CN120536401B

CN120536401B - 一种提高玉米蛋白含量的突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶蛋白

Info

Publication number: CN120536401B
Application number: CN202510761024.7A
Authority: CN
Inventors: 巫永睿; 黄永财; 王海海; 朱一栋; 崔亚辉
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2025-06-09
Filing date: 2025-06-09
Publication date: 2025-11-14
Anticipated expiration: 2045-06-09
Also published as: CN120536401A

Abstract

本发明提供了一种提高玉米蛋白含量的优异基因THP3，所述THP3编码突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT1)，所述THP3基因可用于构建籽粒及全株高蛋白玉米，并且可利用其变异位点进行高蛋白玉米的遗传改良。此外，将THP3和THP9同时引入玉米中，能够更进一步地提高玉米的籽粒及全株蛋白含量。

Description

一种提高玉米蛋白含量的突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶蛋白

技术领域

本发明属于作物遗传改良技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高玉米蛋白含量的突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶蛋白。

背景技术

大豆和玉米是当前主要的饲料来源。大豆是高蛋白(蛋白含量35％)高油作物，榨油后的副产品—豆粕是主要蛋白饲料；而玉米籽粒蛋白含量低而富含碳水化合物，是牲畜和家禽的主要能量来源。然而我国大豆严重依赖进口，2024年大豆进口总量已突破1亿吨，达到10503.2万吨。

玉米在饲料中的配方占比在50％以上，粗蛋白含量只有8％左右。我国玉米产量2023年已经达到2.9亿吨，如果蛋白含量提高一个百分点，那么会增加290万吨蛋白，这相当于800万吨大豆的蛋白含量；如将玉米蛋白含量提高4个百分点，可替代约3200万吨大豆。培育高蛋白高产玉米是实施“饲用豆粕减量替代”的有效途径。

然而玉米高蛋白品质复杂性状形成的分子基础与遗传调控网络比较复杂，目前可以育种应用的高蛋白基因和分子标记少。野生玉米(teosinte)籽粒蛋白含量高达30％，含有丰富的高蛋白优异基因资源，但其在驯化过程中丢失的高蛋白形成机制尚未被解析。我国对玉米高蛋白复杂性状形成的分子基础和遗传调控网络研究不够深入和系统，高蛋白种质资源也严重缺乏，这将会阻碍高蛋白玉米分子育种的进程。

因此，本领域急需开发一种能够有效提高玉米蛋白含量的基因/蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高玉米蛋白含量的优异基因/蛋白。

本发明首次从野生玉米中克隆到控制玉米籽粒高蛋白含量的关键QTL基因THP3，编码突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶GOT1(Glutamic-Oxaloacetic Transaminase 1)，并揭示其通过谷氨酰胺、天冬酰胺(Asn)介导的氮储运新机制协同提高蛋白质含量与氮利用效率。

在本发明的第一方面，提供了一种提高玉米蛋白含量的突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT1)蛋白，所述蛋白选自下组：

a.具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白；或

b.将SEQ ID NO.:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高玉米蛋白含量的功能的由a衍生的蛋白。

在另一优选例中，编码所述突变型GOT1蛋白的基因是THP3，所述THP3的序列如SEQID NO.1所示。

在另一优选例中，野生型GOT1蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO.3所示。

在另一优选例中，野生型GOT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在另一优选例中，所述THP3来源于野生玉米。

在另一优选例中，所述突变型GOT1蛋白能够提高玉米籽粒蛋白含量。

在另一优选例中，所述突变型GOT1蛋白能够提高玉米籽粒蛋白含量至12％-18％。

在另一优选例中，所述突变型GOT1蛋白能够提高玉米的全株、根、茎、或叶中的含氮量和/或生物量。

在另一优选例中，所述突变型GOT1能够提高玉米中的谷氨酰胺含量。

在另一优选例中，所述THP3和THP9协同提高玉米中的谷氨酰胺含量。

在另一优选例中，所述THP3和THP9协同促进玉米的氮代谢。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码本发明第一方面所述的蛋白。

在另一优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种改良植物的方法，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物细胞，利用基因工程改造所述植物细胞，或将编码本发明第一方面所述的蛋白的基因转导入所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达本发明第一方面所述的蛋白；和

(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(a1)提供一植物细胞，将编码本发明第一方面所述的蛋白的THP3基因和THP9基因转导入所述植物细胞；和

(b1)将步骤(a1)中的植物细胞再生成植株。

在另一优选例中，步骤(a1)中所述的转导包括先后转导或同时转导。

在另一优选例中，所述方法用于提高植物的蛋白含量或构建高蛋白含量的植物。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：玉米、水稻、大豆、小麦、高粱或其组合。

在另一优选例中，所述基因工程改造包括：通过基因编辑技术，将所述植物中野生型GOT1的基因改造为THP3基因。

在另一优选例中，所述步骤(a)中的基因转导包括：将包含THP3表达框的表达载体导入所述植物细胞。

在另一优选例中，所述THP3表达框包含如SEQ ID NO.5所示的启动子，和SEQ IDNO.6所示的带有FLAG标记的THP3基因序列(3xFLAG-GOT1)。

在另一优选例中，通过农杆菌将包含THP3表达框的表达载体导入玉米胚芽中，获得转基因玉米。

在另一优选例中，所述方法还包括：

A.将编码本发明第一方面所述的蛋白的THP3基因和THP9基因分别转导入父本和母本植株；和

B.将所述父本植株和所述母本植株杂交，从而获得THP3-THP9双基因杂交种并长成植株。

在另一优选例中，所述方法还包括鉴定成功转导THP3的阳性植株的方法，所述方法包括：

S1.提取待测植株的基因组DNA；

S2.使用如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所述的引物对，进行所述基因组DNA的PCR扩增，获得PCR产物；和

S3.若所述PCR产物包含如SEQ ID NO.9所示的序列，则表明所述植株是成功转导THP3的阳性植株。

在另一优选例中，所述方法还包括鉴定成功引入THP3变异的阳性植株的方法，，所述方法包括：

S1.提取待测植株的基因组DNA；

S2.使用如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所述的引物对，进行所述基因组DNA的PCR扩增，获得PCR产物；和

S3.若所述PCR产物包含如SEQ ID NO.12所示的序列，则表明所述植株是阳性变异植株，若所述PCR产物包含如SEQ ID NO.13所示的序列，则表明所述植株非阳性变异植株。

在另一优选例中，所述THP3变异是将野生型GOT1的基因改造为THP3基因。

在本发明的第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的蛋白的用途，所述用途包括：

1)用于提高植物的蛋白含量或构建高蛋白植物；和/或

2)与THP9基因协同提高植物的蛋白含量或构建高蛋白含量的植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组：玉米、水稻、大豆、小麦、高粱或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种用于提高植物的蛋白含量或构建高蛋白植物的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)表达本发明的第一方面所述的蛋白的载体或表达盒；和

任选的(2)表达THP9基因编码的蛋白的载体或表达盒。

在本发明的第七方面，提供了一种高蛋白含量的植物，所述高蛋白含量的植物包含如本发明第一方面所述的蛋白。

在另一优选例中，所述高蛋白含量的植物是被转导了编码如本发明第一方面所述的蛋白的基因的植物。

在另一优选例中，所述高蛋白含量的植物是被转导了编码如本发明第一方面所述的蛋白的基因和THP9基因的植物。

在另一优选例中，所述高蛋白含量的植物是植物中的野生型GOT1蛋白被改造为如本发明第一方面所述的蛋白的植物。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了野生玉米高蛋白QTL位点THP3的图位克隆定位与和近等基因系的籽粒蛋白含量：A为BSA混池测序分析结果，B为BC8群体精细定位分析结果，C为构建的NILB73和NILTHP3棒子对比，D-G为2022三亚，2023三亚，2024上海，2024三亚NILB73和NILTHP3籽粒蛋白含量和百粒重的比较分析，I为NILB73和NILTHP3谷氨酰胺含量测定比较分析。

图2显示了THP3近等基因系多年多点的植株蛋白含量和生物量测定：A为构建的NILB73和NILTHP3植株对比，B为2023年三亚，2024年上海，2024年三亚NILB73和NILTHP3授粉后15D根茎叶总N含量测定以及地上地下部分生物量的比较分析。

图3显示了过量表达野生玉米优异基因THP3遗传验证：A为ubi1启动子驱动候选基因过表达载体的图谱，B为候选基因过表达的阴性对照及三个阳性的line，C为过表达转基因株系的PCR鉴定，D为过表达转基因株系的Western检测，E为THP3基因过表达的22个不同株系和阴性对照的籽粒蛋白含量比较，F为B73背景的GOT1基因在B73中过表达的株系和阴性对照的籽粒蛋白含量比较。

图4为THP3与THP9的协同效应促进谷氨酰胺和天冬酰胺合成以及蛋白含量的提升：A为构建的NILB73、NILTHP3、NILTHP3；THP9的棒子对比，B为2021三亚，2022三亚，2024三亚NILB73和NILTHP3；THP9籽粒蛋白含量比较分析，C为2021三亚，2022三亚，2024三亚NILB73和NILTHP3；THP9籽粒蛋白含量比较分析，D为NILB73,NILTHP3及NILTHP3；THP9根当中测定的谷氨酰胺含量比较分析，E为NILB73,NILTHP3及NILTHP3；THP9根当中测定的天冬酰胺含量比较分析。

图5显示了THP3和THP9聚合后多年多点的植株蛋白含量和生物量测定。

图6显示了THP3和THP9聚合改良杂交种郑单958可以显著提高籽粒蛋白含量：A-C为郑单958亲本郑58和昌7-2导入THP3,THP9后植株表型考察，籽粒蛋白含量比较分析，D为郑单958和导入了THP3,THP9的郑单958棒子比较，E-F为郑单958，导入了THP9的郑单958，导入了THP3的郑单958和导入了THP3,THP9的郑单958籽粒蛋白含量及百粒重比较分析，G为2023三亚郑单958，导入了THP3的郑单958和导入了THP3,THP9的郑单958籽粒蛋白含量及穗粒重比较分析，H为2024年春季郑单958，导入了THP3的郑单958和导入了THP3,THP9的郑单958籽粒蛋白含量比较分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，从野生玉米中克隆到了一种提高玉米蛋白含量的优异基因THP3，将其引入栽培玉米中可有效提高玉米的籽粒蛋白含量。此外，本发明还发现，将THP3和THP9基因同时引入玉米中，可进一步将玉米的籽粒蛋白含量从8％左右稳定提升至15-16％。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

本发明中，术语“聚合”表示将两个变异通过回交和分子标记选择的方法同时导入的同一个玉米自交系或骨干亲本中。

本发明中，“突变基因THP3”、“基因THP3”、“THP3”、“本发明突变基因”和“THP3基因”可互换使用，均表示来源于野生玉米的编码突变型谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(Glutamic-Oxaloacetic Transaminase 1，GOT1)蛋白的基因。

野生型GOT1蛋白的基因号为Zm00001d043382。

突变型GOT1和野生型GOT1的基因序列和氨基酸序列如下：

在本发明中，“突变型GOT1”、“突变型GOT1蛋白”、“GOT1-T”等可互换使用个，均指具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白或多肽，或其衍生的具有提高植物蛋白含量性能的衍生多肽或活性片段。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明蛋白

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括突变型GOT1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然突变型GOT1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“突变型GOT1蛋白”指具有SEQ ID NO:2序列的蛋白。该术语还包括具有与突变型GOT1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变型GOT1蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明还提供突变型GOT1蛋白的类似物。这些类似物与突变型GOT1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“突变型GOT1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

多核苷酸

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，其长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码突变型GOT1的多聚核苷酸。

在另一优选例中，本发明构建了突变型GOT1的过表达载体，其过表达框为：ubi启动子+3xFLAG-GOT1，其中，加入FLAG标记，用于筛选成功表达突变型GOT1基因的阳性植株，

其中，ubi启动子的序列如下(SEQ ID NO.5)：

aagcttctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacc tccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcaggtcgactctagaggatcc；

3xFLAG-GOT1的序列如下(SEQ ID NO.6)：

atggactacaaggaccatgacggtgactacaaggaccatgacattgactacaaggatgacgatgacaagggaggaggagcccctgctaacgtgcgcgcggcgcaggcgcaggcgcaggcccccagcgccgaccgcaggttaagtacgctagtggggcacctgcttccttcctccccacgaagagcagcagcagacacctccgccacctccaccctcgaatcgttccccaccatggcgtcgcagggatcctccgtcttcgccgcactcgagcaggccccggaggaccccatcctcggagtgaccgttgcctacaacaaggatcccagccccatgaaggtcaacctcggggttggcgcctaccggaccgaggaagggaagcccctagtgctgaacgtggtcaggcgcgccgagcaaatgttgatcaataatccgtcacgtgtcaaggagtacctaccaatcaccggtctggctgaattcaataagctgagcgctaagcttatctttggcgctgacagccctgctattcaggagaatagggttgctaccgtgcagtgcctatcgggtactggttctttaagagtcggaggtgaatttcttgcaaggcactatcacgagcgcactatctacatcccacaaccaacctggggaaatcacccaaaagtcttcaccctatctggcttgaacgttaggagctaccgctattatgatcctgcaacatgcagccttcacttcgaaggactcctggaagacctcggttctgctccttcaggttcaattgtactgctgcatgcctgtgcccacaaccctactggagtagatcctaccatcgaacagtgggaacagattaggcagctgatgagatcaaaatcactgcttccgttctttgacagtgcctatcaaggctttgcaagtggaagtcttgacaaagatgctcagtcagtgcgtatgtttgttgctgatggtggtgaactgctcatggctcagagctacgctaagaacatgggattgtatggagagcgtgttggcgctttgagcattgtatgtagaagtgccgatgtagctgttagggttgaaagtcaactcaaacttgtcatcaggcctatgtattcaaaccctcctcttcatggtgcctctattgttgctaccatactcagggacagcgagatgttcaacgaatggactctggaactgaaggccatggctgataggatcattaacatgaggcaacaactatttaatgcgctgaaatccagaggaacccctggtgattggagccatatcattaagcaaattgggatgtttactttcactgggctgaatagcgaacaagtggcattcatgaggcaggaataccacatttatatgacatctg atgggaggatcagcatggccggtttgagcatgaggactgtgccccatcttgcagatgccatacacgctgcagttactcaactgaaatga。

在另一优选例中，通过提取玉米叶片基因组DNA，进行PCR反应，利用琼脂糖电泳解析PCR产物，从而鉴定成功导入THP3基因的阳性植株，

其中，PCR反应的引物对包括：

GOT1OE-F(SEQ ID NO.7)：TTAGCCCTGCCTTCATACGC，

GOT1OE-R(SEQ ID NO.8)：ATGGTGGGGAACGATTCGAG，

阳性植株的PCR产物大小为350bp，序列为(SEQ ID NO.9)：

TTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAGGCGGCCGCACCCGGCTTGCGCACGCGGATCCATGGACTACAAGGACCATGACGGTGACTACAAGGACCATGACATTGACTACAAGGATGACGATGACAAGGGAGGAGGAGCCCCTGCTAACGTGCGCGCGGCGCAGGCGCAGGCGCAGGCCCCCAGCGCCGACCGCAGGTTAAGTACGCTAGTGGGGCACCTGCTTCCTTCCTCCCCACGAAGAGCAGCAGCAGACACCTCCGCCACCTCCACCCTCGAATCGTTCCCCACCAT。

在另一优选例中，提取玉米叶片基因组DNA，使用THP3变异位点特异性引物进行PCR反应，对PCR反应产物进行测序，检测变异位点，用于鉴定是否引入了THP3的优异变异，所述变异用于改良普通玉米为高蛋白玉米，

其中，特异性引物对如下：

GOT1-F(SEQ ID NO.10)：TCAGATAAATGCATCCGTAGCTT；

GOT1-R(SEQ ID NO.11)：ACGTATTCTCGTGTGCGCTAA；

包含优异变异的PCR产物大小为315bp，序列为(SEQ ID NO.12)：

TCAGATAAATGCATCCGTAGCTTATAAAAATGGTGATAGTTTTTTTCTTCCTGAAAATAGAAATCTAGTTTTGTGATAAACAAATAATTTTTAATTTAACTATTTATACTACTCCCCTCGTTCCAAATTATATTTTTTCTATATACATTATTTTTATAGACATAGTTTGTTTTTAAGAGAAAAAGCTAAAATGCCATAAAATTTGAGAATTAAGACAGTACTGCTTATGATAAGCAAATTTAAACTCAGAATATATTTTTATAAAAAATTATTGATATGAGATTGACCAAGCGCTTAGCGCACACGAGAATACGT；

不含优异变异的PCR产物大小为266bp，序列为(SEQ ID NO.13)：

TCAGATAAATGCATCCGTAGCTTATAAAAATGGTGATAGTGTTTTTTCTTCCTGAAAATAGAAATCTAGTTTTGTGATAAACAAATAATTTTTAATTTAACTATTTATAGACATAGTTTGTTTTTAAGAGAAAAAGCTAAAATGCCATAAAATTTGAGAATTAAGACAGTACTGCTTATGATAAGCAAATTTAAACTCAGAATATATTTATATAAAAAAATATTGATATGAGATTGACCAAGCGCTTAGCGCACACGAGAATACGT。

前期从野生玉米中克隆了控制玉米高蛋白品质形成和氮素高效利用的关键变异基因Teosinte High Protein 9(THP9)(Huang et al,Nature,2022,612(7939):292-300，专利申请号：202210449373.1)，所述THP9编码天冬酰胺合成酶4(ASN4)，成功提高全株玉米的蛋白质含量，其中自交系籽粒蛋白含量提高约35％，杂交种蛋白含量提高到11％。然而，饲料蛋白的需求在12-20％，于是本发明克隆了第二个高蛋白QTL位点THP3，并聚合不同THP3和THP9构建新高蛋白玉米遗传材料，为培育优质高蛋白玉米奠定遗传和材料基础。

本发明的核心优势在于利用野生玉米天然等位基因，规避外源基因风险，通过分子标记辅助选择，聚合THP3和THP9改良杂交种郑单958，可将杂交种的籽粒蛋白含量从8％左右稳定提升至12-13％。

本发明可广泛应用于：(1)玉米分子设计育种(高蛋白品种选育)；(2)饲用与食品加工专用玉米开发；(3)野生植物资源功能基因挖掘与利用。

与现有技术相比，本发明的主要优点包括：

1.本发明通过引入野生玉米高蛋白主效QTL THP3(野生玉米中的突变型GOT1基因)及其协同基因THP9，显著提升了玉米籽粒蛋白质含量，且谷氨酰胺、天冬酰胺等必需氨基酸含量显著增加，大幅提升了蛋白质的营养价值，同时籽粒饱满，百粒重不变，在培育高蛋白玉米中具有重要的应用价值。

2.由于突变型GOT1(THP3)和ASN4(THP9)都具有氮高效的功能，因此这两个基因聚合后可通过增强氮素利用效率(NUE)，显著减少氮肥施用量。这一特性不仅降低了农业生产成本，还减少了土壤酸化、水体富营养化等环境风险，为绿色农业提供了可持续解决方案。

3.本发明可以通过分子标记辅助选择或基因编辑技术精准提升GOT1功能，无需引入外源基因，安全性和普适性更高。改良后的高蛋白玉米可直接替代高价蛋白原料(如豆粕)，降低畜牧业饲料成本；同时，其稳定产量和低氮需求使农民种植效益显著提升。此外，THP3-THP9的协同设计模型为水稻、小麦等作物的营养品质改良提供了可借鉴的育种范式。

4.本发明在保障粮食产量的同时提升营养品质，契合全球人口增长与资源短缺的双重挑战。通过减少氮肥依赖和增强作物对低氮胁迫的适应性，为气候智能型农业提供了遗传解决方案，助力全球粮食安全与可持续发展目标的实现。

5.由于高蛋白玉米复杂性状的形成受多基因控制，而且遗传调控复杂，挖掘控制高蛋白玉米形成的主效QTL非常困难克隆。通过常规杂交育种方法进行高蛋白玉米培育和种质创新，需要很多代的选择，费时费力、效率比较低、而且方向不明确。本发明通过挖掘野生玉米天然基因资源，创新性地实现了蛋白含量、氮效率与产量的协同提升，为农业绿色转型和营养强化提供了高效、安全、可推广的技术路径，具有深远的产业价值与社会意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本文的实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(20-30℃)。

材料和方法

玉米的自交、杂交、大田育种等按照常规的育种方式进行。

实施例中的引物合成及基因测序皆由上海博尚生物技术有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据试剂供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

实施例1.野生玉米优异基因THP3遗传定位与候选基因鉴定

前期在玉米3号染色体上鉴定到一个调控野生玉米籽粒蛋白含量的主效位点。为解析其遗传机制，本研究以野生玉米Ames21813(籽粒蛋白含量约30％)与栽培玉米B73(籽粒蛋白含量约10％)构建杂交及回交群体。遗传分析表明，籽粒蛋白含量受母体基因型调控，因此采用定向回交策略：在BC2及后续世代中，每一代均测定果穗籽粒蛋白含量(杜马斯燃烧仪)，筛选高蛋白单株(>15％)并继续以B73花粉回交，同时结合3号染色体分子标记辅助选择，逐步纯化遗传背景。经6代构建，获得BC6群体(规模>2000株)，通过BSA混池测序(高/低蛋白池各100株)，将主效位点锁定于3号染色体165-216.5Mb区间(B73_V4)(图1A)。

为进一步精细定位，继续回交至BC8世代(群体规模1000株)，基于极端表型个体(高蛋白>15％vs.低蛋白<10％，各50株)的20X深度重测序分析，将区间压缩至195.04-202.46Mb(B73_V5)。通过大规模交换单株筛选(BC9群体>2000株)及多态性标记图位克隆，最终将候选区间缩小至198.1-201.0Mb(图1B)。结合RNA-seq组织特异性表达谱与野生-栽培种间结构变异分析，发现谷氨酸草酰乙酸转氨酶基因GOT1(Zm00001d043382)在野生玉米中具有显著表达优势及功能变异，将其命名为THP3(Teosinte High Protein 3)，确认为调控蛋白含量的核心基因。

进一步将携带野生玉米GOT1-T(THP3)基因的BC9群体连续自交4代，获得遗传背景高度纯合的近等基因系NILTHP3(与轮回亲本B73基因组相似度>99％)。经连续5年(2020-2025)在上海与三亚的多环境测试，NILTHP3表现出稳定的籽粒蛋白含量提升效应(图1C-G)：三亚基地2022年将对照NILB73以及近等基因系NILTHP3种植并进行测试，发现近等基因系籽粒蛋白含量相对于对照从9.76％提升至12.84％，且百粒重与单产与对照无显著差异。三亚基地2023年将近等基因系材料种植并进行测试，发现近等基因系相对于对照从10.96％提升至13.65％，且百粒重与单产与对照无显著差异。上海基地2024年将近等基因系材料种植并进行测试，发现近等基因系NILTHP3籽粒蛋白含量相对于对照NILB73的10.24％提高至13.12％，且百粒重与单产与对照无显著差异。三亚基地2024年将对照NILB73以及近等基因系NILTHP3种植并进行测试，现近等基因系NILTHP3籽粒蛋白含量相对于对照NILB73的10.77％提升至13.98％，且百粒重与单产与对照无显著差异。同时NILTHP3中谷氨酰胺的含量显著升高(图1H-I)。

以上多年多点的测试表明携带野生玉米优异基因GOT1的NILTHP3有效提高现代栽培玉米的籽粒蛋白含量，并且增加氮素的同化能力。该近等基因系的成功构建为GOT1基因的商业化应用提供了核心种质资源。

实施例2.野生玉米优异基因GOT1提高全株根、茎和叶总氮含量及生物量

将对照NILB73以及近等基因系NILTHP3的根、茎和叶不同组织在三亚和上海不同时间和地点进行总氮的测试，以探索其对于培育全株高蛋白玉米的作用。结果发现三亚点2022年NIL-THP3植株根、茎、叶的总氮含量分别提高18.1％、20.0％和10.4％，三亚点2023年NIL-THP3植株根、茎、叶的总氮含量分别提高30.6％、18.3％和13.3％，上海点2024年NIL-THP3植株根、茎、叶的总氮含量分别提高24％、9.3％和12.8％，三亚点2024年NIL-THP3植株根、茎、叶的总氮含量分别提高14.7％、10.7％和20.0％；另外地上部分和地下部分的生物量也增加(图2A、B)。

这些多年多点的测试表明，导入野生玉米优异基因THP3到栽培玉米中，在培育全株高蛋白玉米上有着重要的潜能。

实施例3.过表达突变型GOT1基因(THP3)可有效提高籽粒蛋白含量

在玉米自交系B104背景下过量表达野生玉米的突变型GOT1基因(THP3)，由玉米泛素启动子Ubiquitin驱动，并通过分子标记辅助筛选获得转基因阳性株系。

表型分析结果显示，过表达突变型GOT1基因(THP3)的株系的籽粒蛋白含量显著提升：GOT1-T-OE的22个株系的籽粒蛋白含量平均达14.2％，对照组B104(没有过表达基因的自交系)为11.5％，相对提高19.0％(图3E)；而过表达野生型GOT1基因的株系的籽粒蛋白含量与其对照组(B73)无明显差异(图3F)。

实验方法

1.野生玉米叶根cDNA制备：

(1)取约50-100mg野生玉米根的冻存粉末，加入1mL的Trizol提取液，充分震荡，冰上放置5min；

(2)加200μL的氯仿，充分震荡，冰上放置5min，12000rpm转速下4℃离心10min，吸取上清液(切勿吸到中间层和下面有机相)500μL到新的离心管中；

(3)向上清中加500μL的异丙醇，充分震荡，放置冰上10min，12000rpm转速下4℃离心10min后，弃上清；

(4)加1mL的70％乙醇溶液，轻弹使沉淀漂浮，冰上放置1min后，12000rpm转速下4℃离心5min，弃上清；

(5)离心机短暂离心，用小枪头吸取多于液体。室温晾干RNA沉淀2min左右，加100μL的ddH2O溶解沉淀；

(6)利用QIAGEN的RNeasy Plus MiniKit试剂盒，按照试剂盒标准方法将上述初提RNA过柱进行纯化处理，其中涉及使用DNaseI进行DNA的去除，最后用30μL无RNA酶的H2O进行溶解；

(7)RNA的反转录：采用Pomega公司的反转录试剂盒(ImProm-II^TMReverseTranscription System)进行RNA的反转录，按照试剂盒中标准方法进行。

2.突变型GOT1基因过表达载体的构建

设计野生玉米突变型GOT1基因的扩增引物：

GOT1CDS-F：GTTCACGTCCCCCGCTC，

GOT1CDS-R：TTCACGAAAGCTGCGATACT；

在野生玉米的根cDNA扩增GOT1的CDS序列，然后同时进行测序验证。

构建突变型GOT1基因的过表达载体，用下述引物对扩增突变型GOT1基因的CDS：

GOT1Flag-F：

TTGGTGTTACTTCTGCAGGCGGCCGCACCCGGCTTGCGCACGCGGATCCAT GGACTACAAGGACCATGACGGTGACTACAAGGACCATGACATTGACTACAAGG ATGACGATGACAAGGGAGGAGGAGCCCCTGCTAACGTGCGCGCGGC，

GOT13300-R：

GAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCCTCATTTCAGTTGAGTAACTGCAG，

连接同源臂以及在N端连接Flag标；利用BamH1+Sac1酶切位点通过同源重组的方法连接到由ubi1启动子(Zm00001d043382)驱动的pCAMBIA3300中，形成GOT1过表达载体ubipro-GOT1-3300(图3A)。

3.构建THP3过表达的转基因玉米并进行PCR和WB鉴定

1)载体ubipro-GOT1-3300经过测序验证后，转化农杆菌EHA105菌株；

2)将含该载体的农杆菌介导法转化玉米B104幼胚，获得GOT1OE的T0代转基因玉米。

3)对T0代植株进行PCR鉴定，选择鉴定为阳性的T0代植株自交。

PCR鉴定时，取THP3过表达的转基因玉米的叶片进行DNA抽提，用引物GOT1OE-F(位于ubi启动子区)和GOT1OE-R(位于GOT1基因CDS区)进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验检测条带，阳性植株的PCR产物大小为350bp；同时取三个PCR阳性样品进行测序，结果用SnapGene软件进行序列分析，其PCR产物的序列如下(图3B-C)：

此外，WB结果表明，转基因植株(OE1、OE2)成功表达了突变型GOT1蛋白，而对照组(B104)并无突变型GOT1蛋白产生(图3D)。

基因组DNA提取：

(1)取玉米叶片放于2mL管中，加入钢珠，液氮处理后进行研磨(60Hz，60s)；

(2)研磨后，加入0.6mL CTAB提取缓冲液，混匀，放入65℃烘箱60min，期间每10-15min混匀一下；

(3)取出置于室温5-10min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)至离心管，密封后摇晃5min；

(4)室温13000rpm转速下离心15min，吸取上清至新1.5mL离心管中；加等体积异丙醇，来回颠倒混匀，放置负20度20min；室温12000rpm转速下离心1min，倒掉上清；

(5)沉淀用1mL的75％乙醇洗DNA沉淀1至2次，每次12000rpm转速下离心1min后，将乙醇倒出；在室温中晾干DNA沉淀；

(6)加入0.3mL ddH2O溶解DNA沉淀。

THP3过表达的PCR鉴定：

(1)PCR反应用上海翊圣生物公司的PCR Master Mix试剂盒进行；

(2)配置20μL反应体系：PCR Master Mix 10μL，引物各1μL，DNA 2μL，ddH2O 6μL；

(3)PCR条件为：预变性95℃5min；扩增95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；终止72℃10min，16℃1min。引物为GOT1OE-F：TTAGCCCTGCCTTCATACGC；GOT1OE-R：ATGGTGGGGAACGATTCGAG，通过1％跑琼脂糖胶进行检测PCR产物。

THP3过表达的Western检测：

(1)总蛋白提取：称量新鲜叶片磨好粉的样品各100mg于2mL离心管中。加入1mL非醇溶蛋白提取缓冲液，室温孵育2h。15900g转速下离心15min，取上清到新的1.5mL离心管中，保存于4℃冰箱备用。

(2)Western免疫印迹：吸取抽提好的蛋白15μL，4x Protein Loading Buffer 5μL于200μL离心管中并涡旋混匀，使用PCR仪95℃孵育5min进行变性。制备分离胶12％，浓缩胶为4％的PGAE凝胶备用。使用1x SDS-PAGE Buffer进行电泳，120V，60min。裁剪和凝胶大小相同的PVDF膜，并使用甲醇活化5s备用。电泳结束后使用BIO-RAD半干转膜仪进行转膜。将转好的膜放入干净的杂交盒中，使用1x TBST溶解的5％进口脱脂奶粉在4℃房间过夜封闭。第二天使用1x TBST按照1：1000的比例稀释一抗稀释液，在室温下杂交孵育1h。用1x TBST进行洗膜，每隔15min更换一次TBST，重复4次洗膜。用1x TBST按照1：5000的比例稀释二抗稀释液，在室温下孵育1h。用1x TBST进行洗膜，每隔15min更换一次TBST，重复4次洗膜。加入化学发光液进行显色反应和成像。

实施例4.THP3有效提高谷氨酰胺含量，聚合野生玉米THP9显著提高籽粒蛋白含量

前期从野生玉米中克隆了控制玉米高蛋白品质形成和氮素高效利用的关键变异基因Teosinte High Protein 9(THP9)。野生玉米优良基因Thp9导入玉米自交系B73后，使种子蛋白质含量增加约35％，根中氮含量增加约54％，茎中氮含量增加约94％，叶片中氮含量增加约18％，并且生物量即植株整体重量也大大增加。

进一步，将NILTHP3与NILTHP9进行杂交同时聚合野生玉米优异基因位点THP3和THP9。结果发现同时聚合2个优异位点THP3和THP9的近等基因系NILTHP3；THP9，相对于对照NILB73，在2021年三亚其籽粒蛋白含量由12.03％提升至16.39％，2022年三亚籽粒蛋白含量由9.98％提升至15.15％，2024年三亚其籽粒蛋白含量由10.7％提升至15.9％等(图4A-C)。

通过功能验证发现，玉米内源基因THP3能够特异性调控籽粒谷氨酰胺(Gln)的合成，NILTHP3近等基因系谷氨酰胺含量提升142.3％(相较于对照NILB73)(图4D)，为蛋白质合成提供充足氮源。进一步将THP3与野生玉米来源的THP9基因聚合后，代谢组学分析显示，根中天冬酰胺(Asn)含量提升3倍(346％)(图4E)，表明THP9通过激活天冬酰胺合成酶(ASN)途径，协同THP3实现氮代谢流的精准重编程。

在双基因聚合株系NILTHP3；THP9中，谷氨酰胺与天冬酰胺的协同积累驱动了籽粒蛋白质合成效率的飞跃，籽粒蛋白质含量从对照NILB73的10％稳定提升至15-16％，且籽粒形态饱满，百粒重与单产无显著差异。田间试验进一步证实，该聚合效应在多年多点测试中表现稳定，植株的根、茎、叶蛋白含量叶显著提升幅度达40-60％，生物量也显著增加(图5)。

上述结果表明，THP3-THP9模块通过“Gln-Asn双引擎”策略，突破了传统单基因调控的代谢瓶颈，为玉米蛋白含量的阶梯式提升提供了精准的分子设计路径。

实施例5.野生玉米优异单倍型THP3与THP9在高蛋白玉米培育中的应用

本发明通过将野生玉米优异单位型THP3(GOT1-T)与THP9(ASN4-T)分别导入杂交种郑单958的亲本郑58(母本)和昌7-2(父本)(父本和母本不含有这两个高蛋白优异变异，郑58蛋白含量8-9％，昌7-2蛋白含量10％左右)，蛋白含量可提高到15-16％(图6A-C)(图6C中的Z-58-14、Z58-816-5为改良郑58后的两个高蛋白株系；C7-2-1236-1、C7-2-1236-8是改良昌7-2后的两个高蛋白株系)，然后构建了高蛋白杂交种。经连续3年、上海、三亚不同地点的田间试验验证，改良杂交种的籽粒蛋白质含量从原品种8％稳定提升至12-13％以上，且百粒重不受影响(图6D-H)。

其中，在2022年三亚点导入THP3单个位点的郑单958籽粒蛋白含量从8.7％提升至10.3％，而导入了THP3与THP9两个位点的郑单958籽粒蛋白含量相较于野生型郑单958则从8.7％提升至了11.7％，而百粒重基本相同(图6E-F)；

在2023年三亚点导入THP3单个位点的郑单958籽粒蛋白含量从8.3％提升至10.4％，而导入了THP3与THP9两个位点的郑单958籽粒蛋白含量相较于野生型郑单958则提升从8.3％至了12.6％，更进一步的测定了其穗粒重发现也基本相同(图6G)；

在2024年春季点导入THP3单个位点的郑单958籽粒蛋白含量从8.5％提升至10.15％，而导入了THP3与THP9两个位点的郑单958籽粒蛋白含量相较于野生型郑单958则提升从8.5％至12.09％(图6H)。本发明首次实现双位点野生玉米优异单倍型在杂交种中的高效聚合，为高产高蛋白玉米品种的规模化应用提供了可靠技术方案。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种提高玉米蛋白含量的突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT1)蛋白，其特征在于，所述突变型谷氨酸草酰乙酸转氨酶蛋白为：

具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白。

2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，编码所述蛋白的基因是THP3，所述THP3的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白能够提高玉米籽粒蛋白含量至12％-18％。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的蛋白。

5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种改良植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)将编码权利要求1所述的蛋白的基因转导入所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达权利要求1所述的蛋白；和

(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株；

其中，所述改良为提高植物的蛋白含量，所述植物为玉米。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

(a1)将编码权利要求1所述的蛋白的THP3基因和THP9基因转导入所述植物细胞；和

(b1)将步骤(a1)中的植物细胞再生成植株；

其中，所述植物为玉米。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括鉴定成功转导THP3的阳性植株的步骤，所述步骤包括：

S1.提取待测植株的基因组DNA；

9.一种如权利要求1所述的蛋白的用途，其特征在于，所述用途包括：

1)用于提高植物的蛋白含量或构建高蛋白植物；和/或

2)与THP9基因协同提高植物的蛋白含量或构建高蛋白含量的植物；

其中，所述植物为玉米。

10.一种用于提高植物的蛋白含量或构建高蛋白植物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)表达如权利要求1所述的蛋白的载体或表达盒；和

任选的(2)表达THP9基因编码的蛋白的载体或表达盒；

其中，所述植物为玉米。