（mononuclear cell, MN）； 血管1型巨噬细胞（vascularMacrophage 1,vM1）；胎盘外滋养层祖细胞（extravillous trophoblast, EVT）其；幼稚B细胞（Naïve B cell）及合体滋养层细胞（Syncytiotrophoblast, STB）13个亚群（图2A）。hPASCs与胎盘微血管组织相关性分析表明，hPASCs与胎盘组织大部分细胞分离，但部分细胞群体具有一定的相关性，说明hPASCs是由胎盘微血管组织的部分细胞类型发育而来（图2B，图2C）。进一步通过拟时针发育分析鉴定发育轨迹，结果表明hPASCs是由胎盘微血管组织有血管内皮祖细胞（EPCs），血管壁干细胞（CSCs）及血管2型巨噬细胞（vM2）发育而来（图2D）。

上述结果表明hPASCs是具有血管生成潜能干细胞群体、且不同于已有干细胞类型，因此将其定义为一种新型干细胞：人胎盘源促血管干细胞（human placenta derivedangiogenic stem cells），简称hPASCs。实施例1获得的人胎盘源促血管干细胞hPASCs已于2025年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:C202592。

实施例2 hPASCs 3D Matrigel或3D“sandwich”培养的血管生成潜能

2.1 hPASCs生物力学检测

丙烯酰胺和双丙烯酰胺以3%:0.1%比例混合，形成刚度1 kpa的聚丙烯酰胺(PA)凝胶。PA凝胶包被35mm玻璃底培养皿，结合硅烷预处理，室温聚合30min。罗丹明0.5μm羧酸修饰荧光珠以1:50比例水稀释，包被在PA凝胶表面25 min。1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺，盐酸 (EDC，Invitrogen，3.8 mg mL-1 in 2-(N-Morpholino)，乙磺酸(MES，Sigma)，pH 5.5和羟基-2，5-二氧吡啶-3-磺酸(sulo - nhs，Sigma，7.6 mg/mL MES，pH 5.5)溶液室温下使荧光珠与凝胶表面共价结合2 h，换用PBS (pH 7.4) 2h。经磺胺-Sanpah (Pierce)活化后，玻璃体连接蛋白4℃过夜功能化凝胶底物。细胞接种于底物上6h，在细胞分化过程中加入10μM Y27632 (Y27)或10mM Blebbistatin (Bleb) 48h，以抑制细胞骨架的收缩。记录细胞消化前后的单细胞图像(相衬)和荧光图像。利用数字图像相关(DIC)技术，根据细胞脱离前后荧光珠的位置变化，计算细胞收缩引起底物的位移场。采用参考傅立叶变换牵引细胞术的滤波方法在MATLAB中重构牵引应力。测量单个细胞施加的平均方根牵引力（RMS）和总应变能（pJ）。

2.2 hPASCs 3D Matrigel与3D“sandwich”培养血管

3D培养：

材料预处理：Matrigel基质胶（R&D Systems；货号3433-005-01）置于4℃冰上缓慢解冻；48孔培养板预热至37.5℃；提前将1.5 mL微量离心管和P200移液枪头预冷至4℃。

底层制备：将50% Matrigel（V/V）与50%培养基（V/V）混合均匀；置于37.5℃、5%CO₂培养箱中孵育30分钟使其充分凝固。

上层接种：将细胞悬液（密度5.3×10⁶cells/mL）用内皮细胞培养基重悬后加至凝固的基质胶上层培养。

3D“sandwich”培养

基质低层制备：在预冷的1.5 mL离心管中将100μL内皮细胞培养基与100μLMatrigel混匀，将混合液转移至预热的低吸附48孔板中，37.5℃、5% CO₂条件下孵育30分钟使基质胶凝固。

细胞中层构建：人脐静脉内皮细胞（hUVECs），人脐带间充质干细胞（hUCMSCs），人胎盘源促血管干细胞（hPASCs），hUVECs+hUCMSCs共培养组，hUVECs+hPASCs共培养组，分别将100μL细胞悬液与100 μL Matrigel（1:1，V/V）混合转移至已凝固的基质层上；再次37.5℃孵育30分钟使细胞层基质胶凝固。

上层培养维持：每孔加入250 μL预温的内皮细胞培养基，每日更换新鲜培养基。

2.3 结果

为了系统比较hUVECs、hUCMSCs及hPASCs的生物力学特性差异，采用牵引力显微镜（TFM）定量分析了单细胞的牵引力（RMS）和总应变能（TSE）。单细胞RMS分布分析显示（图3A），hUCMSCs的牵引力RMS显著高于hUVECs（P<0.0001，n=17）和hPASCs（P<0.0001，n=17），而hPASCs的牵引力RMS又显著高于hUVECs（P=0.0074，n=17）；在总应变能（pJ）方面，hUCMSCs同样显著高于hUVECs（P<0.0001，n=17）和hPASCs（P<0.0001，n=17），但hPASCs与hUVECs之间无统计学差异（图3B）。这些结果表明，hUCMSCs表现出最强的机械牵引特性和应变能。

为验证hPASCs的血管生成能力，建立了体外3D Matrigel培养体系，3D培养模式如图3C。首先，单独培养实验显示，hUCMSCs在24小时后形成球状聚集体，而hUVECs和hPASCs均能形成典型的血管网络结构（图3D），表明hPASCs具有内在的血管生成潜能。其次，通过不同比例（20:1、10:1、5:1、2:1和1:1）的共培养实验发现，hUVECs/hUCMSCs共培养组仅形成球状聚集体，而hUVECs/hPASCs共培养组在20:1、10:1和5:1比例下维持了稳定的血管网络结构，在2:1和1:1比例下还表现出显著的迁移能力（图3E），表明hPASCs具有优于hUCMSCs的促血管生成和迁移特性。

连续活细胞成像进一步证实，hUVECs、hPASCs及其1:1共培养组均能形成血管网络，而hUCMSCs及其与hUVECs共培养组则完全不具备此能力（图3F）。

为更精确模拟体内微环境，本发明建立了3D"sandwich"Matrigel培养模型（图3G）。为进一步解析细胞间相互作用，采用荧光标记技术（mCherry标记hUCMSCs/hPASCs，GFP标记hUVECs）进行观察。该模型结果显示，hPASCs单独或与hUVECs共培养时均可形成空间三维血管网络，而hUVECs、hUCMSCs及其共培养组均未能构建血管结构（图3H和图3I）。值得注意的是，hUVECs在常规3D和"sandwich"模型中的表现差异，提示后者能更准确地模拟体内血管生成所需的复杂空间微环境。综合上述结果，hPASCs表现出独特的自发血管形成能力，这一特性在hUCMSCs和hUVECs中均未观察到。

实施例3 hPASCs体外注入肾脏脱细胞支架材料（DKS）灌流培养后血管结构形成

3.1 大鼠肾脏脱细胞支架材料（DKS）制备

大鼠（SD）3%异氟烷 (RWD, R510-22-10) 吸入麻醉，以仰卧位固定腹部清洁并除毛, 从耻骨联合至剑突作纵向切口；首先，经肝门静脉注入100 ml肝素钠溶液 (BoyunBiotech, BY12126) 清除肾脏中残余血液，再去除肾周脂肪及肾被膜；钝性分离腹主动脉与下腔静脉，分离肾脏，保留肾动脉及与其连接的1 cm腹主动脉和肾静脉及与其连接的1cm的下腔静脉；24G带翼留置针套管(汇邦)对肾动、静脉插管，4-0缝线 (金环) 血管外结扎固定；大鼠肾脏置于10cm无菌培养皿 (JET，02023662-TCD010100) 中, 下方放置玻璃烧杯承接脱细胞废液；利用装配泵头(DG-4,10 rollers) 蠕动泵 (longer pump, BT300-2J)以转速5rpm(5 ml/min) 给予脱细胞灌注液，灌注流程为：首先，1ɡ/L肝素钠溶液500 ml；其次，1% (v/v) Triton X-100溶液(Beyotime, ST795) 500 ml；第三；8 ɡ/L SDS溶液(BioFroxx,151-21-3) 800 ml；第四，脱细胞后含有1% Pen Strep（Gibco，15140-122）的2000 ml PBS以1.5 rpm (1.5 ml/min) 转速清洗支架；最后，清洗完毕将脱细胞肾支架置于盛有PBS (含1% Pen Strep) 的50 ml离心管中，于-80℃保存。

3.2 肾脏类器官（KIO）制备

肾脏类器官构建的组织来源于人类肾脏捐赠或活检组织。组织处理采用1:1混合的胶原酶I（Gibco，171018029）和胶原酶II（Gibco，171701015），浓度为1 mg/ml。消化过程在37℃下进行30分钟，通过添加含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12培养基（Sigma；D8537-500 ml）终止反应。随后以800×g离心5分钟沉淀细胞组分。在进行3D" sandwich "培养前，先将48孔板（Jet Biofil）置于CO₂培养箱中预热。Matrigel基质胶（R&D Systems；3433-005-01）全程冰上保存以维持其生物活性。该3D“sandwich”培养体系由三层结构组成：底层为50% Matrigel（V/V）（R&D Systems，3433-005-01）与50% PM-hKOCM（V/V）的混合液，加入预热孔板后轻斜使Matrigel均匀铺展，随后置于37℃ CO₂培养箱中固化30分钟；中层为30%Matrigel与70% PM-hKOCM的混合体系，将原代肾脏细胞悬液混入其中，充分混匀后加至已固化的底层上，37℃固化30分钟；最后在固化中层表面缓慢加入300 µL PM-hKOCM完全培养基。整个培养体系置于CO₂培养箱中维持，每日更换新鲜培养基。获得肾脏类器官（KIO）。

其中，PM-hKOCM的培养基组成为：pericyte medium (ScienCell^TM, Cat.1201)，添加补充成分为：1% Pen Strep (V/V),1% GlutaMAX-1 (V/V), 1% MEM NEAA (V/V)(Gibco, 11140-050), 10 mM HEPES (Solarbio,H1095), 1% Insulin-Transferrin-Selenium-X (V/V) (Gibco, 51500-056), 0.1% 2-mercaptoethanol (V/V) (Gibco,21985-023), 2% B-27(V/V) (Gibco,17504044), 1% KnockOut SR XenoFree medium(KSR) (Gibco,12618013), 100 ng/mL R-spondin 1 (R&D systems,4645-RS-025),25ng/mL Wnt3a (R&D systems, 5036-WNP), 3µM CHIR-99021 (Selleck,S1263),50ng/mLEGF (Peprotech, 100-47), 50ng/mL FGF10 (Peprotech, 100-26), 50 ng/mL KGF(Peprotech, 100-19), 0.2 µM A 83-01 (MedChemExpress, HY-10432)，50 ng/mL GDNF(Peprotech, 450-10), 0.2 µM LDN193189 (MedChemExpress, HY-12071), 5µM SB202190 (MedChemExpress, HY-10295), 0.1µM TTNPB (MedChemExpress, HY-15682)，10µM Y-27632（Selleck；S6390）和0.2% Primocin™（V/V）（Invivogen，ant-pm）。

3.3 hPASCs体外注入肾脏脱细胞支架材料循环灌注再细胞化培养

150μl细胞培养基重悬2×10⁷细胞，1 ml注射器 (Tansoole, 02026616-TS069-004) 吸取细胞悬液, 通过连接于脱细胞肾支架动、静脉的留置针套管进行等量注射; 流动相瓶中置入50ml离心管, 加入20 ml细胞培养基; 蠕动泵硅胶管动脉端 (A端) 和静脉端 (V端) 通过流动相瓶盖分别与再细胞化肾脏支架动脉端和静脉端的留置针套管连接，肾脏支架浸入细胞培养基; 调转速为17rpm (1 ml/min), 调培养基流动方向为A端到V端,开启蠕动泵, 12h后调转速为20 rpm (1.2 ml/min); 细胞培养每2-3天换液。

hPASCs体外注入肾脏脱细胞支架培养4天后，将肾脏类器官用培养基重悬至150μL;按照前述相同注射方法将肾脏类器官注入肾脏支架材料并培养，培养至24 h进行取材和肾被膜移植。移植前取一组织块于4%多聚甲醛(上海凌峰，20100601)固定用于石蜡包埋，另一组织块于预冷的2.5%戊二醛(Alfa Aesar，111-30-8)固定用于扫描电镜和透射电镜，其余组织用于大鼠肾被膜下移植。

3.4 扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）

样本体积约4 mm × 3 mm × 3 mm，2.5％戊二醛(EMS，16020) 4 ℃浸泡12 h以上；去离子水洗涤3次，每次15 min，置入培养皿 (Jet，TCD010100)后加双蒸水使组织完全淹没；置于-80℃冰箱24 h，真空冷冻干燥仪(Labconco，USA)干燥24 h；固定于导电胶的铜板，真空喷镀仪（HITACHI，Japan）喷金2 min; 扫描电子显微镜(HITACHI，Japan)采集图像。

3.5透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）

样本体积约1mm³，0.1％氯化钠溶液 (左巴健康科技有限公司，C19091502) 清洗，2.5％ 戊二醛 (EMS，16020) 4ºC固定2 h；0.1 M 磷酸缓冲液(钰博生物，YB160232) 清洗3次，1％锇酸 (tedpella，18459) 避光固定1 h，磷酸缓冲液、纯水各清洗2次；1％醋酸铀(Syntechem，541-09-3) 染色2h，70％丙酮、80％丙酮、90％丙酮、100 ％丙酮依次脱水，组织依次于丙酮和环氧树脂 (SPI，1220324) 1:1混合物中浸透后置于37℃烘箱1 h，于丙酮和环氧树脂1:4混合物置于37℃烘箱过夜，于环氧树脂置于45℃ 烘箱2h，定向包埋后依次置于45℃烘箱3h，65℃烘箱48h聚合。超薄切片机(Ultramicrotome，USA) 切取小于100nm组织薄片，透射电子显微镜 (HITACHI，Japan) 观察并以15000×，30000×拍摄图像。

3.6 结果

荧光标记hUCMSCs，hPASCs及hUVECs进一步示踪在脱细胞支架（DKS）中血管形成能力。DKS+hPASCs+KIO组形成hPASCs表达CD31血管结构，表明hPASCs能够分化为内皮细胞且形成血管管腔结构； DKS+hUVECs+KIO组具有血管结构，但hUVECs与CD31并未完全重合，表明hUVECs失去内皮细胞特征；DKS+hPASCs+hUVECs+KIO组形成血管结构hUVECs附着于hPASCs外侧，表明hPASCs相较于内皮细胞hUVECs更倾向于附着于支架；DKS+hUCMSCs+KIO与DKS+hUCMSCs+hUVECs+KIO组中，细胞聚集而没有特定细胞分布；DKS和DKS+KIO组未见血管结构及CD31表达（图4A）。进一步α-SMA染色显示与上述CD31结果相似（图4B）。SEM结果显示体外持续动态培养DKS+KIO与DKS+hPASCs+KIO组支架空间结构得到良好维持，而其他组空间结构出现不同程度塌陷；DKS+hPASCs+KIO组出现细胞连接结构（图4C）。TEM结果表明DKS+hPASCs+KIO组细胞延伸伪足附着于支架，并形成细胞之间连接结构；而其他组中观察到细胞碎片、空泡和凋亡小体（图4D）。 综上所述，hPASCs具有强大粘附能力，能够形成血管结构。

实施例4 hPASCs注入脱细胞支架材料培养后肾被膜移植促进血管新生

4.1肾被膜下移植术：

大鼠经2%异氟烷吸入麻醉后固定于右侧卧位。在左肾区作1.5-2 cm纵行切口，于无菌条件下暴露双侧肾脏。在肾被膜下极作2mm切口，将移植物植入包膜下间隙后，用显微镊将其推至上极。肾脏还纳腹腔后，用4-0缝线分层缝合切口。术后14天处死大鼠取材。

4.2组织形态染色

组织工程样本4 %多聚甲醛 (上海凌峰，20100601) 固定24 h，石蜡包埋，连续4μm组织切片(LEICA)。60℃烘烤1 h，依次置于二甲苯Ⅰ (JIA NI，20130115)，二甲苯Ⅱ (JIANI，20130115)，无水乙醇 (露泉，20220401)，95%，90%，85%，80 %乙醇溶液浸泡各10 min，最后蒸馏水浸泡5 min脱蜡至水后染色。H＆E染色（Hematoxylin-eosin staining）(Solarbio，G1120)，马松三色染色(Masson's trichrome staining) (Solarbio，G1343)参照说明书。

4.3免疫荧光染色

将组织切片浸入PBS缓冲液（Solarbio，P1010）10分钟。用0.25% Triton X-100（Beyotime，P0096）通透5-15分钟，随后用含0.1% Tween-20的PBS（Solarbio，T8220，PBST）洗涤。用5%驴血清（Solarbio，SL050）封闭30-60分钟。将一抗用2.5%驴血清稀释后4℃孵育过夜。PBST洗涤后，用2.5%驴血清稀释的二抗孵育1小时15分钟。PBST洗涤后，加入DAPI染液（Solarbio，S2110），封片后使用激光共聚焦显微镜（Zeiss，LSM 900）观察。采用ZEN 2.6软件分析数据。一抗信息：CD31（Abcam；ab281583，1:100稀释）；α-SMA（Abcam；ab7817，1:150稀释）；EHD 抗体 (Proteintech; 25320-1-AP, diluted 1:200)。

4.4 统计学方法

连续资料若服从正态分布则以均数±标准差（Mean ± SD）表示，α=0.05；两组间比较若方差齐则采用两独立样本t检验，若方差不齐则采用韦尔奇检验（Welch two-samplet-test）；多组比较若方差齐采用单因素方差分析与Turkey’s 多重分析（one-way ANOVAwith Turkey’s post hoc test），方差不齐时则采用单因素方差分析和Tamhane^，s T2 检验进行分析。双侧P<0.05时认为差异有统计学意义。连续资料若不服从正态分布则以中位数和四分位数间距表示（Median with interquartile range），α=0.05；两组间比较使用Mann-Whitney U 检验，多组比较使用Kruskal-Wallis秩和检验。双侧P <0.05时认为差异有统计学意义。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics 25软件进行，所有统计图均使用GraphPad Prism。

4.5结果

为了确定hPASCs肾被膜移植促血管生成作用，HE染色显示DKS+hPASCs+KIO与DKS+hPASCs+hUVECs+KIO组血管结构数量高于其他组（图5A）。进一步通过CD31染色，DKS+hPASCs+KIO组CD31⁺血管明显多于其他组（图5B）；统计分析显示，DKS+hPASCs+KIO植入物中的CD31⁺血管密度显著高于DKS（n=3，P=0.002），DKS+KIO（n=3，P=0.046），DKS+hUCMSCs+KIO（n=5，P=0.004）及DKS+hUVECs+KIO（n=5，P=0.001）组，而DKS+hUVECs+KIO、DKS+hUCMSCs+KIO、DKS+KIO与DKS组中CD31+血管密度无统计学差异（图5C），该结果表明hPASCs相比于hUVECs和hUCMSCs具有更强的促血管生成作用，而hUCMSCs或hPASCs与hUVECs共植入并未显著促进肾被膜移植血管生成。为了进一步验证，hPASCs在肾被膜下是否参与了宿主血管的形成，mCherry-hPASCs进行追踪，结果发现mCherry与肾血管内皮细胞EDH3，CD31与α-SMA共表达（图5D），该结果表明hPASCs植入脱细胞支架材料移植后参与了宿主血管形成。

实施例5 hPASCs注入脱细胞支架材料培养后肾切除移植促进血管新生

5.1 肾脏部分切除移植术

大鼠经2%异氟烷麻醉后保持右侧卧位。通过肾脏区域背侧横切口（1.5-2 cm）无菌暴露左肾，右肾不作处理。钝性分离左肾动静脉后，用无创微血管夹阻断血流。夹闭后左肾呈紫绀色，维持夹闭35分钟以防止缺血再灌注损伤。切除肾脏下极1/3部分后，使用可吸收5-0缝线（金环医疗用品有限公司，R516）将剩余肾脏与修剪后的支架（体积与切除肾脏相似）等距缝合，缝线间隔约2 mm，共8-9针。移植后移除血管夹恢复血流灌注，肾脏立即恢复红润。将左肾还纳腹腔后，使用不可吸收4-0缝线（金环医疗用品有限公司，F402）分层缝合切口。术后14天处死大鼠获取左肾标本。

5.2 超声检测

采用高分辨率动物超声系统（VisualSonics，Vevo 3100）在肾部分切除和移植术后第14天进行肾脏B超检查。使用2%异氟烷麻醉大鼠并置于右侧卧位后，采用MX250:20 MHz探头检查左肾区域。探头从腹侧缓慢移动至靠近脊柱的背侧，平行于肾脏长轴，以扫描整个肾脏。记录宿主肾脏和移植区域的大小、形态、位置及血流情况。

5.3 结果

肾切除移植于D14超声3D血管建模显示DKS+hPASCs+KIO植入组血管密度高于其他组，而DKS+KIO，DKS+hUVECs+KIO及DKS+hUCMSCs+hUVECs+KIO移植物血管密度相对较低（图6A）。荧光染色显示DKS+hPASCs+KIO移植物CD31⁺血管数量相对较多（图6B），统计分析表明DKS+hPASCs+KIO移植物血管密度高于DKS+hUVECs+KIO（n=5，P=0.032），DKS+hUCMSCs+KIO（n=5，P=0.003），DKS+KIO（n=4，P=0.001）及DKS（n=4，P=0.000037）组，其他组之间无显著差异；DKS+hPASCs+KIO移植物血管密度高于DKS+hUVECs+hPASCs+KIO组（n=5，P=0.024）（图6C）；统计结果表明，hPASCs相对于hUCMSCs或hUVECs在肾脏切除模型中具有更强促血管生成能力，与hUVECs联合移植对宿主血管生成无显著作用。再次，hPASCs荧光mCherry标记追踪结果显示hPASCs与血管表面相关表面标志物EDH3，CD31及α-SMA共表达（图6D），该结果表明hPASCs参与了宿主血管形成。

实施例6 hPASCs体内促进血管新生机制

6.1 RNA测序分析

将组织样本（20-50 mg）置于无RNase EP管（Axygen，MCT-150-C）中，-80°C保存。使用组织研磨仪（上海净信，JXFSPTPR-24）在1 ml TRIzol（Ambion，15596026）中以60 Hz频率匀浆50秒，室温静置5分钟后将匀浆液转移至新管。加入200μl氯仿（Aldrich，485403-500MG），混匀静置3分钟，离心（12,000 rpm，15分钟，4℃）。收集水相，加入5 μl AcrylCarrier（Solarbio，SA1020）和500 μl异丙醇（Titan，G75885B），混匀静置10分钟后离心（12,000 rpm，10分钟，4℃）。弃上清，加入1 ml 75%乙醇，混匀离心（7,500 rpm，2分钟，4℃）。残留上清干燥5分钟后，用30μl无RNase dH₂O（Takara，RR047A）重悬。使用Nano DropOne（Thermo Fisher Scientific）检测RNA浓度和质量，目标A260/A280比值为1.9-2.0。采用科晓K5500分光光度计和RNA Nano 6000检测试剂盒（Agilent Technologies，5067-1511）进一步评估总RNA纯度和完整性。使用oligo-dT磁珠纯化mRNA，二价阳离子溶液片段化后作为模板合成第一链cDNA，继而合成互补链形成双链cDNA。使用QiaQuick PCR纯化试剂盒（Qiagen，28104）纯化文库片段，进行末端修复、加A尾并连接接头。通过PCR扩增目标产物构建文库。采用HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS（Illumina）进行RNA文库簇生成，在Illumina平台进行测序，获得150 bp双端读长。测序后分析差异基因富集的高表达信号通路，Western blotting验证。设置3个生物学重复，P值<0.05认为具有统计学意义。

6.2 Western blotting实验

移植肾组织用RIPA裂解液（Beyotime，P1048）裂解，匀浆后冰水浴孵育10分钟。4℃、12,000 rpm离心10分钟获取上清。配制BCA工作液和标准品（ThermoScientific，23225），测定562 nm吸光度并绘制标准曲线计算样本浓度。按1:4（v/v）加入5×上样缓冲液（Fude Biological Technology, FD002），99℃煮沸10分钟后-20℃保存。样本与蛋白Marker（ThermoScientific，REF26617）上样至PAGE胶(YAMAY BIOTECH, PG21)，80 V电泳30分钟后改为100 V，直至溴酚蓝到达胶底端。PVDF膜（Immobilon，ISEQ00010）经甲醇(Hongsheng Fine Chemical, CY20211010)激活5分钟后，300 mA转膜1.5小时。室温下用5%封闭液（Beyotime，P0216）封闭1小时，4℃孵育一抗过夜。使用的一抗包括：AKT兔多抗（abclonal，A11016）、磷酸化AKT兔多抗（abclonal，AP0274）、VEGFA兔多抗（abclonal，A5708）及内参β-Actin兔单抗（abclonal，AC026）。室温孵育二抗（山羊抗兔IgG，HRP标记抗体，CST，7074）1小时。使用多功能凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）采集图像，Image Lab和ImageJ 3.0软件分析灰度值。

6.3 结果

RNA测序及GO富集分析显示，与DKS+hUVECs+KIO组相比，DKS+hPASCs+KIO组血管发育通路显著上调；而与DKS+hUCMSCs+KIO组相比，其血管生成调控通路明显上调（图7A）。KEGG分析进一步表明，DKS+hPASCs+KIO组的PIP3/AKT信号通路表达水平高于DKS+hUVECs+KIO组（图7B），提示hPASCs移植后可激活血管生成相关通路。Western blotting验证结果显示：在肾被膜下移植模型中DKS+hPASCs+KIO组pAKT表达量显著高于DKS+hUVECs+KIO组（n=3，P=0.0246）及DKS+hUCMSCs+KIO组（n=3，P=0.0032）；DKS+hPASCs+KIO组VEGFA表达量显著高于DKS+hUVECs+KIO组（n=3，P=0.0398）（图7C）。在肾部分切除联合生物工程肾脏缝合大鼠模型中：DKS+hPASCs+KIO组的pAKT表达量显著高于DKS+hUVECs+KIO组（n=3，P=0.0297）；DKS+hPASCs+KIO组的VEGFA表达量显著高于DKS+hUVECs+KIO组（n=3，P=0.0456）及DKS+hUCMSCs+KIO组（n=3，P=0.0044）（图7D）。因此，hPASCs通过激活AKT信号通路促进血管生成。

Claims (15)

1.人胎盘源促血管干细胞hPASCs，其特征在于，所述hPASCs的保藏编号为CCTCC NO:C202592。

2.人胎盘源促血管干细胞hPASCs，其特征在于，所述hPASCs呈标志物PAI-1阳性，MECOM阳性，CD201阳性，CD44阳性，CD73阳性，HLA-ABC阳性，CD34阴性，CD146阴性，CD31阴性和CD326阴性；优选地，所述hPASCs来源于胎盘血管组织巨噬细胞、血管壁干细胞和/或血管内皮祖细胞。

3.人胎盘源促血管干细胞hPASCs的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：1）人胎盘组织消化；2）消化产物沉降获取上清；3）滤网过滤上清，反冲滤网获得胎盘微血管组织；4）在hPASC培养基中培养胎盘微血管组织获得原代细胞；5）原代细胞传代培养；6）hPASC鉴定；

优选地，其中所述胎盘微血管组织的直径为20μm-100μm，优选为40μm-70μm；

优选地，所述hPASC培养基以周边细胞培养基作为基础培养基，并添加青霉素/链霉素双抗；

优选地，所述周边细胞培养基为Pericyte Medium，货号1201，购买自ScienCell；

优选地，所述Pericyte Medium中的血清被Platelet Lysate替换；

优选地，所述鉴定包括将具有选自以下的一种或多种特征的细胞定义为hPASCs：a)含有4个血管生成干细胞亚群且具有干细胞“干性”；b)体外或体内培养中能够形成血管结构;c)表面标志物呈PAI-1阳性，MECOM阳性，CD201阳性，CD44阳性，CD73阳性，HLA-ABC阳性，CD34阴性，CD146阴性，CD31阴性和CD326阴性。

4.根据权利要求3所述的分离方法获得的人胎盘源促血管干细胞hPASCs。

5.组合物，其特征在于，包含权利要求1、2和4任一项所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs。

6.根据权利要求1、2和4任一项所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或权利要求5所述的组合物在制备病症缓解或疾病治疗的药物中的应用，其中所述疾病或病症选自心血管疾病、糖尿病并发症、神经系统疾病、眼科疾病、慢性创口和溃疡。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述心血管疾病选自心肌梗死、慢性缺血性心脏病、外周动脉疾病、冠状动脉再狭窄和心力衰竭；和/或，所述糖尿病并发症选自糖尿病足溃疡、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病和糖尿病周围神经病变；和/或，所述神经系统疾病选自缺血性脑卒中、脊髓损伤、阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症；和/或，所述眼科疾病选自年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、角膜新生血管性疾病和青光眼视神经病变；和/或，所述慢性创口选自烧伤创面、术后难愈性创口和压疮；和/或，所述溃疡选自静脉性溃疡、动脉性溃疡和放射性溃疡。

8.权利要求1、2和4任一项所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或权利要求5所述的组合物在组织工程与再生医学中的应用，其特征在于，所述应用包括促进人工器官的血管化、皮肤再生、骨与软骨再生、神经组织修复和复杂组织结构重建；优选地，所述应用在体外进行。

9.根据权利要求1、2和4任一项所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或权利要求5所述的组合物在制备生物工程人工器官中的应用，其中，所述生物工程人工器官包括工程肾、工程血管、工程肝脏、心脏补片、人工皮肤、人工气管、人工膀胱和人工角膜；优选地，所述生物工程人工器官为生物工程肾。

10.一种制备生物工程器官的方法，所述方法包括将权利要求1、2和4任一项所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs和类器官植入脱细胞支架的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物工程器官选自工程肾、工程血管、工程肝脏、心脏补片、人工皮肤、人工气管、人工膀胱和人工角膜；优选地，所述生物工程人工器官为生物工程肾；优选地，所述生物工程器官为生物工程肾，和/或所述类器官为肾脏类器官，和/或所述脱细胞支架为肾脏脱细胞支架。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述脱细胞支架由离体器官经脱细胞处理获得。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述脱细胞处理包括给予离体器官脱细胞灌注液的灌注步骤；优选地，所述灌注采用蠕动泵进行；优选地，所述灌注步骤进行一次或以上；优选地，所述灌注液选自肝素钠溶液、TritonX-100和SDS溶液中一种或多种；任选地，进一步包括灌注后的清洗步骤。

14.生物工程器官，其包含权利要求1、2和4任一项所述的人胎盘源促血管干细胞hPASCs或权利要求5所述的组合物；优选地，所述生物工程器官根据权利要求10-13任一项所述的方法获得的；优选地，所述生物工程器官选自生物工程肾、生物工程血管、生物工程肝脏、心脏补片、人工皮肤、人工气管、人工膀胱和人工角膜，优选为生物工程肾。

15.根据权利要求14所述的生物工程器官在制备用于治疗疾病的药物或医疗器械中的用途；优选地，所述生物工程器官为生物工程肾，所述用于药物或医疗器械治疗肾病。