CN120437388A - 一种脂肪脱细胞填充材料及其制备方法 - Google Patents
一种脂肪脱细胞填充材料及其制备方法Info
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Abstract
本发明涉及一种脂肪脱细胞填充材料及其制备方法，属于生物医用材料技术领域。本发明通过梯度渗透压裂解‑非离子表面活性剂清洗‑超临界CO2脱脂，协同实现高效去细胞化与细胞外基质结构保护；再通过Pluronic F127‑多巴胺共聚物接枝，突破传统材料被动填充局限多巴胺介导的细胞粘附率提高，促进血管长入与组织再生。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种脂肪脱细胞填充材料及其制备方法。
背景技术
填充材料在再生医学和整形外科中扮演着至关重要的角色。它们被用来修复和替代受损或病变的组织，恢复其结构和功能。传统的填充材料包括自体组织、同种异体组织和合成材料等。自体组织移植，如脂肪移植，由于其高度的生物相容性和低免疫排斥反应，被广泛应用。然而，供体部位的有限性和移植后体积的不稳定性限制了其应用。合成材料如硅胶和羟基磷灰石尽管在一定程度上解决了供体问题，但其生物相容性较差，不能完全整合到宿主组织中，容易引发异物反应和炎症。因此，开发一种既具有良好生物相容性，又能提供足够力学强度和稳定性的填充材料将极具优势。
脂肪脱细胞(Decellularized Adipose Tissue，DAT)技术近年来受到广泛关注。脂肪组织中丰富的细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖等，对细胞的增殖、分化和功能发挥具有重要作用。通过去除脂肪组织中的细胞成分，保留其ECM结构，可以获得一种高生物相容性的填充材料。脱细胞处理后的脂肪组织不仅保留了原有的三维结构和力学特性，还可以减少免疫原性，降低移植后的免疫排斥反应。DAT材料可以作为一种天然的支架材料，促进宿主细胞的黏附、迁移和增殖，最终实现组织的再生和修复。这种材料在软组织填充、创面修复和器官再生等领域具有广阔的应用前景。
尽管脂肪脱细胞填充材料展示了许多优越性，但现有技术仍存在一些不足之处。首先，传统的脱细胞方法，如物理、化学和酶解处理，往往在去除细胞成分的同时，可能损伤ECM的结构和功能，影响材料的生物性能。其次，残留的脱细胞处理试剂，如去污剂和酶，可能对宿主组织产生毒性影响，影响材料的安全性。此外，现有的脱细胞处理流程通常较为复杂和耗时，难以实现大规模生产，限制了其应用。因此，如何优化脱细胞技术，保留ECM的完整性和功能，开发高效、可控的处理流程，成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，获取了一种高效且具有良好生物相容性的脂肪脱细胞填充材料。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织剪碎至1-5mm3碎块，用20-50mM，pH为6.5-7.5的磷酸盐缓冲液冲洗去除游离脂质及血液成分；
(2)将组织碎块浸入pH 7.2-7.6，50-100mOsm/L Tris-HCl缓冲液，2-6℃震荡处理2-4h，使脂肪细胞膨胀破裂；
(3)转入800-1200mOsm/L蔗糖溶液中，15-25℃静置1-2h，收缩组织以去除碎片；
(4)离心收集沉淀物并用20-50mM，pH为6.5-7.5的磷酸盐缓冲液冲洗2-3次；
(5)将沉淀物浸泡于0.5-2％(w/v)聚山梨酯类或Triton X-100非离子表面活性剂溶液，35-39℃震荡处理12-24h，清除残留细胞核成分及膜结合蛋白得到；
(6)采用超临界CO2流体萃取去除中性脂质及残余表面活性剂得到脱细胞细胞外基质微粒；
(7)收集脱脂脱细胞细胞外基质冻干并球磨过筛，获得粒径100-500μm微粒；
(8)将脱细胞细胞外基质微粒浸入5-20％(w/v)Pluronic F127-多巴胺溶液中，4℃交联12-24h，形成共价接枝界面。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(5)所述聚山梨酯类为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(5)所述非离子表面活性剂溶液含0.05-0.1％EDTA。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(6)所述超临界CO2流体萃取分两阶段进行：第一阶段：压力7-8MPa，温度35-40℃，持续2-4h；第二阶段：压力9-10MPa，温度40-45℃，持续2-4h。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(8)所述化学交联采用EDC和NHS，交联剂浓度为10-20mM，反应pH为5.5-6.5。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(8)所述Pluronic F127-多巴胺共聚物制备方法为：
A1、将Pluronic F127溶解于DMSO中(浓度5-15％w/v)，加入琥珀酸酐(PluronicF127与琥珀酸酐摩尔比1:5)，60℃反应18-24h，透析去除未反应试剂，冻干得羧基化Pluronic F127；
A2、将羧基化Pluronic F127溶于pH 6.0的MES缓冲液中，加入EDC使浓度为10-15mM、加入NHS使浓度为5-10mM，15-25℃活化1-2h；
A3、加入多巴胺盐酸盐(Pluronic F127与多巴胺盐酸盐摩尔比1:0.12)，避光条件下搅拌反应12h，透析去除游离多巴胺，冻干得Pluronic F127-多巴胺共聚物。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过三步脱细胞工艺：梯度渗透压裂解-非离子表面活性剂清洗-超临界CO2脱脂，协同实现高效去细胞化与ECM结构保护。
(2)Pluronic F127-多巴胺共聚物接枝，突破传统材料被动填充局限多巴胺介导的细胞粘附率提高。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下。
实施例1
脂肪组织获取自常规脂肪抽吸术的健康女性：
一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织剪碎至3mm3碎块，用30mM，pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗去除游离脂质及血液成分；
(2)将组织碎块浸入pH 7.4，80mOsm/L Tris-HCl缓冲液，4℃震荡处理3h，使脂肪细胞膨胀破裂；
(3)转入1000mOsm/L蔗糖溶液中，20℃静置1.5h，收缩组织以去除碎片；
(4)离心收集沉淀物并用30mM，pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗3次；
(5)将沉淀物浸泡于1％(w/v)Triton X-100非离子表面活性剂溶液，37℃震荡处理20h，清除残留细胞核成分及膜结合蛋白得到；
(6)采用超临界CO2流体萃取去除中性脂质及残余表面活性剂得到脱细胞细胞外基质微粒；
(7)收集脱脂脱细胞细胞外基质冻干并球磨过筛，获得粒径200μm微粒；
(8)将脱细胞细胞外基质微粒浸入10％(w/v)Pluronic F127-多巴胺溶液中，4℃交联16h，形成共价接枝界面；
(9)将功能化ECM微粒(10％w/v)与3％海藻糖溶液混合，加入0.1％抗坏血酸，加入调节pH至6.8-7.4；分装至预充式注射器，γ射线辐照灭菌4℃避光保存。
步骤(5)所述非离子表面活性剂溶液含0.07％EDTA。
步骤(6)所述超临界CO2流体萃取分两阶段进行：第一阶段：压力7MPa，温度37℃，持续3h；第二阶段：压力9MPa，温度42℃，持续3h。
步骤(8)所述化学交联采用质量比为1:1的EDC和NHS，交联剂浓度为15mM，反应pH为6.0。
步骤(8)所述Pluronic F127-多巴胺共聚物制备方法为：
A1、将Pluronic F127溶解于DMSO中(浓度10％w/v)，加入琥珀酸酐(PluronicF127与琥珀酸酐摩尔比1:5)，60℃反应20h，透析去除未反应试剂，冻干得羧基化PluronicF127；
A2、将羧基化Pluronic F127溶于pH 6.0的MES缓冲液中，加入EDC使浓度为12mM、加入NHS使浓度为7mM，20℃活化1.5h；
A3、加入多巴胺盐酸盐(Pluronic F127与多巴胺盐酸盐摩尔比1:0.12)，避光条件下搅拌反应12h，透析去除游离多巴胺，冻干得Pluronic F127-多巴胺共聚物。
实施例2
脂肪组织获取自常规脂肪抽吸术的健康女性：
一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织剪碎至4mm3碎块，用20mM，pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗去除游离脂质及血液成分；
(2)将组织碎块浸入pH 7.4，80mOsm/L Tris-HCl缓冲液，4℃震荡处理3h，使脂肪细胞膨胀破裂；
(3)转入1000mOsm/L蔗糖溶液中，20℃静置1.5h，收缩组织以去除碎片；
(4)离心收集沉淀物并用30mM，pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗3次；
(5)将沉淀物浸泡于1％(w/v)吐温40非离子表面活性剂溶液，37℃震荡处理20h，清除残留细胞核成分及膜结合蛋白得到；
(6)采用超临界CO2流体萃取去除中性脂质及残余表面活性剂得到脱细胞细胞外基质微粒；
(7)收集脱脂脱细胞细胞外基质冻干并球磨过筛，获得粒径300μm微粒；
(8)将脱细胞细胞外基质微粒浸入5％(w/v)Pluronic F127-多巴胺溶液中，4℃交联16h，形成共价接枝界面；
(9)将功能化ECM微粒(10％w/v)与3％海藻糖溶液混合，加入0.1％抗坏血酸，加入调节pH至6.8-7.4；分装至预充式注射器，γ射线辐照灭菌4℃避光保存。
步骤(5)所述非离子表面活性剂溶液含0.07％EDTA。
步骤(6)所述超临界CO2流体萃取分两阶段进行：第一阶段：压力7MPa，温度37℃，持续3h；第二阶段：压力9MPa，温度42℃，持续3h。
步骤(8)所述化学交联采用质量比为1:1的EDC和NHS，交联剂浓度为15mM，反应pH为6.0。
步骤(8)所述Pluronic F127-多巴胺共聚物制备方法为：
A1、将Pluronic F127溶解于DMSO中(浓度10％w/v)，加入琥珀酸酐(PluronicF127与琥珀酸酐摩尔比1:5)，60℃反应20h，透析去除未反应试剂，冻干得羧基化PluronicF127；
A2、将羧基化Pluronic F127溶于pH 6.0的MES缓冲液中，加入EDC使浓度为12mM、加入NHS使浓度为7mM，20℃活化1.5h；
A3、加入多巴胺盐酸盐(Pluronic F127与多巴胺盐酸盐摩尔比1:0.12)，避光条件下搅拌反应12h，透析去除游离多巴胺，冻干得Pluronic F127-多巴胺共聚物。
实施例3
脂肪组织获取自新鲜的猪小肠脂肪组织：
一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织剪碎至1mm3碎块，用50mM，pH为7.5的磷酸盐缓冲液冲洗去除游离脂质及血液成分；
(2)将组织碎块浸入pH 7.6，100mOsm/L Tris-HCl缓冲液，6℃震荡处理4h，使脂肪细胞膨胀破裂；
(3)转入800mOsm/L蔗糖溶液中，25℃静置2h，收缩组织以去除碎片；
(4)离心收集沉淀物并用50mM，pH为7.5的磷酸盐缓冲液冲洗3次；
(5)将沉淀物浸泡于0.5％(w/v)吐温20非离子表面活性剂溶液，39℃震荡处理24h，清除残留细胞核成分及膜结合蛋白得到；
(6)采用超临界CO2流体萃取去除中性脂质及残余表面活性剂得到脱细胞细胞外基质微粒；
(7)收集脱脂脱细胞细胞外基质冻干并球磨过筛，获得粒径100-500μm微粒；
(8)将脱细胞细胞外基质微粒浸入10％(w/v)Pluronic F127-多巴胺溶液中，4℃交联24h，形成共价接枝界面；
(9)将功能化ECM微粒(10％w/v)与3％海藻糖溶液混合，加入0.1％抗坏血酸，加入调节pH至6.8-7.4；分装至预充式注射器，γ射线辐照灭菌4℃避光保存。
步骤(5)所述非离子表面活性剂溶液含0.05％EDTA。
步骤(6)所述超临界CO2流体萃取分两阶段进行：第一阶段：压力8MPa，温度40℃，持续4h；第二阶段：压力10MPa，温度45℃，持续4h。
步骤(8)所述化学交联采用质量比为1:1的EDC和NHS，交联剂浓度为10mM，反应pH为5.5。
步骤(8)所述Pluronic F127-多巴胺共聚物制备方法为：
A1、将Pluronic F127溶解于DMSO中(浓度5％w/v)，加入琥珀酸酐(Pluronic F127与琥珀酸酐摩尔比1:5)，60℃反应18h，透析去除未反应试剂，冻干得羧基化PluronicF127；
A2、将羧基化Pluronic F127溶于pH 6.0的MES缓冲液中，加入EDC使浓度为10mM、加入NHS使浓度为5mM，25℃活化2h；
A3、加入多巴胺盐酸盐(Pluronic F127与多巴胺盐酸盐摩尔比1:0.12)，避光条件下搅拌反应12h，透析去除游离多巴胺，冻干得Pluronic F127-多巴胺共聚物。
实施例4
脂肪组织获取自新鲜的猪小肠脂肪组织：
一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织剪碎至1mm3碎块，用50mM，pH为7.5的磷酸盐缓冲液冲洗去除游离脂质及血液成分；
(2)将组织碎块浸入pH 7.6，100mOsm/L Tris-HCl缓冲液，6℃震荡处理4h，使脂肪细胞膨胀破裂；
(3)转入800mOsm/L蔗糖溶液中，25℃静置2h，收缩组织以去除碎片；
(4)离心收集沉淀物并用50mM，pH为7.5的磷酸盐缓冲液冲洗3次；
(5)将沉淀物浸泡于0.5％(w/v)吐温80非离子表面活性剂溶液，39℃震荡处理24h，清除残留细胞核成分及膜结合蛋白得到；
(6)采用超临界CO2流体萃取去除中性脂质及残余表面活性剂得到脱细胞细胞外基质微粒；
(7)收集脱脂脱细胞细胞外基质冻干并球磨过筛，获得粒径100-500μm微粒；
(8)将脱细胞细胞外基质微粒浸入20％(w/v)Pluronic F127-多巴胺溶液中，4℃交联24h，形成共价接枝界面；
(9)将功能化ECM微粒(10％w/v)与3％海藻糖溶液混合，加入0.1％抗坏血酸，加入调节pH至6.8-7.4；分装至预充式注射器，γ射线辐照灭菌4℃避光保存。
步骤(5)所述非离子表面活性剂溶液含0.05％EDTA。
步骤(6)所述超临界CO2流体萃取分两阶段进行：第一阶段：压力8MPa，温度40℃，持续4h；第二阶段：压力10MPa，温度45℃，持续4h。
步骤(8)所述化学交联采用质量比为1:1的EDC和NHS，交联剂浓度为10mM，反应pH为5.5。
步骤(8)所述Pluronic F127-多巴胺共聚物制备方法为：
A1、将Pluronic F127溶解于DMSO中(浓度5％w/v)，加入琥珀酸酐(Pluronic F127与琥珀酸酐摩尔比1:5)，60℃反应18h，透析去除未反应试剂，冻干得羧基化PluronicF127；
A2、将羧基化Pluronic F127溶于pH 6.0的MES缓冲液中，加入EDC使浓度为10mM、加入NHS使浓度为5mM，25℃活化2h；
A3、加入多巴胺盐酸盐(Pluronic F127与多巴胺盐酸盐摩尔比1:0.12)，避光条件下搅拌反应12h，透析去除游离多巴胺，冻干得Pluronic F127-多巴胺共聚物。
对比例1
在实施例1的基础上，仅用单一低渗溶液：将组织碎块浸入pH 7.4，80mOsm/LTris-HCl缓冲液，4℃震荡处理4.5h，其余与实施例1保持一致。
对比例2
在实施例1的基础上，超临界CO2改为单一阶段萃取(7MPa，37℃，6h)，其余与实施例1保持一致。
对比例3
在实施例1的基础上，超临界CO2改为单一阶段萃取(9MPa，42℃，6h)，其余与实施例1保持一致。
对比例4
在实施例1的基础上，步骤(8)改为将脱细胞细胞外基质微粒浸入2％(w/v)Pluronic F127-多巴胺溶液中，其余与实施例1保持一致。
对比例5
在实施例1的基础上，步骤(8)改为将脱细胞细胞外基质微粒浸入40％(w/v)Pluronic F127-多巴胺溶液中，其余与实施例1保持一致。
性能测试：
脂质残留：索氏提取法(使用氯仿-甲醇混合溶剂)测定中性脂质含量，残留率(％)＝(残留脂质质量/材料干重)×100％。
相容性测试：将材料微粒与细胞直接共培养，通过活死染色(Calcein-AM/PI)法评估细胞存活率。
通过动态温度扫描(25℃至37℃)测定储溶胶-凝胶转变温度。
| 脂质残留量/％ | 细胞存活率/％ | 温敏凝胶形成/℃ | |
| 实施例1 | 2.5 | 96 | 32 |
| 实施例2 | 2.6 | 95 | 33 |
| 实施例3 | 3.1 | 93 | 32 |
| 实施例4 | 3.3 | 92 | 31 |
| 对比例1 | 18.6 | 78 | 不能形成凝胶 |
| 对比例2 | 8.3 | 85 | 35 |
| 对比例3 | 5.3 | 80 | 33 |
| 对比例4 | 3.1 | 89 | 部分形成凝胶 |
| 对比例5 | 3.0 | 72 | 脆性凝胶 |
脂质残留控制：
通过实施例1-4脂质残留2.5-3.3％，而对比例1因缺乏高渗步骤残留达18.6％，证明梯度渗透压对脂质排出的必要性。超临界CO2分阶段萃取脂质去除效率显著优于单阶段低压(对比例2：8.3％)或高压(对比例3：5.7％)。对于生物相容性平衡：实施例1-4细胞存活率达92-96％；对比例1由于脂质残留多不能形成凝胶对比例4在低浓度多巴胺接枝可能导致黏附不足，只能部分转为凝胶，而对比例5高浓度多巴胺接枝引发毒性(存活率72％)及材料脆性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何间接修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将脂肪组织置于梯度渗透压溶液中，通过低渗膨胀与高渗收缩处理，裂解脂肪细胞膜，保留细胞外基质结构；
(2)使用非离子表面活性剂溶液清除残留细胞核成分及膜结合蛋白；
(3)采用超临界CO2流体萃取去除中性脂质及残余表面活性剂得到脱细胞细胞外基质微粒；
(4)将脱细胞细胞外基质微粒与Pluronic F127-多巴胺共聚物溶液混合，通过化学交联在微粒表面接枝共聚物，所述多巴胺接枝率为5-15％。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述梯度渗透压溶液包括低渗溶液和高渗溶液；所述低渗溶液为50-100mOsm/L的Tris-HCl缓冲液，高渗溶液为800-1200mOsm/L的蔗糖溶液。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，其特征在于：所述低渗膨胀处理时间为2-4h，高渗收缩处理为时间为1-2h。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述非离子表面活性剂选自聚山梨酯类或Triton X-100，浓度为0.5-2％w/v。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述超临界CO2流体萃取分两阶段进行：第一阶段：压力7-8MPa，温度35-40℃，持续2-4h；第二阶段：压力9-10MPa，温度40-45℃，持续2-4h。
6.根据权利要求1所述的一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述化学交联采用EDC和NHS，交联剂浓度为10-20mM，反应pH为5.5-6.5。
7.根据权利要求1所述的一种脂肪脱细胞填充材料的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述Pluronic F127-多巴胺共聚物制备方法为：将Pluronic F127用琥珀酸酐羧基化，加入EDC和NHS活化后，添加多巴胺盐酸盐，避光反应，得Pluronic F127-多巴胺共聚物。
8.一种脂肪脱细胞填充材料，其特征在于，由权利要求1所述制备方法获得。
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2025
- 2025-05-06 CN CN202510576118.7A patent/CN120437388A/zh active Pending
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