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CN120505323B - 小蛋白UFD1s及其在预防、治疗和诊断非酒精性脂肪性肝炎中的应用 - Google Patents

小蛋白UFD1s及其在预防、治疗和诊断非酒精性脂肪性肝炎中的应用

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CN120505323B
CN120505323B CN202511007836.9A CN202511007836A CN120505323B CN 120505323 B CN120505323 B CN 120505323B CN 202511007836 A CN202511007836 A CN 202511007836A CN 120505323 B CN120505323 B CN 120505323B
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China
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ufd1s
seq
small protein
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nash
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Hefei Comprehensive National Science Center Big Health Research Institute
University of Science and Technology of China USTC
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种小蛋白UFD1s及其在预防、治疗和诊断非酒精性脂肪性肝炎中的应用，本发明中提供的小蛋白UFD1s具有能量代谢调控和抵抗细胞应激的作用，UFD1s可作为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的辅助诊断标志物。同时，UFD1s的缺失或表达量低与NASH的发生、发展相关，通过本发明中构建的表达载体和方法使UFD1s在体内表达，可发挥预防和/或治疗NASH的效果，为NASH的预防和/或治疗提供新的思路。

Description

小蛋白UFD1s及其在预防、治疗和诊断非酒精性脂肪性肝炎中 的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种与非酒精性脂肪性肝炎相关的小蛋白UFD1s，还涉及该小蛋白UFD1s在预防、治疗和诊断非酒精性脂肪性肝炎中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是一种常见的与酒精消耗无关的慢性肝脏疾病，并被广泛认为与胰岛素抵抗、肥胖和代谢综合症密切相关。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指超过5%的肝组织细胞中含有过多以甘油三酯形式的脂肪堆积在肝脏中（脂肪变性），而NASH患者的肝脏中除了含有过多的脂肪外，组织形态上还具有小叶炎症，肝细胞气球样变，以及与NAFLD相比具有更快发展的纤维化。短期内，NAFLD中单纯的脂肪变性程度与发病率或死亡率增加没有明显的相关性，然而一旦发展成NASH则显著增加肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌（HCC）的风险，是一种潜在的致命性疾病。
很多NASH患者的身体看似健康并不知其肝脏异常，因此不易被察觉。目前主要是通过检测血清中的甘油三酯，胆固醇和转氨酶（例如天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶）的含量来判断肝脏功能是否异常。而NASH的唯一诊断方法则是肝脏活检，即通过组织病理学检测确认肝脏是否有炎症或纤维化症状，但组织病理学检测的操作复杂，耗时长且价格昂贵，临床上缺少方便辅助诊断NASH的生物标志物。此外，关于NASH的治疗，对于一些早期NASH的患者，主要通过糖尿病药物控制血糖和改善生活方式，如积极锻炼，少坐多动，可以减缓甚至能逆转脂肪变性的过程；然而对于晚期NASH患者，目前缺乏标准且明确的治疗措施，因此迫切需要有效的预防和治疗措施。
发明内容
有鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种小蛋白UFD1s，其是申请人首次发现在哺乳动物中保守的具有能量代谢调控和抵抗细胞应激作用的蛋白，其在NASH的诊断、预防和治疗中能够发挥重要的作用，可以为NASH的诊断、预防和治疗提供新的方法。
在本发明中，通过前期探究结果发现人和小鼠保守的小蛋白UFD1s具有调控能量代谢、抵抗细胞应激的保护作用。在正常情况下，UFD1s缺乏表现出更低的能量消耗、更少的氧体积消耗和更高的呼吸交换率（RER）。此外，UFD1s蛋白的缺乏导致肝脏形态异常，包括轻度水样变性、肿胀、肝细胞胞质疏松和肝脏中脂滴的异常累积，而此异常现象在24 h的饥饿处理后更为严重。更为重要的是，本发明通过小鼠实验发现NASH小鼠肝脏中UFD1s RNA表达水平显著减少，且UFD1s的缺失加速了NASH疾病进程，包括血清中高水平的脂质和转氨酶、严重的脂肪变性、小叶炎症和纤维化现象。基于以上探究结果，可以确定小蛋白UFD1s在营养失衡代谢性疾病如NASH中具有一定的治疗、稳定、改善或者预防的效果，并可以作为辅助诊断NASH的一个生物标志物。基于此，本发明提出小蛋白UFD1s在诊断、预防和治疗营养失衡代谢性疾病如NASH中的用途。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面公开了具有能量代谢调控和抵抗细胞应激作用的小蛋白UFD1s，所述小蛋白UFD1s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个方面公开了一种表达载体，所述表达载体含有编码所述的小蛋白UFD1s的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个方面公开了一种预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，所述药物含有所述的小蛋白UFD1s或者所述的表达载体。
本发明的第四个方面公开了如以下任意一项的应用：
（1）检测受试者肝脏组织中UFD1s表达水平的试剂在制备辅助诊断非酒精性脂肪性肝炎产品中的应用，其中，所述UFD1s为前文所述的小蛋白UFD1s；
（2）如前文所述的小蛋白UFD1s或所述的表达载体在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用。
申请人通过大量前期调研和实验找寻具有应激响应和能量代谢调控作用的新转录本，从中发现人和鼠中具有高度保守性的泛素融合降解蛋白UFD1剪切形式，在本发明中，命名为UFD1s。该UFD1s此前没有报道过，本发明确定了人和鼠保守的UFD1s蛋白具有调控能量代谢、抵抗细胞应激的保护作用。
在本发明中，所述小蛋白UFD1s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1（人源）：
MFSFNMFDHPIPRVFQNRFSTQYRCFSVSMLAGPNDSNYATLGPGPTQPT。
SEQ ID NO.2（鼠源）：
MFSFNMFDHPIPRVFQNRFSTQYRCFSVSMLAGPNDSNYATLSPRSTQPAQHYLSYAV。
在本发明中，编码所述小蛋白UFD1s的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.3（人源）：
ATGTTCTCTTTCAACATGTTCGACCACCCTATTCCCAGGGTCTTCCAAAACCGCTTCTCCACACAGTACCGCTGCTTCTCTGTGTCCATGCTAGCAGGGCCTAATGACAGTAATTATGCCACCCTCGGCCCTGGACCAACTCAGCCGACTTAA（153 nt）。
SEQ ID NO.4（鼠源）：
ATGTTTTCTTTCAACATGTTTGACCACCCGATTCCCCGGGTCTTCCAGAACCGCTTCTCCACGCAGTACCGCTGCTTCTCCGTGTCCATGCTAGCAGGGCCTAATGACAGTAATTATGCCACCCTCAGCCCTCGATCAACTCAGCCGGCTCAACATTACCTATCCTATGCTGTTTAA（177 nt）。
在本发明的一些实施方式中，本文中所述的UFD1s可以作为辅助诊断非酒精性脂肪性肝炎的生物标志物，通过检测受试者肝脏组织中的UFD1s表达水平从而可作为诊断非酒精性脂肪性肝的辅助指标，协同其他非酒精性脂肪性肝炎指标方便诊断非酒精性脂肪性肝炎，相较于目前传统的组织病理学检测，检测方式更加简单，成本更低。
其中，在本发明中，所述的产品是指体外检测产品，例如可以是制剂、试纸、芯片或试剂盒等，但并不限于此。较优的，所述产品为芯片或试剂盒。
在本发明中，所述检测受试者肝脏组织中UFD1s表达水平的试剂为检测生物样本中UFD1s蛋白表达量的试剂，或者检测受试者肝脏组织中UFD1s的RNA表达水平的试剂。通过检测受试者肝脏组织中的UFD1s的蛋白表达量或RNA表达水平，来辅助判断受试者是否患有NASH。具体的说，若UFD1s的蛋白表达量或RNA表达水平低，则提示受试者很可能患有NASH。具体的判断方法，本领域技术人员能够基于已知的方法或实验来确定，这里没有特别限定。例如在一些具体案例中，以UFD1s的RNA表达水平来辅助判断，若与给定人群正常肝脏组织（如癌旁组织）中平均RNA表达水平相比，受试者肝脏组织中RNA表达水平有50%以上比例的降低，则认为UFD1s的RNA表达水平低，提示受试者很可能患有NASH，再通过协同其他指标，能够实现NASH的诊断。
在本发明中，所述的受试者是指哺乳动物，例如可以是人、鼠、兔或羊等，较优的，所述受试者是指人或鼠，在一些具体的实施案例中，所述受试者为鼠。
可以理解的是，所述检测受试者肝脏组织中UFD1s表达水平的试剂根据检测目标（蛋白或RNA）以及检测技术的不同而有所区别，具体的检测方法可采用本领域技术人员熟知的，例如可以是聚合酶链式反应（PCR）、定量聚合酶链式反应（qPCR）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、Western Blot、流失式细胞术或免疫组织化学染色技术（IHC）等，但并不限于此。采用的试剂例如可以是特异性结合UFD1s的抗体、核酸探针或引物等。
在一些具体的实施案例中，所述检测受试者肝脏组织中UFD1s表达水平的试剂为检测受试者肝脏组织中UFD1s的RNA表达水平的试剂。在一些具体的实施案例中，所述的受试者为人，则所述试剂中含有序列如SEQ ID NO.5和6所示的引物对；在另一些具体的实施案例中，所述的受试者为鼠，则所述试剂中含有序列如SEQ ID NO.7和8所示的引物对。
此外，可以理解的是，前文所述的产品中除了包括检测UFD1s表达水平必须的试剂外，还包括基于不同检测技术所需的缓冲液、洗涤液等，这些均可基于本领域中需要进行选择，故而没有具体的限定。
在本发明的另一些实施方式中，本发明通过细胞试验和动物实验确定了小蛋白UFD1s影响NASH疾病的进程或进展，UFD1s的缺失加速了NASH疾病进程，通过向受试者体内注入小蛋白UFD1s的表达载体，提高小蛋白UFD1s在受试者体内的表达水平，能够实现预防和/或治疗NASH的效果。
在本发明中，所述的表达载体是指本领域中任意的能够在肝脏中特异性表达的质粒或RNA。所述的表达载体含有编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示，从而能够在肝脏中特异性表达UFD1s，提高肝脏中UFD1s的表达水平，进而实现预防和/或治疗NASH的效果。在本发明中，其具体的种类可以是重组质粒或环形RNA。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述表达载体为重组质粒，所述重组质粒是将如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列插入骨架载体中构建得到的，在本发明中，所述的骨架载体为本领域中任意能够在肝脏中特异性表达的载体，例如可以是pLIVE或pAlb-Luc，但并不限于此。
具体的重组质粒的构建方法可以采用本领域技术人员熟知的，主要包括以下步骤：
将编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列克隆至骨架载体中，并经过测序鉴定，得到重组质粒。
在一些具体的实施案例中，本发明采用pLIVE构建了重组质粒，命名为pLIVE-UFD1s质粒。
在本发明的另一些具体的实施方式中，所述表达载体为环形RNA，所述环形RNA是将UFD1s在体外环化，具体可采用本领域技术人员熟悉的方法进行体外环化，而没有特别的限定。在一些具体的实施案例中，UFD1s的体外环化主要包括以下步骤：
体外转录得到含有编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列的线性RNA，经过环化反应，得到环化RNA，即circUFD1s。
进一步的，在本发明中，所述的预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物是指含有有效量的小蛋白UFD1s或前文所述的表达载体作为活性成分的药物，它们能够提高肝脏组织中小蛋白UFD1s的表达水平。
在本发明中，所述预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物具有以下功效中的至少一种：
（1）降低受试者血清脂质的水平，所述血清脂质包括甘油三酯和总胆固醇；
（2）降低受试者血清天冬氨酸转氨酶的水平；
（3）降低受试者肝脏脂肪变性程度；
（4）改善受试者肝脏炎症程度；
（5）改善受试者肝脏纤维化程度。
具体的说，通过将含有小蛋白UFD1s或前文所述的表达载体的药物施用于受试者，从而提高受试者肝脏中小蛋白UFD1s的表达水平，进而发挥预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的效果。
这里的有效量是指能够产生期望预防和/或治疗效果的最小剂量，且这个剂量在安全范围内（即不会产生不良反应）。在本发明中，所述的期望的预防效果是指提高受试者肝脏内的UFD1s的表达水平，进而避免发展成NASH；所述的期望的治疗效果是指提高受试者肝脏内的UFD1s的表达水平，使得NASH患者得到改善甚至治愈。具体的有效量，根据受试者的种类、病情的进展程度以及施药方式、制剂等的不同而有所区别，本领域技术人员能够基于已知的方法通过实验确定，故而没有特别的限定。例如，在本发明的一些具体的案例中，受试者为小鼠，其中，pLIVE-UFD1s质粒的注射量为15 μg/次，次数为一次；circUFD1s的注射量为10 μg/次，次数为两次。
可以理解的是，前文所述的药物还包含任意药学上可接收的载体和/或辅料，这些载体和/或辅料可根据具体的药物剂型不同而有所区别，主要作用包括但不限于提高药物的稳定性、提高药物的递送效率、改善受试者对药物的吸收或代谢能力等，以使得药物能够更好的发挥预防和/或治疗的效果。所述的载体和/或辅料，都可以基于本领域技术人员已知的方式进行选择或调整，故而这里不再具体阐述。
进一步的，前文所述的药物还可以包含其他具有预防和/治疗非酒精性脂肪性肝炎的治疗性物质，这些治疗性物质是指任意可以与本申请中的表达载体进行配合，以进一步提高预防和/治疗非酒精性脂肪性肝炎的效果。
在本发明中，所述的药物剂型没有特别的限定，可以是本领域中熟知的诸如颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、口服液、注射剂等。较优的，所述药物为注射剂。
本发明的有益效果：
本发明确定了人和小鼠中高度保守的小蛋白UFD1s具有调控能量代谢和抵抗细胞应激的保护作用。UFD1s的缺失加速了NASH疾病的进程。本发明确定了UFD1s在NASH中的表达水平显著降低，因此UFD1s可以作为辅助诊断NASH的生物标志物；同时通过在肝脏中表达小蛋白UFD1s可有效预防和/或改善NASH的发生和发展。
本发明基于小蛋白UFD1s构建了其相关的表达载体，通过将表达载体递送至受试者体内，这些表达载体能够使得UFD1s在受试者肝脏中高效且稳定的表达，进而发挥治疗NASH的效果，通过递送表达载体，降低了血清中脂质和转氨酶，降低了NASH的脂肪变性、脂滴数目、纤维化和炎症程度。从而为非酒精性脂肪性肝炎的预防和/或治疗药物的开发提供了新的思路。
附图说明
图1：展示CRISPR/cas9技术介导的UFD1s-/-缺陷小鼠的策略（图1中A），UFD1s及其长转录本形式（UFD1f）的RNA水平（图1中B）和蛋白水平（图1中C）。
图2：正常条件下，通过代谢笼分析野生型和UFD1s缺失小鼠的总能量消耗、耗氧量和气体交换率（图2中A）。正常和饥饿条件下分别通过苏木精-伊红（HE）观察UFD1s缺失小鼠的肝脏形态；并通过油红染色（Oil red O）检测脂滴含量，以及通过自噬marker LC3的免疫组化（IHC）观察自噬情况（图2中B）。
图3：正常和NASH小鼠模型肝脏中UFD1s RNA水平（图3中A），血清中甘油三酯和总胆固醇水平（图3中B），血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平（图3中C）。
图4：正常和NASH模型小鼠肝脏的HE、油红和Masson染色，分别用来观察肝脏脂肪变性、脂滴数量和纤维化程度。
图5：在蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）诱导的NASH小鼠模型中分别利用质粒和环形RNA两种策略表达UFD1s蛋白的流程（图5中A），并通过UFD1s的IHC检测UFD1s在肝脏中的表达水平（图5中B）。
图6：质粒和环形RNA表达UFD1s的NASH小鼠血清中甘油三酯和胆固醇水平（图6中A）以及血清中AST和ALT水平（图6中B）。
图7：质粒和环形RNA表达UFD1s的NASH小鼠肝脏的H&E、油红和Masson染色，分别用来观察肝脏脂肪变性、脂滴数量和纤维化程度。
图8：两种策略表达UFD1s的NASH小鼠肝脏的炎症评分（图8中A），以及肝脏中纤维化marker（COLLA1）、炎症marker（TNF）mRNA表达水平（图8中B）。
图9：免疫组化染色分析小蛋白UFD1s在非NASH和NASH临床病人肝脏组织中的表达情况（N=8例）（图9中A）；人的HEK293T野生型（WT）和UFD1s缺失（UFD1s KO）细胞中甘油三酯的含量测定结果（图9中B）；尼罗红染色检测小蛋白UFD1s缺失和过表达（UFD1s OE）细胞中脂滴含量（图9中C）；外源加入棕榈酸（PA）测量细胞的耗氧率（OCR）评估小蛋白UFD1s缺失和过表达细胞中脂肪酸氧化速率结果（图9中D和E）。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。
动物来源及饲养环境：本文中涉及的C57BL/6野生型小鼠均购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。所有的小鼠均被饲养在无特定病原体（SPF）环境中，12/12h光照/黑暗的节律循环（光照时间：8:00~20:00），22±2℃，40%~60%湿度。所有的动物流程获得中国科学技术大学动物保护和使用委员会的许可，动物伦理号为USTCACUC202101048。
实施例1 UFD1s缺失小鼠的构建及其在饥饿条件下的应激保护作用
本实施例中通过CRISPR/cas9系统构建了UFD1s缺失小鼠，并在RNA和蛋白水平上对UFD1s进行检测。利用代谢笼对UFD1s缺失小鼠的代谢情况进行监测。分别在正常饮食和24小时饥饿处理后对野生型和UFD1s缺失小鼠的肝脏进行HE、LC3 IHC和油红染色。所有图像均由Olympus IX81倒置荧光显微镜拍摄，比例尺为50 μm。具体实验过程如下：
1.1 UFD1s缺失小鼠的构建
Cas9 mRNA和相对应的sgRNA（核苷酸序列为TGCTAGCAGGGCCTAATGAC）分别通过mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA转录试剂盒（Invitrogen，AM1345）和MEGAshortscriptTMT7转录试剂盒（Invitrogen，AM1354）转录产生，之后用MEGAclearTM 转录纯化试剂盒（Invitrogen，AM1908）进行纯化。
委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成单链寡聚脱氧核糖核苷酸（ssODN），其包含突变的剪切位点序列（AGGTCA to CGCAGC，是UFD1f的同义突变）以及两侧的同源序列（119个核苷酸）（SEQ ID NO.9）。
然后将Cas9 mRNA/sgRNA和ssODN显微注射到C57BL/6小鼠的胚胎中，出生两周后所有的小鼠通过PCR（采用的引物对的正向引物为GATGACTTGCTATGTTAGTGCTTGG和反向引物为CCATGCCTTAGGACAGTGACATT）进行基因型鉴定，并经Sanger测序验证。后续UFD1s-/-（UFD1s缺失）所有相关实验都以同窝同年龄同性别的野生型小鼠作为对照组。
1.2 代谢笼
分别将野生型和UFD1s缺失小鼠（各4只/组）放入Promethion Metabolic CageSystem （Sable Systems）的饲养笼中，在正常条件下进行饲养。适应24小时后，收集连续24小时内的数据并进行相关数据的分析，包括总能量消耗、氧气（O2）、呼吸交换率（RER）。
1.3 qPCR检测RNA
1.3.1 RNA抽提
（1）1×PBS清洗相应肝脏组织后加入1 mL Trizol（Invitrogen，15596026）和研磨珠子（Servicebio，G0204），于组织破碎仪中剧烈震荡，机械破碎。
（2）将200 μL的三氯甲烷加到1 mL TRIzol中对RNA进行萃取，上下剧烈晃动离心管30次，室温静置2 min左右。
（3）静置后于4℃离心机12000 g转速离心15 min。
（4）离心结束后，会看到液体分为三层（依次为RNA层，蛋白层和DNA层），将离心管倾斜45°，用无核酸酶的枪头将最上层澄清液体转移到另一个无核酸酶的1.5 mL离心管中（不要触碰到中间层）。
（5）加入相同体积的异丙醇并上下颠倒充分混匀，室温静置10 min或者-20℃沉淀20 min，也可置于-80℃冰箱长时间保存。
（6）4℃，12000 g离心15 min后弃掉上清，并加入1 mL预冷的80%乙醇，上下颠倒充分混匀后，7500 g转速离心5 min。
（7）弃掉乙醇后，将离心管倒扣自然晾干。
（8）RNA晾干后，加入39 μL焦碳酸二乙酯处理过的水（DEPC H2O）对RNA进行溶解。
（9）按照表1所示的配方DNase I消化体系进行DNA酶消化：
表1 DNase I消化体系
（10）加入DNase I消化体系后，充分混匀后放入37℃水浴锅中消化30 min。
（11）DNase I消化结束后，加入5 μL stop buffer，70℃加热5 min，使DNase I变性失活。
（12）向上述体系中加入45 μL DEPC H2O、250 μL 4℃预冷的无水乙醇和10 μL 3M醋酸钠并充分混匀，将样品放于-80℃冰箱沉淀30 min。
（13）4℃，12000 g，15 min，离心结束后弃掉液体，并加入1 mL预冷的80%乙醇，上下颠倒后，4℃，7500 g，5 min。
（14）弃掉乙醇后，将离心管倒扣自然晾干，并用适量体积的DEPC H2O对RNA沉淀进行溶解（冰上）。
（15）溶解充分后，并测定各样品的RNA浓度和纯度，纯度可以通过光密度OD260/OD280的比值来判断，纯净RNA的比值应该不低于2.0。
1.3.2 反转录
（1）采用Promega GoScripTM反转录试剂盒（Promega，A5000），在无核酸酶的PCR管中取500 ng~1 μg的目的RNA，加入1 μL oligo（dT）/Random primer，并用DEPCH2O补齐至10μL，混匀后置于70℃金属浴加热变性5 min，变性后立即冰上放置2 min。
（2）期间准备如表2所示的反转录体系：
表2 反转录体系
（3）采用步骤（2）中的反转录体系按照表3所示的PCR程序进行反转录：
表3 PCR程序
（4）反应结束后的产物进行适当比例的稀释可进行聚合酶链式反应（PCR）或实时定量PCR（qPCR），产物保存于-20℃。
1.3.3 实时荧光定量PCR（qPCR）
（1）按照表4所示的反应体系配制一个样品所需要的体系：
表4 qPCR反应体系
该体系中涉及的引物信息具体如表5所示：
表5 实时定量qPCR中的引物信息
（2）将反应混合物充分混匀后，短暂离心，向96孔板的孔中加入15 μL步骤（1）的体系，共需加三个孔，为三个重复。
（3）待所有样品全部加完后，贴上封口膜，并用刮子刮平后离心（注意在此过程中手不要触碰膜），将96孔板放入实时荧光定量PCR仪QuantStudio 3中，并按照表6所示的程序进行反应：
表6 qPCR反应程序
（4）待反应结束后保存结果，拿出产物并将仪器正确关机。
（5）数据分析，首先要根据上样顺序以及样品名和检测的基因名正确板布局，使用管家基因ACTB mRNA作为内参，利用双Δ法分析目的基因的表达量。
1.4 蛋白质免疫印迹（western blotting，WB）检测蛋白水平
（1）样品准备：1×PBS清洗相应肝脏组织后加入适当体积的RIPA裂解液（50 mMTris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1×protease inhibitor cocktail（Roche，05892970001））和研磨珠子，于组织破碎仪中震荡，机械破碎；4℃高速离心后取上清，取小部分体积用于蛋白定量（Pierce® BCA蛋白检测试剂盒，Thermo，23227）备用，剩余的加入5×SDS loading buffer至1×，并加入10 mM的DTT充分混匀后，100℃金属浴变性10 min，变性结束后离心放冰上静置待实验或者-80℃冰箱保存。
（2）制备好的蛋白样品在SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜（PALL）上，参照常规的蛋白质免疫印迹实验步骤进行。通过ImageQuant LAS4000生物分子成像仪（GEHealthcare）进行拍摄图像，并利用Image J软件对蛋白条带的灰度值进行统计。
该步骤（2）蛋白质免疫印迹实验中涉及的抗体信息如表7所示：
表7 蛋白质免疫印迹实验抗体信息
1.5 小鼠饥饿处理
小鼠在23~25℃环境中（正常的光照时间），第一天晚上9点自由饮水，不提供食物，饥饿24小时，第二天继续禁食12小时，第三天早上9点流血牺牲。所有对照小鼠禁食12小时，于第三天上午9点异氟烷麻醉放血牺牲，将肝脏组织剥离出，放在4%多聚甲醛固定液中至少固定24小时（3只小鼠/组）。
1.6 苏木精-伊红（HE）染色
固定后的肝脏组织经无水乙醇脱水后，进行石蜡包埋。包埋后的组织用超薄切片机切成5 μm厚度的薄片并贴在多聚赖氨酸包被的载玻片上，并用苏木精和伊红染料套装（Servicebio，G1003）进行HE染色。在Olympus IX81倒置荧光显微镜下观察并拍照。通过Image J测定核/细胞质面积比（%）。
1.7 免疫组化（IHC）染色
（1）石蜡切片脱蜡至水：将小鼠肝脏的石蜡切片依次放入脱蜡液10 min→三次无水乙醇5 min→蒸馏水洗。
（2）抗原修复：用抗原修复液对切片进行抗原修复，防止缓冲液过度蒸发。自然冷却后将切片放于PBS中并在摇床上晃动洗三次，每次5 min。
（3）阻断内源性过氧化物酶：将切片放入3%双氧水中，避光孵育25 min后，将切片放于PBS中并在摇床上晃动洗三次，每次5 min。
（4）血清封闭：在组化圈内滴加3% BSA至覆盖组织，室温封闭30 min。
（5）孵一抗：轻轻甩掉封闭液，滴加稀释好的相应蛋白的一抗（用PBS按一定比列稀释），将切片置于湿盒中4℃过夜孵育。
（6）孵二抗：将切片置于PBS中并在摇床上晃动洗三次，每次5 min。切片甩干后根据一抗滴加相应种属的二抗，室温孵育1 h。
（7）二氨基联苯胺（DAB）（Servicebio，G1212）显色：将切片置于PBS中并在摇床上晃动洗三次，每次5 min。切片甩干后滴加新鲜配制的DAB显色液，并在显微镜下控制显色时间，棕黄色为阳性，用超纯水洗片终止继续显色。
（8）细胞核复染：苏木精染液对细胞核染色3 min左右，超纯水冲洗，苏木精分化液分化数秒，超纯水冲洗，苏木精反蓝液反蓝，流水冲洗。
（9）脱水封片：将切片依次放入75%乙醇5 min→85%乙醇5 min→2次无水乙醇5min→正丁醇5 min→二甲苯脱水透明5 min，最后切片晾干封片。
（10）镜检：在Olympus IX81倒置荧光显微镜下观察并拍照。通过图像Image J计算平均光密度（AOD）来表示IHC信号。
该步骤中涉及的抗体信息如表8所示：
表8 IHC中的抗体信息
1.8 油红（Oil red O）染色
（1）冰冻切片固定：将小鼠肝脏组织的冰冻切片复温干燥，并在4%多聚甲醛固定液中固定15 min，超纯水洗，自然晾干。
（2）油红染色：将切片放入油红染液（Servicebio，G1015）中避光浸染10 min。
（3）背景分化：将切片放入60%异丙醇分化两次，各3 s和5 s。再将切片浸入超纯水浸洗2次，每次10 s。
（4）苏木精染核：取出切片并置于苏木精溶液中复染5 min；然后用超纯水浸洗3次，依次5 s，10 s和10 s；并用分化液分化5 s后，超纯水洗2次，每次10 s；反蓝液反蓝1 s，并将切片置于超纯水中浸洗2次，分别为5 s和10 s。
（5）封片镜检：切片封片后，置于Olympus IX81倒置荧光显微镜下镜检并拍照。油红阳性面积的百分比由Image-Pro plus软件计算而得。
1.9 结果与分析
图1展示了CRISPR/cas9技术介导的UFD1s-/-缺陷小鼠的策略（图1中A），UFD1s及其长转录本形式（UFD1f）的RNA水平（图1中B）和蛋白水平（图1中C）。可以看出，UFD1基因可变剪切位点的同义突变，使得UFD1s蛋白水平显著减少而不影响长转录本UFD1f蛋白的表达。
通过图2可以看出，相较于野生型小鼠，UFD1s缺失小鼠能量消耗、氧体积消耗降低、呼吸交换率（RER）增加（图2中A）。此外，UFD1s缺失小鼠的肝脏形态异常，自噬活性降低、脂滴的累积，并且此现象在饥饿处理后更为严重（图2中B）。
以上结果表明，UFD1s具有抗应激的细胞保护作用。
实施例2 鼠源UFD1s的缺失与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的进程相关性研究
本实施例中通过蛋氨酸-胆碱（MCD）缺乏的饲料喂食小鼠4周即可诱导NASH模型，也是目前国际上被广泛认可的模型。NASH疾病模型诱导成功后，通过肝脏UFD1s RNA表达水平的检测，血清脂质和转氨酶水平、脂肪变性评分、油红染色及纤维化染色判定NASH的发生发展进程。具体实验过程如下：
2.1 MCD诱导NASH模型
小鼠先进行过夜饥饿处理（可以自由获取水），然后喂食正常饮食（正常组）或MCD饲料（NASH组），共持续4周，期间每2~3天换一次新鲜饲料。在所有的模型诱导实验过程中，没有小鼠发生死亡。所有小鼠在牺牲之前需做12小时的饥饿处理，6只鼠/组。
2.2 血清甘油三酯、总胆固醇、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的测定
用异氟烷对小鼠进行麻醉，摘眼球取血，收集的血液于3000 rpm，室温离心10 min后保留上清液即为血清。随后分别利用甘油三酯测定试剂盒（NJJC，F001-1-1）、总胆固醇测定试剂盒（NJJC，F002-1-1）、天冬氨酸转氨酶检测试剂盒（Solarbio，BC1560）、丙氨酸转氨酶测定试剂盒（Solarbio，BC1555）测定血清中甘油三酯、总胆固醇、AST和ALT转氨酶水平。所有操作均按照试剂盒说明书进行。
2.3 肝脂肪变性（Steatosis）评分
为了量化不同实验组中肝脂肪变性程度的差别，通过对肝脏组织进行HE染色（比例尺为50 μm）并进行脂肪变性等级的病理评估，评分由病理专家评估（武汉赛维尔生物科技公司）。
脂肪变性等级（评分：0-3）由微空泡/脂肪变性的百分比所决定，观察的视野是20×，具体评分标准如表9中所示的：
表9 脂肪变性等级评分标准
2.4 Masson染色
为了观察肝脏的纤维化程度，利用Masson染色可将纤维化程度通过颜色的深浅呈现出。同实施例1中组织染色准备步骤一样，制备5 μm厚度的石蜡切片，通过Masson染液（Servicebio，G1006）进行染色。最后置于Olympus IX81倒置荧光显微镜下镜检并拍照，通过Image J计算Masson阳性面积的百分比，比例尺为50 μm。
其他均采用同实施例1相同的方法进行检测或染色，这里不再一一阐述。
2.5 结果与分析
通过图3可以看出，与正常小鼠相比，患有NASH小鼠肝脏中UFD1s RNA水平显著降低（图3中A），这说明UFD1s可以作为NASH辅助诊断的新的生物标志物。更重要的是，正常组中UFD1s缺失的小鼠和NASH组中UFD1s缺失的小鼠血清中甘油三酯和总胆固醇水平均显著升高（图3中B）。本领域技术人员熟知，转氨酶水平用以评估肝脏损伤程度，在正常组和NASH组中，UFD1s缺失均导致小鼠血清AST水平明显增加，而ALT水平则没有显著变化（图3中C）。图3中的结果表明，UFD1s的缺失会造成更为严重的肝损伤。
通过图4可以看出，与正常组相比，NASH组中UFD1s缺失小鼠肝脏产生了更严重的脂肪变性、更多的脂滴累积和更高程度的纤维化。这说明UFD1s的缺失加速了NASH的发展。
实施例3 鼠源UFD1s与NASH进程相关性研究
为探究UFD1s治疗潜力，本实施例中分别构建了含有编码UFD1s的核苷酸序列的重组质粒和环形RNA，并分别通过质粒注射和环形RNA递送两种策略在NASH小鼠疾病模型中表达UFD1s蛋白。通过对血清脂质、转氨酶水平的检测、肝脏脂肪变性等级评估、脂滴数目、纤维化程度以及炎症评分，对UFD1s的治疗效果进行综合评估。所有图像均由Olympus IX81倒置荧光显微镜拍摄，比例尺为50 μm。6只鼠/组。
3.1 pLIVE-UFD1s质粒的构建和高压注射
将鼠的编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列（SEQ ID NO.4）克隆至pLIVE载体骨架中（NheI和SacI酶切位点间）（Mirus Bio，MIR 5420），并经Sanger测序鉴定，构建得到pLIVE-UFD1s质粒。
在实施例2中MCD饮食诱导NASH疾病模型的4周过程中，选择在第2周进行质粒注射（图5中A）。为了获得UFD1s在肝脏中的特异表达，本实施例中用2 mL的生理盐水（0.9%NaCl）稀释15 μg pLIVE空载或pLIVE-UFD1s质粒，约体重的10%。随后用2.5 mL注射器和27号针头通过尾静脉将相应质粒注射至小鼠血液中，此过程需在5 s迅速完成。在高压注射完成后，未观察到小鼠有异常和致死现象。
3.2 UFD1s的体外环化（circUFD1s）和递送
1、体外环化
（1）利用TranscriptAid T7 High Yield转录试剂盒（Thermo，K0441）体外转录出鼠的编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列（SEQ ID NO.4）并含有CVB3内部核糖体进入位点（IRES）的线性RNA形式，同时将UFD1s的ATG突变为ATT作为负参照，即分别将1 μg线性化模板（优环生物）、2 μL T7 RNA聚合酶、10 mM NTP充分混合均匀（20 μL体系），于37℃反应4h。
（2）利用TIE成环系统，即将体外转录产物置于50℃反应30 min进行环化反应。环化结束后加入DNase I，37℃孵育消化15 min用以去除DNA模板。
（3）环化反应结束后，产物经RNase R（Epicentre，RNR07250）消化去除线性RNA。
（4）通过5%尿素胶分离环化形式的RNA，根据片段大小，切下circUFD1s相应的胶条，放于elution buffer中溶解。
（5）利用苯酚/氯仿法（pH 4.5）抽提纯化circUFD1s。
2、circUFD1s的递送
在实施例2 MCD饮食诱导NASH疾病模型的4周过程中，分别在第2周和第3周进行circUFD1s或circUFD1sATG-ATT的注射（图5中的A）。将10 μg circRNA与20 μLLipofectamine 3000（Invitrogen，L3000015）（PBS稀释，总体积为100 μL）充分混匀室温静置15 min。随后，使用1 mL注射器和27号针头通过尾静脉30 s内将circRNA-Lipofectamine3000混合物注射至小鼠体内。注射完成后，小鼠无异常或致死现象。
3.3 炎症评分
为检测UFD1s的体内表达对NASH的炎症是否有治疗效果，通过对肝脏组织进行HE染色（比例尺为50 μm）并进行小叶炎症的病理评估，评分由病理专家评估（武汉赛维尔生物科技公司）。小叶炎症程度（评分：0-3）根据炎症位点数（foci）量进行评估，具体评分标准如表10所示的：
表10 小叶炎症程度评分标准
3.4 肝脏纤维化和炎症程度
采用同前文相同的方法进行相应的染色以评估肝脏脂肪变性、脂滴数量和纤维化程度。同时，通过检测肝脏中纤维化marker（COLLA1）和炎症marker（TNF）mRNA表达水平考察肝脏纤维化程度（qPCR方法同前文相同）和炎症程度，涉及的引物具体信息如表11所示：
表11 引物信息
3.5 结果与分析
通过图5可以看出，与相应的对照组相比，pLIVE-UFD1s和circUFD1s组在肝脏中都有高水平UFD1s蛋白表达（图5中B），这说明两种策略均能实现UFD1s在肝脏中高效且稳定的表达。
通过图6可以看出，与相应的对照组相比，注射pLIVE-UFD1s和circUFD1s组NASH小鼠血清中甘油三酯和胆固醇水平显著降低（图6中A）；此外，与相应的对照组相比，注射pLIVE-UFD1s组的小鼠中AST和ALT转氨酶水平均明显降低（图6中B），注射circUFD1s组小鼠血清中AST水平显著降低，而ALT水平未发生明显变化。这说明UFD1s的表达能够显著降低血清中脂质和转氨酶（尤其是AST）的水平。
此外，与相应的对照组相比，表达UFD1s的NASH小鼠肝脏的肝脏脂肪变性、脂滴数量和纤维化程度均显著降低（图7）。同时，表达UFD1s的NASH小鼠肝脏的炎症评分，肝脏中纤维化marker（COLLA1）和炎症marker（TNF）mRNA表达水平均显著低于相应的对照组（图8中A和图8中B），说明通过在NASH小鼠肝脏中表达UFD1s均能降低NASH小鼠的脂肪变性、脂滴数目、纤维化和炎症程度。
综合以上结果，可以得出UFD1s可以缓解NASH发展进程，基于UFD1s可开发出相应的预防和/或治疗NASH的药物。
实施例4 人源UFD1s与NASH进程相关性以及治疗NASH的研究
4.1 临床样本的免疫组化
临床样本共16例（其中，非NASH对照和NASH肝脏样本各8例）。这些临床样本均为石蜡包埋的肝细胞癌的癌旁组织，由中国科学技术大学第一附属医院提供。所有组织样本均按照知情同意政策收集，且该研究获得中国科大第一附属医院生物医学伦理委员会批准，生物医学伦理号为2024-RE-491。
临床样本的纳入标准：
1、自获得生物医学伦理后，在中国科学技术大学第一附属医院就诊并手术的肝脏原发性恶性肿瘤患者，且经病理学确诊。
2、年龄37~81周岁。
3、对上述肝癌患者的癌旁组织进行NASH的病理评分，由中国科学技术大学第一附属医院的病理科专家进行诊断。分别对气球样变（0分，无；1分，少见；2分，多见），脂肪变性（0分（<5%）；1分（5%～33%）；2分（34%～66%）；3分（>66%））和小叶炎症（20倍镜计数坏死灶）（0分，无；1分（<2个）；2分（2～4个）；3分（>4个）），必须同时包括这三项且总评分即NAS评分≥4分的诊断为NASH患者，否则即为非NASH。
4、签署知情同意书，有较好的依从性，愿意接受随访。
临床样本的排除标准（满足以下≥1项即排除）：
1、同时患有两种及以上恶性肿瘤，或者手术部位恶性肿瘤灶非原发病灶。
2、血妊娠试验阳性或未进行妊娠试验的育龄女性怀孕或哺乳女性。
3、患者患病期间曾参与其他不能明确治疗措施或无法收集治疗信息的治疗性临床试验。
4、因肿瘤扩散而无法实施手术、无法获取肿瘤组织的患者。
5、合并严重的中枢神经系统疾病，呼吸系统疾病、自身免疫性疾病、慢性肾功能不全等疾病，长期使用免疫抑制剂，合并严重的未控制的感染。
对临床样本进行小蛋白UFD1s的免疫组化（IHC）染色，具体步骤可参照实施例1中所述的。
4.2 细胞材料
1、人的HEK293K（WT）：ATCC，CRL-11268。
2、UFD1s缺失细胞（UFD1s KO）的构建：
（1）质粒构建：设计一条靶向人源UFD1s的sgRNA（具体序列信息可参见表12）并将其构建到px330-mCherry载体（Addgene，98750）中；将UFD1s突变的剪切位点序列（AGGTCA突变为CGCAGC）以及两侧的同源序列构建到pcDNA3.0（Invitrogen，V79020）载体中。
（2）细胞转染：将50万个HEK293T野生型细胞接种于6孔板中，并将表达Cas9 mRNA的sgRNA质粒（1 μg）和同源质粒（1 μg）共转至接种的细胞。
（3）流式分选：细胞转染48 h后，通过BD FACSAria™III细胞分选系统（Beckman，5激光）进行单细胞分选，并提前准备好鞘液。用胰酶(Gibco，25200072)将细胞消化下来后用PBS清洗两次后用含10%血清的PBS重悬细胞，并用含有滤膜的流式管进行过滤。同时准备分选的96孔细胞培养板，最后根据红色荧光进行阳性单细胞分选。
（4）细胞扩大培养及鉴定：将分选后的96孔板放置培养箱中培养10天左右，显微镜下进行观察，只挑选形成单克隆细胞的孔，将其细胞传至48孔板扩大培养，同时保留少量细胞抽提基因组，并进行PCR和Sanger一代测序的基因型鉴定，PCR鉴定引物序列参见表12中的Human UFD1s KO F和Human UFD1s KO R。
表12 构建UFD1s KO涉及的序列信息
3、UFD1s过表达细胞（UFD1s OE）的构建：
以人的cDNA作为模板，PCR扩增得到含有5’非翻译区（UTR）序列的编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列（SEQ ID NO.3），并以p3×FLAG-Myc-CMV24（Sigma，E9283）作为载体骨架，利用同源重组原理（Vazyme，C112-02）将FLAG标签构建到编码UFD1s核苷酸序列的C末端，构建人源UFD1s过表达质粒，即UFD1s-FLAG质粒，构建的质粒经Sanger测序验证。后续将UFD1s-FLAG转染至相应细胞中，进行质粒过表达（UFD1s OE）（具体步骤可参照UFD1s KO细胞转染步骤），并以p3×FLAG-Myc-CMV24载体质粒作为空载对照（EV）。人源UFD1s-FLAG质粒构建的引物序列参见表13。
表13 构建UFD1s-FLAG质粒涉及引物信息
所有细胞培养在标准条件下进行，完全培养基由DMEM基础培养基（Gibco，11995065），10%胎牛血清（CLARK，FB25015）和1%青霉素/链霉素双抗（Beyotime，C0222）组成，并在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱（Thermo）中进行培养。用PCR方法和DAPI染色法检查细胞，确保细胞没有受到支原体污染。后续所有测试均在细胞培养24 h后进行。
4.3 细胞内甘油三酯含量的测定
（1）通过甘油三酯测定试剂盒（南京建成生物，NJJC，F001-1-1）检测细胞内甘油三酯水平。
（2）收集细胞并用RIPA裂解液裂解细胞30 min，随后4℃离心10 min保留上清液，取等体积的细胞裂解液测定甘油三酯水平。
（3）分别将空白管（0 μL）、标准品（3 μL）、测定管（3 μL）与甘油三酯测定液（300 μL）充分混匀后置于37℃水浴5 min，以空白管校零，在546 nm波长下比色读取各管吸光度值。
（4）将甘油三酯测量值与Bradford法蛋白质定量试剂盒测定的细胞总蛋白量（thermo，23200）进行归一，得到最终甘油三酯的含量。
4.4 尼罗红染色
（1）将种植在玻片上的细胞经PBS溶液洗涤两次后，加入4%甲醛溶液（PBS配制），室温固定10 min。
（2）移除细胞中的固定液后，加入PBS洗两次后与 0.05 μg/mL尼罗红溶液（PBS稀释）室温孵育20 min。
（3）移除尼罗红染液，加入 1 μg/mL的Hoechst 33342对细胞核进行染色，室温孵育10 min，并用PBS洗两次。
（4）镜检。在共聚焦显微镜（Zeiss LSM 980）下观察脂滴情况并进行拍照，通过Image J软件对尼罗红信号进行定量。
4.5 脂肪酸氧化的测定
（1）利用细胞能量代谢分析仪（Seahorse XFe96，Agilent）分析细胞的脂肪酸（FAO）氧化情况，FAO需要在细胞耗氧率（OCR）实验基础上进行检测。
（2）将1.0×104~2.0×104个细胞/孔种植到96孔XF细胞培养板中，加入正常的DMEM培养基培养24 h。
（3）检测FAO时需要对细胞进行饥饿处理，即将培养基换成底物限制DMEM（同时包含0.5 mM葡萄糖glucose，1 mM谷氨酰胺glutamine，0.5 mM肉毒碱carnitine，1% FBS）处理12 h。
（4）饥饿处理结束后，去除底物限制的DMEM并加入FAO实验培养基（KHB buffer：111 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.25 mM CaCl2，2 mM MgSO4，1.2 mM NaH2PO4，并加入2.5 mM葡萄糖glucose，0.5 mM肉毒碱carnitine，5 mM HEPES，pH 7.4），在无CO2的37℃培养箱孵育45 min。
（5）随后分别加入Cell Mito Stress Test Kit（Agient，103015-100）中的试剂，包括寡霉素oligomycin（1.5 μM），碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙FCCP（1.0 μM）和鱼藤酮/抗霉素A rotenone/antimycin A（Rot/AA，0.5 μM）。
（6）上机检测前，向细胞微孔中分别加入BSA或者棕榈酸（PA）（终浓度为50 μM）。
（7）Wave软件获得所有的数据，并用GraphPad Prism软件对数据进行分析。
4.6 结果与分析
图9中呈现了实施例4中的实验结果。
图9中A通过免疫组化染色显示小蛋白UFD1s在非NASH和NASH临床病人肝脏组织中的表达情况（N=8例）。结果表明小蛋白UFD1s在NASH病人的肝脏组织中低表达。
图9中B是对人的HEK293T野生型（WT）和UFD1s缺失细胞（UFD1s KO）中甘油三酯的含量进行测定，发现UFD1s的缺失导致细胞中甘油三酯的水平增加。
图9中C则是在人的HEK293T细胞中通过尼罗红染色检测小蛋白UFD1s缺失（UFD1sKO）和过表达细胞（UFD1s OE）中脂滴含量。结果显示，小蛋白UFD1s能够抑制细胞中脂滴的累积。
图9中D和E则是通过外源加入棕榈酸（PA）测量细胞的耗氧率（OCR）评估小蛋白UFD1s缺失和过表达细胞中脂肪酸氧化速率，结果表明，小蛋白UFD1s能够促进脂肪酸氧化。
综合图9中的实验结果可知，小蛋白UFD1s能够促进脂肪酸氧化，抑制脂滴的类累积，减轻脂肪毒性，故而具有治疗NASH的效果。
综合实施例1-4的实验结果，说明UFD1s具有抵抗细胞应激的保护作用，在非酒精性脂肪性肝炎的小鼠中表达水平显著降低，与非酒精性脂肪性肝炎的发生发展有关，可以作为该疾病辅助诊断的生物标志物；在鼠中分别利用质粒和环形RNA两种方法体内表达UFD1s后，对非酒精性脂肪性肝炎的治疗产生明显的效果，很大程度抑制营养失衡代谢性疾病的进展。同时以临床样本进行分析，发现NASH病人中UFD1s的表达显著低于非NASH，同时通过细胞实验进一步印证了UFD1s在人源细胞同样具有治疗NASH的效果，因此，本发明公开的小蛋白UFD1s具有很高的医疗价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1. 具有能量代谢调控和抵抗细胞应激作用的小蛋白UFD1s，其特征在于，所述小蛋白UFD1s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2. 如权利要求1所述的具有能量代谢调控和抵抗细胞应激作用的小蛋白UFD1s，其特征在于，编码所述小蛋白UFD1s的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码权利要求1或2所述的小蛋白UFD1s的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒或环形RNA。
5.一种预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，其特征在于，所述药物含有：
a）小蛋白UFD1s，所述小蛋白UFD1s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
或者b）表达载体，所述表达载体含有编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物具有以下功效中的至少一种：
（1）降低受试者血清脂质的水平，所述血清脂质包括甘油三酯和总胆固醇；
（2）降低受试者血清天冬氨酸转氨酶的水平；
（3）降低受试者肝脏脂肪变性程度；
（4）改善受试者肝脏炎症程度；
（5）改善受试者肝脏纤维化程度。
7.如以下任意一项的应用：
（1）检测受试者肝脏组织中UFD1s表达水平的试剂在制备辅助诊断非酒精性脂肪性肝炎产品中的应用，其中，所述UFD1s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
（2）小蛋白UFD1s，或者表达载体在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用，所述小蛋白UFD1s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述表达载体含有编码小蛋白UFD1s的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片或试剂盒。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测受试者肝脏组织中UFD1s表达水平的试剂为检测受试者肝脏组织中UFD1s蛋白表达量的试剂，或者检测受试者肝脏组织中UFD1s的RNA表达水平的试剂。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测受试者肝脏组织中UFD1s表达水平的试剂为检测受试者肝脏组织中UFD1s的RNA表达水平的试剂，所述试剂中含有以下引物对中的一组：
（1）核苷酸序列如SEQ ID NO.5和6所示的引物对；
（2）核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示的引物对。
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