CN120436336A - 不溶性膳食纤维-egcg复合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种不溶性膳食纤维‑EGCG复合物、其制备方法及应用，属于食品加工领域。所述不溶性膳食纤维‑EGCG复合物的制备方法包括：将不溶性膳食纤维分散于磷酸盐缓冲液中，充分膨胀后与溶解于磷酸盐缓冲液的EGCG溶液混合均匀，室温下放置一段时间，离心后取沉淀物干燥，制得不溶性膳食纤维‑EGCG复合物。本发明的不溶性膳食纤维‑EGCG复合物显著缓解小鼠结肠炎模型中的肠道炎症，效果远优于单独使用HPSIDF或EGCG；且HPSIDF‑EGCG复合物对肠道菌群‑免疫轴协同调控，改善肠道屏障功能，吸附反应条件温和，适合工业化生产，有望开发成为高附加值的产品。

Description

不溶性膳食纤维-EGCG复合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物、其制备方法及应用。

背景技术

豆渣作为富含营养、安全性好的食品原辅料，属于尚未充分利用的宝贵资源，其有着良好的发展趋势与较大的市场发展空间。豆渣中所含有的膳食纤维被称为“第七营养素”，是一类具有独特营养的功能性食品成分。其中不溶性膳食纤维占膳食纤维总量的90%以上。不溶性膳食纤维的成分包括纤维素、半纤维素、木质素和抗性淀粉等，因其独特的功能性与生理作用，使其具有良好的保健功能，包括促进肠道蠕动、改善糖尿病病情、增进心血管健康、减少肥胖及延缓慢性病的发生等。

膳食纤维具有疏松多孔的结构，具有良好的吸附性，因其特殊的结构特征，通常被用作对于淀粉酶的吸附，进而达到膳食纤维降脂的作用，甚至是用于吸附重金属离子，如硝酸铅、硝酸锌、硝酸铜和硝酸铬等。同时，膳食纤维还有一定吸附有害物质的能力，如吸附葡萄糖、胆固醇、胆酸钠及丙烯酰胺等。从豆渣中提取出的豆渣不溶性膳食纤维具有良好的持水性、膨胀性、持油性，对提高豆渣膳食纤维的附加值和促进综合利用具有积极的作用。

豆渣不溶性膳食纤维针对急性肠炎与慢性肠炎均有改善肠道炎症的作用，若以豆渣不溶性膳食纤维进行对肠炎的预防，试验证明，长期摄入豆渣不溶性膳食纤维后，在结肠炎出现时在一定程度上起到了抵抗和预防损伤的作用，但是作用均不够显著。

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是一种多酚，是茶多酚（Green TeaPolyphenols）中最有效的生物活性成分，属于儿茶素，广泛应用于保健品的应用与生产。它是绿茶中主要的活性和水溶性成分，是儿茶素含量最高的组分，因其具有特殊的立体化学结构，EGCG具有非常强的抗氧化活性，抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，能够保护细胞和DNA免受损害。在医药保健方面，EGCG具有防治癌症等多种疾病的发生和增强免疫力等功能；在食品工业中，可以用作抗氧剂。

EGCG对抗炎有着很强的作用。研究发现EGCG在体内和体外通过抑制NF-κB的生成和其活性，从而发挥抗炎作用；EGCG通过抑制IL-1β信号转导途径，抑制IL-1β分泌而抑制炎症反应；此外，EGCG可以通过TNF-α阻断IL-8释放，发挥潜在的抗炎和抗氧化作用。但是，单独使用EGCG容易出现如下问题：（1）肝肾毒性：高剂量的EGCG可能导致肝肾功能损害。例如，有研究表明，长期或高剂量摄入EGCG可能引起肝脏损伤和肾功能衰竭，这与剂量、纯度以及个体差异有关；（2）胃肠道反应：EGCG可能引起恶心、呕吐、腹泻、便秘等胃肠道不适症状；这些副作用通常与剂量相关，尤其是超过每日800毫克时更为显著；（3）低血糖和贫血：EGCG抑制肝脏的糖异生作用，可能引发低血糖症状；此外，由于其抑制铁吸收的作用，长期使用可能导致贫血；（4）神经系统影响：EGCG可能产生类似苯二氮卓类药物的抗焦虑作用，导致头晕、失眠等中枢神经系统症状；（5）细胞毒性：在高浓度下，EGCG对细胞具有毒性作用，可能影响细胞周期并导致细胞死亡；例如，研究表明，当EGCG浓度超过100μM时，会引发氧化DNA损伤和细胞毒性。这些弊端都限制了EGCG的使用和发展。

随着食品工业的迅猛发展，单一的食品体系已不再能满足人们对口感、功能甚至是健康方面的需求，复合型食品体系（如多糖、多酚、蛋白质的复合）应运而生，但如何使多酚与膳食纤维相互作用在现今行业当中还属于空白，还有待深入研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种不溶性膳食纤维-EGCG复合物及其制备方法，以期至少部分地解决上述技术问题。

为了实现上述目的，作为本发明的第一个方面，提出了一种不溶性膳食纤维-EGCG复合物的制备方法，包括以下步骤：

将不溶性膳食纤维分散于磷酸盐缓冲液中，与溶解于磷酸盐缓冲液的EGCG溶液混合均匀，室温下放置一段时间，离心后取沉淀物干燥，制得所述不溶性膳食纤维-EGCG复合物。

作为本发明的第二个方面，还提出了一种采用如上所述的制备方法制备得到的不溶性膳食纤维-EGCG复合物。

作为本发明的第三个方面，还提出了一种如上所述的不溶性膳食纤维-EGCG复合物在食品添加剂中的应用。

基于上述技术方案可知，本发明的不溶性膳食纤维-EGCG复合物及其制备方法，相对于现有技术，至少具备如下有益效果之一：

1、本发明中的HPSIDF-EGCG复合物通过抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子释放，显著缓解小鼠结肠炎模型中的肠道炎症，效果远优于单独使用HPSIDF或EGCG；而且HPSIDF-EGCG复合物对肠道菌群-免疫轴协同调控，HPSIDF作为一种不溶性膳食纤维，已经通过团队证明可以促进短链脂肪的产生，改善肠道屏障功能，协同抑制炎症因子的释放；

2、本发明中的HPSIDF-EGCG复合物在模拟胃液和肠液中的保留率分别达到80.1%和86.6%，EGCG通过HPSIDF的孔隙吸附形成稳定结构，避免胃酸降解；尤其当豆渣不溶性膳食纤维与EGCG组合成复合物时，突破了EGCG的生物利用度瓶颈，因HPSIDF具有多孔结构，能够对EGCG进行物理吸附、包埋，延缓EGCG的释放；

3、本发明中的HPSIDF-EGCG复合物清除活性氧（ROS）的效率提升30%，并显著提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，有效缓解氧化应激；

4、本发明中以豆渣为原料，结合EGCG构建复合物，提升豆渣膳食纤维生理功能，实现大豆副产物的功能性升级，推动环保与经济效益双赢，最终有效实现了食品加工副产物向健康食品原料的升级转型；

5、本发明中利用复合酶法提取HPSIDF的工艺成熟，吸附反应条件温和，适合工业化生产；并且，HPSIDF与EGCG两种功能性食品原料，其独特的饱腹感与抗炎抗氧化特性，促进肠道蠕动等功能，有望开发成为高附加值的产品，如：肠道健康食品、运动营养食品和银发食品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明的HPSIDF-EGCG复合物制备方法的流程示意图；

图2为不同实验组的小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的柱状图，其中图2A为血清炎症水平，图2B为组织炎症水平；

图3为不同实验组的小鼠白介素1β（IL-1β）水平的柱状图，其中，图3A为血清炎症水平，图3B为组织炎症水平；

图4为不同实验组的小鼠白介素6（IL-6）水平的柱状图，其中，图4A为血清炎症水平，图4B为组织炎症水平；

图5为不同实验组的小鼠白介素8（IL-8）水平的柱状图，其中，图5A为血清炎症水平，图5B为组织炎症水平；

图6为不同实验组的组织中MPO水平的柱状图；

图7为不同实验组的组织中ROS水平的柱状图；

图8为不同实验组的组织中SOD水平的柱状图；

图9为不同实验组的急性溃疡性结肠炎小鼠的肠道长度的柱状图；

图10为不同实验组的急性溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的H&E染色图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

在本发明中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明实施例。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其它含义。

不溶性膳食纤维因其良好的持水性、膨胀性和结构稳定性，被广泛应用于食品工业中。

例如：不溶性膳食纤维可以改善面团的质地和结构，使烘焙食品形成更好的形状和质地；或者

在酸奶中，添加不溶性膳食纤维能够增加酸奶的黏度，缩短发酵时间，并改善口感；或者

在面包、饼干、饮料等食品中，不溶性膳食纤维通过提供体积和改善肠道健康功能，成为重要的功能性成分，等等。

其中一项比较重要的应用是将其与其它物质复合，发挥彼此协同的作用，例如：吸附与清除作用：不溶性膳食纤维可以通过与金属离子形成复合物来吸附有害物质，例如清除一氧化氮（NO）。研究表明，膳食纤维的羧基和金属离子之间可以形成桥接作用，从而生成膳食纤维-金属离子-NO复合物，进而清除NO。

抗氧化功能：不溶性膳食纤维被用于包埋抗氧化剂（如葛根素），通过微胶囊技术提高其在体内的释放效率和生物利用度。例如，猴头菇不溶性膳食纤维被用作壁材，成功包埋葛根素，显著提高了抗氧化剂的缓释效果。

降脂功能：不溶性膳食纤维通过结合胆固醇胶束和胆酸盐，抑制胰脂肪酶活性，从而发挥降脂作用。例如，橘皮不溶性膳食纤维对大豆油吸附能力强，并能显著抑制胰脂肪酶活性。

但是，经检索发现，现有技术中不溶性膳食纤维通常被用于吸附如金属离子、胆固醇等物质，但与多酚类物质，如EGCG的复合则还是空白，并没有现成案例，说明虽然膳食纤维吸附其它成分常见，但与EGCG的结合并未被探索。且EGCG因为分子量相对较大，本身可以直接使用，通常也未想到要将其与膳食纤维复合。

为了解决传统方法制备的膳食纤维功能单一，未发展膳食纤维与多酚的复合体系，以及多酚与纤维的稳定结合技术尚未成熟，导致复合物在体内保留率低、效果不显著等问题，本发明人对不溶性膳食纤维，尤其是豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）与多酚表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），以及两者的复合均进行了深入的研究，并提出了如下优选的方案，经过多项实验验证证明，所述复合物可以充分发挥两者的协同效应，效果证实远超预期，其在模拟胃肠液中的保留率显著克服了EGCG在酸性条件下易分解的问题，体内动物试验的结果展示了复合物在抗炎和抗氧化作用上的协同效应，在炎症因子水平测定中，复合物组别的效果均显著优于单一组分，这些数据表明复合物的效果并非简单叠加，而是协同增效，是现有技术无法预测的协同效果，且EGCG对于HPSIDF整体体系的添加有效地促进了有益菌阿克曼菌属的产生；在对比范例中，米糠膳食纤维对于蓝莓多酚的吸附效果受温度影响大，而豆渣不溶性膳食纤维在相同条件下表现得更加稳定，进一步证明了豆渣不溶性膳食纤维与EGCG的结合具有特定优势。

具体地，本发明提出了一种不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物的制备方法，包括以下步骤：

将不溶性膳食纤维分散于磷酸盐缓冲液中，充分膨胀后与溶解于磷酸盐缓冲液的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）溶液混合均匀，在室温下放置一段时间，离心后取沉淀物干燥，制得不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物。

上述制备步骤中，不溶性膳食纤维分散于磷酸盐缓冲液中尽量充分膨胀20-60min，优选为30 min。本文中“充分膨胀”是指在特定条件下，不溶性纤维在接触水或其他溶剂后，能够吸收并保持大量水分，从而显著增加其体积的现象，即按照本领域公知的含义进行理解。

上述制备步骤中，不溶性膳食纤维与溶解于磷酸盐缓冲液的EGCG溶液在室温下最好放置1-4小时，优选2小时。其中，通过体外表征结果表明，在放置期间，HPSIDF-EGCG复合物以非共价的形式，例如强氢键、疏水相互作用以及微弱的静电相互作用进行反应结合，因此这个放置是只要保证两者混合在一起即可，可以是静置，也可以是缓慢搅动或剧烈搅动。

上述制备步骤中，离心后的沉淀物例如可以通过真空抽滤后阴干、真空冷冻干燥等方式进行干燥。

上述制备步骤中，不溶性膳食纤维主要来源可以是植物性食物，尤其是谷物、豆类、坚果、蔬菜和水果的外壳或纤维部分，例如从黄精渣中提取，或者从莴苣叶中提取，等等。作为优选，不溶性膳食纤维采用豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF），其可以与EGCG构建更优的复合体系，具有协同增效的发展空间。

具体地，豆渣不溶性膳食纤维例如可以是由脱脂豆粕通过复合酶法制备得到。

需要说明的是，脱脂豆粕的溶解是指将脱脂豆粕与溶剂混合，使豆粕中的成分分散在溶剂中形成均匀体系的过程。

优选的，所述复合酶法制备方法的具体步骤包括：

将脱脂豆粕溶解后依次加入α-淀粉酶、中性蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶，酶解后进行洗涤，选取不溶的固体物质，具体例如通过水洗、离心、醇沉、抽滤并真空冷冻干燥，得到所述豆渣不溶性膳食纤维。

优选的，所述反应体系中豆渣不溶性膳食纤维的质量浓度例如为2 mg/mL，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度例如为0.2～0.6mg/mL，从而豆渣不溶性膳食纤维与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量比例如为3.3~10：1，优选为5：1。

优选的，反应完离心取沉淀物的步骤中，离心条件例如为：转速7500 r/min，离心时间10-15 min。

优选的，所述不溶性膳食纤维-EGCG复合物吸附EGCG的吸附率为15-20%，吸附量为0.03～0.04 g/g。

优选的，所述不溶性膳食纤维-EGCG复合物在pH为1.2的模拟胃液中的保留率≥80%，在pH为6.8的模拟肠液中的保留率≥85%。

本发明还提出了一种采用上述的制备方法制备得到的不溶性膳食纤维-EGCG复合物。

本发明还提出了一种如上所述的不溶性膳食纤维-EGCG复合物在食品添加剂中的应用。

下文将通过具体实施例来对本发明作进一步阐述说明。需要注意的是，下述的实施例仅是举例说明，而不是用于限定本发明。基于本发明下文展示的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明实施例保护的范围。

实施例1

豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复配比例的筛选。

参照图1，称量经过复合酶法提取的豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）2份（40 mg），溶于1份（20 mL）PBS缓冲液（pH 7.0-7.2）中，得到HPSIDF的质量浓度为2 mg/mL（w/v），称量4mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）溶解于20 mL PBS缓冲液中，得到表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度为0.2 mg/mL（w/v）的溶液，将两种溶液混匀，于室温下充分反应2h，此时表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）占总反应体系的质量浓度为0.1 mg/mL（w/v）。在7500 r/min的条件下进行离心，取沉淀物真空冷冻干燥，得到豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物。

实施例2

称量6 mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）溶解于20 mL PBS缓冲液中，得到表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度为0.3 mg/mL（m/v）的溶液，将两种溶液混匀，于室温下充分反应2h，此时表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）占总反应体系的质量浓度为0.15 mg/mL（w/v）。在7500 r/min的条件下进行离心，取沉淀物真空冷冻干燥，得到复配比例不同的豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物。

实施例3

称量8 mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）溶解于20 mL PBS缓冲液中，得到表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度为0.4 mg/mL（m/v）的溶液，将两种溶液混匀，于室温下充分反应2h，此时表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）占总反应体系的质量浓度为0.2 mg/mL（w/v）。在7500 r/min的条件下进行离心，取沉淀物真空冷冻干燥，得到复配比例不同的豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物。

实施例4

称量10 mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）溶解于20 mL PBS缓冲液中，得到表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度为0.5 mg/mL（m/v）的溶液，将两种溶液混匀，于室温下充分反应2h，此时表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）占总反应体系的质量浓度为0.25 mg/mL（w/v）。在7500 r/min的条件下进行离心，取沉淀物真空冷冻干燥，得到复配比例不同的豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物。

实施例5

称量12 mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）溶解于20 mL PBS缓冲液中，得到表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度为0.6 mg/mL（m/v）的溶液，将两种溶液混匀，于室温下充分反应2h，此时表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）占总反应体系的质量浓度为0.3 mg/mL（w/v）。在7500 r/min的条件下进行离心，取沉淀物真空冷冻干燥，得到复配比例不同的豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物。

对实施例1-5制备的豆渣不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物进行如下测定：

豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）对表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）吸附能力的测定

通过福林酚（Folin-Ciocalteu，FC）法测定所得豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的含量。取复合物样品0.5 mL（0.2 mg/mL）与2.5 mL的FC试剂（0.2N）反应10 min，加入2 mL的Na₂CO₃（75mg/mL），涡旋混匀，置于室温下避光反应2h，用酶标仪在760 nm处测量其吸光度。吸附的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量通过绘制表没食子儿茶素没食子酸酯浓度的标准曲线来计算。

豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）对表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的吸附率根据公式（1）计算：

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）吸附率（%）=

×100 （1）。

豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）对表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的吸附量根据公式（2）计算：

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）吸附量（g/g）=（2）。

式中：C0为吸附前表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）在溶液体系中质量浓度（mg/mL）；Ct为吸附后上清液中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）质量浓度（mg/mL）；V为吸附反应发生时溶液总体积（mL）；m为豆渣不溶性膳食纤维质量（mg）。

结果见表1，从表中可以看出，在豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的复配比例为20:4时，吸附率达到了18%，吸附量（每克HPSIDF结合EGCG的含量）达到了0.035 g/g。为了方便描述，本发明中仅选取吸附量作为范围限定标准来确定保护范围。

表1吸附特性结果列表

对比例1

具体制备步骤同实施例1，区别仅在于采用米糠不溶性膳食纤维来代替豆渣不溶性膳食纤维。将两者的蓝莓多酚吸附量进行对比，得到如下结论：

米糠不溶性膳食纤维可吸附蓝莓多酚，在环境因素不同的情况下，米糠不溶性膳食纤维对于蓝莓多酚的吸附量存在于不同区间。在同等中性条件（pH 7.0-7.2）下，米糠不溶性膳食纤维对于蓝莓多酚吸附量达到0.03～0.04（g/g）区间。但温度与米糠不溶性膳食纤维吸附蓝莓多酚的含量呈负相关趋势，随着温度从室温升高至55℃，米糠不溶性膳食纤维对于蓝莓多酚的吸附量从0.05-0.10区间降至0.00-0.05区间。说明豆渣不溶性膳食纤维具有良好的吸附能力。

对豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物的体外模拟消化。

1、模拟消化液的制备。

模拟消化液的制备方法根据美国药典（United States Pharmacopoeia，USP）方法进行配制，具体方法如下：

模拟胃液（Simulated gastric fluid，SGF）的配制：取2g氯化钠（NaCl）和3.2g胃蛋白酶，加入7mL盐酸（HCl），使用无菌水定容至1L即得模拟胃液，此时模拟胃液的pH应为1.2左右。

模拟肠液（Simulated Intestinal fluid，SIF）的配制：取磷酸二氢钾（KH₂PO₄）6.8g，加入无菌水250 mL溶解，加入0.2 mol/L氯化钠（NaCl）溶液77 mL和500 mL无菌水，再加10g胰蛋白酶溶解后，使用0.2 mol/L氢氧化钠（NaOH）或稀盐酸（HCl）溶液调整pH至6.8左右，使用无菌水定容至1L即得模拟肠液。

2、体外模拟消化的方法。

在模拟胃液消化时加入适量体积的模拟胃液，使表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度（w/v）达到1 mg/mL，在37℃条件下进行水浴混合2h。

在模拟肠液消化时加入适量体积的模拟肠液，使表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量浓度（w/v）达到1 mg/mL，在37℃条件下进行水浴混合4h。

3、保留率的测定。

通过福林酚（Folin-Ciocalteu，FC）法测定，豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）对于表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的吸附作用具有一定的稳定性。根据绘制的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）浓度的标准曲线进行计算，豆渣不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物在经过模拟胃液消化后，其强酸的环境消化分解出一部分豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物，被消化分解的不稳定游离酚扩散在溶液中，所得的保留率为80.1%；豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物在经过模拟肠液消化后，所得的保留率为86.6%。因此，推测豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物在胃中经过消化分解后到达肠道保留率可达到69.3%，豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）的孔洞吸附表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）形成了在中性条件下的稳定结构。

对实施例1-5制备的豆渣不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物进行动物试验。

1、动物的选择。

选择健康成年的雄性C57BL/6小鼠60只，将小鼠随机分配为5组，每组12只，饲喂不同饮食，分别为：

A组：正常对照组（Control）：普通饲料；

B组：模型对照组（DSS）：普通饲料+硫酸葡聚糖造模；

C组：干预组（DSS+HPSIDF）：普通饲料+硫酸葡聚糖造模+豆渣不溶性膳食纤维；

D组：干预组（DSS+EGCG）：普通饲料+硫酸葡聚糖造模+表没食子儿茶素没食子酸酯；

E组：干预组（DSS+HPSIDF-EGCG）：普通饲料+硫酸葡聚糖造模+豆渣不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物。

在图9中，A组：正常对照组（Control）；B组：模型对照组（DSS）；C组：干预组（DSS+HPSIDF）；D组：干预组：（DSS+EGCG）；E组：干预组（DSS+HPSIDF-EGCG）。

小鼠造模前各组给予基础饲料适应性喂养1周，待其代谢状态稳定后随机分成5组，一组给予饮用水和普通饲料，作为正常对照组；一组饮用硫酸葡聚糖溶液并给予普通饲料，作为模型对照组；一组饮用硫酸葡聚糖溶液、给予普通饲料并额外摄入10 mg/天的豆渣不溶性膳食纤维进行喂养，作为干预组；一组饮用硫酸葡聚糖溶液、给予普通饲料并额外摄入10 mg/天的豆渣不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物，作为干预组；一组饮用硫酸葡聚糖溶液、给予普通饲料并额外摄入0.35 g/天的表没食子儿茶素没食子酸酯，作为干预组。每6只分笼。每天光照时间12h，温度控制在20±2℃，湿度50±5%。在小鼠喂养7天后，眼球取血处死。处死前进行称重，处死后打开小鼠腹腔，立即分离小鼠的结肠，从结肠的远端和近端各取0.5cm的结肠组织用于苏木精-伊红（H&E）染色。

2、小鼠组织样品的制备。

小鼠处死后立即打开腹腔，从完整的结肠组织中取出0.2g结肠组织放入5mL离心管中，用移液枪加2 mL PBS缓冲液，且将5 mL的离心管底部放入到盛有冰的容器中，左手持便携式匀浆机，速度控制在10000-15000 r/min，右手将捣杆垂直插入5 mL离心管中，研磨数十次（6-8 min），充分研磨，使结肠组织充分匀浆化。将匀浆所得的组织液按照4℃下3000r/min离心15 min，随后取得上清液留存待检。

3、炎症因子水平的测定。

小鼠结肠组织中白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、髓过氧化物酶抗体（MPO）、活性氧含量（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）与肿瘤坏死因子（TNF-α）的指标严格按照酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒说明书进行操作。

结果及分析：

图2A、2B均为不同实验组的小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的柱状图。其中，不同柱体上方的表示水平的不同字母代表存在显著性差异（p<0.05）；图2A为血清炎症水平，图2B为组织炎症水平。

图3A、3B均为不同实验组的小鼠白介素1β（IL-1β）水平的柱状图。其中，不同柱体上方的不同字母代表存在显著性差异（p<0.05）；图3A为血清炎症水平，图3B为组织炎症水平。

图4为本发明的豆渣不溶性膳食纤维对于表没食子儿茶素没食子酸酯的质量浓度与吸附率的折线图。

图5A、5B均为不同实验组的小鼠白介素8（IL-8）水平的柱状图。其中，不同柱体上方的不同小写字母代表存在显著性差异（p<0.05）；图5A为血清炎症水平，图5B为组织炎症水平。

图6为不同实验组的组织中MPO水平的柱状图。其中，不同柱体上方的不同字母代表存在显著性差异（p<0.05）。

图7为不同实验组的组织中ROS水平的柱状图。其中，不同字母代表存在显著性差异（p<0.05）。

图8为不同实验组的组织中SOD水平的柱状图。其中，不同字母代表存在显著性差异（p<0.05）。

图9为不同实验组的急性溃疡性结肠炎小鼠的肠道长度的柱状图。其中，不同字母代表存在显著性差异（p<0.05）。

从上述图2A-图9可以看出，与B组模型对照组相比，A组正常对照组与E组干预组均显著低于B组模型对照组，摄入豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物能够一定程度上降低机体免疫细胞释放IL-1β，缓解机体受损；与B组模型对照组相比，E组干预组显著低于B组模型对照组，摄入豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物有效地缓解了IL-6的过度释放；与A组正常对照组、B组模型对照组相比，E组干预组均有显著的变化，摄入豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物在一定程度上抑制了IL-8的释放，避免了中性粒细胞的聚集，缓解了炎症反应；与B组模型对照组相比，E组干预组显著降低，摄入豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物后一定程度上降低了MPO的水平，能够促使机体释放MPO参与炎症的调控；与B组模型对照组相比，E组干预组与D组干预组的数值十分接近，且显著降低，摄入豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物可以使机体ROS水平逐渐向A组正常对照组发展；与A组正常对照组相比，E组干预组的SOD水平有向健康组炎症水平接近的趋势，摄入豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物能够抑制机体内部氧自由基的生成，缓解氧化应激情况；与B组模型对照组相比，E组干预组的TNF-α水平显著降低，通常情况下，TNF-α水平越高，代表机体炎症越重，摄入豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物有效缓解了炎症。

综上结果表明，豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物同时具有良好的抗炎能力，同时，作为具有益生元潜能的多糖-多酚复合物对DSS诱导的急性肠炎具有保护作用；同时，比较了单独干预豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）与单独干预表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的两种干预方法，豆渣不溶性膳食纤维（HPSIDF）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）复合物在小鼠体内的各项指标均优于单独干预组，证明这种多糖-多酚复合物在一定程度上起到了协同增效的作用。

4、急性溃疡性结肠炎小鼠结肠组织状态与苏木精-伊红（H&E）染色的测定。

小鼠处死后立即打开腹腔，取出完整的结肠组织，以测量长度。用PBS溶液冲洗结肠，以清除其中的粪便。从结肠的远端和近端各取约0.5cm的组织样本，进行苏木精-伊红（H&E）染色。

结肠H&E染色方法：

（1）离肛门2cm处剪取长度约1cm肠段，置于PBS溶液中清洗；

（2）标本在4%的多聚甲醛中固定，约12h；

（3）将标本用石蜡包埋，沿肠管冠状面进行切片，厚度约4μm；

（4）平展切片，放置于载玻片上，45℃恒温箱中烘干；

（5）二甲苯脱去石蜡，共三次，每次20 min；

（6）按从高到低浓度使用酒精依次处理切片，100%酒精、95%酒精、85%酒精、70%酒精各2 min；

（7）放入蒸馏水中清洗切片5 min；

（8）苏木素染色5 min后蒸馏水再次冲洗1 min；

（9）1%盐酸酒精（70％酒精配制）分色10s后再次用蒸馏水冲洗1 min水洗玻片；

（10）0.1%伊红染液混合2滴冰醋酸染色5 min；

（11）按从低到高浓度使用酒精依次处理切片，70%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精各2 min；

（12）二甲苯处理2次，每次5 min；

（13）封片：用中性树胶将盖玻片封固；

（14）HE染色后在显微镜下观察。

图10为不同实验组的急性溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的苏木精-伊红（H&E）染色图。从图上可以看出，DSS组受试动物结肠黏膜严重受损，并伴随显著的炎症细胞浸润，杯状细胞数量减少。相比之下，DSS+HPSIDF-EGCG组受试动物的结肠黏膜结构明显恢复，炎症细胞浸润显著减少，杯状细胞数量有所回升，表明复合物有助于修复黏膜屏障功能，缓解炎症反应。此外，结肠组织长度测量结果进一步验证了这一结论。DSS组受试动物结肠组织长度显著缩短，而DSS+HPSIDF-EGCG组结肠组织长度较其他DSS处理组明显回升（p<0.05），表明该复合物能有效减轻结肠萎缩，抑制肠道损伤。

本发明还提供了上述技术方案所述的方法在制备豆渣不溶性膳食纤维-表没食子儿茶素没食子酸酯复合物中的应用。所述复合物通过协同增效作用，提高豆渣膳食纤维的附加值和生理活性。所述复合物通过抑制IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α炎症因子释放，缓解肠道炎症。所述复合物通过清除活性氧（ROS）和提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，减轻氧化应激损伤。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种不溶性膳食纤维-EGCG复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将不溶性膳食纤维分散于磷酸盐缓冲液中，与溶解于磷酸盐缓冲液的EGCG溶液混合均匀，室温下放置一段时间，离心后取沉淀物干燥，制得所述不溶性膳食纤维-EGCG复合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

将所述不溶性膳食纤维分散于磷酸盐缓冲液中时，充分膨胀20~60 min；和/或

所述不溶性膳食纤维与溶解于磷酸盐缓冲液的EGCG溶液搅拌均匀后，室温下放置1~4小时；和/或

离心后的沉淀物通过真空抽滤后阴干或真空冷冻干燥的方式来干燥。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

将所述不溶性膳食纤维分散于磷酸盐缓冲液中时，充分膨胀30 min；和/或

所述不溶性膳食纤维与溶解于磷酸盐缓冲液的EGCG溶液搅拌均匀后，室温下放置2小时。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述不溶性膳食纤维为豆渣不溶性膳食纤维。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述豆渣不溶性膳食纤维由脱脂豆粕通过复合酶法制备得到；所述复合酶法的步骤具体包括：将脱脂豆粕溶解后依次加入α-淀粉酶、中性蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶，酶解后水洗、分离出固体物质并干燥。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述豆渣不溶性膳食纤维与EGCG的质量比为3.3~10：1；和/或

室温下放置1~4小时后进行离心的条件为：离心速度为7500 r/min，离心时间为10~15min。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述豆渣不溶性膳食纤维与EGCG的质量比为5：1。

8.一种采用如权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的不溶性膳食纤维-EGCG复合物。

9.一种如权利要求8所述的不溶性膳食纤维-EGCG复合物在食品添加剂中的应用。