CN120456918A

CN120456918A - 重组rsv疫苗：制备和使用其的方法

Info

Publication number: CN120456918A
Application number: CN202380084427.1A
Authority: CN
Inventors: 何飙; 金红; M·C·金格里奇
Original assignee: Blue Lake Biotech Ag
Current assignee: Blue Lake Biotech Ag
Priority date: 2022-11-04
Filing date: 2023-11-03
Publication date: 2025-08-08
Also published as: US20240148857A1; KR20250096845A; JP2025537199A; EP4611804A1; AU2023372210A1; MX2025005203A; WO2024097976A1

Abstract

在患有RSV的受试者中诱导免疫反应的组合物和方法包括施用包含针对RSV感染的预防性疫苗的药物组合物，其中所述疫苗包含经工程改造以表达RSV F蛋白的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架。

Description

重组RSV疫苗：制备和使用其的方法

相关申请的引用

本申请要求2022年11月4日提交的美国临时申请号63/382,453的权益和优先权，所述申请以引用的方式整体并入。

对序列表的引用

本申请含有序列表，所述序列表以.XML格式以电子方式提交并且特此以引用的方式整体并入。在2023年11月2日创建的所述.XML拷贝命名为“065095.004PCT.xml”，并且大小为42，181字节。该.XML文件中含有的序列表是本申请的一部分，并且特此以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及免疫调节领域，并且更具体地涉及调节针对呼吸道合胞病毒(RSV)感染疾病的免疫反应的组合物和方法。

背景技术

人RSV是幼儿下呼吸道疾病和住院的主要病毒原因。感染RSV的绝大多数儿童患有轻度上呼吸道感染；然而，一小部分儿童会经历严重的RSV诱发的下呼吸道感染(LRI)和细支气管炎，这往往需要住院治疗并且可能危及生命(Collins等人，Respiratory syncytialvirus，In：Fields Virology，Knipe和Howley，编辑，Lippincott Williams & Wilcins，NewYork(1996)，第1313-1351页)。由于几乎每个儿童最终都会感染RSV，并且20-30％的RSV感染儿童会出现严重的LRI，因此RSV每年在美国造成超过130,000名儿童住院(Shay等人，JAMA，282(5)：1440-1446(1999)，和World Health Organization，Initiative forVaccine Research(IVR)，Respiratory syncytial virus(RSV)。

已经明确鉴定出发展严重RSV诱发疾病的一些风险因素，包括早产(Navas等人，J.Pediatr.，121(3)：348-54(1992))、支气管肺发育不良(Groothuis等人，Pediatrics，82(2)：199-203(1988))、先天性心脏病(MacDonald等人，N.Engl.J.Med，307(1)：397-400(1982))和T细胞免疫缺陷(Mcintosh等人，J.Pediatr.，82(4)：578-90(1973))。然而，因严重RSV诱发疾病而住院的儿童中，超过一半没有识别出风险因素(Boyce等人，J.Pediatr.，137(6)：865-70(2000))，这意味着大约1-2％的健康儿童没有任何可识别的风险因素，但却会遭受RSV诱发疾病的潜在危及生命的后果(Collins等人，同上)。

RSV诱发的儿童严重疾病也与哮喘的发展有关(参见例如，Sigurs等人，Pediatrics，95(4)：500-505(1995)；Welliver等人，Pediatr.Pulmonol，15(1)：19-27(1993)；Cifiientes等人，Pediatr.Pulmonol，36(4)：316-321(2003)；Schauer等人，Eur.Respir.J.，20(5)：1277-1283(2002)；Sigurs等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，161(5)：1501-1507(2000)；和Stein等人，Lancet，354(9178)：541-545(1999))。这种关联的基础尚不清楚，但可能是由于潜在的遗传因素、免疫功能障碍、抗原特异性反应或严重RSV疾病后肺重塑引起的结构性病变。

尽管RSV感染在三岁时几乎普遍存在，但由于自然RSV感染不能提供完全的免疫力，因此在整个生命过程中都会发生再感染(Hall等人，J.Infect.Dis.，163(4)：693-698(1991)，和Muelenaer等人，J.Infect.Dis.，164：15-21(1991))。在老年人中，RSV是发病和死亡的重要原因。在一项回顾性队列研究中，RSV导致每1,000名疗养院居民每年平均有IS例住院和17例死亡，而流感在相同环境下平均导致28例住院和15例死亡(Garofalo等人，Pediatr.Allergy Immunol.，5(2)：111-117(1994)。因此，在该群体中，RSV的分离频率与甲型流感一样高，并且死亡率也与甲型流感相当(Ellis等人，J.Am.Geriatr.Soc，51(6)：761-72003；和Falsey等人，J.Infect.Dis.，772(2)：389-394(1995))。

目前尚无FDA批准用于在儿童中预防RSV感染或治疗RSV诱发疾病的疫苗。唯一FDA批准的用于预防RSV感染的药物是(帕利珠单抗(palivizumab))(Medlmmune，Gaithersburg，MD)，它是一种人源化单克隆抗体，针对施用于高危婴儿的RSV F蛋白的A抗原位点的表位。尽管在预防下呼吸道急性RSV疾病和缓解下呼吸道感染方面表现出重大进展，但在允许剂量下，它并未显示出针对上呼吸道RSV感染有效。2023年，FDA批准了半衰期延长的长效RSV单克隆抗体Beyfortus(尼塞韦单抗(nirsevimab))，该单克隆抗体建议用于在第一个RSV季节期间出生或进入第一个RSV季节的所有年龄<8个月的婴儿，以及患严重RSV疾病风险增加且正在进入第二个RSV季节的8-19个月大的婴儿和儿童。

RSV疫苗开发受到儿童自然RSV感染后疫苗增强疾病的影响(Kim等人，Am.J.Epidemiol，89(4)：422-434(1969)；和Kapikian等人，Am.J.Epidemiol，89(4)：405-421(1969))。例如，在20世纪60年代初期，一种福尔马林灭活的明矾沉淀疫苗候选(FI-RSV)被施用于20世纪60年代初期的RSV幼稚婴儿，尽管它具有免疫原性，但却不能保护儿童免受自然感染。此外，与免疫接种福尔马林灭活副流感病毒的对照儿童相比，随后感染RSV的疫苗接种者住院率更高，且病情更严重，包括两例死亡(Kapikian等人，同上，Chin等人，Am.J.Epidemiol.，89(4)：449-463(1969)；和Polack等人，J.Exp.Med，196(6)：859-65(2002))。RSV免疫接种的其他方法包括减毒活RSV、RSV亚单位蛋白和副流感病毒嵌合体。减毒活RSV疫苗已在RSV幼稚婴儿的临床试验中进行了测试，但尚未显示出实现突变的遗传稳定性、婴儿安全减毒之间的最佳平衡或保护性免疫反应(Karron等人，J.Infect.Dis.，191(7)：1093-1104(2005)；和Bukreyev等人，J.Virol，79(15)：9515-9526(2005))。基于RSV G和F蛋白的蛋白质亚单位疫苗已安全地施用于成人和RSV血清阳性儿童，但免疫原性适中(Tristram等人.Vaccine，12(6)：551-556(1994))。

因此，仍然需要有效且安全地预防或治疗RSV感染的组合物和方法。

因此，本发明提供了用于有效且安全地预防或治疗哺乳动物(优选地人)的RSV感染的此类组合物和方法。

发明内容

根据本发明的目的，如本文所体现和广泛描述的，本发明在一个方面中涉及一种病毒表达载体，其包含副流感病毒5(PIV5)基因组，该基因组具有与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的异源核酸序列，其中该病毒表达载体表达异源多肽，该异源多肽包含经工程改造以表达RSV F蛋白作为靶抗原的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架。在一个实施方案中，RSV F蛋白由野生型或突变的RSV F蛋白基因编码。在另一个实施方案中，RSV F蛋白基因经密码子优化以在人受试者中表达。在再另一个实施方案中，RSV F蛋白基因插入CPI反基因组cDNA的SH和HN接合部之间，其中用具有与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19或19具有至少95％序列同一性的核酸序列的引物对CPI反基因组cDNA进行测序。在另一个实施方案中，经工程改造以表达RSV F蛋白的副流感病毒(CPI)载体骨架包含22个氨基酸延伸作为其细胞质尾的一部分。

在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含副流感病毒5(PIV5)病毒表达载体，该载体具有与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的异源核酸序列，其中该病毒表达载体表达异源多肽，该异源多肽包含经工程改造以表达RSV F蛋白作为靶抗原的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架。在一个实施方案中，RSV F蛋白由野生型或突变的RSV F蛋白基因编码，其中RSV F蛋白基因经密码子优化以在人受试者中表达。在另一个实施方案中，RSV F蛋白基因插入CPI反基因组cDNA的SH和HN接合部之间，其中用具有与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19或19具有至少95％序列同一性的核酸序列的引物对CPI反基因组cDNA进行测序。在再另一个实施方案中，经工程改造以表达RSV F蛋白的副流感病毒(CPI)载体骨架包含22个氨基酸延伸作为其细胞质尾的一部分。在另一个实施方案中，经工程改造以表达RSV F蛋白的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架是针对RSV感染的预防性疫苗。

在再另一个方面中，本发明涉及一种在患有RSV的受试者中诱导免疫反应的方法，该方法包括施用针对RSV感染的预防性疫苗，其中该疫苗包含经工程改造以表达如上所述的RSV F蛋白的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架。在另一个实施方案中，该疫苗诱导RSVF蛋白特异性血清抗体和细胞介导的反应。在另一个实施方案中，与通过施用福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)获得的免疫反应相比，RSV-F特异性血清抗体和细胞介导的反应与RSV诱发的病理性肺反应的发生率降低相关。在另一个实施方案中，病理性肺反应选自由以下组成的组：细支气管周围炎、血管周围炎、间质性肺炎和肺泡炎。在另一个实施方案中，疫苗鼻内、肌肉内、局部或口服施用。在另一个实施方案中，疫苗以单剂量方案或多剂量方案施用。

本发明的其他优点将在下面的描述中部分列出，并且部分将由描述而变得显而易见，或可以通过本发明的实践来学习。本发明的优点将借助在所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现和达到。应理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。

附图说明

并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图说明本发明的一个或几个实施方案，并且连同描述一起用来解释本发明的原理。

图1A-1B示出了免疫接种的AGM中的RSV F特异性免疫反应。免疫接种的非洲绿猴(AGM)中的RSV F特异性细胞免疫反应。在疫苗接种前一天以及免疫接种后14和28天从免疫接种的AGM中分离PBMC。用RSV F肽池刺激PBMC，并通过ICS量化CD4⁺(图1A)和CD8⁺(图1B)细胞中的不同细胞因子水平，并以所有细胞因子的总和％表示。第1组＝对照，第6组＝CPI-RSV-F。

图2A-2B示出了pSP28(图2A)和pAB94(图2B)的质粒图谱。

图3示出了CPI-RSV-F疫苗载体质粒和图谱。

图4示出了病毒拯救的示意图。

图5A-5C示出了RSV F蛋白百分比表达测定CPI-RSV-F前MVS的代表性图像。

图6A-6C示出了RSV F蛋白百分比表达测定CPI-RSV-F MVS的代表性图像。

图7示出了CHD03实验时间线的图示。

图8示出了CHD04实验时间线的图示。

图9A-9B示出了CHD03(图9A)和CHD04(图9B)RSV-F血清抗体滴度。用PBS治疗幼稚BALB/c小鼠，或用10⁵PFU的PIV5-RSV-F、PIV5ΔSH-RSV-F、CPI-RSV-F、CPIΔSH-RSV-F或RSV_rA2鼻内免疫接种幼稚BALB/c小鼠。在免疫接种后4周采集血清。通过ELISA(N＝5)测定RSV-F特异性IgG抗体终点滴度。水平线代表每组的几何平均抗体滴度。通过ANOVA和邓肯多重比较检验(Dunnett's multiple comparison test)确定统计学意义。****P<0.0001，PBS组和疫苗组之间的显著性。LOD，检测限。

图10A-10B示出了CHD03和CHD04 RSV-F ELISPOT滴度。用PBS处理幼稚BALB/c小鼠或用10⁵PFU的PIV5-RSV-F、PIV5ΔSH-RSV-F、CPI-RSV-F、CPIΔSH-RSV-F或RSV_rA2鼻内免疫接种幼稚BALB/c小鼠。收获脾细胞并用RSV F肽刺激。结果表示为每10⁶个脾细胞中IFN-γ分泌细胞的数量(N＝5)。水平线代表几何平均ELISPOT滴度。通过ANOVA和邓肯多重比较检验确定统计学意义。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，PBS组和疫苗组之间的显著性。

图11A-11B示出了CHD03(图11A)和CHDO4(图11B)肺滴度。

图12示出了RSV攻击后肺RSV攻击病毒滴度。

图13示出了鼻冲洗液中RSV攻击后鼻RSV攻击病毒滴度。

图14示出了RSV中和抗体反应。

图15示出了通过ELISA得到的抗RSV F蛋白IgG抗体反应。

图16A-16D是示出RSV NS1、IL-4、IL-2和IFN-γ mRNA的表达的条形图。

图17A-17F是示出年轻人(第1组)和老年人(第2组)在疫苗接种BLB201(CPI-RSV-F)之前和之后血清RSV特异性抗体(Ab)滴度的条形图。图17A-17B示出了通过微量中和测定得到的RSV中和抗体；图17C-17D示出了F特异性RSV IgA，并且图17E-17F示出了通过ELISA得到的F特异性IgG Ab。左列图表示出了第1、15和29天按年龄组的个体log₂滴度和平均log₂滴度以及各自的标准差(误差线)，右列图表示出了第15和29天按年龄组的相对于基线的几何平均倍数增加(GMFR)。*P<.05；**P<.01；***P<.001，由Wilcoxon检验得到。

图18A-18D是示出个体受试者在疫苗接种BLB201(CPI-RSV-F)之前和之后(第1、15和29天)的第1组(图18A)和第2组(图18B)的血清RSV中和(nAb)滴度以及鼻F特异性IgA抗体(Ab)滴度(图18C-18D)的折线图，并按年龄第1组和第2组划分。

图19A-19D是示出两个疫苗接种组在用BLB201(CPI-RSV-F)疫苗接种之前和之后血清PIV5抗体(Ab)滴度的条形图。图19A-19B示出了通过微量中和测定得到的PIV5中和抗体；并且图19C-19D示出了通过ELISA得到的PIV5特异性RSVIgG Ab。左列图表示出了第1、15和29天按年龄组的个体log₂滴度和平均log₂滴度以及各自的标准差(误差线)，并且右列图表示出了第15和29天按年龄组的相对于基线的几何平均倍数增加(GMFR)。*P<.05；**P<.01；***P<.001，由Wilcoxon检验得到。

图20A-20C是示出基于基线(疫苗接种前)的PIV5中和抗体(nAb)水平的PIV5-RSV疫苗接种的反应率之间的关系的条形图。基于个体受试者的基线PIV5 nAb滴度低于(L)或高于(H)每个年龄组(第1组和第2组)的PIV5 nAb的基线几何平均滴度、按亚组划分、具有对PIV5-RSV疫苗的PIV5中和(nAb)血清反应(滴度升高≥1.5倍)的患者(图20A)和具有对PIV5-RSV疫苗的RSV中和(nAb)血清反应(滴度升高≥1.5倍)的患者(图20B)的百分比。图20C示出了基于个体基线鼻F特异性IgA滴度低于(L)或高于(H)每个年龄组(第1组和第2组)的鼻F特异性IgA的基线几何平均滴度、按亚组划分、具有对PIV5-RSV疫苗的鼻F特异性IgA反应(滴度升高≥2倍)的受试者的百分比。

图21A-21B是示出第1组和第2组疫苗接种之前和之后鼻IgA抗体滴度的条形图。通过ELISA得到的F特异性RSV IgA Ab。左图(图21A)示出了第1、15和29天按年龄组的个体log₂滴度和平均log₂滴度以及各自的标准差(误差线)，并且图(图21B)示出了第15和29天按年龄组的相对于基线的几何平均倍数增加(GMFR)。

图22A-22J示出了疫苗接种BLB201(CPI-RSV-F)之前和之后RSV F特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。根据所示免疫标志物的表达，按年龄组在第1、15和29天的每个个体的CD4⁺T细胞(上图)和CD8⁺T细胞(22A-D)的百分比(以符号和连续线表示)。图22E和22F示出了根据指示的Th1/细胞毒性标志物组合(IFN-γ、TNF-α、CD107a)，按年龄组在第1、15和29天的CD4⁺T细胞(左图)和CD8⁺T细胞(右图)的平均百分比，以堆叠直方图表示。图22G和22H示出了按年龄组在第15和29天CD4⁺和CD8⁺T细胞相对于基线的几何平均倍数增加(GMFR)。图22G和22H示出了疫苗接种后第15和29天CD4和CD8T细胞反应的倍数变化。图22I和22J为第1组和第2组在第15和29天表达1、2或3种Th1/细胞毒性标志物(IFN-γ、TNF-α、CD107a)的F特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例的饼图表示。*P<.05；**P<.01；***P<.001，ns：不显著。

具体实施方式

通过参考本发明的优选实施方案的以下具体实施方式和其中所包括的实施例，以及附图及其先前和以下描述可以更容易理解本发明。

I.定义

为了便于理解本公开的各个实施方案的原理和特征，本文解释了各个例示性实施方案。尽管详细解释了本公开的示例性实施方案，但应当理解，还可以考虑其他实施方案。因此，本公开的范围并不局限于描述或实施例中阐述的组件的构造和排列的细节。本公开能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实现或执行。

在描述示例性实施方案时，为了清楚起见，将采用特定术语。除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，提及一组件也旨在包括多个组件的组合物。提及含有“一”成分的组合物旨在包括除所指定的一个成分之外的其他成分。

范围可在本文中表达为自“约”或“大约”或“基本上”一个特定值起和/或至“约”或“大约”或“基本上”另一个特定值。当表示此种范围时，另一个示例性实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。除非另有说明，否则说明书和权利要求中使用的表示组分的量、分子量等的所有数值都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另外有相反的指示，否则说明书和权利要求中所阐述的数值参数为近似值，其可根据本发明要寻求获得的所需性质而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求范围的等价范围的原则，每个数值参数均应当至少根据报道的有效数字的数值和通过应用普通四含五入技术来解读。

尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在特定实例中所陈述的数值尽可能准确地进行报道。然而，所有数值固有地包含必然由在其各自的测试测量值中发现的标准偏差引起的范围。

对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，所述步骤可以以任何可行的顺序进行。并且，如果合适，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。

该描述举例说明了例示性实施方案。在整个申请的几个地方，通过实例列表提供了指导，这些实例可以以各种组合使用。在每种情况下，所列举的列表仅用作代表性组并且不应被解释为排他性列表。

所有标题都是为了方便读者，并且除非另有说明，否则不应用于限制标题后文本的含义。

本发明通过以下实例说明。应理解，特定实例、材料、量和程序应根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来广义的解释。

类似地，如本文所用，“基本上不含”某种物质或“基本上纯”以及类似的特征可包括“至少基本上不含”某种物质或“至少基本上纯”，以及“完全不含”某种物质或“完全纯”。

“包括”或“含有”或“包含”的意思是，组合物或物品或方法中至少存在所指定的化合物、元素、颗粒或方法步骤，但不排除其他化合物、材料、颗粒、方法步骤的存在，即使其他此类化合物、材料、颗粒、方法步骤具有与所指定的相同的功能。

词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选的实施方案的叙述并不意味着其他实施方案不可用，并且并不旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

术语“患者”、“个体”、“受试者”和“动物”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人和兽医动物(例如，猫、狗、牛、马、绵羊、猪等)和实验动物模型。在一优选实施方案中，受试者是人。

如本文所述，术语“疫苗接种”通常指示向受试者顺序施用一种或多种抗原，以产生和/或增强针对抗原的免疫反应。顺序施用包括初次免疫接种，随后进行一次或几次增强免疫接种。

在本发明的上下文中，术语“病原体”是指可导致病理状况的任何剂。“病原体”的例子包括但不限于细胞(例如，细菌细胞、患病哺乳动物细胞、癌症哺乳动物细胞)、真菌、寄生虫、病毒、朊病毒或毒素。优选的病原体是传染性病原体。在具体实施方案中，传染性病原体是病毒，诸如冠状病毒。

如本文所用的抗原指示可在受试者体内引起T细胞或B细胞免疫反应的任何分子。对病原体具有特异性的抗原通常是从所述病原体获得或衍生自其的元素，其含有表位，并且可引起针对病原体的免疫反应。根据病原体的不同，抗原可具有多种性质，诸如(多)肽、蛋白质、核酸、脂质、细胞等。也可使用病原体的活减毒形式(例如，细菌、病毒)或其杀伤或灭活的形式，或者从中纯化的材料，诸如蛋白质、肽、脂质等。抗原可是天然存在的或人工产生的。对于接受治疗的哺乳动物来说，它可能是外源性的，也可能是内源性的(例如，肿瘤抗原)。抗原可通过本领域本身已知的技术来产生，诸如例如合成或重组技术，或酶促方法。

在具体实施方案中，抗原是蛋白质、多肽和/或肽。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基可是修饰的或非天然存在的残基，诸如对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。应当理解，术语“蛋白质”还包括不同抗原的片段或变体，诸如含有表位的片段，或从病原体获得且随后经酶、化学、机械或热修饰的蛋白质。

“治疗有效量”意指当将化合物(例如，如本文所述的基于PIV5的组合物)施用于受试者以治疗状态、病症或疾患时足以实现此类治疗的量。“治疗有效量”将根据所施用的化合物或细菌以及疾病及其严重程度以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。

如与本公开的组合物相关使用的短语“药学上可接受的”是指此类组合物的分子实体和其他成分在生理上可耐受，并且当施用于哺乳动物(例如，人)时通常不会产生不良反应。优选地，如本文所用的术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出，以用于哺乳动物并且更具体地为用于人。

本文所使用的术语“药学上可接受的组合物”是指包含与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的本文公开的至少一种化合物的组合物。

术语“施用”是指通过某种合适的方法将一定量的预定物质引入患者体内。本文公开的组合物可经由任何常见途径施用，只要其能够到达所需的组织即可，例如但不限于吸入、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内施用。然而，由于肽在口服施用时会被消化，因此口服施用的组合物的活性成分应该进行包衣或配制，以保护免于在胃中降解。

术语“剂量”意指施用的化合物或剂的单次量；和/或“方案”：意指多个预定剂量，这些剂量在量方面可不同或类似，以不同的时间间隔给予，该时间间隔在持续时间方面可不同或类似。在一些实施方案中，方案还涵盖递送期(例如，剂施用期或治疗期)的时间。或者，方案是以预定时间间隔给予的多个预定的多个预定蒸发量。

术语“载剂”是指使用其来施用化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物载剂可以是无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或含水盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油水溶液优选用作载剂，特别是用于可注射溶液。或者，载剂可是固体剂型载剂，包括但不限于粘合剂(用于压丸)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。合适的药物载剂由E.W.Martin.描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。

术语“治疗(treat/treatment)”状态、病症或疾患包括：(1)预防或延迟在可能患有或易患该状态、病症或疾患但尚未经历或表现出该状态、病症或疾患的临床或亚临床症状的受试者中出现该状态、病症或疾患的至少一种临床或亚临床症状；或(2)抑制该状态、病症或疾患，即阻止、减轻或延迟疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状；或(3)缓解该疾病，即导致该状态、病症或疾患或其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。对于接受治疗的受试者而言，该益处要么具有统计学意义，要么至少对于患者或医生而言是可察觉的。

如本文所用的术语“副流感病毒5”(PIV5)包括例如但不限于毒株KNU-11、CC-14、D277、1168-1和08-1990。PIV5基因组的非限制性实例列于GenBank登录号NC_006430.1、AF052755.1、KC852177.1、KP893891.1、KC237065.1、KC237064.1和KC237063.1中，这些登录号特此以引用的方式并入。

如本文所用的术语“表达”是指多核酸转录为mRNA并翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核酸来源于基因组DNA，并且选择了适当的真核宿主细胞或生物体，则表达可包括mRNA的剪接。在本发明的上下文中，该术语还涵盖RSV F基因mRNA和其表达后获得的RSVF蛋白的产生。

如本文所用，术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”是指具有RSV融合蛋白多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。多种RSV融合物和粘附蛋白已被描述，且为本领域技术人员已知的。WO/2008/114149(其以引用的方式整体并入本文)列出了示例性F蛋白变体和G蛋白变体(例如，天然存在的变体)。

描述为构成本公开的各个元素的材料仅是说明性的而非限制性的。旨在本公开的范围内涵盖实现与本文所述材料相同或类似功能的许多合适材料。本文未描述的此类其他材料可包括但不限于例如在本公开开发时间之后开发的材料。

II.CPI-RSV-F组合物

呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科肺病毒属(genus Pneumovirus of thefamily Paramyxoviridae)的成员。人RSV(HRSV)是幼儿严重下呼吸道疾病的主要原因，并且也是造成人大量发病和死亡的原因。RSV也被认为是免疫受损的成人和老年人的重要疾病病原体。由于自然感染后感染宿主对RSV的保护不完全，RSV可能在儿童期和成人期多次感染。

该病毒的基因组由单链负义RNA组成，该单链负义RNA与病毒蛋白紧密缔合以形成核衣壳。病毒包膜由质膜衍生的脂质双层组成，该脂质双层含有病毒编码的结构蛋白。病毒聚合酶与病毒体一起包装，并将基因组RNA转录为mRNA。RSV基因组编码三种跨膜结构蛋白F、G和SH、两种基质蛋白M和M2、三种核衣壳蛋白N、P和L、以及两种非结构蛋白NS1和NS2。

HRSV与感染细胞膜的融合被认为发生在细胞表面，并且是感染早期阶段病毒核糖核蛋白转移到细胞质中的必要步骤。该过程由融合(F)蛋白介导，该融合(F)蛋白还促进感染细胞的膜与邻近细胞的膜融合，以形成特征性的合胞体，这既是一种显著的细胞病变效应，也是病毒传播的另一种机制。因此，中和融合活性对于阻止病毒感染很重要，并且对于宿主免疫也很重要。事实上，针对F蛋白开发的单克隆抗体已被证明中和病毒传染性并抑制膜融合(Calder等人，2000，Virology 271：122-131)。

RSV的F蛋白与其他副粘病毒的F糖蛋白具有相同的结构特征和有限但显著的氨基酸序列同一性。它被合成为574个氨基酸的非活性前体(F0)，在内质网中在天冬酰胺上共翻译糖基化，在内质网中组装成同源低聚物。在到达细胞表面之前，F0前体被蛋白酶从N末端切割为F2，从C末端切割为F1。F2和F1链仍然通过一个或多个二硫键共价连接。

CPI-RSV-F是一种基于副流感病毒(PIV5)的RSV疫苗，其表达RSV F蛋白，在本文中提供作为预防性鼻内疫苗，以预防RSV感染和与RSV感染相关的严重并发症。CPI-RSV-F旨在诱导对RSV的F蛋白的免疫反应，F蛋白是RSV亚型A和B之间高度保守的主要抗原蛋白。抗F抗体可抑制病毒进入宿主细胞，并且根据商业产品帕利珠单抗(RSV F单克隆抗体)的功效数据，RSV F是经过验证的疫苗靶标。

本公开提供了CPI-RSV-F组合物、系统和方法，用于多种应用，包括功能基因组学、药物发现、靶标验证、蛋白质生产(例如，治疗性蛋白质、疫苗、单克隆抗体)、基因治疗和治疗性治疗(诸如癌症治疗)。

A.RSV研究的药理学总结

先前发表的基于PIV5构建体的W3A毒株(该毒株经工程改造以表达RSV-F蛋白)的研究包括对小鼠、棉鼠和非洲绿猴的免疫原性和攻击研究(1，2,3)。作为这些研究的一部分，在棉鼠和非洲猴中证实了PIV5复制的允许性(1，2)。此外，还进行了以下研究：1)比较了基于CPI的载体构建体与基于W3A PIV5毒株的载体构建体；2)比较了表达融合前RSV的疫苗构建体与wt F蛋白代替PIV5 SH基因(ΔSH)或插入PIV5 SH和NH之间(SH-NH)或插入HN和L之间(HN-L)的疫苗构建体。这些研究选择了CPI-RSV-F(CPI-RSV-F)，CPI-RSV-F含有插入SH和HN基因之间的全长RSV F蛋白(图1)，用于初步人体研究。

此外，在小鼠和棉鼠中进行的RSV攻击研究中，已经评估了CPI-RSV-F疫苗的保护功效。与对照相比，基于免疫接种动物的肺和鼻冲洗液中观察到的RSV病毒滴度显著降低，以单次鼻内剂量的免疫接种保护动物免受RSV感染。

利用疫苗载体构建体CPI-RSV-F进行的近期临床前概念验证研究包括Blue LakeBiotechnology Inc.对小鼠和非洲绿猴进行的免疫原性和攻击研究。此外，还总结了由NIH赞助的棉鼠攻击研究中的CPI-RSV-F构建体研究的临床前数据，该研究由Blue LakeBiotechnology Inc.提供疫苗产品。这些近期非临床研究中使用的CPI-RSV-F疫苗使用了先前的疫苗载体构建体(从BHK细胞拯救)，该构建体与用于临床试验材料的载体构建体(从293/Vero细胞拯救)相同，并且同样使用无血清Vero细胞作为底物并用蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)缓冲液配制来产生。这些非临床研究包括W3AΔSH-RSV-F(经工程改造以表达RSV F蛋白的PIV5 W3A毒株)作为活性比较剂。

CIP-RSV-F的1期临床试验证明，RSV疫苗在年轻人(第1组)和老年人(第2组)中的安全性。该疫苗引发血清RSV特异性和鼻IgA抗体反应以及强大的细胞免疫反应(Spearman等人，Sci.Adv.9，eadj7611(2023))。

综上所述，在各种动物模型中的非临床研究已经证明了CPI-RSV-F诱导RSV F特异性免疫反应的能力，如单次鼻内剂量后通过F特异性抗体和细胞介导的反应所观察到的。CPI-RSV-F在这些动物模型中耐受性良好，并且疫苗接种CPI-RSV-F后未观察到致敏迹象。以下总结了最近在小鼠、棉鼠和非洲绿猴中使用CPI-RSV-F疫苗构建体(基于CPIPIV5毒株的疫苗)进行的非临床研究。这些研究包括一个活性比较剂(基于PIV5 W3A毒株的疫苗载体)，其中RSV F蛋白替换SH基因(ΔSH)。有关疫苗载体构建体的更多详细信息，请参见图1。有关使用各种疫苗载体构建体进行的非临床研究的概述，请参见表1。

表1：先前疫苗构建体研究和最近使用CPI-RSV-F构建体的研究的非临床研究概述。

i.小鼠、棉鼠和猴子中表达RSV F蛋白的相关W3A PIV5载体的研究

在Balb/c小鼠中的PIV5(W3A)-RSV-F和RSV-G蛋白研究(3，Phan等人2014)：在本研究中，Balb/c小鼠接受单次鼻内剂量的PIV5-RSV-F(50μl中10⁶PFU剂量)，然后接受RSV攻击。本研究中的PIV5 W3A疫苗载体构建体由插入PIV5 HN和L基因间区域的野生型RSV F蛋白组成。单次鼻内剂量产生的IgG2a/IgG1 RSV反应与免疫接种后第21天野生型RSV A2感染后观察到的反应类似。

在小鼠和棉鼠中的表达野生型或融合前RSVF蛋白的PIV5(W3A)攻击研究(1，Phan等人2017)：本研究评估了通过改变F蛋白插入位置(插入PIV5的SH-HN接合部或用RSV F蛋白基因替换SH)改进的PIV5载体疫苗。此外，本研究评估了野生型(wt)F蛋白或融合前构象F蛋白(pF)。

小鼠以单剂量的以下各项以1x 10⁶PFU鼻内免疫接种：W3AΔSH-RSV-F(RSV F蛋白基因插入PIV5的缺失SH区域)表达野生型F蛋白或融合前稳定的RSV F突变体(W3AΔSH-RSV-pF)或改进的载体W3A-RSV-F SH-HN或W3A-RSV-pF SH-HN(F蛋白基因插入SH-HN接合部)。研究组如下(表2)。

表2：小鼠攻击研究中的研究组

疫苗/途径	动物数量	攻击病毒
			PBS	10	1x10⁶ PFU RSV A/A2
RSV A2	5	1x10⁶PFU RSV A/A2
			W3A(HN-L)-RSV-F，10⁶PFU，i.n.	10	1x10⁶ PFU RSV A/A2
W3A(SH-HN)-RSV-F，10⁶PFU，i.n.	10	1x10⁶ PFU RSV A/A2
			W3A(SH-HN)-RSV-pF，10⁶PFU，i.n.	10	1x10⁶ PFU RSV A/A2
W3AΔSH-RSV-F，10⁶PFU，i.n.	10	1x10⁶ PFU RSV A/A2
			W3AΔSH-RSV-pF，10⁶PFU，i.n.	10	1x10⁶ PFU RSV A/A2

免疫后，观察到体液和细胞介导的免疫反应。使用wt F蛋白的疫苗构建体检测到了最高的中和抗体反应。此外，含有在HN与ΔSH接合之前插入的wt F的疫苗构建体似乎具有最强的免疫原性。各种疫苗构建体的细胞介导免疫反应水平(基于使用ELISPOT的IFN-γ)类似。

小鼠免疫接种后28天接受RSV A2攻击以确定保护功效。在攻击后第4天，只有W3AΔSH-RSV-F组的五只小鼠中的一只小鼠体内发现了攻击病毒，而其他疫苗接种组的小鼠体内均未发现病毒。在PBS对照组中，所有小鼠均恢复了攻击病毒。

在更容易感染RSV的棉鼠中也进行了类似的研究。大鼠使用低剂量10³PFU的含有野生型或灌注稳定的F蛋白(pF)的修饰载体(W3A-RSV-F(SH-HN)、W3A-RSV-pF、W3AΔSH-RSV-F)或10²PFU的W3AΔSH-RSV-pF进行免疫接种。

所有组均观察到免疫反应，包括针对RSV A Tracy毒株(与RSV A/A2毒株97％相同)的中和抗体反应。与小鼠研究类似，用含有wt F蛋白的疫苗构建体免疫接种的组与pF组相比具有更高的抗体水平，其中在HN基因与ΔSH接合之前的F插入具有最高值(滴度大约为128)。对RSV/B/18537的中和抗体滴度显著低于RSV/A Tracy毒株，仅W3A(SH-HN)-RSV-F和W3AΔSH-RSV-F组检测到了显著的抗体水平(滴度大约为8)。在第28天用1.21x10⁵PFU的RSV/A/Tracy进行RSV攻击后，所有疫苗剂量组均观察到鼻冲洗液中RSV病毒负荷减少(减少1.4-1.66Log₁₀)以及肺灌洗液中RSV病毒负荷减少(减少2-3Log₁₀)。从PBS对照组的所有小鼠中均恢复了RSV攻击病毒(大约10⁵PFU/鼻冲洗液，或10⁵PFU/g肺冲洗液)。

总体而言，在小鼠和棉鼠模型中的这些初步研究并未示出融合前F蛋白比野生型F蛋白更具免疫原性和保护性的证据。此外，对于鼻内途径，ΔSH和SH-HN插入载体构建体的载体性能未观察到差异。

使用鼻内和皮下途径的棉鼠中的Sigmovir方案#XV-131研究报告(Phan等人2017)攻击研究：在后续研究(1，Phan等人2017)中，在棉鼠攻击研究中测试了较高剂量10⁵和10⁶PFU的W3A(SH-NH)-RSV-F和对照的功效、免疫原性和安全性，评估了两种不同途径——鼻内(i.n.)和皮下(s.c)。这项研究还包括增强疾病的阳性对照(用FI-RSV免疫接种然后受到RSV攻击的动物，以及由预先感染RSV然后受到RSV攻击的动物组成的阳性对照组。本研究中的动物在第49天接受RSV A2攻击，并在5天后(第54天)进行尸检和组织学。本研究的研究组如下(表3)。

表3：方案#XV-131中的研究组。

疫苗/途径	N＝动物数量	RSV/A2攻击
			PBS i.m.	5	PBS
PBS i.m	5	5Log₁₀ PFU
			FI-RSV i.m	5	5Log₁₀ PFU
RSV/A2活，i.n.(阳性对照)	5	5Log₁₀ PFU
			W3A(SH-HN)-RSV-F，10⁵PFU i.n.	5	5Log₁₀ PFU
W3A(SH-HN)-RSV-F，10⁵PFU s.c	5	5Log₁₀ PFU
			W3A(SH-HN)-RSV-F，10⁶PFU s.c	5	5Log₁₀ PFU
W3AΔSH-RSV-F，10⁵PFU i.n.	5	5Log₁₀ PFU
			W3AΔSH-RSV-F，10⁵PFU s.c.	5	5Log₁₀ PFU
W3AΔSH-RSV-F，10⁶s.c.	5	5Log₁₀ PFU

免疫原性：W3A(SH-HN)-RSV-F在10⁵和10⁶剂量下在i.n组和s.c组之间产生类似的中和抗体滴度。W3AΔSH-RSV-F疫苗接种诱导的中和抗体滴度在i.n组中与s.c组相比略高，其中10⁶剂量的滴度略高，尽管并不具有统计学意义。

功效：W3A(SH-HN)-RSV-F通过i.n或s.c施用对下呼吸道提供完全保护。动物上呼吸道的病毒负荷也显著更低。

与用PBS假免疫接种的对照动物(平均滴度为10⁵PFU)相比，W3A(SH-HN)-RSV-F疫苗接种通过s.c施用在下呼吸道产生完全保护，通过i.n施用几乎产生完全保护，这是基于在肺和鼻冲洗液中观察到的滴度降低(平均滴度为10³PFU)。

安全性：检查了不同组的肺切片，以确定是否有肺部炎症的特征：细支气管周围炎、血管周围炎、间质性肺炎和肺泡炎，并进行评分以确定严重程度。在FI-RSV免疫接种、RSV攻击组(阳性对照组)中观察到最大的病变。在用W3A-RSV-F(SH-HN)或W3AΔSH-RSV-F(鼻内或皮下)免疫接种的组中，肺部变化中等，其水平低于在RSV免疫接种、RSV攻击的阳性对照组中观察到的水平，并且与在PBS假免疫接种、RSV攻击的组中观察到的水平类似。

通过定量实时PCR(qPCR)测量攻击后5天肺组织中的细胞因子水平并未表明感染增强的可能性。IL-4mRNA水平仅在FI-RSV疫苗接种组中显著升高，这与组织病理学结果和增强的疾病表型一致。IFNγ-mRNA水平在假免疫接种组和FI-RSV免疫接种组中最高。使用基于PIV5的候选物免疫接种的组和RSV免疫接种组的IFN-mRNA水平类似地较低。各组IL-2mRNA水平类似，但FI-RSV免疫接种组的平均IL-2水平显著高于其他组。

免疫接种后第28天，用RSV A2(50μl中10⁶PFU)对免疫接种小鼠进行鼻内攻击后，攻击后第4天获得的肺切片显示，与RSV-A2免疫接种小鼠相比，肺病变没有加剧。观察保护性免疫，如通过肺组织中的病毒负荷所评估(每组n＝5只小鼠)。

在棉鼠和非洲绿猴中的表达RSV F或G蛋白的PIV5(W3A)攻击研究(2，Wang等人2017)：本研究评估了PIV5载体RSV F蛋白在棉鼠和非洲绿猴中的复制、免疫原性和保护免受RSV攻击的功效。在本研究中，将F蛋白插入PIV5 HN和L基因的基因间区域。

PIV5在棉鼠和非洲绿猴中的复制允许性：将1x10⁵PFU的PIV5以10μl或100μl的体积鼻内接种到棉鼠(每组n＝4)中。在第4天时在鼻子匀浆中观察到病毒滴度(上升1x10⁴PFU)，到第6天时病毒滴度几乎消失。较大的接种量(100μl)导致在第6天时在所有动物的肺中观察到疫苗病毒，而仅在接种了较小体积10μl的一只动物中观察到了这种病毒。

为了评估PIV5在非洲绿猴中的允许性，对60只动物进行了抗PIV5抗体筛选，并且发现全部为阴性。动物(每组n＝3)鼻内感染0.25mL剂量体积中的1x10²多至1x10⁸PFU的PIV5。在第3、5、7、10和14天对鼻洗液和支气管肺泡洗液进行病毒脱落评估。病毒从鼻子和肺脱落，持续长达10天，剂量低至1x10²PFU时，病毒复制在第5天达到峰值。此数据表明非洲绿猴对PIV5的允许性。

单剂量对照后棉鼠和非洲绿猴中的免疫原性：用1x10³、1x10⁴、1x10⁵和1x10⁶PFU的W3A-RSV-F(SH-HN)对棉鼠进行鼻内免疫接种。在所有剂量水平下，第28天均观察到IgG抗体反应，并且每个剂量组的反应相当。所有剂量组均观察到中和抗体，滴度范围为64至256(NT50％)。此外，接种后第21天，所有剂量组的肺匀浆中均观察到IgA反应。

非洲绿猴(PIV5和RSV血清阴性)接受1x10⁴或1x10⁶PFU W3A-RSV-F(SH-HN)单次鼻内免疫接种。接种后第21天获得的血清显示出高滴度的F特异性抗体反应。此外，在第21天观察到低水平的中和抗体反应(NT50％，1x10⁶PFU剂量组中52)。免疫接种后21天获得的鼻拭子显示出显著水平的F蛋白IgA反应。通过γ干扰素评估的细胞介导反应显示，1x10⁶PFU剂量组的反应水平较低。

接受RSV攻击的棉鼠和非洲绿猴中的保护作用：用1x10³至1x10⁶PFU W3A-RSV-F(SH-HN)范围内的单剂量鼻内免疫接种的棉鼠在免疫接种后第28天接受RSV A2毒株攻击。通过测量鼻子和肺组织中的病毒负荷来评估保护。病毒负荷以剂量依赖性方式降低，1x10⁶PFU组除外，该组相对于1x10³PFU组显示出更高的水平，但与对照组相比仍然降低。在1x10⁵剂量组中，肺中未检测到病毒，但在鼻子中观察到滴度降低(3log₁₀级)。

用1x10⁴或1x10⁶PFU W3A-RSV-F(SH-HN)免疫接种的非洲绿猴在免疫接种后28天接受RSV A2攻击。攻击后第3-14天对鼻和BAL样品进行了RSV病毒负荷评估。用对照免疫接种并未缩短病毒脱落时间，然而，两个剂量组的峰值病毒RSV负荷均减少了10至100倍，其中在1x10⁶PFU剂量组中观察到最高减少。

在RSV暴露非洲绿猴中对对照的反应：先前暴露于RSV不会影响非洲绿猴(通过鼻内感染RSV A2发生血清转化)提高RSV中和抗体滴度(增加50倍)的能力。

W3A-RSV-F(SH-HN)免疫接种的棉鼠在RSV攻击后的肺病理学：在第0天用剂量1x10⁶PFU W3A-RSV-F免疫接种并在第49天用RSV A2攻击的动物中，对攻击后五天获得的肺进行组织病理学盲检，以检查肺泡炎、间质性肺炎、血管周围炎和支气管周围炎，并与获自接种有福尔马林灭活RSV的对照动物的肺进行比较。接种有福尔马林灭活RSV的阳性对照动物的评分显著高于PBS对照动物，但没有高于W3A-RSV-F(SH-HN)动物的评分(ANOVA配对t检验)。

B.副流感病毒5(PIV5)

副流感病毒5(PIV5)是一种负链RNA病毒，是副粘病毒科腮腺炎病毒属(Rubulavirus genus)的成员，该副粘病毒科包括许多重要的人和动物病原体，诸如腮腺炎病毒、2型和4型人副流感病毒、新城疫病毒、仙台病毒、HPIV3、麻疹病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒和呼吸道合胞病毒。PIV5先前被称为猿猴病毒-5(SV5)。尽管PIV5是一种感染多种动物和人的病毒，但人中尚未发现与PIV5相关的已知症状或疾病。与大多数副粘液病毒不同，PIV5感染正常细胞时几乎没有细胞病变效应。作为负链RNA病毒，PIV5的基因组非常稳定。由于PIV5在其生命周期中没有DNA阶段并且仅在细胞质中复制，因此PIV5无法整合到宿主基因组中。因此，使用PIV5作为载体会避免宿主细胞DNA的遗传修饰可能造成的意外后果。PIV5可在细胞中生长到高滴度，包括已被WHO和FDA批准用于疫苗生产的Vero细胞。因此，PIV5作为疫苗载体呈现许多优势。

本发明的基于PIV5的疫苗载体可基于多种野生型、突变型或重组(rPIV5)毒株中的任一种。野生型毒株包括但不限于PIV5毒株W3A、WR(编号VR-288TM)、犬副流感病毒毒株78-238(ATCC编号VR-1573)(Evermann等人，1980，J Am Vet Med Assoc；177：1132-1134；和Evermann等人，1981，Arch Virol；68：165-172)、犬副流感病毒毒株D008(ATCC编号VR-399)(Binn等人，1967，Proc Soc Exp Biol Med；126：140-145)、MIL、DEN、LN、MEL、隐病毒、CPI+、CPI-、H221、78524、T1和SER。参见例如，Chatziandreou等人，2004，J Gen Virol；85(Pt 10)：3007-16；Choppin，1964，Virology：23：224-233；和Baumgartner等人，1987，Intervirology；27：218-223。另外，可以使用商业犬舍咳疫苗中使用的PIV5毒株，诸如例如BI、FD、Merck和Merial疫苗。

C.PIV5 CPI毒株载体骨架

PIV5 CPI毒株载体骨架与PIV5 W3A毒株载体骨架的不同之处如下：最显著的差异在于CPI毒株的PIV5 F蛋白，其由作为其细胞质尾的一部分的额外的22个氨基酸延伸组成。F蛋白的延伸被认为会抑制病毒的融合性质(5，6)。与没有延伸的PIV5 F蛋白尾且与CPI相比具有额外氨基酸差异的基于W3A的病毒相比，基于CPI的病毒溶解性更强，且在感染细胞中可产生更多的子代病毒(4)。

i.PIV5 CPI载体RSV构建体

本发明的PIV5疫苗载体可使用多种方法中的任一种来构建，包括但不限于在He等人(Virology；237(2)：249-60，1997)中更详细描述的反向遗传学系统。PIV5编码八种病毒蛋白。核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大RNA聚合酶(L)蛋白对病毒RNA基因组的转录和复制很重要。V蛋白在病毒发病机制以及病毒RNA合成中发挥重要作用。融合(F)蛋白是一种糖蛋白，它以不依赖pH的方式介导细胞至细胞和病毒至细胞的融合，这对于病毒进入细胞至关重要。F蛋白的结构已被确定，并且已识别出有效融合的关键氨基酸残基。血凝素神经氨酸酶(HN)糖蛋白也参与病毒进入宿主细胞和从宿主细胞释放。基质(M)蛋白在病毒组装和出芽中起重要作用。疏水(SH)蛋白是一种44个残基的疏水性整合膜蛋白，并且位于膜中，其N末端位于细胞质中。有关副粘病毒的分子生物学的综述，请参见例如Whelan等人，2004，Curr Top Microbiol Immunol；283：61-119；和Lamb&Parks，(2006).Paramyxoviridae：theviruses and their replication.In Fields Virology，第5版，第1449-1496页.D.M.Knipe&P.M.Howley编辑.Philadelphia，PA：Lippincott Williams&Wilkins。

此前，已生成表达来自多种病原体(包括流感、狂犬病、呼吸道合胞病毒、结核病、伯克氏菌属(Burkholderia)和MERS-CoV)的外源基因的重组PIV5病毒，并将其作为疫苗候选进行测试(Li，Z.，等人，JVirol，87(1)：354(2013)；Chen，Z.，等人，J Virol，87(6)：2986(2013)；Wang，D.，等人，J Virol，91(11)(2017)；Chen，Z.，等人，Vaccine，33(51)：7217(2015)；Lafontaine，E.R.，等人，Vaccine X.，1：100002(2018)；Li，K.，等人，mBio，11(2)(2020))。由于PIV5载体疫苗在鼻内免疫接种后会在呼吸道中主动复制，因此它可产生粘膜免疫，包括抗原特异性IgA抗体和长寿IgA浆细胞(Wang，D.，等人，J Virol，91(11)(2017).Xiao，P.，等人，Front Immunol,.12：623996(2021))。

在一个实施方案中，本文中提出的CPI-RSV-F疫苗药物物质(CPI-RSV-F)包含基于PIV5的CPI毒株的活重组PIV5载体病毒，其表达RSV的野生型F蛋白(F蛋白序列基于GenBank登录号FJ614814J，SV A2毒株)，并针对在人中表达进行了密码子优化(图7)。野生型RSV F蛋白插入PIV5 SH和NH区域之间(图1)。

ii.CPI-RSV-F疫苗构建体的免疫原性和攻击研究

在非临床研究中，单次i.n.剂量后，发现单剂量的CPI-RSV-F在小鼠、棉鼠和AGM中具有免疫原性，剂量水平范围为10⁴至10⁶PFU。检测到了F特异性血清免疫反应和细胞介导的反应。证实了PIV5载体在棉鼠和AGM中复制的能力。

单次i.n.剂量的CPI-RSV-F或相关疫苗构建体能够在使用RSV A2作为攻击的各种动物攻击模型(小鼠、棉鼠和AGM)中防止感染。功效是基于攻击后在肺和鼻冲洗液中观察到的病毒负荷与对照动物中观察到的病毒负荷相比的降低。

在用于提出的第1阶段研究CPI-RSV-F的CPI-RSV-F载体构建体的棉鼠攻击模型中未观察到增强的疾病/肺病理学。该结论是基于与接种有福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)并用RSV攻击的阳性对照动物相比，观察到的肺组织中的细胞因子概况(IL-4反应没有增加)。类似地，在先前发表的小鼠、棉鼠和AGM的攻击研究中，评估了在PIV5W3A内不同位置处插入F蛋白的各种基于W3A的载体构建体，没有观察到增强的疾病/肺病理的迹象。

考虑到也能够在与W3A构建体类似的剂量水平下诱导保护性免疫反应(尽管对W3A的免疫反应似乎略高)，因此选择CPI-RSV-F而不是W3A进行初步临床评估。此外，相同CPIPIV5骨架经工程改造以表达SARS-CoV-2的S蛋白，也正在根据交叉引用的IND 027418进行临床评估。迄今为止利用该相关载体构建体获得的临床前数据和有限的临床数据显示，当以10⁶PFU的单次鼻内剂量向18-55岁健康成人施用时，具有良好的安全性概况。

III.BLB基因组序列

本文提供了CPI-RSV-F基因组序列。

A.CPI-RSV-F基因组序列

i.CPI-RSV-F 5’至3’

本文提供了CPI-RSV-F 5′-3′核酸序列。

IV.治疗方法

本公开可用于基因疗法和/或涉及宿主细胞中感兴趣的核苷酸序列的增加或减少的用于治疗疾病的治疗方法。在这些实施方案中，可表达的异源核苷酸序列可来源于哺乳动物基因组。在一些实施方案中，具有来源于人基因组的可表达异源核苷酸序列可能特别有用，其中野生型RNA和/或蛋白质的表达可在患者中产生治疗效果。例如，可表达的异源核苷酸序列可编码CFTR、NeuroD1、Cas9和指导RNA，或任何其他此种序列。在其他实施方案中，异源核苷酸序列编码分泌蛋白质。

在其他实施方案中，可表达的异源核苷酸序列对正向选择刺激作出反应。在其他实施方案中，可表达的异源核苷酸序列也对负向选择刺激作出反应。在进一步的实施方案中，多核苷酸序列进一步包含报告基因可是有用的。例如，报告基因可是荧光素酶或绿色荧光蛋白。

V.施用方法

A.通过疫苗接种施用

本发明包括通过向受试者施用如本文所述的病毒表达载体、病毒颗粒或组合物来对受试者进行疫苗接种的方法。

本发明提供了由经工程改造以表达RSV F蛋白作为靶抗原的犬副流感病毒(CPI)组成的基于重组PIV5的活疫苗，以开发CPI-RSV-F疫苗作为针对RSV感染的新型预防性疫苗。

i.鼻内疫苗接种

在一个实施方案中，所公开的CPI-RSV-F组合物被配制以允许鼻内施用。已经进行了大量非临床研究，以评估使用鼻内(i.n.)途径在各种动物模型中表达RSV F蛋白的CPI-RSV-F或非常密切相关的疫苗构建体(例如基于W3A PIV5的构建体)的免疫原性和功效。这包括小鼠、棉鼠和非洲绿猴(AGM)中的早期开发研究，评估载体构建体(F蛋白在载体中的位置)和RSV F蛋白插入物(野生型或融合前F蛋白)的变化。我们总结了这些研究的发现，并将出版物特此通过并入包括在内。

鼻内组合物可包括包含治疗剂的可吸入干粉药物制剂，其中治疗剂以游离碱或盐和游离碱的混合物的形式存在。本文公开的药物制剂可配制成适合于气道施用，例如鼻、鼻内、窦状腺(sinusoidal)、经口和/或肺部施用。通常，制剂的生产方式是使其具有气道施用途径或目标的适当粒度。因此，可生产本文公开的制剂以具有确定的粒度分布。

例如，用于鼻内施用的治疗剂的盐形式的粒度分布可在约5μm至约350μm之间。更具体地，治疗剂的盐形式对于鼻内施用可具有约5μ至约250μm、约10μm至约200μm、约15μm至约150μm、约20μm至约100μm、约38μm至约100μm、约53μm至约100、约53μm至约150μm或约20μm至约53μm之间的粒度分布。本发明的药物组合物中的治疗剂的盐形式对于鼻内施用而言可具有小于约200μm的粒度分布范围。在其他实施方案中，药物组合物中治疗剂的盐形式的粒度分布小于约150μm、小于约100μm、小于约53μm、小于约38μm、小于约20μm、小于约10μm或小于约5μm。本发明的药物组合物中的治疗剂的盐形式对于鼻内施用可具有大于约5μm、大于约10μm、大于约15μm、大于约20μm、大于约38μm、小于约53μm、小于约70μm、大于约100μm或大于约150μm的粒度分布范围。

此外，本发明的药物组合物中的治疗剂的盐形式对于肺施用可具有约1μm至约10μm之间的粒度分布范围。在用于肺施用的其他实施方案中，粒度分布范围在约1μm至约5μm，或约2μm至约5μm之间。在其他实施方案中，治疗剂的盐形式具有至少1μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、至少5μm、至少10μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm或至少100μm的平均粒度。

在一些实施方案中，所公开的大麻素组合物包括一种或多种大麻素或其药学上可接受的衍生物或盐、推进剂、醇和二醇和/或二醇醚。该醇可是一元醇或多元醇，且优选地为一元醇。一元醇的粘度比二醇或二醇醚低。因此，与不存在一元醇的组合物相比，该组合物能够形成直径更小的液滴。本发明人意外地发现，一元醇与二醇或二醇醚的特定比率可产生具有长期稳定性(例如，该组合物在2-40℃的温度下保持单相持续至少一周)和小液滴大小的所需组合的组合物。

a.小鼠下呼吸道中的疫苗免疫原性和保护

一个实施方案提供了鼻内施用的候选疫苗病毒，其在CHD03和CHD04研究中均引发高水平的抗F血清抗体。在W3AΔSH-RSV-F疫苗接种的动物中，CHD03的RSV F抗体滴度的几何平均滴度为3.1Log₁₀/mL，而CHD04的RSV F抗体滴度的几何平均滴度为3.4Log₁₀/mL。在CPI-RSV-F疫苗接种的动物中，CHD03的几何平均滴度为3.0Log₁₀/mL，而CHD04的几何平均滴度为3.2Log₁₀/mL。这些值彼此之间没有统计学意义，并且与RSV_rA2阳性对照组的值类似。两种疫苗病毒也引发了RSV F蛋白特异性细胞反应，如通过IFN-γ分泌细胞所衡量。在CHD03中，W3AΔSH-RSV-F的几何平均值为每10⁶个脾细胞有28个IFN-γ分泌细胞，而CPI-RSV-F的几何平均值为23个IFN-γ分泌细胞。在CHD04中，W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F的几何平均值分别为每10⁶个脾细胞有35个IFN-γ分泌细胞和48个IFN-γ分泌细胞。这些值与PBS对照组相比具有统计学意义，但与疫苗接种组或RSV_rA2阳性对照组相比没有差异。CHD04中CPI-RSV-F组的IFN-γ分泌细胞显著高于阳性对照。与CHD03和CHD04中的PBS对照组相比，W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F的RSV攻击病毒滴度均显著更低。对于W3AΔSH-RSV-F，该值为1.35Log₁₀ PFU/g和1.37Log₁₀ PFU/g，并且对于CPI-RSV-F，该值为1.48Log₁₀PFU/g和1.40Log₁₀ PFU/g(分别对于CHD03和CHD04)，而PBS对照组则为3.21Log₁₀ PFU/g和3.33Log₁₀PFU/g。RSV_rA2阳性对照组在CHD03中的值为1.39Log₁₀ PFU/g，而在CHD04中的值为1.32Log₁₀ PFU/g，与感兴趣的疫苗组类似。

总体而言，本文呈现的结果表明，W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F以及其他两种候选药物(W3A-RSV-F(SH-HN)和CPIΔSH-RSV-F)以10⁵PFU的剂量水平鼻内施用，可诱导相当的RSV特异性免疫反应，并显著保护BALB/c小鼠的下呼吸道免受RSV攻击病毒复制。

b.使用RSV A/A2病毒株在棉鼠病毒攻击模型中对基于PIV5的CPI毒株的PIV5ΔSH-RSV-F疫苗进行临床前测试。与基于PIV5 W3A的PIV5ΔSH-RSV-F疫苗的比较。

在RSV A/A2攻击的棉鼠Sigmodon hispidus模型中评估了基于PIV5的CPI毒株或W3A毒株的RSV F蛋白疫苗候选(分别为CPI-RSV-F和W3AΔSH-RSV-F)的功效和安全性。首先用100μl含有10⁴、10⁵或10⁶PFU病毒的基于PIV5的疫苗对动物进行鼻内免疫接种，然后在四周后用10⁵PFU RSVA/A2攻击。一次感染对照组用PBS进行模拟免疫接种，然后用RSV A/A2感染。二次感染对照组感染RSV A/A2，且七周后再次感染。疫苗增强疾病对照组用FI-RSV免疫接种两次，间隔四周，且于第二次免疫接种后三周感染RSV。RSV攻击后五天处死动物以采集样品。测量了RSV在肺和鼻子中的复制、肺组织病理学、肺细胞因子和RSV NS1 mRNA表达以及RSV血清中和抗体(NA)和抗F蛋白结合抗体滴度。为了确认PIV5疫苗在棉鼠的呼吸道中的复制，将3只动物的各组鼻内接种10⁶PFU的CPI-RSV-F或W3AΔSH-RSV-F，并在四天后处死。这些样品被提交用于斑块测定评估。简而言之，发现两种候选疫苗病毒都能在棉鼠的上呼吸道和下呼吸道中有效复制。W3AΔSH-RSV-F疫苗病毒在上呼吸道的复制水平比CPI-RSV-F更高，但在下呼吸道的复制水平比CPI-RSV-F更低。

如斑块测定和qPCR所表明，CPI-RSV-F和W3AΔSH-RSV-F疫苗均高效保护棉鼠的肺，在所有测试的疫苗剂量下均诱导近乎无菌的免疫力。两种疫苗的所有剂量也都对鼻子产生了具有统计学意义的保护，与CPI-RSV-F免疫接种相比，W3AΔSH-RSV-F更强。

在测试的所有三种疫苗剂量下，W3AΔSH-RSV-F都将鼻病毒负荷降低到几乎无法检测到的水平。对于CPI-RSV-F，10⁶PFU剂量诱导的保护最强，其次是10⁵PFU和10⁴PFU剂量。CPI-RSV-F和对照疫苗均诱导了强烈的NA反应，在测试的所有三种剂量中，对照诱导的NA滴度高于以最高剂量(10⁶PFU)施用的CPI-RSV-F。较低剂量的CPI-RSV-F会诱导较弱的NA^-反应。CPI-RSV-F和W3AΔSH-RSV-F免疫接种均诱导高水平的结合IgG，其中W3AΔSH-RSV-F疫苗接种的结合IgG水平略高。除了用中等剂量(10⁵PFU)的W3AΔSH-RSV-F免疫接种的一只动物外，其他疫苗均未诱导出在FI-RSV免疫接种动物中观察到的肺组织病理学或IL-4mRNA表达水平。总体而言，在测试的所有剂量中，W3AΔSH-RSV-F疫苗在鼻保护和中和抗体反应方面的功效似乎都超过了CPI-RSV-F。将W3AΔSH-RSV-F的剂量从10^4PFU增加到10⁶PFU在提高疫苗功效方面没有明显的优势。

ii.肺组合物

一个实施方案提供了一种通过吸入或肺施用治疗肺系统中的SARS-CoV-2的制剂和方法。选择特定药物制剂通过肺组织的扩散特性以获得待治疗组织中的有效浓度和有效停留时间。可增加或减少剂量，或增加或减少给予频率以达到选定的血液水平。另外，优选控制施用时间和制剂的量，以优化所施用制剂对待治疗的组织的治疗效果和/或滴定至特定的血液水平。

还可通过添加到制剂中的各种赋形剂来改变在肺组织中的扩散，以减缓或加速药物到肺组织的吸收。例如，该药物可与表面活性剂诸如磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油组合。这些药物还可与支气管扩张剂一起使用，可放松支气管气道并使抗肿瘤药物更容易进入肺。沙丁胺醇是后者的一个实例，本领域中还有许多其他已知的药物。此外，该药物可与生物相容性聚合物、胶束形成结构或环糊精复合。

本实例中使用的气雾化药物的粒度经测量约为1.0-5.0μm，GSD小于约2.0，以沉积在肺的中央和周围区室内。如本文其他地方所述，粒度的选择取决于药物颗粒在呼吸道内所需沉积的部位。

可在本发明中使用的气雾剂包括水性媒介物，诸如含有或不含有乙醇的水或盐水，并且可含有防腐剂或抗菌剂，诸如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯等，和/或稳定剂诸如聚乙二醇。

可在本发明中使用的粉末包括纯药物的制剂或药物与赋形剂或载剂(诸如甘露醇、乳糖或其他糖)组合的制剂。本文使用的粉末有效地悬浮在载剂气体中以便施用。或者，可以将粉末分散在含有气体或气体混合物的腔室中，然后由患者吸入。

本公开的剂可一次施用，或者可分成多个剂量以时间间隔施用。例如，本发明的剂可以重复施用，例如至少2、3、4、5、6、7、8次或更多次，或者可通过连续输注施用。应当理解，精确的剂量和治疗持续时间取决于所治疗的疾病，并且可通过使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据推断来在经验上确定。值得注意的是，浓度和剂量值也可能随着要缓解的疾患的严重程度而变化。还需要理解，对于任何具体受试者，应当随着时间根据个体需求以及施用组合物或监管组合物施用的人的专业判断来调节具体剂量方案，本文所列的任何浓度范围仅仅是示例性的，并不意在限制所要求保护的组合物和方法的范围或实践。

在一些治疗实施方案中，剂的“有效量”是导致至少一种病理参数减少的量。因此，例如，在本公开的一些方面中，有效量是与未用该剂治疗的个体中参数的预期降低相比，有效实现至少约10％、至少约15％、至少约20％或至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的降低的量。

在一些方面中，WO 2013/112690和WO 2013/112720(其特此以引用的方式整体并入本文)中描述的任何基于PIV5的构建体和方法均可用于本发明。

如本文所用的术语“受试者”表示生物体，包括例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物和其他非人脊椎动物。受试者可是“个体”、“患者”或“宿主”。非人脊椎动物包括家畜动物(诸如但不限于牛、马、山羊和猪)、家养宠物或伴侣动物(诸如但不限于狗或猫)和实验动物。非人受试者还包括非人灵长类动物以及啮齿动物，诸如但不限于大鼠或小鼠。非人受试者还包括但不限于家禽、马、牛、猪、山羊、狗、猫、豚鼠、仓鼠、水貂和兔。

如本文所用的“体外”为在细胞培养物中，而“体内”为在受试者体内。如本文所用，“分离的”是指已经从其自然环境(例如，如果是天然存在的，则是自然环境)中取出、使用重组技术产生、或化学或酶促合成，并且因此“通过人工”从其天然状态改变的材料。

实施例

实施例1：CPI-RSV-F在非洲绿猴(AGM)中的免疫原性(非GLP研究)

目的：比较单剂量鼻内施用CPI-RSV-F和W3AΔSH-RSV-F在非洲绿猴模型中的免疫原性。

方法

每个剂量组的四只猴子在第0天用10⁶PFU的CPI-RSV-F(第6组)或对照(第1组)鼻内免疫接种。

结果

如表4所示，通过ELISA测定(用重组RSV F蛋白包被的板，来源：SinoBiologicals：11049-V088 LC120C 2910，或PIV5野生型病毒)确定了第28天对RSV F蛋白和PIV5载体的抗体反应。总之，所有动物都产生了针对由CPI或W3AΔSH载体表达的F蛋白的抗体，两组之间的RSV F ELISA滴度相当。

表4：AGM研究中对RSV F和PIV5的血清抗体反应。

细胞介导的反应：通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定评估RSV F蛋白特异性细胞反应。免疫接种后，在第-1、14和28天采集血液，以量化RSV F蛋白特异性CD4和CD8细胞反应。对INFγ、TNFα、MIP-1b、IL-13和CD107a阳性细胞进行量化(参见图1A-1B)。免疫接种前第-1天采集的PBMC未能按预期对RSV F肽刺激作出反应。免疫接种后，用W3AΔSH-RSV-F(第1组)和CPI-RSV-F(第6组)免疫接种的AGM产生了CD4和CD8细胞反应，这些反应是RSV F蛋白特异性的，如在第14天和第28天所评估。在对照动物中未检测到F特异性细胞反应(数据未显示)，而用W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F免疫接种的动物的细胞反应在免疫接种后第14天至第28天增加(图1A-1B)。在第14天，W3AΔSH-RSV-F引发的CD4反应低于CPI-RSV-F，但差异并不具有统计学意义。免疫接种后第28天，W3AΔSH-RSV-F诱导的CD4反应比CPI-RSV-F更高，但这种差异也并不具有统计学意义。W3AΔSH-RSV-F引发的CD8特异性反应高于CPI-RSV-F，但第14天(P＝0.0883)或第28天的差异并不具有统计学意义。

CPI-RSV-F和W3AΔSH-RSV-F均引发针对RSV F蛋白的免疫反应。单次鼻内剂量10⁶PFU后，CPI-RSV-F或W3AΔSH-RSV-F引发的针对RSV F蛋白的抗体反应相当。CPI-RSV-F引发的CD4和CD8细胞反应略低于W3AΔSH-RSV-F，但差异并不具有统计学意义。

实施例2：制造过程和过程控制

步骤1：疫苗载体构建

pCVL41(CPI-RSV-F)反基因组cDNA的构建：通过RsrII和AatII限制性内切酶消化pSP28质粒，获得CPI-RSV-Fopt基因组。pSB28是一个低拷贝质粒，在CPI反基因组cDNA的SH和HN接合部之间插入了密码子优化的RSV F蛋白基因(Fopt，序列基于GenBank AccessionM74568，RSV A2毒株，针对人进行密码子优化)(图2A)(3)。pAB94质粒是一个高拷贝质粒，在CPI反基因组cDNA的SH和HN接合部之间插入了EGFP基因(图2B)。将RsrII和AatII限制性内切酶消化的CPI-RSV-Fopt中的Fopt基因插入RSrII和AatII消化的pAB94中，以使用T4 DNA连接酶用Fopt替换EGFP基因。

将连接好的cDNA转化TOP10感受态细胞，在含有氯霉素的LB培养基中生长出单菌落。

所得质粒DNA(指定为pCVL41或pCPI-RSV-Fopt；图3)通过Qiagen miniprep试剂盒纯化并进行测序。通过桑格测序(Sanger sequencing)证实，插入SH和HN基因接合部的密码子优化的RSV-F基因是正确的。

步骤2：疫苗载体拯救

对用于产生CPI-RSV-F(CPI-RSV-F)的重组载体病毒进行了拯救。为了拯救重组CPI-RSV-F病毒，将pCPI-RSV-Fopt质粒与编码PIV5 NP、P、L蛋白和T7 RNA聚合酶的质粒一起转染到无血清293T悬浮细胞(从GenHunter Corporation获得)中，从而可从转染的细胞培养物中拯救重组病毒(图4)。

编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)或大聚合酶蛋白(L)的支持性PIV5质粒克隆此前已有描述(1，2)，每个基因均位于pCAGGS载体中的T7启动子下。以下5种质粒用于产生CPI-RSV-FRVS。

1.pCPI-RSV-Fopt(pCVL41-CPI-RSV-F反基因组cDNA)：该质粒为高拷贝质粒，且含有氨苄青霉素抗性基因。该质粒编码插入犬副流感病毒(CPI)的SH和HN基因接合部之间的RSV F抗原基因。

2.pCAGGS-NP质粒：该质粒含有T7启动子下的PIV5 NP基因，并具有氨苄青霉素抗性基因。

3.pCAGGS-P质粒：该质粒含有T7启动子下的PIV5 P基因，并具有氨苄青霉素抗性基因。

4.pCAGGS-L质粒：该质粒含有T7启动子下的PIV5 L基因，并具有氨苄青霉素抗性基因。

5.pCAGGS-T7质粒(与pBH437-T7相同)：该质粒编码SV40启动子下的T7 RNA聚合酶基因。

用于病毒拯救的培养基是含有4mM GlutaMAX(Gibco)的CDM4HEK293培养基(Hyclone)。

孵育两天后，将293T细胞与由Vero MCB细胞(获自CRL：非洲绿猴肾(WHO Vero 10-87)CyanVac MCB DOM：19AUG2020-P148)传代的无血清Vero细胞(P159)一起共培养。孵育4天后，取2mL的含有拯救病毒的上清液，与10XSPG混合，并且储存在-80℃下。

步骤3：斑块纯化和病毒拯救种子的扩增

将含有拯救病毒的冷冻原液的等分试样连续稀释，在6孔板中对无血清Vero细胞(P155-来源于WHO Vero 10-87CyanVac MCB DOM：19AUG2020)进行斑块测定，目的是获得6个分离的单个斑块。使用1000μL移液器尖头戳破单个斑块，并且将其重悬于含有4mMGlutaMAX的VP-SFM培养基中。然后使用重悬的斑块感染6孔板中的新鲜无血清Vero细胞(P155-来源于WHO Vero 10-87 CyanVac MCB DOM：19AUG2020)。6天后，将感染单个斑块的6孔板的上清液(2mL)与10％10XSPG混合，并储存在-80℃下(以产生1X SPG)。该材料指定为Lot#CPI-RSV-F-PP1-PQ10-42621，制造日期为2021年4月6日)。部分上清液(140μL)用于RNA提取和RT-PCR以验证病毒基因组序列。使用表5中描述的引物进行RT-PCR。

表5：用于扩增病毒cDNA以对CPI-RSV-F反基因组cDNA进行测序的引物

步骤4：在无血清Vero细胞上制造prMVS(Lot#210519MCBC HD-PQ10)

使用来自Lot#CPI-RSV-F-PP1-PQ10-42621(斑块纯化病毒)的等分试样感染T75烧瓶中的无血清Vero细胞(P159，来源于WHO Vero10-87 CyanVac MCB DOM：19AUG2020)，在37℃下孵育5天，并且将细胞培养上清液在4℃下以1，500rpm离心10分钟，以去除细胞碎片。将澄清的上清液(20mL)与含有10％精氨酸的10％10X SPG(Sigma Aldrich)混合，以1mL等分试样快速冷冻，并作为前MVS库储存在-80℃下。该前MVS指定为Lot#210519MCBCHD-PQ10。对前MVS从NP基因到L基因进行测序，以确认病毒基因组序列和RSV F蛋白的正确插入(在NP的AA54中发现了单个沉默突变)。

在用于cGMP生产MVS之前，在CRL对前MVS(Lot# 210519MCBCHD-PQ10)进行了无菌性(直接法)、抑菌和抑真菌、支原体、分枝杆菌、猪和牛圆环病毒的存在以及明显病毒的测试。

使用免疫荧光测定(IFA)针对前MVS和MVS库评估了CPI-RSV-F疫苗载体构建体感染Vero细胞和表达功能性F-蛋白(包括融合前F蛋白)的能力，如下所述。此外，通过桑格方法对前MVS和MVS进行测序，以确认PIV5病毒骨架中存在正确的F蛋白基因插入物(从前导区到尾随区测序)。

对Lot# 210519MCBCHD-PQ10)的前MVS进行了以下特性测试。

通过IFA得到的感染的Vero细胞中CPI-RSV-F前MVS表达的F蛋白：通过对PIV5载体(HN)和RSV F蛋白进行IFA染色来评估CPI-RSV-F表达的F蛋白，使用帕利珠单抗，帕利珠单抗是一种人源化鼠单克隆抗体，可识别呼吸道合胞病毒(RSV)F糖蛋白的融合前(前F)和融合后(后F)构象上的抗原位点II。通过计算对PIV5(HN蛋白)染色呈阳性，也对F蛋白染色呈阳性的细胞数量来确定F表达百分比(图5A-5C和表6)。

表6：CPI-RSV-F前MVS共表达百分比。

Vero-SF细胞被稀释10倍、100倍和1000倍的CPI-RSV-F前MVS病毒感染。在37℃下孵育1小时后，更换培养基，并将细胞在37℃下孵育18小时。免疫染色分别使用小鼠抗PIV5-HN和人抗F(帕利珠单抗)抗体，然后分别使用抗小鼠Cy3和抗人FITC二抗进行。图5A-5C是感染CPI-RSV-F前MVS的孔的代表性图像，显示红色和绿色细胞。表6显示了PIV5感染细胞中RSV F蛋白的表达百分比。图像以10X拍摄。

通过IFA得到的CPI-RSV-F MVS感染细胞表达的F蛋白：根据CVL-方案-034，通过对PIV-5载体(HN)和F蛋白进行IFA染色来评估CPI-RSV-F表达的F蛋白。通过计算对PIV5(HN蛋白)染色呈阳性，也对RSV F蛋白染色呈阳性的细胞数量来确定表达百分比(图6A-6C和表7)。

表7：CPI-RSV-F(MVS)的RSV-F和PIV5的共表达百分比。

Vero-SF细胞被稀释100倍、1000倍和10000倍的CPI-RSV-FMVS病毒感染。在37℃下孵育1小时后，更换培养基，并将细胞在37℃下孵育18小时。免疫染色分别使用小鼠抗PIV5-HN和人抗F(帕利珠单抗)抗体，然后分别使用抗小鼠Cy3和抗人FITC二抗进行。图6A-6C是感染CPI-RSV-F MVS的孔的代表性图像，显示绿色和红色细胞。表7显示了PIV5感染细胞中RSVF蛋白的表达百分比。图像以10X拍摄。

步骤5：MVS的制造过程

CPI-RSV-F MVS的生产按照cGMP进行。主病毒种子库(MVS)也用作1期临床批号材料，是使用无血清Vero细胞CyanVac MCB(DOM：19AUG2020，在CRL扩增至第152代)按照2021年8月CRL的cGMP(CBR-1862)生产的。

疫苗原料药制造：将在无血清培养基(VP-SFM)的T225烧瓶中生长的Vero细胞用CPI-RSV-F前MVS Lot# 210519MCBCHD-PQ10(使用2小瓶)以0.002的MOI在37℃下感染7天。感染细胞的细胞培养液构成粗疫苗原料药(3.0升)。对MVS粗原料病毒液的样品进行以下测试：无菌性(直接法)、抑菌和抑真菌、体外支原体测试(琼脂可培养和不可培养)、组织培养安全性测试(GP-V810.2)、体外分枝杆菌测试、隐性病毒(inapparent virus)、PBERT、效力。

疫苗原料药通过在2-8℃下以1,500rpm离心10min，得到1.2L，然后通过ThermoFisher的0.45μM PES过滤单元过滤，得到1.2L来澄清。澄清和过滤的疫苗原料药立即与10XSPG一起配制，以在填充前稳定病毒。在配制和填充之前，疫苗原料药没有保存。

在病毒生产过程中，使用来自同一生产批号的未感染的Vero细胞制备对照收获液。对照液储存在-60℃或以下。收获生产对照液并测试抑菌和抑真菌原料产品(直接法)、无菌性、残留Vero DNA的检测和定量以及内毒素水平(LAL)的测定。

疫苗药品制造(配制和填充)/MVS：过滤的病毒通过与10％10X SPG缓冲液一起配制而稳定，并使用校准的中继移液器(repeater pipette)以1mL的体积分配到2mL的冷冻小瓶中，制成MVS库/疫苗产品(共1281小瓶，每小瓶1mL)。分配的MVS/疫苗产品在干冰/甲醇浴中快速冷冻，并储存在-60℃或以下。

临床批号材料：对于提议的初步1期试验，主病毒种子(MVS)，Lot# CPI-RSV-F(CPI-RSV-F-210519PQ10MVSDOM：26AUG2021)用作疫苗药品。

MVS表征：此外，通过对NP基因至L基因区域的病毒反基因组cDNA进行测序来确认遗传身份以确认身份。

实施例3：在BALB/c小鼠中PIV5载体对照和CPI-RSV-F疫苗候选之间的比较研究

材料和方法

本报告中两项小鼠研究(CHD03和CHD04)的目的是比较两种RSV疫苗候选W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F在BALB/c小鼠模型中的免疫原性和保护功效。此外，研究还包括另外两种疫苗候选：W3A-RSV-F(SH-HN)和CPIΔSH-RSV-F。通过RSV F特异性ELISA测定测量抗体滴度，且通过ELISPOT测定测量细胞免疫反应。通过肺匀浆斑块测定来确定疫苗接种的小鼠针对下呼吸道野生型RSV毒株攻击感染的保护(表8)。

表8.CHD03和CHD04研究中W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F数据的总结。

dpi＝免疫接种后天数；dpc＝攻击后天数

使用的关键材料和试剂列于表9。实验中使用的病毒列于表10。

表9.关键材料和试剂

表10.病毒

疫苗接种前，所有病毒均用1XPBS稀释至2X10⁶ PFU/mL。RSV_rA2原液在攻击前未经稀释。

表11和12中总结了适用于ELISA、ELISPOT和斑块测定测试的实验组。

表11：CHD03给药组和测试。

表12：CHD04的给药组和测试。

小鼠的免疫接种：将六至八周大的雌性BALB/c小鼠通过腹膜内注射250μL的2,2，2-三溴乙醇的叔戊醇(Avertin)溶液进行麻醉。免疫接种通过以50μL(每个鼻孔25μL)体积鼻内施用10⁵PFU的每种疫苗候选加上RSV_rA2阳性对照来进行。阴性对照用50μL(每个鼻孔25μL)的PBS鼻内处理。RSV_rA2阳性对照用于模拟疫苗接种前的自然RSV感染。所有动物实验均按照佐治亚大学(University of Georgia)机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

免疫接种后二十七天(CHD03的A、D、G、J、M、P组小鼠和CHD04的A、E、G、K、M、P组小鼠)或28天(CHD03的B、C、E、F、H、I、K、L、N、O、Q、R组小鼠和CHD04的B、C、D、F、H、I、J、L、N、O、Q、R组小鼠)，经由颊部放血采集血液进行血清学分析。免疫接种后27天，还采集了CHD03的笼A、D、G、J、M、P中小鼠的脾脏以及CHD04的笼A、E、G、K、M、P中小鼠的脾脏，以进行ELISPOT测定。免疫后三十五天，通过腹膜内注射250μL的Avertin对小鼠进行麻醉，并且用50μL(每个鼻孔25μL)体积的3.8X10⁵PFU的RSV A2鼻内攻击CHD03的组B、C、E、F、H、I、K、L、N、O、Q、R和CHD04的组B、C、D、F、H、I、J、L、N、O、Q、R。攻击后，小鼠继续按照其疫苗接种组安置在一起。四天后，每组采集7-10只小鼠的肺，通过对肺匀浆进行斑块测定来评估病毒负担。实验时间线如图7和8所示。

抗F ELISA测定：根据CVL SOP-049，通过抗F ELISA测定确定抗F抗体滴度。将12.5ng/mL的RSV的F蛋白以50μL/孔包被Immulon 2HB 96孔板过夜。将血清样品预稀释10倍，然后进行3倍连续稀释，并添加到F蛋白包被的板(50μL/孔)中，在室温下持续1小时。板洗涤后，添加50μL/孔1：1250稀释的山羊抗小鼠IgG HRP缀合抗体，并在室温下孵育1小时。洗涤后，添加100μL/孔的SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底物持续3-5min，并且通过添加100μL/孔的1N HCl停止反应。添加HCL后立即使用读板仪(SpectraMax iD3多模式微孔板读板仪)在450nm处读取板。超过OD₄₅₀截止值0.20的样品在至少两次连续稀释中被视为阳性。抗体滴度定义为出现阳性信号时的最高倒数稀释度。该测定由位于加州洛斯加托斯的蓝湖生物技术公司(Blue Lake Biotechnology)进行。

酶联免疫斑点测定(ELISPOT)：使用BD^TM ELISPOT小鼠IFN-γ组通过ELISPOT测定测量IFN-γ分泌细胞的水平。在进行测定前24小时，用纯化的抗小鼠IFN-γ抗体包被BD^TMELISPOT板。免疫接种后27天采集小鼠脾脏(每组n＝5)，并且放入含有5mL的HBSS的15mL锥形管中。通过将脾脏压过70μM细胞滤器，用ACK裂解缓冲液孵育，用HBSS洗涤，然后重悬在完全肿瘤培养基(CTM)中至浓度为5×10⁶个细胞/mL来制备脾细胞。从板中去除捕获抗体溶液，然后用PBS洗涤板5-6次。然后用CTM封闭板90min。弃去封闭溶液，并且将含0.1μg的RSVF肽(85-93)的50μL CTM添加到孔中。接下来，将50μL的脾细胞(2.5×10⁵个细胞/孔)添加到板中，并在37℃、5％CO₂下孵育48h。根据BD^TM ELISPOT Set说明书对斑点进行免疫染色，并使用分析仪(Cell Technology Limited，CTL)进行计数。结果以每10⁶个脾细胞中IFN-γ分泌细胞的平均数量表示。该测定是在佐治亚州雅典的佐治亚大学进行的。

斑块测定：通过斑块测定在Vero细胞中对肺匀浆中的RSV病毒滴度进行。简而言之，将小鼠肺采集在含有3mL的含1％BSA的Opti-MEM的gentleMACS M管中，并保持在冰上。将肺称重，然后使用gentleMACS解离器的Protein_01程序在4℃下进行均质化，然后以3000×g离心10min。上清液用于进行3倍连续稀释，总体积为0.6mL，从未稀释至1：27。将24孔板中的Vero细胞用100μL的每种稀释度感染，重复三次。在37℃下吸附1小时后，去除接种物，用PBS洗涤板1次，并向每个孔中添加大约1mL的甲基纤维素。在7天的孵育后，去除甲基纤维素，并用大约500μL的60％丙酮/40％甲醇固定细胞20分钟。洗涤细胞，然后用400μL/孔的blotto封闭30分钟。封闭后，将细胞在室温下与200μL/孔的1：1000稀释的人抗RSV-F抗体(帕利珠单抗，1mg/mL)一起孵育1小时。板洗涤后，添加200μL/孔1：1000稀释的山羊抗人IgGHRP缀合抗体，并在室温下孵育1小时。洗涤后，在室温下添加200μL/孔的AEC底物，持续30分钟。病毒滴度是通过对稀释度下的斑块进行计数来确定的，其中斑块计数范围在10-100之间。结果以肺的PFU/g报告。该测定是在佐治亚州雅典的佐治亚大学进行的。

结果

抗F抗体滴度：疫苗接种后第27天，从CHD03的组A、D、G、J、M、P中的动物和CHD04的组A、E、G、K、M、P中的动物获得抗F抗体滴度，且结果如图9A-9B所示。总体而言，与PBS对照组相比，所有疫苗接种组的抗F抗体滴度均显著更高。CHD03中的J组(W3AΔSH-RSV-F)和M组(CPI-RSV-F)以及CHD04中的K组(W3AΔSH-RSV-F)和M组(CPI-RSV-F)的抗F抗体滴度非常类似。在CHD03中，W3AΔSH-RSV-F的几何平均滴度为3.1Log₁₀/mL，而CPI-RSV-F的几何平均滴度为3.0Log₁₀/mL。在CHD04中，W3AΔSH-RSV-F的几何平均滴度为3.4Log₁₀/mL，而CPI-RSV-F的几何平均滴度为3.2Log₁₀/mL。CHD03和CHD04中的W3A-RSV-F均具有最高的抗F抗体滴度，两次实验中的几何平均滴度均为3.7Log₁₀/mL。在CHD03和CHD04中，W3AΔSH-RSV-F组和CPI-RSV-F组的抗F抗体滴度与RSV_rA2阳性对照组类似。CPIΔSH-RSV-F在两项研究中也引发了相当的血清抗体水平。

这些结果表明，W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F以及其他两种疫苗候选在鼻内施用1x10⁵PFU剂量时在BALB/c小鼠中引发类似水平的抗F抗体。

F特异性细胞免疫反应：通过IFN-γ分泌细胞的水平来衡量疫苗候选诱导的细胞免疫反应。在CHD03中，J组(W3AΔSH-RSV-F)和M组(CPI-RSV-F)的IFN-γ分泌细胞水平较高，其中J组具有每10⁶个脾细胞28个IFN-γ分泌细胞的几何平均值，而M组具有每10⁶个脾细胞23个IFN-γ分泌细胞的几何平均值。这些值与PBS组相比没有统计学意义，但它们彼此之间也没有统计学意义。G组(W3A-RSV-F)与PBS组相比值最高，具有每10⁶个脾细胞57个IFN-γ分泌细胞的几何平均值，与其他组没有显著差异。W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F组的值与RSV_rA2组中观察到的IFN-γ分泌细胞水平类似。

在CHD04中，K组(W3AΔSH-RSV-F)和M组(CPI-RSV-F)的IFN-γ分泌细胞水平最高，其中K组具有每10⁶个脾细胞35个IFN-γ分泌细胞的几何平均值，而M组具有每10⁶个脾细胞48个细胞的几何平均值。这些值与PBS对照组相比有统计学意义，但它们彼此之间没有统计学意义。在两个感兴趣的疫苗组中，只有CPI-RSV-F组的IFN-γ分泌细胞量显著高于RSV_rA2阳性对照组。W3A-RSV-F和CPIΔSH-RSV-F也引发了F特异性细胞反应。

图10A-10B表明，感兴趣的W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F疫苗候选以及其他两种疫苗候选(W3A-RSV-F和CPIΔSH-RSV-F)在BALB/c小鼠中引发类似水平的细胞介导的免疫反应。

RSV攻击病毒肺滴度：评估四种RSV疫苗候选针对小鼠下呼吸道RSV_rA2病毒攻击感染的保护。总体而言，在CHD03(图11A)和CHD04(图11B)中，所有疫苗组的肺病毒滴度均显著低于PBS对照，其几何平均滴度分别为3.21Log₁₀ PFU/g和3.33Log₁₀ PFU/g。在CHD03中，K组和L组(W3AΔSH-RSV-F)的RSV攻击病毒滴度为1.35Log₁₀ PFU/g，而N组和O组(CPI-RSV-F)的几何平均滴度为1.48Log₁₀ PFU/g。这些值彼此之间没有统计学意义。测试的其他疫苗候选(W3A-RSV-F和CPIΔSH-RSV-F)的几何平均滴度分别为1.35Log₁₀PFU/g和1.40Log₁₀ PFU/g。这些值也显著低于PBS对照。在CHD04中，J组和L组(W3AΔSH-RSV-F)的几何平均滴度为1.37Log₁₀ PFU/g，而N组和O组(CPI-RSV-F)的几何平均滴度为1.40Log₁₀ PFU/g。与CHD03类似，这些值彼此之间没有统计学意义，但显著低于PBS对照组。W3A-RSV-F和CPIΔSH-RSV-F疫苗候选的几何平均滴度分别为1.35Log₁₀ PFU/g和1.40Log₁₀ PFU/g。这些值与实验CHD03相同，并且也显著低于PBS对照组。所有疫苗组的肺RSV病毒滴度与CHD03和CHD04中的RSV_rA2阳性对照组中观察到的类似。

图11A-11B表明W3AΔSH-RSV-F和CPI-RSV-F疫苗候选以及其他两种疫苗候选均保护BALB/c小鼠的下呼吸道免受RSV攻击病毒感染。

实施例4：棉鼠上呼吸道和下呼吸道的病毒复制。

方法和材料

动物：五十五(55)只近交系、6-8周龄、Sigmodon hispidus雌性和雄性棉鼠(来源：Sigmovir Biosystems，Inc.，Rockville MD)在兽医监督下按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的指导方针和Sigmovir机构动物护理和使用委员会(Sigmovir Institutional Animal Care and Use Committee)批准的动物研究方案(IACUC方案#15)进行维持和处理。每组动物包括3只雌性(每组前三只动物)和2只雄性(每组后2只动物)。将棉鼠安置在透明的聚碳酸酯笼中，并即兴(ad lib)提供标准啮齿动物食物(Harlan#7004)和自来水。

病毒：呼吸道合胞病毒株A/A2(RSV A/A2)(ATCC，Manassas，VA)在连续斑块纯化后在HEp-2细胞中繁殖，以减少缺陷干扰颗粒。在本体内实验中使用了一批指定为hRSV A/A2Lot# 092215 SSM的病毒，其中蔗糖稳定培养基中含有大约3.0x10⁸pfu/mL。该病毒库储存于-80℃，已在棉鼠模型中进行了体内表征，并验证了其在上呼吸道和下呼吸道的复制。

步骤：将55只雌性和雄性年轻成年棉鼠(6-8周龄)分成9组，每组5只动物(3只雌性，2只雄性)，一组4只动物(2只雌性，2只雄性)，以及2组，每组3只动物(2只雌性和1只雄性)。对所有动物进行预先放血以采集血清并贴上耳标。按照下表13所示，用0.1ml制剂对动物进行免疫接种或感染。

表13：动物的免疫接种或感染。

处死K组和L组的动物。收获鼻组织并在3ml的补充有10％SPG的HBSS中均质化，以进行病毒滴定。整块收获肺并三部分切割以进行病毒滴定(左部分，在3ml的补充有10％SPG的HBSS中均质化)、组织病理学(右部分，用10％中性缓冲福尔马林充气)和qPCR(舌叶(lingular lobe)，在液氮中快速冷冻)。

对所有动物放血以采集血清。如上表所示，用0.1ml的制剂对A组、B组、C组动物进行增强。

对所有动物放血以采集血清。使用0.1ml的PBS(pH 7.4)对A组进行鼻内(IN)模拟攻击。使用0.1ml的RSV/A2(Lot# 092215SSM)对B至J组动物进行攻击，每只动物10⁵PFU。对攻击病毒进行反滴定以确认攻击剂量。

处死所有动物。收获鼻组织并在3ml的补充有10％SPG的HBSS中均质化，以进行病毒滴定。整块收获肺并三部分切割以进行病毒滴定(左部分，在3ml的补充有10％SPG的HBSS中均质化)、组织病理学(右部分，用10％中性缓冲福尔马林充气)和qPCR(舌叶(1ingularlobe)，在液氮中快速冷冻)。动物处死组如表14所示，并且样品采集如表15所示。

表14：动物处死组。

组	动物#s
		A	124831-124834
B	124835-124839
		C	124840-124844
D	124845-124849
		E	124850-124854
F	124855-124859
		G	124860-124864
H	124865-124869
		I	124870-124874
J	124875-124879
		K	124880-124882
L	124883-124885

表15：样品采集。

样品采集	采集日期	集合数量
			肺和鼻子匀浆	4(GrK-L)	3*
肺和鼻子匀浆	54(GrA-J)	2
			肺组织学	4(GrK-L)；54(GrA-J)	1
血清	0、28和49	2
			肺总RNA	4(GrK-L)；54(GrA-J)	1

表16示出了终点测定方案概要。

表16：终点测定方案

终点测定	样品	贮存
			RSV病毒滴定(GrA-J)	肺匀浆	-80℃
	鼻子匀浆
			PIV病毒滴定(GrK-L)	肺匀浆	-80℃
	鼻子匀浆
			肺组织病理学(GrA-K)	H&E肺切片	RT
RSV中和Ab(GrA-J)	血清	-20℃
			(RSV/A2)(d0、28和49)
RSV/A2血清IgG ELISA(GrA-J)	血清	-20℃
			(d0、28、49)(4-稀释格式)
qPCR(GrA-J)	肺RNA	-80℃
			RSV/A2 NS-1基因；IL-4、IL-2、IFN-γ
qPCR PIV(GrK,L)	肺RNA	-80℃

肺和鼻子RSV病毒滴度：通过离心澄清肺和鼻子匀浆并在EMEM中稀释。将汇合的HEp-2单层用24孔板中的稀释匀浆重复感染。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育一小时后，用0.75％甲基纤维素培养基覆盖孔。孵育4天后，去除覆盖物，用0.1％结晶紫染料固定细胞一小时，然后冲洗并风干。对斑块进行计数，并将病毒滴度表示为每克组织的斑块形成单位。病毒滴度以给定时间内一组中所有动物的几何平均值±标准差来计算。

肺组织病理学：解剖肺并用10％中性缓冲福尔马林充气至其正常体积，然后浸入相同的固定溶液中。固定后，将肺嵌入石蜡中，切片并用苏木精和伊红(H&E)染色。评估了肺炎症的四个参数：细支气管周围炎(细支气管周围炎症细胞浸润)、血管周围炎(小血管周围炎症细胞浸润)、间质性肺炎(炎症细胞浸润和肺泡壁增厚)和肺泡炎(肺泡腔内的细胞)。载玻片按照0-4严重程度量表进行盲评分。随后将评分转换为0-100％组织病理学量表。

用于临床前研究的RSV中和抗体测定(减少60％)：用EMEM将热灭活血清样品以1：10稀释，并且再以1：4进一步连续稀释。将稀释的血清样品与RSV(25-50PFU)在室温下孵育1小时，并且重复接种到24孔板中的汇合的HEp^-2单层上。在5％CO2培养箱中在37℃下孵育一小时后，孔覆盖有0.75％甲基纤维素培养基。孵育4天后(RSV B为6天)，去除覆盖物，用0.1％结晶紫染料固定细胞一小时，然后冲洗并风干。使用统计程序在病毒对照的60％减少终点确定对应的倒数中和抗体滴度。计算给定时间内一组中所有动物的几何平均值±标准差。

用于临床前研究的RSV IgG ELISA：将用UV灭活的整个RSV或从RSV感染的HEp-2细胞中提取的纯化F蛋白稀释并涂覆在96孔ELISA板上过夜。倾析出包被抗原，并将板在封闭溶液中在室温下孵育一小时，随后进行洗涤。将稀释的血清(1：500，重复)以及阳性和阴性对照添加到孔中，并在室温下孵育一小时。洗涤板后，将兔抗棉鼠IgG(1：500)添加到所有孔中，并且在室温下孵育一小时。然后在室温下与山羊抗兔IgG-HRP(1：6，000)孵育一小时。最后，将TMB底物添加到所有孔中并在室温下孵育15分钟。将TMB-Stop溶液添加到所有孔中并记录450nm处的光密度。测量所有三份血清样品的光密度(OD₄₅₀)的几何平均值+每个时间点的组中所有样品的标准误差。

用于临床前研究的实时PCR：使用RNeasy纯化试剂盒(QIAGEN)从均质化组织或细胞中提取总RNA。使用一μg总RNA，使用Super Script II RT(Invitrogen)和寡dT引物(1μl，Invitrogen)制备cDNA。对于实时PCR反应，所用Bio-Rad iQ^TM SYBR Green Supermix的最终体积为25μl，最终引物浓度为0.5μM。在96孔板中重复设置反应。扩增在Bio-Rad iCycler上进行，1个循环：95℃3分钟，然后40个循环：95℃10秒、60℃10秒和72℃15秒。基线循环和循环阈值(Ct)由iQ5软件在PCR基线扣除曲线拟合模式下计算。对所有样品均进行DNA的相对定量。标准曲线是使用在感兴趣的转录本中最富集的连续稀释的cDNA样品(例如，FI-RSV免疫接种动物的RSV感染后6小时的肺或PIV5特异性对照)开发的。Ct值根据log10 cDNA稀释因子绘制。这些曲线用于将不同样品获得的Ct值转换为相对表达单位。然后将这些相对表达单位归一化为对应样品中表达的β-肌动蛋白mRNA(“管家基因”)的水平。对于动物研究，mRNA水平表示为给定时间内一组所有动物的几何平均值±SEM。

结果

确认疫苗病毒在棉鼠模型中的复制：为了确认基于PIV5的疫苗在棉鼠呼吸道中的复制，将3只动物组用10⁶PFU的CPI-RSV-F或W3AΔSH-RSV-F鼻内接种，并在四天后处死，将样品提交给蓝湖生物技术公司(BLB)进行评估。BLB对提交的样品进行了斑块测定。简而言之，发现两种候选疫苗病毒都能在棉鼠的上呼吸道和下呼吸道中复制(表17)。在CPI-RSV-F疫苗接种的动物中，疫苗病毒在上呼吸道(鼻子)和下呼吸道(肺)中类似地复制，分别为3.9和3.5Log₁₀PFU/mL。W3AΔSH-RSV-F在上呼吸道的复制滴度(5.0Log₁₀PFU/mL)高于下呼吸道(2.2Log₁₀PFU/mL)。W3AΔSH-RSV-F疫苗病毒在上呼吸道的复制水平比CPI-RSV-F更高，但在下呼吸道的复制水平比CPI-RSV-F更低。总体而言，两种疫苗病毒在棉鼠模型中的复制均得到成功确认(表17)。

表17：CPI-RSV-F和W3AΔSH-RSV-F在棉鼠呼吸道中复制的评估。

将动物用10⁶PFU的CPI-RSV-F或W3AΔSH-RSV-F鼻内接种，并且在四天后处死。采集肺和鼻子样品并运送至BLB进行斑块测定。

评估疫苗在RSV A/A2感染棉鼠模型中的功效和安全性。

肺病毒滴度：在鼻内RSV攻击后5天评估棉鼠肺中的RSV A/A2负荷(图12)。用PBS模拟免疫接种的RSV感染动物(B组)肺中病毒的滴度显示为5.3Log₁₀PFU/g，并用于与所有其他RSV感染组(C-J组)进行比较。两次感染RSV的动物(D组)的肺中未检测到病毒。FI-RSV免疫接种(C组)适度但显著地降低肺RSV滴度至3.4Log₁₀PFU/g。用剂量为10⁴、10⁵或10⁶PFU的CPI-RSV-F(分别为E组、F组和G组)或用剂量为10⁴、10⁵或10⁶PFU的W3AΔSH-RSV-F(分别为H组、I组和J组)进行免疫接种可将所有疫苗接种动物中的RSV负荷降低至不可检测的水平。

鼻子病毒滴度：在鼻内RSV攻击后5天评估棉鼠鼻子中的RSV A/A2负荷(图13)。用PBS模拟免疫接种的RSV感染动物(B组)鼻子中病毒的滴度显示为6.19Log10 PFU/g，并用于与所有其他RSV感染组(C-J组)进行比较。两次感染RSV的动物(D组)的鼻子中未检测到病毒。FI-RSV免疫接种(C组)对鼻子中RSV负荷(6.02Log10PFU/g)没有影响。以10⁴、10⁵或10⁶PFU剂量的CPI-RSV-F进行免疫接种导致鼻子中病毒负荷剂量依赖性降低：E组、F组和G组分别为3.65、3.00和2.44PFU/g。使用测试的所有三个剂量的W3AΔSH-RSV-F进行免疫接种(H-J组)将鼻子中的RSV复制降低到几乎不可检测的水平，每组中的一些动物仅有个位数的斑块(H组、I组和J组中分别有1、3和1只动物具有1至5个斑块)。

血清RSV A/A2中和抗体：在实验开始前(第0天)、首次免疫接种后4周(第28天)和三周后(第49天)测量所有动物针对RSV A/A2的血清中和抗体(图14)。感染RSV A/A2的动物(D组)在感染后四周显示出高血清RSV A/A2中和抗体滴度(第28天数据，11.14Log2)，并且在感染后七周仍然保持升高(第49天数据，10.07Log2)。用10⁴、10⁵或10⁶PFU剂量(分别为E组、F组和G组)的CPI-RSV-F进行免疫接种导致第28天的NA滴度为5.92、5.87和7.55。

用最高剂量的测试疫苗免疫接种的动物(G组，10⁶PFU)到第49天仍保持较高的NA滴度(6.65Log2)，而E组和F组的NA水平到第49天则分别下降至4.6和4.62Log2。用10⁴、10⁵或10⁶PFU的W3AΔSH-RSV-F进行免疫接种(H-J组)导致在第28天NA滴度分别为9.24、10.11和9.91Log2。这些组中的NA滴度在第49天仍然保持很高(分别为8.79、8.97、8.64Log2)。没有其他动物组表现出可检测的针对RSV A/A2的中和抗体。

血清RSV A/A2结合IgG抗体：在实验开始前(第0天)、首次免疫接种后4周(第28天)和三周后(第49天)测量所有动物针对RSV A/A2 F蛋白的血清结合IgG抗体(图15)。在疫苗接种FI-RSV的动物(C组)中，可见结合IgG略有增加。感染RSV A/A2(D组)的动物和所有用CPI-RSV-F(E-G组)或W3AΔSH-RSV-F(H-J组)免疫接种的动物在接种后第28天和第49天具有高水平的结合IgG。未观察到IgG水平对CPI-RSV-F(E-G组)或W3AΔSH-RSV-F(H-J组)剂量的剂量依赖性。在第28天和第49天，W3AΔSH-RSV-F免疫接种动物的IgG水平略高于用CPI-RSV-F(E-G组)免疫接种的动物。

肺组织病理学：在RSV A/A2攻击后5天评估所有动物的肺组织病理学(数据未显示)。用PBS模拟免疫接种的RSV感染动物(B组)或用RSV攻击两次的动物(D组)具有中等水平的病理学。在用FI-RSV(C组)免疫接种的动物中检测到了最高水平的肺组织病理学，间质炎症和肺泡炎显著增加。所有剂量的CPI-RSV-F免疫接种的动物(E-G组)的病理学均未超过二次RSV感染的动物(D组)中观察到的病理学。一组用10⁵PFU剂量的W3AΔSH-RSV-F免疫接种的动物(I组)中有一只动物(#124872)出现间质炎症和肺泡炎加重。该组中的其他四只动物以及用其他两个剂量的疫苗免疫接种的所有动物(H组和J组)未表现出间质炎症和肺泡炎。

qPCR结果：在RSV A/A2攻击后第5天采集的肺样品中评估了RSV NS1、IL-4、IL-2和IFN-γmRNA的表达，并通过每个样品中的β-肌动蛋白mRNA水平进行归一化(图16A-16D)。两种疫苗均极大降低NS-1mRNA的表达，与以两个较低剂量(10⁴和10⁵PFU)施用的CPI-RSV-F相比，W3AΔSH-RSV-F在降低肺NS1 mRNA方面略微更有效。FI-RSV免疫接种(C组)导致肺RSVNS1 mRNA水平中度降低，但IL-4mRNA水平显著增加。用CPI-RSV-F(E-G组)或W3AΔSH-RSV-F(H-J组)免疫接种的动物的IL-4、IL-2和IFN-γmRNA水平总体上没有超过一次RSV感染动物(B组)中观察到的水平。与二次RSV感染的动物(D组)相比，用中等剂量CPI-RSV-F免疫接种的组中的几只动物(F组，10⁵PFU剂量)的IL-2和IFN-γ mRNA水平略有升高。使用中等剂量W3AΔSH-RSV-F免疫接种的组中的一只动物(I组，10⁵PFU剂量，动物##124872)的IL-4mRNA升高。巧合的是，同一只动物在组织病理学评估中表现出肺泡炎和间质炎症升高。

实施例5：PIV5-RSV疫苗的I期临床试验-RSV抗体和CMI反应率

材料和方法

参与者和研究实施：共有30名受试者入组了此项1期试验，并且所有受试者均接受了10^7.5PFU的单次鼻内剂量的PIV5-RSV疫苗。使用MAD Nasal^TM鼻内黏膜雾化装置(TeleflexMAD300)将疫苗以0.25mL喷雾的形式施用至每个鼻孔(总体积0.5mL)。第1组(计划参与者年龄18-59岁，且实际入组者年龄33-59岁)和第2组(计划参与者年龄60-75岁，且实际入组者年龄61-75岁)的平均年龄分别为45岁和67岁(表18)。大多数参与者为女性(70％)。两组中大多数参与者都是白人(第1组和第2组分别为73％和80％)。除一名参与者外，其余参与者均完成了研究；并且第1组中的这名参与者在第7天后失去随访。

表18：试验队列人口统计数据

*一名参与者于第8天退出研究(失去随访)。

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研究设计和疫苗接种：PIV5-RSV疫苗(也称为BLB201；临床试验NCT05281263)的1期临床试验已获得Advarra中央IRB批准，并在US两个研究地点进行。参与者被招募至两个研究队列：健康的年轻人(第1组，33-59岁)和健康的老年人(第2组，61-75岁)。有生育能力的参与者必须采取避孕措施以防止怀孕。排除标准包括试验疫苗前30天内接种过任何活疫苗、之前接种过任何研究性RSV疫苗或试验期间正在入组的任何基于PIV5的疫苗(CVXGA1)以及已知感染人免疫缺陷病毒、乙肝病毒或丙肝病毒。完整的纳入和排除标准列表可在临床试验网站上找到。参与者未进行RSV血清抗体水平的预筛查。符合条件的参与者在第1天将单剂量浓度为10^7.5斑块形成单位(PFU)的PIV5-RSV疫苗使用MAD Nasal^TM鼻内粘膜雾化装置(Teleflex MAD300)以0.25mL喷雾的形式施用至每个鼻孔(总体积0.5mL)，并在给药后立即观察30分钟。此外，受试者被要求在疫苗接种后的一周内保持对所征求的全身性AE和局部反应的记忆辅助。每组首先对四名哨兵参与者进行给药，并在该组其余参与者入组之前由安全监测委员会(SMC)审查他们的安全性数据。

主要结果测量包括(i)征求的AE(第1-8天)和(ii)未征求的AE(第1-29天)。次要结果测量包括(i)RSV蛋白的血清IgG滴度(第15天和第29天)(ii)SAE(第1-181天)和(iii)特别感兴趣的AE(AESI)，包括x次发作的慢性医疗疾患和需要就医的AE(第1-181天)。

免疫原性评估：在基线(疫苗接种前第1天)、疫苗接种后第15天和第29天采集血液和鼻样品。为了减少样品差异，在所有测定中，来自同一参与者的样品都以盲法在同一板上运行。通过基于RSV-A2-rLuc报告病毒的合格RSV A2微量中和(MN)测定确定血清RSV nAb水平(45)。简而言之，将起始稀释度为1：100的连续2倍稀释的血清样品(一式四份)与175±75PFU RSV-rLuc一起孵育1小时，并且在96孔、白壁、透明底板上感染Vero细胞。孵育20至24小时后，使用Renilla-Glo荧光素酶测定(Promega)裂解细胞，并在SpectraMax iD3多模式微孔板读板仪(Molecular Devices)上读取荧光素酶信号。RSV nAb滴度定义为抑制病毒对照至少50％信号的倒数稀释度，如通过使用Prism(macOS版本9.5.1，GraphPad软件)进行5PL曲线拟合确定。基于从NIBSC(London，UK)获得的标准血清(16/284)将RSV nAb滴度转换为国际单位。

使用25ng/孔纯化的RSV F蛋白(SinoBiological，目录号11049-V08B)和封闭缓冲液(1x KPL洗涤缓冲液(Seracare)中的5％牛奶/0.5％BSA)中的2倍连续稀释液(重复)，通过ELISA测定确定RSV F特异性血清IgG和IgA抗体以及鼻IgA抗体水平。使用Prism通过4PL曲线拟合计算终点滴度，并以倒数稀释度的形式报告。分别使用PIV5病毒包被板通过ELISA测定以及通过在Vero细胞中的基于PIV5-rLuc的MN测定来确定PIV5特异性IgG和nAb滴度。PIV5 IgG终点滴度通过4PL曲线拟合计算并以倒数稀释度形式报告。PIV5 MN测定的与基于RSV-rLuc的MN测定类似地执行，只是进行了重复两次而不是四次。PIV5 MN分析与基于RSV-rLuc的MN测定相同，并且nAb滴度定义为抑制病毒对照至少50％信号的倒数稀释度。

使用从第1天(疫苗接种前)、第15天和第29天的全血中分离的冷冻保存外周血单核细胞(PBMC)，通过细胞内细胞因子染色测定评估抗原特异性T细胞频率。将一百万个冷冻保存的PBMC在完全10％FBS RPMI培养基中解冻，并在37℃下静置过夜，然后在1μg/mL抗CD28 ECD(Beckman Coulter，克隆CD28.2)、抗CD107a FITC(BD Biosciences，克隆H4A3)和抗CD49d(BD Biosciences，克隆9F10)的存在下与GenScript的RSV F肽池一起孵育，最终浓度为1μg/mL。此外，用1μL含有0.5％二甲基亚砜的完全培养基(DMSO，对应于RSV-F肽池的DMSO浓度的阴性对照)或1μL PMA/离子霉素(25ng/mL PMA和1μg/mL离子霉素)刺激PBMC以分别用作阴性和阳性对照。在37℃下孵育2小时后，添加10μg/mL布雷菲德菌素A(BDBiosciences)，并将细胞再孵育4小时。用PBS洗涤细胞，并在室温下与Aqua-Viability染料(Invitrogen)一起孵育15min。用补充有2％胎牛血清(FBS)的PBS洗涤细胞，并在4℃下用抗CD3 Alexa700(BD Biosciences，克隆SP34-2)、抗CD4 BV605(BD Biosciences，克隆L200)、抗CD8 BV450(BD Biosciences，克隆RPA-T8)和抗CD95PE-Cy5(BD Biosciences，克隆DX2)进行表面染色持续30min。用含有2％FBS的PBS洗涤细胞，用Cytofix/Cytoperm(BDBiosciences)固定，用1x Perm/Wash(BD Biosciences)透化，并与抗IFN-γPE-Cy7(BDBiosciences，克隆B27)、抗TNF-αAPC-Cy7(BioLegend，克隆Mab11)、抗IL-13PE(MiltenyiBiotec，克隆JES10-5A2.2)和抗MIP-1βAPC(eBioscience，克隆FL34Z3L)抗体在4℃下一起孵育30min。用1x Perm/Wash和含2％FBS的PBS洗涤细胞，然后将其重悬在PBS/2％甲醛中，以便在BD FACSAria Fusion细胞分选仪上进行采集。将CD3+细胞门控为CD4⁺和CD8⁺T细胞，并用CD28和CD95分为记忆细胞和幼稚细胞。通过减去用DMSO刺激样品(阴性对照)获得的值来确定细胞因子分泌细胞的净百分比。如果在减去基线后检测到的细胞因子阳性CD4⁺或CD8⁺T细胞频率>0.1％，则认为T细胞频率为阳性。数据使用FlowJo软件(版本10)分析。使用布尔(Boolean)组合和SPICE软件来确定产生两种或更多种细胞因子的CD4⁺和CD8⁺T细胞的多功能反应。

统计分析：使用GraphPad Prism软件(版本9)进行统计分析。由于样品大小较小，统计分析主要是描述性和总结性的。P值用于显示0.05显著性水平下潜在显著性的差异。通过Wilcoxon匹配对符号秩检验(Wilcoxon matched-pairs signed rank test)(第15天或第29天与第1天，或第15天与第29天)评估了RSV特异性CMI反应和抗体反应的两组比较。疫苗接种后抗体滴度相对于基线增加□1.5倍被认为是有意义的，因为当在同一板上测试来自单个参与者的样品时，测定特征显示1.2-1.3倍(95％置信度)的变化是显著变化。

结果

血清抗体滴度：所有参与者在基线时均对RSV中和抗体(nAb)呈血清阳性，并且滴度变化如图17A-17F和图18A-18B所示。在第1组中，nAb几何平均滴度(GMT)在基线时为880(9.8log₂)，并且在疫苗接种后2周增加至1316(10.4log₂)，在疫苗接种后4周增加至1312(10.4log₂)(P<.05)，反映几何平均倍数增加(GMFR)为1.5。在7/14(50％)名参与者中鉴定出RSV-nAb血清反应(增加≥1.5倍)。在第2组中，基线时的nAb GMT为850(9.7log₂)，与第1组类似，在疫苗接种后2周增加至1103(10.1log₂)(P<.05)，并且在疫苗接种后4周增加至1372(10.4log₂)(P<.05)，反映几何平均倍数增加(GMFRs)分别为1.3和1.5。该组中6/15(40％)名参与者被鉴定为RSV-nAb血清反应(表19)(个体nAb滴度变化如图18A-18D所示)。值得注意的是，在所有5名疫苗病毒脱落呈阳性的参与者中均鉴定出RSV-nAb血清反应，这表明复制和全身抗体反应之间的潜在相关性。

表19：RSV抗体和CMI反应率的总结

阳性血清反应定义为RSV F IgG和IgG较基线增加≥1.5倍。阳性鼻IgA抗体反应定义为比基线增加≥2倍。CMI反应定义为减去基线(疫苗接种前)后，分泌>1种细胞因子的单个T细胞总数增加>0.1％。CTL反应由产生INF-γ的CD8⁺细胞的变化来定义。缩写：CMI，细胞介导的免疫；CTL，细胞毒性T淋巴细胞；PBMC，外周血单核细胞；PIV5，副流感病毒5型；RSV，呼吸道合胞病毒。

所有参与者在基线时均对RSV-F特异性血清IgA和IgG Ab呈血清阳性(图17A-17F)。在第1组中，F特异性血清IgA GMT从基线时的530(9.0log₂)分别增加到疫苗接种后第2周和第4周的821(9.7log₂)和756(9.6log₂)。F特异性血清IgG GMT从基线时的1640(10.7log₂)增加到疫苗接种后2周时的2049(11.0log₂)和4周时的2055(11.0log₂)。在6/14(43％)名参与者和3/14(21％)名参与者中分别鉴定出F特异性血清IgA和IgG血清反应(≥1.5倍)(表19)。在第2组中，F特异性血清IgA GMT从基线时的445(8.8log₂)分别增加到疫苗接种后第2周和第4周的582(9.2log₂)和641(9.3log₂)。F特异性血清IgG GMT从基线时的1088(10.1log₂)增加到疫苗接种后第2周和第4周的1198(10.2log₂)和1325(10.4log₂)。在5/15(33％)名参与者和1/15(7％)名参与者中分别鉴定出F特异性IgA和IgG血清反应(表19)。

总体而言，结果表明PIV5-RSV疫苗提高了年轻人(33-59岁)和老年人(61-75岁)的RSV特异性血清Ab水平，但成年人的提高幅度大于老年人。有趣的是，RSV特异性Ab滴度的增加倍数与基线滴度呈负相关。较高的基线滴度可能接近最高水平。

接下来我们检查了载体特异性免疫反应。对于基线时的PIV5nAb，15/29(52％)名参与者呈血清阳性，如由滴度1：10所定义(图19A-19B)。这种背景血清阳性水平可能反映了通过暴露于接受犬舍咳疫苗的狗而被动暴露于PIV5。在第1组中，PIV5-nAb GMT从基线时的26(4.7log₂)分别增加到疫苗接种后第2周和第4周的48(5.6log₂)和51(5.7log₂)，分别反映了几何平均倍数增加为1.8和2.0。在7/14(50％)名参与者中鉴定出PIV5-nAb血清反应(增加≥1.5倍)(表19)。在第2组中，PIV5-nAb GMT从基线时的19(4.2log₂)分别增加到疫苗接种后第2周和第4周的34(5.1log₂)和44(5.5log₂)，分别反映了GMFR为1.8和2.2。在10/15(67％)名参与者中鉴定出PIV5-nAb血清反应(增加≥1.5倍)。使用PIV5特异性IgG滴度观察到了类似的动力学(图19C-19D)，但具有更高的GMFR(第1组中≤4.6倍以及第2组中≤3.4倍)和血清反应(第1组中86％以及第2组中87％)。通过比较具有低PIV5 nAb滴度的参与者和具有高PIV5 nAb滴度的参与者，基线PIV5 nAb滴度对PIV5-nAb血清反应率没有明显影响，并且似乎不会抑制RSV-nAb血清反应率(图20A-20C)。

鼻拭子中RSV F特异性IgA抗体滴度：在基线时，鼻拭子中RSV F特异性IgA抗体(Ab)滴度各不相同，范围从LOD以下到514(9.0log₂)(图21A)。在第1组中，F特异性鼻IgA几何平均滴度(GMT)在基线时为19(4.2log₂)，在疫苗接种后第2周和第4周增加至40(5.3log₂)(P<.05)，反映GMFR为2.1(图21B)。在9/14(64％)的参与者中鉴定出F特异性鼻IgA反应(增加≥2倍)(表19)。在第2组中，基线F特异性鼻IgA GMT为18(4.2log₂)与第1组类似，但疫苗接种后第2周和第4周GMT没有增强(P＞.05)(图21A和21B)。然而，在第2组中5/15(33％)的参与者中鉴定出F特异性鼻IgA反应(个体的鼻IgA抗体变化如图18C-18D所示)。在第1组和第2组中，在4/5名疫苗病毒脱落呈阳性的参与者中鉴定出F特异性鼻IgA反应。

总体而言，结果表明PIV5-RSV疫苗可提高成年人和老年人的RSV特异性鼻IgA水平，但老年人的程度较低。与全身抗体反应观察到的结果类似，两组中F特异性鼻IgA滴度的增加倍数与基线滴度呈负相关(图20A-20C)。

基于Th1或细胞毒性T细胞因子/标志物IFN-γ、TNF-α、MIP-1β和CD107a的表达，以及Th2细胞因子IL-13的表达，检测到基线细胞介导的免疫、RSV F特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞(图22A-22D)。在第1组中，表达至少一种Th1/细胞毒性标志物的F特异性CD4⁺T细胞的平均百分比从基线时的0.06％增加到疫苗接种后2周的最大值0.42％(P<.001；图22E-22F)，并且相同表型的CD8⁺T细胞的平均百分比从基线时的0.08％增加到疫苗接种后4周的最大值0.38％(P<.001)。在第2组中，相同表型的CD4⁺T细胞的平均百分比从0.02增加到疫苗接种后2周的最大值0.26％(P<.001)，并且CD8⁺T细胞的平均百分比从0.04增加到疫苗接种后4周的最大值0.40％(P<.001)。在第1组和第2组中，分别在13/14(93％)名参与者和15/15(100％)名参与者中鉴定出针对PIV5-RSV疫苗的F特异性细胞介导免疫(CMI)反应(定义为表达至少2种Th1/细胞毒性生物标志物的T细胞从基线增加>0.1％)(表19)。并且分别在12/14(86％)名参与者和13/15(87％)名参与者中鉴定出针对PIV5-RSV疫苗的F特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应(定义为表达IFN-γ的CD8⁺T细胞从基线增加>0.1％)。这表明PIV5-RSV疫苗增强了几乎所有参与者的F特异性Th1(CD4⁺)和细胞毒性(CD8⁺)T细胞的产生。尽管两组免疫接种后CD4⁺和CD8⁺T细胞数量类似，但到第15天，第1组和第2组的CD4⁺T细胞几何平均值分别增加至6.1倍和9.1倍，而到第29天，第1组和第2组的CD8⁺T细胞几何平均值分别增加至3.6倍和10倍(图22G-22H)，这反映了第2组的基线低于第1组。该结果表明，与鼻IgA反应相比，PIV5-RSV疫苗在成人和老年人中诱导的CMI水平类似。

在第1组和第2组中，表达单种Th1/细胞毒性生物标志物的T细胞比表达至少两种Th1/细胞毒性生物标志物的T细胞的频率更高(图22I-22J)。然而，与第2组相比，第1组中共表达至少两种Th1/细胞毒性生物标志物的T细胞的频率更高，这表明基于多功能Th1/细胞毒性反应，PIV5-RSV疫苗可能在较年轻年龄组中诱导更高质量的抗原特异性效应/记忆T细胞。

与Th1和细胞毒性表型相比，在第1组或第2组中，疫苗接种后表达IL-13的F特异性CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的百分比均未增加(图22A-22D)，这表明对PIV5-RSV疫苗没有Th2偏向性反应，这已被鉴定为疫苗相关增强RSV疾病的潜在风险因素(F.P.Polack，等人，J ExpMed 196，859-865(2002)；B.Bagga，等人，J Infect Dis 212，1719-1725(2015))。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可用材料的完整公开(包括例如：例如GenBank和RefSeq中提交的核苷酸序列，以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中提交的氨基酸序列，以及GenBank和RefSeq中带注释的编码区的翻译)通过引用并入。如果本申请的公开内容与通过引用并入本文的任何文件的公开内容之间存在任何不一致，则以本申请的公开内容为准。前面的具体实施方式和实施例只是为了清楚地理解而给出的。从中不应理解任何不必要的限制。本发明不限于所示和所描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将被包括在由权利要求限定的本发明内。

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Claims

1.一种病毒表达载体，其包含副流感病毒5(PIV5)基因组，所述副流感病毒5(PIV5)基因组具有与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的异源核酸序列，其中所述病毒表达载体表达异源多肽，所述异源多肽包含经工程改造以表达RSV F蛋白作为靶抗原的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架。

2.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中所述RSV F蛋白由野生型或突变的RSV F蛋白基因编码。

3.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中所述RSV F蛋白基因经密码子优化以在人受试者中表达。

4.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中所述RSV F蛋白基因插入CPI反基因组cDNA的SH和HN接合部之间。

5.如权利要求4所述的病毒表达载体，其中所述CPI反基因组cDNA用具有与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19或19具有至少95％序列同一性的核酸序列的引物进行测序。

6.如权利要求1所述的病毒表达载体，其中经工程改造以表达所述RSV F蛋白的所述副流感病毒(CPI)载体骨架包含22个氨基酸延伸作为其细胞质尾的一部分。

7.一种药物组合物，其包含副流感病毒5(PIV5)病毒表达载体，所述副流感病毒5(PIV5)病毒表达载体具有与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的异源核酸序列，其中所述病毒表达载体表达异源多肽，所述异源多肽包含经工程改造以表达RSV F蛋白作为靶抗原的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述RSV F蛋白由野生型或突变的RSV F蛋白基因编码。

9.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述RSV F蛋白基因经密码子优化以在人受试者中表达。

10.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述RSV F蛋白基因插入CPI反基因组cDNA的SH和HN接合部之间。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述CPI反基因组cDNA用具有与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19或19具有至少95％序列同一性的核酸序列的引物进行测序。

12.如权利要求7所述的药物组合物，其中经工程改造以表达所述RSV F蛋白的所述副流感病毒(CPI)载体骨架包含22个氨基酸延伸作为其细胞质尾的一部分。

13.如权利要求7所述的药物组合物，其中经工程改造以表达RSV F蛋白的活重组犬副流感病毒(CPI)载体骨架是针对RSV感染的预防性疫苗。

14.一种在患有RSV的受试者中诱导免疫反应的方法，其包括施用针对RSV感染的预防性疫苗，其中所述疫苗包含如权利要求7所述的药物组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述疫苗诱导RSV F蛋白特异性血清抗体和细胞介导的反应。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述RSV特异性细胞介导反应包括CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表达增加。

17.如权利要求15所述的方法，其中与通过施用福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)获得的免疫反应相比，所述RSV-F特异性血清抗体和细胞介导的反应与RSV诱发的病理性肺反应的发生率降低相关。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述病理性肺反应选自由以下组成的组：细支气管周围炎、血管周围炎、间质性肺炎和肺泡炎。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述疫苗鼻内、肌肉内、局部或口服施用。

20.如权利要求14所述的方法，其中所述疫苗以单剂量方案或多剂量方案施用。