CN120399078A

CN120399078A - 靶向cd117的纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN120399078A
Application number: CN202510592573.6A
Authority: CN
Inventors: 朱晰; 陈红; 洛文靖; 赵小平
Original assignee: Shanghai Tianze Yuntai Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanghai Tianze Yuntai Biomedical Co ltd
Priority date: 2025-05-08
Filing date: 2025-05-08
Publication date: 2025-08-01

Abstract

本申请涉及一种靶向CD117的纳米抗体及其应用。本申请还涉及靶向CD117的抗体或其抗原结合片段及其应用。

Description

靶向CD117的纳米抗体及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向CD117的纳米抗体及其应用。

背景技术

造血干细胞(HSCs)是血液和免疫系统的基石细胞，具有自我更新和分化为所有血细胞谱系的能力。在临床上，以HSCs作为核心的骨髓抑制是一种用于治疗多种血液疾病(包括白血病、淋巴瘤以及严重的β-地中海贫血和镰状细胞病等遗传性血液病)的治愈性疗法。在基因治疗中，HSCs可以作为治愈疾病的突破点，患者的自身HSCs可以在体外进行基因校正，然后返回体内重建健康的血液系统，这在针对血红蛋白病的新兴基因组编辑疗法中得到了体现。然而，HSC基础疗法面临着诸多挑战，例如供体有限、异体移植中的移植物抗宿主病风险以及体外HSC操作的复杂性。因此，开发能够直接在患者体内靶向递送以修饰或清除HSCs的系统具有重大意义，这可能会使移植和基因治疗变得更加安全且易于获取。

CD117，也称为c-Kit，是一种能够与干细胞因子(SCF)结合的跨膜受体酪氨酸激酶。CD117对于造血干细胞(HSC)的生物学功能至关重要：SCF与c-Kit的相互作用能够促进HSC的存活、增殖和分化，并且CD117被广泛用作定义HSC和早期祖细胞的标记物。几乎所有多能HSC和祖细胞都高表达CD117。鉴于其关键作用，CD117在基于HSC的治疗中一直是靶向目标。例如，针对CD117的单克隆抗体可以阻断SCF信号传导并耗竭HSC；这种方法正在被开发作为一种非基因毒性调理方案，用于在移植前清除患者的骨髓。抗CD117抗体疗法(包括抗体药物偶联物，即ADCs)已在临床前模型中显示出通过选择性清除HSC来促进供体细胞植入的疗效，同时避免了化疗或放疗调理。除了移植领域，CD117还在某些白血病或骨髓增生异常干细胞上表达，抗CD117免疫疗法正在被探索用于清除这些病变的HSC。总之，CD117是HSC的关键标识符和功能调节器，使它们成为将治疗直接送入HSC区域的有吸引力的靶点。

现有的针对造血干细胞(HSCs)及其标记物的抗体靶向策略虽然显示出一定的前景，但也存在显著的局限性。传统的全长单克隆抗体(通常是IgG)的分子量较大(约150kDa)，其组织穿透能力可能受限(例如难以进入骨髓微环境)，并且在体内循环时间较长。尽管针对HSC标记物(如CD117)的IgG抗体或抗体药物偶联物(ADCs)在靶向HSCs方面可能有效，但它们的大小和结构并不适合某些应用，比如将基因治疗有效载荷递送至细胞内。标准抗体通常不会高效内化进入细胞，除非经过工程改造使其具备这种能力，而且它们的Fc段可能会触发免疫效应功能(补体激活、ADCC)，从而导致非选择性的炎症反应或细胞丢失。此外，使用全IgG进行HSC特异性靶向可能不够精确：像CD117这样的标记物也存在于其他细胞类型上(例如T细胞亚群或祖细胞)，因此全身给药一种强效的IgG或ADC可能会影响非靶向细胞，或者需要谨慎调整剂量。基因治疗载体(如慢病毒或AAV载体)面临不同的挑战：它们通常缺乏对HSCs的天然趋向性，而且体内的HSCs大多处于静止状态，并且位于循环载体难以到达的保护性微环境中。为了克服这些障碍，需要靶向配体既能高度特异性地结合HSC标记物，又具有较小的尺寸和模块化特性，以便能够连接到各种递送载体上。有人还提出了双特异性或多价形式的抗体，通过结合多个HSC标记物来提高特异性，因为它们需要同时识别两种标记物，但构建稳定的大型抗体复合物可能较为复杂。总体而言，尽管现有的基于抗体的方法证明了HSC靶向的概念，但对于体内基因递送、精确细胞分离和安全调理等应用来说，仍需要改进的靶向剂。

单域抗体在针对CD117以及其他造血干细胞(HSC)标记物的治疗和诊断应用中具有独特的优势。典型的单域抗体在结构上包含VHH片段。VHH是从骆驼科动物的重链抗体中衍生的单域抗原结合片段，其典型大小仅为约12–15KD。由于其小尺寸和单域结构，VHH在一系列条件下展现出高抗原结合亲和力和特异性，同时具有卓越的稳定性。借助这些小而坚固的抗体，该发明旨在提供工具和方法，显著提高HSC靶向的特异性和效率，以用于多种治疗、预防和诊断目的。

发明内容

本申请提供了一种靶向CD117的抗体或其抗原结合片段，优选为纳米抗体，其能够特异性结合人CD117并靶向表达CD117的造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)。在具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段可以用于检测混合体系内CD117的含量，可以检测混合体系内造血干细胞的含量，也可以通过与其他药物进行偶联来治疗造血干细胞相关的疾病。

本申请提供的靶向CD117的抗体或其抗原结合片段，其可以具有下述性质中的一种或多种：1)能够特异性结合CD117和/或表达CD117的细胞；2)能够抑制CD117与至少一种其配体的结合；3)能够抑制CD117介导的信号转导；4)能够抑制表达CD117的细胞的迁移、积累、募集和/或浸润；5)能够介导对于表达CD117的细胞的杀伤作用；6)能够诱导细胞表面的CD117受体内吞，从而降低免疫细胞的激活；7)能够用于治疗CD117相关疾病和/或病症；8)能够用于CD117和/或表达CD117的细胞的检测。

本申请还提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、表达载体、宿主细胞、包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物、制备所述抗体或其抗原结合片段的方法以及本申请所述抗体或其抗原结合片段的用途。

第一方面，本申请提供了一种特异性结合人CD117的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人CD117。所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)。所述重链可变区包括重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)。

在某些实施方式中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3选自以下任一组：

(1)所述HCDR1包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

(2)所述HCDR1包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或

(3)所述HCDR1包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述VH包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或者包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约99.5％的序列同源性。

在某些实施方式中，所述抗体选自下组的一种或多种：单特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。

在某些实施方式中，所述抗体选自下组的一种或多种：单价抗体和多价抗体。

在某些实施方式中，所述抗原结合片段选自下组的一种或多种：VH、Fab、Fv、F(ab’)2和单链Fv(scFv)。

在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为特异性结合人CD117的VH。

在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为纳米抗体。更优选地，所述纳米抗体的分子量小于50KD，还更优选小于45KD，小于40KD，小于35KD，小于30KD，小于25KD，小于15KD，小于10KD，小于5KD。

在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为单域抗体。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含Fc片段。

第二方面，本申请提供了一种融合蛋白。其包含第一方面中任一种抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，所述融合蛋白可以是嵌合抗原受体(CAR)。

在某些实施方式中，所述融合蛋白为双特异性抗体。

在某些实施方式中，所述融合蛋白为多特异性抗体。

第三方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其编码第一方面任一种抗体或其抗原结合片段或第二方面任一种融合蛋白。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。

第四方面，本申请提供了一种载体。其包含第三方面任一种分离的核酸分子。

在某些实施方式中，所述载体包含表达载体。在某些实施方式中，所述载体包含DNA载体和RNA载体。

在某些实施方式中，所述RNA载体为mRNA载体。

第五方面，本申请提供了一种细胞。其包含第三方面任一种分离的核酸分子或第四方面任一种载体。

在某些实施方式中，所述细胞包含宿主细胞。

在具体的实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。

在具体的实施方式中，所述细胞为细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。更具体地，可以是生产抗体的工程细胞，比如293T细胞。

第六方面，本申请提供了一种生产第一方面任一种抗体或其抗原结合片段的方法。具体地，所述方法包含：

(1)构建表达载体，所述表达载体含有编码所述抗体或其抗原结合片段的基因序列，

(2)将所述表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，和

(3)从表达产物中分离获得所述抗体或其抗原结合片段。

第七方面，本申请提供了一种药物组合物。其包含第一方面任一种抗体或其抗原结合片段，第二方面任一种融合蛋白，第三方面任一种分离的核酸分子，第四方面任一种载体，第五方面任一种细胞，和/或任选地药学上可接受的载剂。

在某些实施方式中，所述药物组合物用作单一疗法。

在某些实施方式中，所述药物组合物与其他药物联合使用。优选地，其他药物为小分子靶向抗癌剂、其他抗体药物、过继细胞疗法和/或溶瘤病毒增强剂。

在某些实施方式中，所述药物组合物可以是第一方面任一种抗体或其抗原结合片段与其他分子的偶联物。更具体地，所述其他分子可以是小分子药物，可以是靶向除CD117外的抗原的抗体，可以是脂质纳米颗粒(LNP)。

第八方面，本申请提供了第一方面任一种抗体或其抗原结合片段，第二方面任一种融合蛋白，第三方面任一种分离的核酸分子，第四方面任一种载体，第五方面任一种细胞，和/或第七方面任一种药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病。

在某些实施方式中，所述药物可以是双特异性抗体，可以是多特异性抗体，可以是抗体偶联药物(ADC)，可以是抗体偶联脂质纳米颗粒。

第九方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病的方法。所述方法包含第一方面任一种抗体或其抗原结合片段，第二方面任一种融合蛋白，第三方面任一种分离的核酸分子，第四方面任一种载体，第五方面任一种细胞，和/或第七方面任一种药物组合物的使用。

第十方面，本申请提供了第一方面任一种抗体或其抗原结合片段，第二方面任一种融合蛋白，第三方面任一种分离的核酸分子，第四方面任一种载体，第五方面任一种细胞，和/或第七方面任一种药物组合物在预防和/或治疗疾病的用途。

在某些实施方式中，第八方面、第九方面或第十方面中所述的疾病可以是血液系统疾病。具体地，所述疾病可以是造血干细胞相关的疾病。更具体地，所述造血干细胞相关的疾病可以选自以下的一种或多种：再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性肿瘤、骨髓纤维化、免疫缺陷病、地中海贫血和镰状细胞病。

第十一方面，本申请提供了一种试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒包含第一方面任一种抗体或其抗原结合片段，第二方面任一种融合蛋白，第三方面任一种分离的核酸分子，第四方面任一种载体，第五方面任一种细胞，和/或第七方面任一种药物组合物。

在某些实施方式中，所述试剂盒用于检测混合体系中的CD117含量。

在某些实施方式中，所述试剂盒用于检测混合体系中的表达CD117的细胞的含量。

例如，所述表达CD117的细胞选自下组的一种或多种：造血干细胞、间充质干细胞、角质形成细胞干细胞、神经元、胶质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、基质细胞、激活的内皮细胞、肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞。

第十二方面，本申请提供一种检测CD117的方法。所述方法包含第一方面任一种抗体或其抗原结合片段，第二方面任一种融合蛋白，第三方面任一种分离的核酸分子，第四方面任一种载体，第五方面任一种细胞，和/或第七方面任一种药物组合物的使用。

在某些实施方式中，所述CD117可以是混合体系内游离的CD117。

在某些实施方式中，所述CD117可以是表达在细胞上的CD117。

例如，所述细胞可以选自下组的一种或多种：造血干细胞、间充质干细胞、角质形成细胞干细胞、神经元、胶质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、基质细胞、激活的内皮细胞、肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞。

在某些实施方式中，所述CD117可以是与其他分子偶联的。

例如，所述其他分子可以选自下组的一种或多种：抗体、小分子配体、靶向肽、细胞穿透肽、反义寡核苷酸(ASOs)、小干扰RNA(siRNA)、CRISPR/Cas系统、糖基、脂质、磁性纳米颗粒、光敏材料和组织工程支架。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1显示的是实施例1中经CD117抗原免疫和免疫强化之后的小鼠的血清对表达CD117(CHO-CD117)的细胞和对照细胞(WT)的结合能力。

图2显示的是实施例2中重组抗体对CD117阳性细胞(CHO-CD117和HEL)和对照细胞(CHO-K1)的结合能力。

图3显示的是实施例4中不同浓度候选抗体对人CD117-CHO、猴CD117-CHO或HEL细胞的结合效率。

图4显示的是实施例4中使用ELISA方法评估候选抗体对小鼠CD117抗原的结合效率的结果。

图5显示的是实施例5中纯化抗体的SDS-PAGE鉴定图像。其中NR代表样本中不添加还原剂，R代表样本中添加还原剂。

图6显示的是实施例6中改造后的配体、连接子及二者偶联形成的配体-连接子偶联物的结构示意图。

图7显示的是通过生物正交点击化学反应在脂质纳米颗粒(LNP)表面偶联配体制备靶向性脂质纳米颗粒(tLNP)的方法的步骤示意图。

图8显示的是表面偶联不同长度配体的脂质纳米颗粒在表达CD117的细胞中的递送效率差异。

图9显示的是包含不同铰链的tLNP在细胞系中的递送效率的对比。

图10显示的是评估tLNP体外递送基因编辑组分的基因递送和编辑能力。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“CD117”也称为“c-kit”，是一种由原癌基因4q11-q12编码的Ⅲ型跨膜蛋白酪氨酸激酶受体。它在多种细胞类型中表达，包括造血干细胞、肥大细胞、黑色素细胞、精原细胞、卵细胞以及胃肠道的Cajal细胞。CD117的配体是干细胞因子(也称为肥大细胞生长因子)，这种配体与CD117结合后，能够激活一系列细胞内信号通路，从而调节细胞的生长、存活、分化、迁移和黏附。在本申请中，除非特别说明，CD117可以包括其所有亚型和所有种属。在本申请中，所述CD117可以包括任何脊椎动物来源的任何天然CD117，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在本申请中，所述CD117可以包括“全长”、未加工的CD117以及源自细胞中加工的任何形式的CD117；还可以包括CD117的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。例如，人CD117的完整氨基酸序列在Uniprot网站(https://www.uniprot.org/)的登录号为P10721。

在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。在本申请中，除非特别说明，所述抗体或其抗原结合片段也是分离的。

在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常指具有抗原结合能力的蛋白。例如，抗原结合蛋白可以包括分离的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。参见例如Korndorfer等,2003,Proteins:Structure,Fun ction,andBioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque等,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。抗原结合蛋白的实例包括但不限于：Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、F(ab)2、scFv、di-scFv、dAb、VHH、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、单价抗体、多价抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、或IgG4抗体以及其片段。

在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常指抗体可变区中的区域，其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，在抗体的重链可变区(variabledomain ofheavy chain，VH)中包括三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)。仅由重链组成的抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定，例如，天然存在的骆驼抗体，参见，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、AbM、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。例如，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列编号可以按照IMGT编号方案(IMGT,the international ImMunoGeneTics informationsystem@imgt.cines.fr；imgt.cines.fr；Lefranc等,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212；Ruiz等,2000Nucleic Acids Res.28:219-221；Lefranc等,2001,Nucleic AcidsRes.29:207-209；Lefranc等,2003,Nucleic Acids Res.31:307-310；Lefranc等,2005,DevComp Immunol 29:185-203)。例如，所述抗原结合蛋白的CDR可以根据Kabat编号系统确定(参见例如Kabat EA&Wu TT(1971)Ann NY AcadSci190:382-391和Kabat EAet al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。

在本申请中，术语“可变”通常指在抗体之间可变区的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变区介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在整个可变区范围内均匀分布。它通常集中在轻链或重链可变区中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变区的更高度保守的部分称为框架区(FR)。

在本申请中，术语“FR”通常指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。通常，天然重链可变结构域包含四个FR区，即H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。

在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本申请的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、VHH、dAb和保持抗原结合功能(例如，能够特异性结合CD117)的其它抗体片段。

在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如，CD117)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。

在本申请中，术语“单域抗体”通常是指缺失轻链的抗体。本申请所述单域抗体可以包括重链抗体(HcAb，heavy-chain antibody)，其包括重链可变区和常规的重链CH2、CH3区。本申请所述的单域抗体可以包括抗原结合蛋白的最小结合单元。本申请所述单域抗体可以包括仅由抗体重链可变区组成的抗体片段。

在本申请中，术语“VHH(variabledomain of heavy chain of heavy chainantibody，VHH)”通常是指重链抗体的可变区抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。

在本申请中，术语“纳米抗体”是指一种分子量很小的抗体。在优选的实施方式中，所述纳米抗体仅由重链抗体的可变区组成，分子量通常小于15KD，是传统抗体的1/10。这种结构赋予了纳米抗体一系列独特的特性，包括高亲和力、高稳定性、良好的水溶性、低免疫原性以及强大的组织穿透能力。

在本申请中，“单域抗体”和“纳米抗体”是指完整的可以独立行使功能的抗体，“VHH”是指完整抗体中的结构域。更进一步地，“单域抗体”强调抗体的组成部分(例如，只包含单独一条重链)，而“纳米抗体”则强调抗体的分子量。在本申请中，单域抗体可以包括但不限于纳米抗体。

在本申请中，术语“Fc片段”通常是指免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域-CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。例如，Fc区可以不包含CH1结构域。Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter等人美国专利号5,648,260；5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是所需的，但在其他情况下，可能是不必要的或甚至有害的。

在本申请中，术语“单克隆抗体”通常指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以通过重组DNA方法制备。

在本申请中，术语“单特异性抗体”和“多特异性抗体”通常是指能够特异性结合单个或多个抗原位点的抗体。当特异性结合的抗原位点为多个时，多个抗原位点可以来自于相同的抗原，也可以来自于不同的抗原，优选多个抗原位点来自于不同的抗原。

在本申请中，术语“单价抗体”和“多价抗体”是指抗体分子上具有单个和多个结合抗原的位点。根据本领域技术人员通知，经典的抗体(例如IgG抗体)为二价抗体，具有两个结合抗原的位点。在本申请中，“单价抗体”和“多价抗体”可以包含恒定区和/或Fc片段，也可以不包含恒定区和Fc片段。当所述“单价抗体”或“多价抗体”不包含恒定区和Fc片段时，所述多价抗体可以是由两个以上抗原结合片段首尾相连形成的，所述连接优选为通过共价键进行连接，所述多价抗体的连接方式可以是N端对接C端，也可以是N端对接N端，也可以是C端对接C端。

在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如骆驼科动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如骆驼来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。

在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如骆驼抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如骆驼)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如骆驼，羊驼，小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。

在本申请中，术语“融合蛋白”是指一种通过基因工程技术将两个或多个不同蛋白质的基因序列连接在一起，从而在同一个多肽链中表达出具有两种或多种功能的蛋白质。这种蛋白质融合可以赋予融合蛋白新的功能特性或增强其原有的功能。融合蛋白具有功能多样、稳定性增强、靶向性提高和生产简便的优点，可以应用于生物制药、疫苗开发、细胞治疗和诊断工具等不同领域。在具体的实施方式中，融合蛋白可以是病毒膜融合蛋白、细胞融合蛋白，也可以是双特异性抗体、Fc融合蛋白。

在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。

在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体可以包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类可以包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

在本申请中，术语“细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、CO S-1细胞、NS0细胞。细胞还可包括经工程化改造后的细胞。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本申请所述的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂。

在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。

在本申请中，术语“造血干细胞相关的疾病”通常是指造血干细胞的功能异常、发育缺陷或恶性转化所引起的一系列血液系统疾病。这些疾病通常涉及骨髓造血功能障碍、免疫功能缺陷或血液细胞的恶性增殖。这些疾病可能由遗传因素、环境暴露或未知因素引起，症状包括贫血、出血、感染和器官肿大，诊断和治疗通常需要多学科的综合方法。

氨基酸的“保守取代”是本领域众所周知的，并且通常指将一个氨基酸残基改变为具有结构或功能上相似的侧链的另一个氨基酸残基。例如，下表中提供了示例性的保守取代列表。

在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包括以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。

在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，能够特异性结合CD117的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。

在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，能够特异性结合CD117的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约80％(例如，具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。

在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cy s和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lip man和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。

在本申请中，术语“包含”通常是指“包括”、“总括”、“含有”或“包涵”的含义，这些术语可以互换使用。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

发明详述

抗体或其抗原结合片段、融合蛋白

抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白可通过KABAT编码系统定义。

本申请提供了一种特异性结合人CD117的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)。所述重链可变区包括重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)。

在某些实施方式中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3选自以下任一组：

在某些实施方式中，所述VH包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或者包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约99.5％的序列同源性并且所有氨基酸差异均在非CDR区的氨基酸序列。

优选地，上述氨基酸差异是氨基酸的保守取代。

在本申请中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列中的至少一个CDR，所述CDR可以包括以任何方式划分得到的CDR。通过任何一种方式划定的CDR，如果序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列中相同，则均落入本申请权利要求的保护范围。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段，其包括具有如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的HCDR3的抗原结合蛋白，以及其人源化后的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，所述人源化后的抗原结合蛋白的HCDR1可以具有一个以上的氨基酸突变、所述人源化后的抗原结合蛋白的HCDR2可以具有一个以上的氨基酸突变、和/或所述人源化后的抗原结合蛋白的HCDR3可以具有一个以上的氨基酸突变，而所述人源化后的抗原结合蛋白仍具有结合CD117的能力。

在某些实施方式中，本申请所述的分离的抗原结合蛋白，其包括具有如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的可变区，以及其人源化后的抗原结合蛋白。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可以包括单域抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可以包括重链抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可以包括纳米抗体。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段可以包括仅有重链的抗体。在某些实施方式中，仅有重链的抗体由可变区抗原结合结构域组成，所述可变区抗原结合结构域由FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成。在某些实施方式中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区以及CH2和CH3结构域组成。在某些实施方式中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区和CH2结构域组成。在某些实施方式中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区和CH3结构域组成。其中CH2和/或CH3结构域被截短的仅有重链的抗体也包括在本文中。在另外的实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域组成，但没有铰链区。仅有重链的抗体可呈二聚体形式，其中两条重链通过二硫键键合，否则彼此共价或非共价连接。仅有重链的抗体可以属于IgG亚类，但属于其它亚类的抗体，诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类，也包括在本文中。在特定的实施方案中，重链抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型。

在某些实施方式中，所述抗体可以选自下组中的一种或多种：单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。

在优选的实施方式中，所述抗体可以是纳米抗体，更优选为纳米抗体中的单域抗体。单域抗体在针对CD117以及其他造血干细胞(HSC)标记物的治疗和诊断应用中具有独特的优势。单域抗体最主要的组成成分为VHH，VHH是从骆驼科动物的仅重链抗体中衍生的单域抗原结合片段，其典型大小仅为约12–15kDa。由于其小尺寸和单域结构，VHH在一系列条件下展现出高抗原结合亲和力和特异性，同时具有卓越的稳定性。这些特性使单域抗体能够克服传统抗体的许多限制：它们能够更容易地穿透组织和细胞微环境，可以在低成本的微生物系统中重组生产，并且可以通过基因融合或化学偶联轻松地与各种有效载荷和格式进行工程改造。重要的是，VHH通常能够识别独特或隐藏的表位(得益于它们较长的CDR3环)，并且在与细胞表面靶标结合时往往会高效内化，特别是如果它们是多价的或者与促进内吞的触发因子相连。例如，纳米抗体已被证明在用作递送剂时能够达到细胞内靶标，这对于基因治疗有效载荷的递送是一个关键特性。它们本身缺乏Fc区域，从而避免了不想要的Fc介导的免疫效应；这对于成像剂来说是一个优势(减少在富含Fc受体的器官中的背景摄取)，或者在需要效应功能或延长半衰期时，可以通过添加Fc或其他多聚化标签来缓解。总体而言，单域抗体的稳定性、高亲和力和模块化特性使其成为创新HSC靶向疗法的理想配体。

在本申请中，所述抗体或其抗原结合片段还可以包含Fc片段。在某些实施方式中，所述Fc片段的N端与所述重链可变区的C端直接或间接相连。在某些实施方式中，所述Fc片段的N端与所述重链可变区的C端可以通过铰链区相连。在某些实施方式中，所述Fc片段可以源自人IgG的Fc片段。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白包含源自人IgG的Fc片段野生型。源自人IgG的Fc片段的氨基酸序列是本领域已知的。在某些实施方式中，所述Fc片段可以包括源自下组中任一免疫球蛋白的Fc片段：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白包含源自下组中任一免疫球蛋白的Fc片段野生型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段的氨基酸序列是本领域已知的。例如，所述Fc片段可以包含源自人的IgG1的Fc片段。例如，所述Fc片段可以包含源自人的IgG3的Fc片段。例如，所述Fc片段可以包含源自人的IgG4的Fc片段。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包含Fc片段变体，所述Fc片段变体具有一个或多个相对于野生型Fc片段的氨基酸突变。可以通过对Fc片段序列的优化而延长抗体或其抗原结合片段的半衰期和/或增强抗体或其抗原结合片段的效应子功能。

在本申请中，所述抗体或其抗原结合片段还可以包括进一步经功能优化或修饰后的分离的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白可以包括具有增强的与CD117结合的亲和力的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白可以包括具有增强的抑制CD117与其配体结合的能力的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白可以包括具有增强的抑制CD117介导信号转导的能力的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白可以包括具有增强的抑制表达CD117的细胞的迁移、积累、募集和/或浸润的能力的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白可以包括具有增强的介导对于表达CD117的细胞的杀伤作用的能力的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白可以包括具有增强的诱导细胞表面的CD117受体内吞的能力的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，所述的增强的能力可以是相对于其功能优化前或修饰前的抗原结合蛋白而言的。

本申请所述抗体或其抗原结合片段可以包括存在一个或多个保守序列修饰的重链序列。所谓“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请所述抗体或其抗原结合片段中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述抗体或其抗原结合片段的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换。本领域内的技术人员知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失，具体可以参见，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt et al.,(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10:341-6and Beers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。

在本申请中，所述的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合CD117。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与CD117的结合亲和力可以通过检测所述抗体或其抗原结合片段与表达CD117的细胞的结合能力进行检测。例如，可以通过FACS进行检测。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与CD117的结合可以通过ELISA方法进行检测。例如，本申请所述抗体或其抗原结合片段可以以小于或等于约0.10μg/mL，小于或等于约0.09μg/mL，小于或等于约0.08μg/mL，小于或等于约0.07μg/mL，小于或等于约0.06μg/mL，小于或等于约0.05μg/mL，小于或等于约0.04μg/mL，小于或等于约0.03μg/mL，小于或等于约0.02μg/mL或者小于或等于约0.01μg/mL的EC50值与CD117结合。例如，本申请所述抗体或其抗原结合片段可以以小于或等于50nM，小于或等于约40nM，小于或等于30nM，小于或等于20nM，或者小于或等于10nM的IC50值与CD117结合。

可以通过本领域已知的各种方法测定、鉴别、或表征本申请所述的CD117抗原结合蛋白。例如，可通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FACS)、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本申请抗体或其抗原结合片段的抗原结合活性。

本申请提供的抗体或其抗原结合片段可用于拮抗CD117活性。在本申请中，所述抗体或其抗原结合片段能够预防和/或治疗疾病和/或病症。

基于抗体或其抗原结合片段的衍生物及其应用

本申请还涵盖了所公开的抗CD117单域抗体的变体，这些变体经过工程改造，以赋予或增强针对特定治疗、诊断或研究应用所需的特性。这些变体包括但不限于为了提高亲和力、特异性、稳定性、溶解性、降低免疫原性、增强偶联能力或其他期望的功能特性而进行的修饰。

为了提高抗原结合亲和力和特异性而设计的变体，可以通过本领域已知的方法生成。这些方法包括通过靶向或随机突变进行亲和力成熟，随后采用选择技术，如噬菌体展示或酵母展示。本发明的范围包括具有改善的结合动力学(例如，增加的结合速率、减少的解离速率)或增强的选择性的变体。具有增强稳定性和溶解性的变体包括框架区的修饰。特定的氨基酸替换可能引入稳定化残基或二硫键，以增加热稳定性、抵抗蛋白酶降解的能力，或减少聚集倾向。在一种实施方式中，框架残基的突变在保持靶标特异性和亲和力的同时，增加了抗体在生理或生产条件下的溶解性或稳定性。

在某些实施方式中，所述变体可以是工程化用于位点特异性偶联的变体。所述变体包括在单域抗体的C末端或N末端区域内的预定位置引入一个或多个半胱氨酸残基。这些半胱氨酸残基有助于通过化学连接子(例如马来酰亚胺-硫醇反应)选择性和稳定地偶联治疗药物、毒素、成像剂或功能基团。此外，变体可能包含与工程化半胱氨酸残基相邻的灵活铰链或连接序列，以优化有效载荷的可及性并保持抗体功能。在其他实施例中，所述变体结合了具有生物正交反应基团(例如，叠氮化物、炔基、酮基功能化的氨基酸)的非天然氨基酸。这些残基能够实现高度特异性、正交的偶联反应(“点击化学”)，促进诊断剂、细胞毒性药物或基因编辑组分的精确连接。

在某些实施方式中，所述变体可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以包含一个VHH结构域与额外的功能结构域的遗传融合。这些融合蛋白包括但不限于免疫球蛋白Fc片段(形成延长抗体半衰期的抗体-Fc融合蛋白)、细胞因子(例如，IL-2、IL-15)、诱导凋亡的结构域(例如，截短的毒素)、成像标签(例如，荧光蛋白、放射性标记螯合剂)或其他与治疗相关的多肽。在一个说明性例子中，抗CD117 VHH与Fc结构域的融合产生了一个具有延长血清半衰期和增强亲和力的双价抗体。

在某些实施方式中，所述变体可以是双特异性或多特异性抗体。这些构建物可能涉及通过灵活的肽连接子遗传融合两个或多个不同的VHH结构域。例子包括包含一个抗CD90 VHH结构域与一个抗CD117 VHH结构域相连的双特异性抗体，能够同时靶向造血干细胞上的多个表位，以增强特异性和治疗效力。变体还可能包含设计用于优化不同功能结构域之间间距和方向的连接序列。合适的连接子包括灵活的甘氨酸-丝氨酸(Gly-Ser)n重复序列、刚性螺旋形成序列或对特定细胞环境(例如，蛋白酶可切割序列，促进细胞内有效载荷释放)有响应的可切割连接子。

此外，本申请还包含人源化变体，其中骆驼科动物衍生的VHH序列已被修改，以更接近人类免疫球蛋白可变结构域，减少在治疗应用中的潜在免疫原性。这种人源化可能涉及将骆驼科动物衍生的互补决定区(CDRs)移植到人类可变区框架上，可选地随后进行选择性回突变，以恢复最佳的结合和稳定性特征。

本申请还涉及对所公开的抗CD117单域抗体进行工程改造的衍生物，以增强其在治疗、诊断和研究应用中的用途。本申请范围内的抗体衍生物包括通过遗传连接所公开的单域抗体与额外的功能蛋白结构域而创建的融合蛋白。在一个实施例中，VHH结构域与免疫球蛋白Fc结构域融合，提供增加的抗体亲和力、延长的血清半衰期以及Fc介导的效应功能。在另一个实施例中，单域抗体与细胞穿透肽或内质网逃逸结构域进行遗传融合，从而能够改善核酸或药物等有效载荷的细胞内递送。此外，VHH结构域可以与荧光蛋白、发光报告蛋白或酶促报告蛋白融合，便于其在诊断检测和成像应用中的使用。

在另一个实施例中，本发明包括抗体药物偶联物(ADCs)，其中单域抗体通过化学方法与细胞毒性药物或毒素结合。合适的细胞毒性药物包括奥瑞他汀类、美登素类、多柔比星、卡利奇霉素和吡咯苯二氮卓类(PBDs)。偶联可以通过可切割或不可切割的连接子进行，这些连接子允许在靶向表达CD117的细胞内化后选择性释放细胞毒性有效载荷。

进一步的实施例包括放射性标记的衍生物，其中单域抗体通过化学方法与放射性同位素(如锝-99m、锆-89、碘-125、镥-177或钇-90)结合。这些放射性标记的衍生物可用于正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)的诊断成像，以及用于选择性耗竭特定细胞群的靶向放射治疗。

此外，还可以构建双特异性或多特异性抗体衍生物，以同时结合多个靶抗原，提高治疗的特异性和效力。例如，所述抗体衍生物可以是包含靶向CD117的VHH结构域和另一个临床相关抗原(如CD3用于T细胞结合)的VHH结构域的双特异性抗体，所述抗体衍生物用以提供选择性靶向和强大的生物效应。

在某些实施方式中，所述抗体衍生物被设计用于靶向基因递送和/或基因编辑。这些衍生物包括腺相关病毒(AAV)或慢病毒颗粒等病毒载体，其衣壳或包膜蛋白经过遗传改造以整合VHH抗体结构域，从而实现对表达CD117的造血干细胞(HSCs)和其他相关细胞类型的特异性和高效靶向。

在某些实施方式中，所述抗体衍生物可以是用于细胞治疗的抗体衍生物，如嵌合抗原受体(CARs)。这些构建物将VHH序列整合到免疫效应细胞(T细胞、NK细胞、巨噬细胞)上表达的工程受体中，从而实现对抗原阳性靶细胞的选择性免疫介导清除。同样，使用抗CD117 VHH结构域与T细胞结合结构域(如抗CD3)相连的双特异性T细胞接合剂(类似BiTE的分子)也在本申请范围内，它们能够将免疫反应精确地导向病变或靶细胞。

在某些实施方式中，所述抗体衍生物包括与脂质聚乙二醇(脂质-PEG)基团结合的单域抗体。这些脂质-PEG结合的单域抗体能够实现靶向非病毒递送平台，特别是脂质纳米颗粒(LNPs)、脂质体或基于聚合物的纳米颗粒。这些衍生物提供了增强的稳定性、靶向细胞结合能力和高效的内化作用，用于核酸有效载荷(如mRNA、siRNA或基因编辑工具)的细胞内递送。

本申请的一个主要方面是将VHH或单域抗体克隆工程化为各种形式如融合蛋白或偶联物等，以实现靶向递送或治疗作用。以下是几种实施类别：

1.抗体药物偶联物(ADCs)和毒素融合蛋白：每个抗CD117的VHH可以与细胞毒性药物连接，创建一种能够消除表达目标抗原的细胞的靶向细胞毒素。在一个实施例中，通过在VHH上添加的半胱氨酸残基将VHH与毒素进行化学偶联。例如，在VHH或单域抗体的C末端(最后一个框架残基之后)插入一个半胱氨酸，以便与末端偶联马来酰亚胺的药物连接子进行位点特异性连接。更具体地，将一个马来酰亚胺连接子的美登素衍生物(DM1，一种微管毒素)与这个半胱氨酸偶联，得到抗CD117 VHH-DM1偶联物。在细胞杀伤实验中，这种偶联物特异性地杀死了CD117⁺细胞(如培养中的干细胞/祖细胞)，而对CD117^-细胞没有影响，证明了靶向细胞毒性。同样，可以将VHH与蛋白毒素进行遗传融合；例如，抗CD117的VHH与截短的白喉毒素或凋亡酶(如颗粒酶)融合，可用于耗竭表达CD117的细胞。这种ADC可以被作为调理剂，用于在引入基因校正细胞或供体细胞之前耗竭骨髓中的HSCs。在具体的实施方式中，VHH的小尺寸可能比更大的IgG ADCs具有更好的组织穿透性和更均匀的骨髓分布，可能在较低剂量下实现更有效的HSC清除。

2.靶向脂质纳米颗粒(tLNPs)：本申请包括用于靶向的装载有单域抗体的脂质纳米颗粒递送系统。脂质纳米颗粒可以包裹治疗性有效载荷，如mRNA、siRNA或CRISPR核糖核蛋白，但默认情况下它们是非特异性分布的。通过将抗CD117的VHH连接到LNP表面，我们创建了一种靶向LNP(tLNP)，它能够靶向HSCs。在一个例子中，使用克隆B13制作了靶向CD117的LNPs，这些LNPs对CD117⁺细胞(包括体外的正常人类CD34⁺CD117⁺骨髓细胞)表现出类似的特异性。这些tLNPs进一步用于基因编辑测试：我们用它们装载编码基因编辑器AaCas12b和靶向HBG基因(β-珠蛋白基因位点)的sgRNA的mRNA。处理过的细胞在目标位点显示出高水平的基因编辑(插入/缺失形成)，对于靶向LNPs，编辑效率随着剂量的增加而增加，而未靶向的LNPs活性显著降低。这证实了将我们的VHH连接到LNPs上可以极大地增强将基因编辑工具递送到HSCs的能力，这是一种可以用于治疗β-地中海贫血等疾病的体内基因治疗策略(通过HBG启动子编辑重新激活胎儿血红蛋白)。创建这种tLNPs的方法将在实施例中进一步描述，通常涉及将VHH共价连接到脂质(例如，DSPE-PEG-马来酰亚胺)并在纳米颗粒自组装的过程。

3.病毒载体靶向和CAR构建：本申请所述VHH可用于靶向病毒或嵌合抗原受体的构建。对于病毒载体，一个例子是AAV衣壳修饰：将抗CD117的VHH的编码序列插入AAV衣壳蛋白环中，生成在病毒表面的包含VHH的嵌合衣壳。这种修饰的AAV特异性地转导CD117⁺细胞，有效地将病毒趋向性重新导向HSCs。另一种修饰方法是使用适配器分子——例如，生物素化的抗CD117 VHH可以与表达链霉亲和素的慢病毒结合，从而将病毒锚定到CD117⁺细胞上。这些策略允许基因递送载体(慢病毒、AAV、腺病毒等)实现细胞特异性转导，这是实现无需移植的体内HSC基因治疗的关键步骤。在细胞治疗的背景下，这里的VHH序列可以作为免疫细胞上CAR(嵌合抗原受体)的抗原结合域。例如，通过将CD117 VHH序列与CD8铰链-跨膜结构域以及细胞内CD3ζ和4-1BB信号结构域融合，构建了一个CAR。表达所述CAR的T细胞在体外特异性地识别并溶解表达CD117的细胞，证明了VHH在CAR中保留了结合能力。这种CAR-T细胞可用于靶向和破坏HSCs(用于调理或治疗恶性肿瘤)甚至攻击实体瘤中的CD117⁺癌症干细胞。在CAR中使用VHH的优势在于其小尺寸可能降低免疫原性，并允许更紧密的包装或设计成双CAR(其中两个小域并排使用)。

4.多特异性和双特异性抗体：为了增加结合亲和力或靶向选择性，可以将多个VHH连接在一起。通过遗传融合两个CD117 VHH结构域并用一个灵活的连接子，制造了一个双价的抗CD117构建物，产生了一个串联的VHH，其对CD117的结合价数基本上翻倍。这种双价纳米抗体显示出从抗原上更慢的解离速率，并在体内模型中增加了抗体在骨髓组织中的保留时间。对于双重靶向，将抗CD117的VHH与抗CD45的VHH(CD45是在HSCs上表达的泛白细胞标记物)连接，创建一个双特异性分子，该分子需要同时结合两个标记物才能与细胞结合，因此该分子优先结合HSCs(CD117⁺CD45⁺)而不是T细胞(在周围血液中通常是CD45⁺但CD117^-)。这是多特异性纳米抗体构建物如何精确靶向定义明确的细胞亚群的一个例子。所有这些串联或融合的抗体构建物都在本申请的范围内。

5.与功能基团融合：除了结合目标外，VHH还可以与功能蛋白结构域融合。例如，将抗CD117的VHH与Fc结构域融合(创建一个VHH-Fc或“纳米抗体-Fc”)，赋予该分子类似IgG的特性(双价性和由于FcRn循环而延长的半衰期)。或者，将纳米抗体与酶融合可以将该酶的活性定位到HSCs上——可以将抗CD117的VHH与细胞因子或生长因子连接(将其变成一个优先刺激HSCs的具有靶向性的细胞因子)。在一个实施例中，我们创建了一个IL-2-VHH融合物，其中CD117的VHH与IL-2融合；这种嵌合分子能够将IL-2信号特异性地传递给同时表达IL-2R的CD117⁺细胞，代表了一个细胞选择性细胞因子递送平台。除此之外，本申请还设想了许多这样的组合(纳米抗体与信号分子融合，与诱导凋亡的结构域融合，与荧光蛋白用于成像等)。

所有使用的偶联和工程化技术都是标准的或已知方法的改编。通过NHS酯、马来酰亚胺-硫醇反应、点击化学(例如，叠氮化物-炔烃环加成)等共价连接可以将小分子有效载荷连接到VHH上。并通过遗传融合实现肽/蛋白级整合。通过SDS-PAGE、质谱和功能检测来对最终产品进行表征，以确认VHH在修饰后保留了结合功能。

由此可见，针对造血干细胞(HSCs)上的CD117的单域抗体存在广泛的应用潜力。这些应用涵盖研究和临床领域：

·靶向基因治疗和基因编辑：使用抗CD117的VHH引导基因治疗载体或纳米颗粒至HSCs，实现对干细胞的基因导入或基因编辑(例如，CRISPR系统的递送)。这可以通过原位编辑HSCs来治疗遗传性血液疾病，从而避免移植的需求。

·癌症免疫治疗：利用基于VHH的构建物靶向癌症中的恶性干细胞或支持性微环境。例如，基于抗CD117 VHH的抗体药物偶联物(ADC)可以在不造成广泛附带损害的情况下清除髓系恶性肿瘤中的白血病干细胞。

·HSC移植调理：使用VHH偶联物选择性地耗竭或移植前使患者的HSCs失活。抗CD117纳米抗体-药物偶联物(或引导免疫效应细胞至HSCs的双特异性抗体)可以作为最小毒性调理剂，为供体HSC的植入腾出空间。除此之外，VHHs可以用于将放射性同位素递送至骨髓，以局部照射HSC微环境。

·细胞分离和体外操作：用抗CD117的VHH包被磁珠或柱基质，从骨髓或循环的血液中分离HSCs，用于研究或治疗性移植富集。VHH的小尺寸可能允许比完整抗体更温和、更特异地捕获和释放细胞。同样，VHHs可以靶向培养中的HSCs(例如，向细胞外递送生长因子或基因编辑器)。

·诊断和成像：使用标记的VHH(例如，荧光或放射性标记的纳米抗体)对HSCs或富含HSCs的组织进行诊断成像。与抗CD117 VHH偶联的放射性示踪剂可以对骨髓干细胞的分布进行成像或监测HSCs移植后的植入情况，利用VHHs的快速血液清除率来获得高对比度的图像。在病理实验室中，抗CD117 VHH试剂可以作为特定染色剂，用于在组织切片中识别HSCs或癌症干细胞。

核酸分子、载体和细胞

另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其包含可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白的核苷酸序列。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。

另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的分离的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的分离的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。

生产抗体的方法

另一方面，本申请提供了制备所述抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法可包括，在使得所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。

在某些实施方式中，所述方法可以是分子生物学方法。例如，所述方法包括制备编码前述任一项抗体或其抗原结合片段的一条或多条核苷酸序列，将所述一条或多条编码核苷酸序列构建到一个或多个表达载体中，并在适当的细胞中表达所述表达载体来制备。

本领域技术人员可以理解，在蛋白质的氨基酸序列确定的前提下，由于存在密码子简并性，可以使用不同的编码核苷酸序列，也可以对编码核苷酸序列进行优化。进行编码序列密码子优化的方法是本领域技术人员已知的，包括针对宿主的类型将密码子调整为宿主的偏好密码子，降低GC含量和/或减少富含GC的区域，提高mRNA稳定性，从而提高目标核苷酸在特定宿主中的表达效率。

合适的生产细胞是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞，例如293T、CHO或其衍生细胞系作为生产细胞。在一些实施方案中，使用微生物细胞例如细菌细胞或真菌细胞作为生产细胞，例如大肠杆菌或酵母。在一些实施方案中，使用昆虫细胞作为生产细胞，例如Sf9。可以针对具体的生产细胞系对编码本发明的三特异性抗体的核苷酸序列进行密码子优化。

优选对产生的抗体或其抗原结合片段进行纯化。所述纯化可以通过抗体生产领域的常规方法进行，所述方法可以包括过滤、层析等步骤。所述过滤步骤可以选自深层过滤、超滤、渗滤、纳米过滤中的一种或多种。所述层析步骤可以选自亲和层析、阳离子层析、阴离子层析、大小排阻层析、疏水层析、羟基磷灰石层析中的一种或多种。

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请所述抗体或其抗原结合片段。例如，可以用连接或天然存在的CD117或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。在某些实施方式中，可以通过提取免疫羊驼外周血淋巴细胞，提取细胞核酸片段克隆至载体，通过噬菌体表面展示系统筛选并富集针对CD117的抗体或其抗原结合片段。

任何合适形式的CD117都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对CD117特异的抗体，筛选所述抗体的生物学活性。例如，激发免疫原可以是全长的CD117，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。

药物组合物、治疗用途和检测试剂盒

另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的分离的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。

在某些实施方式中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本申请所述的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

在某些实施方式中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。

在某些实施方式中，所述药物组合物可以包含本文所述未分离的表达产物。具体地，所述表达产物是由前述生产抗体或其抗原结合片段的方法中产生的中间产物，为包含本申请所保护的抗体或其抗原结合片段的混合体系。在某些实施方式中，表达产物可以是均相原液。表达产物的制备和分析可以是本领域众所周知的。

在某些实施方式中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。

在某些实施方式中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂。

在某些实施方式中，所述药物组合物中还包含其他药物，所述其他药物与本申请抗体或其抗原结合片段偶联并通过本申请所述抗体或其抗原结合片段靶向至表达CD117的细胞并治疗相关疾病。

具体地，所述其他药物可以选自下组的一种或多种：小分子靶向抗癌剂、抗体药物、过继细胞疗法、溶瘤病毒和溶瘤病毒增强剂。

更具体地，所述其他药物可以选自下组的一种或多种：酪氨酸激酶抑制剂、丝/苏氨酸激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂、靶向共刺激分子的抗体、CAR-T、CAR-NK、CAR-M、TCR-T、TCR-NK、TCR-M、腺病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒、痘病毒、副粘液病毒、弹状病毒、小核糖核酸病毒、流感病毒和细小病毒。

在某些实施方式中，所述药物可以是包裹内容物的载体，例如，脂质体、腺相关病毒(AAV)、脂质纳米颗粒、囊泡、外泌体、慢病毒载体、腺病毒载体、金属纳米颗粒、介孔二氧化硅纳米颗粒、红细胞和血小板。所述内容物可以选自下组中的一种或多种：RNA药物(例如，mRNA、miRNA、环状RNA)、DNA药物(例如，编码基因、CRISPR系统)、蛋白药物(例如抗体)和小分子药物。

所述偶联方法可以是通过物理方法进行偶联，例如通过相互作用力进行偶联；也可以是通过化学方法进行偶联，例如通过共价键、离子键等进行偶联。

本申请涉及一种治疗有需要的受试者的方法，该方法可以包括向受试者施用预防有效量或治疗有效量的如本文所述的抗体或其抗原结合片段和/或组合物。如本文所用，“受试者”可以包括展现可用本文公开的抗体或其抗原结合片段、组合物和方法治疗的疾病、病症或疾患的症状的任何动物。适宜受试者(例如患者)可以包括非人类灵长类动物和/或人类患者。非人类灵长类动物可以选自以下的一种或多种：实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物(如马或牛)、家畜、宠物(如猫或狗)。

本申请所述“施用”是指将本申请所述抗体或其抗原结合片段、本申请所述分离的核酸分子、本申请所述载体、本申请所述细胞和/或本申请所述药物组合物引入受试者体内，或使本申请所述抗体或其抗原结合片段、本申请所述分离的核酸分子、本申请所述载体、本申请所述细胞和/或本申请所述药物组合物与细胞和/或组织接触。施用可以通过注射、冲洗、吸入、消耗、电渗透、血液透析、离子电渗和/或本领域中已知的其它方法进行。施用途径可以是随所治疗疾病的位置和性质而变化。所述施用途径可以包括施用部位和施用方式。所述施用部位可以选自以下的一种或多种：经耳、经颊、结膜、经皮、经牙、子宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、经肠、硬膜外、间质、关节内、动脉内、腹内、耳内、胆道内、支气管内、粘液囊内、海绵窦内、大脑内、脑池内、角膜内、冠内、冠状动脉内、颅内、真皮内、盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、心外膜内、表皮内、食管内、胃内、齿龈内、肝内、回肠内、病灶内、舌内、管腔内、淋巴内、乳房内、髓内、脑膜内、肌肉内、鼻内、结内、眼内、网膜内、卵巢内、腹膜内、心包内、胸膜内、前列腺内、肺内、瘤胃内、脊椎内、滑膜内、腱内、睾丸内、气管内、鞘内、胸廓内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、室内、膀胱内、前庭内、静脉内、玻璃体内、喉内、经鼻、鼻胃、经口、经眼、口咽、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、呼吸、眼球后(retro tubular)、直肠、脊椎、蛛网膜下、结膜下、皮下、真皮下、龈下、舌下、粘膜下、视网膜下、局部、经皮、心内膜内、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道和阴道。所述施用方式可以选自以下的一种或多种：灌注、灌洗和直接注射。

本申请所述“治疗”(“treating/treatment”)是指向受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗体或其抗原结合片段和/或其组合物，以使该受试者的疾病或疾患，或者疾病或疾患的症状有所改善。所述改善可以是疾病或疾患，或者疾病或疾患的症状的任何改善或医治。所述改善可以是可观察或可测量的改善，也可以是受试者健康状况的总体感觉。因此，本领域技术人员认识到，治疗可以改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。“预防有效量”是指有效实现期望的预防结果的病毒、病毒原液或组合物的量。如本文所用，“预防”可以指疾病症状的完全预防、疾病症状发作的延迟，或随后发生的疾病症状的严重程度的减轻。通常但不是必然地，由于预防剂量可以是在患病之前或患病早期用于受试者，故预防有效量小于治疗有效量。

本发明的抗体可以通过常规方法进行递送，优选进行系统性施用，例如通过静脉输注进行施用。

本发明的抗体可以以治疗有效量施用。“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病，或疾病或病症的至少一种临床症状时，足以使对所述疾病、病症或症状的此类治疗生效的抗体的量。“治疗有效量”可以随抗体，所述疾病、病症和/或疾病或病症的症状，所述疾病、病症和/或疾病或病症的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。

在本申请的一个优选实施方案中，抗体的给药量(mg/kg)基于受试者的体重。例如，本发明的抗体的单次给药剂量可以在约1ng/kg体重至约5mcg/kg体重的范围，优选5ng/kg体重至约2.5mcg/kg体重的范围，更优选0.1mcg/kg体重至约1mcg/kg体重的范围。例如，可以按照约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mcg/kg体重的剂量进行给药。

本发明的抗体的一个优势在于能够高效、完全激活T细胞，且不易发生激活后细胞凋亡，另外可以诱导记忆T细胞以提供持续的免疫应答，由此可以以相对较低的给药间隔进行给药。在优选的实施方案中，在通过静脉输注进行施用时，本发明的抗体两次给药之间的间隔可以不少于1天、不少于3天，不少于5天，或者甚至相隔一周。例如，本发明的抗体可以每周给药7次、每周给药5次、每周给药3次、每周给药两次或每周给药一次。本发明的抗体可以以2-4周例如3周为一周期给药，并且给药一个周期或多个周期。

另一方面，本申请提供一种试剂盒，其包含本申请所述抗体或其抗原结合片段，本申请所述分离的核酸分子，本申请所述载体，本申请所述细胞，和/或本申请所述药物组合物。

在某些实施方式中，所述试剂盒用于检测混合体系中的CD117含量。在某些实施方式中，所述检测可以是定性检测，也可以是定量检测。在某些实例中，CD117的含量可以单独或者与其他指标一起表征混合体系中造血干细胞的丰度。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1.基因工程人源化小鼠抗原免疫

使用AceMouseNB^TM小鼠生成纳米抗体。AceMouseNB^TM是一种基因工程人源化小鼠模型，设计用于产生全人源的仅重链抗体(HcAbs)。该小鼠是通过靶向基因编辑，将小鼠的重链可变区替换为人类对应的重链可变区，同时沉默轻链表达，从而能够产生人源的包含VHH的单域抗体。该模型小鼠能产生高亲和力抗原识别、低免疫原性的单域抗体，加速了用于治疗和诊断应用的单域抗体的发现。

用CD117抗原表达质粒按标准免疫程序免疫小鼠。采用流式细胞术对CD117抗原免疫后的小鼠血清进行分析，评价小鼠体内是否产生特异性抗体。

将CHO-CD117或CHO-WT细胞以同一数目接种于96孔板的每孔中。用稀释液(DPBS+3％FBS)按1:100、1:300、1:900、1:2700、1:8100、1:24300和1:72900的比例依次稀释抗原免疫小鼠血清。将稀释后的血清样品各50μL加入对应含细胞的孔中，轻轻混匀，4℃孵育45分钟。再次离心后用洗涤缓冲液(DPBS+3％FBS)洗涤2次，随后将细胞用50μL、浓度为500ng/mL的二抗溶液(山羊抗小鼠IgG-PE,Invitrogen,12-4010-82；或山羊抗人IgG Fc二抗-PE,Invitrogen,12-4998-82)重悬,4℃孵育30分钟。再次离心并用洗涤缓冲液再洗涤两次，将细胞重悬于25μL的3％ FBS中，用流式细胞术对样品进行分析，以确定每个细胞群的PE中位荧光强度。如图1所示，CD117抗原免疫后小鼠产生了稳定的特异性的免疫应答。经过多次强化免疫和最后一次免疫强化后，这些小鼠适合于分离CD117特异性的单克隆B细胞。

实施例2.抗CD117特异性单个B细胞分离和克隆分析

使用Single-B细胞技术，对脾细胞进行分选。从4个96孔板上获得克隆，随后选择2个板获得抗体基因。抗体基因经PCR扩增后克隆到AceMab表达载体中并瞬时转染以制备重组抗体表达上清进行克隆验证。根据实施例1中描述的方法，通过流式细胞术使用CHO-CD117、CHO-K1或HEL细胞对每个样品进行分析。如图2所示，选择CD117阳性细胞的MFI值大于10000同时对照细胞(CHO-K1)的MFI值小于5000的阳性克隆，使用NGS技术进行测序。

实施例3.抗体纯化

采用AceMab抗体表达载体表达阳性克隆抗体，收集细胞培养基上清进行抗体纯化。简单地说，首先将细胞培养上清通过0.22μm膜过滤器过滤以去除所有细胞碎片和颗粒。后将上清转移到预平衡的磁珠Pro-A中，在室温下孵育30分钟以允许抗体结合。孵育后，用磁铁收集磁珠1分钟，直到溶液变清之后丢弃上清。将磁珠重新悬浮在其5倍体积的洗涤缓冲液中孵育5-10分钟，培养基上清再次收集磁珠1分钟待溶液清除后去除上清并进行洗涤。此清洗过程重复两次，以确保彻底去除非特异性结合蛋白。加入1mL洗脱缓冲液(0.05M柠檬酸，pH＝3.0)洗脱抗体2～3次。加入中和缓冲液(洗脱液体积的1/15)，在280nm处用紫外分光光度法测定抗体浓度。为了进行脱盐和缓冲液交换，洗脱后的抗体通过G25 Sephadex色谱柱进行处理。最后进行标准SDS-PAGE鉴定。

实施例4.抗体表征

抗原结合效率

首先，使用实施例1中的方法，使用人CD117-CHO、猴CD117-CHO或HEL细胞，通过流式细胞术评估单克隆抗体的结合效率。每种抗体初始浓度为10μg/mL，随后进行一系列三倍稀释，以确定不同浓度下的抗体亲和力和特异性。数据如图3所示。

随后，采用ELISA法评估单克隆抗体对小鼠CD117抗原的结合效率。将小鼠CD117抗原用PBS稀释至1μg/mL作为包被液，96孔ELISA板每孔加入100μL，4℃孵育过夜。次日舍弃包被液，用200μL PBS对96孔板洗涤1次；然后每孔加入200μL封闭液室温孵育2小时。封闭后，使用稀释缓冲液稀释抗体至以下浓度：10000、3333.3、1111.1、370.37、123.46、41.15、13.72和4.57ng/mL；各浓度抗体加入50μL至96孔板中，室温孵育1小时。孵育后用200μL洗涤缓冲液(含0.05％ Tween-20的PBS)对96孔板洗涤3次。加入HRP偶联的山羊抗人IgG抗体50μL(0.4μg/mL)，室温孵育1小时；丢弃溶液，200μL洗涤缓冲液洗涤96孔板5次。检测时，加入50μL TMB底物，室温避光孵育3-5分钟；每孔加入50μl0.25M硫酸以停止反应，在450nm处测定吸光度。结果(如图4)表明，没有一个候选克隆与小鼠CD117结合。

亲和力

抗体与人CD117重组蛋白的亲和力采用生物层干涉法进行检测。简单地说，使用前将抗人Fc探针(gator,160003)在缓冲液中水合至少10分钟。抗体在缓冲液中稀释至5μg/mL并加入到96孔板传感器(beyotime,FCP966)上。人CD117重组蛋白抗原在缓冲液中依次稀释至300、100、33.3、11.1、3.7、1.23和0.41nM；另准备一个无抗原的对照孔作为基线参考。将含抗体的传感器浸入含有不同浓度人CD117重组蛋白中，结合期监测240秒；随后将传感器转移到新鲜缓冲液中进行解离监测超过300秒。数据见表1。

表1.候选抗体进行亲和力检测的结果。

ID	koff(1/s)	kon(1/Ms)	KD(M)
				Anti-CD117	2.95E-03	1.41E+06	2.09E-09
H.2346B1	3.67E-04	1.71E+06	2.15E-10
				H.2346B2	9.22E-04	4.85E+05	1.90E-09
H.2346B3	5.06E-04	8.96E+05	5.65E-10
				H.2346B4	7.38E-05	1.48E+06	4.99E-11
H.2346B5	1.54E-03	2.09E+06	7.38E-10
				H.2346B6	1.13E-03	1.73E+06	6.53E-10
H.2346B7	1.17E-03	1.10E+06	1.06E-09
				H.2346B8	1.08E-03	2.04E+06	5.32E-10
H.2346B9	8.72E-04	6.74E+05	1.29E-09
				H.2346B10	2.96E-03	2.71E+05	1.09E-08
H.2346B11	7.20E-04	1.68E+06	4.28E-10
				H.2346B12	7.83E-04	3.98E+05	1.97E-09
H.2346B13	6.42E-04	2.96E+06	2.17E-10
				H.2346B14	7.35E-04	6.02E+05	1.22E-09
H.2346B15	3.65E-03	3.47E+06	1.05E-09
				H.2346B16	6.65E-04	6.06E+05	1.10E-09
H.2346B17	8.27E-04	6.62E+05	1.25E-09

根据抗原结合、亲和力的所有结果，选择H.2346B1、H.2346B3、H.2346B4、H.2346B11、H.2346B13和H.2346B17进行CD117单克隆抗体的表达。

实施例5.修饰的VHH抗体纯化及鉴定

本实施例示范了候选阳性克隆抗体以抗CD117 VHH的形式构建，并对原始的anti-CD117VHH序列进行工程改造，在其C端引入了一个组氨酸标签(histidine-tag)、一个铰链(hinge)序列和一个半胱氨酸(cysteine，C)残基。按照标准方案将其克隆到AceMab抗体表达载体中。将重组表达载体转染到Expi293细胞中进行表达，通过His-tag亲和层析得到纯化的抗体。所有纯化抗体进行标准SDS-PAGE鉴定，如图5所示。

表2图5中各泳道对应的抗体克隆和浓度

泳道	抗体克隆	浓度(ug/ml)
			1\5	H.2346B1	2700
2\6	H.2346B3	1500
			3\7	H.2346B11	3450
4\8	H.2346B17	1800
			9\12	H.2346B3	3880
10\13	H.2346B4	4600
			11\14	H.2346B13	2100

实施例6.配体-连接子偶联物的合成

本实施例示范了利用经过改造的anti-CD117 VHH抗体进行位点特异性偶联以形成配体-连接子偶联物的方法。首先对原始的anti-CD117 VHH序列进行工程改造，在其C端引入了一个组氨酸标签(histidine-tag)、一个铰链(hinge)序列(可选)和一个半胱氨酸(cysteine，C)残基。改造后的VHH序列在Expi293细胞中进行瞬时表达，并经过纯化。所述序列改造可使VHH特定位点接入点击化学反应基团，从而提高偶联潜能，同时不影响VHH的内部结构稳定性。

所述半胱氨酸残基与VHH的连接方式包括直接连接(不含铰链序列)或经由五种不同结构特征的铰链序列(分别命名为Hinge-1、Hinge-2、Hinge-4、Hinge-5和Hinge-7)中的一种进行连接。各铰链序列设计旨在体现不同的结构特性。表2中提供了完整的氨基酸序列以及相应的成分特征，包括增强刚性的残基(如P、Y、F、W、V、I、L)的百分含量、甘氨酸(glycine，G)含量以及促进α螺旋结构稳定的氨基酸(如A、L、E、M)的比例。其中，Hinge-1为常用的柔性铰链序列(G₄S)₃，其具有较高的甘氨酸含量，表现出良好的柔韧性；Hinge-2与Hinge-4归类为受限型铰链序列，其中Hinge-2富含增强刚性的残基且甘氨酸含量极低，Hinge-4则包含超过80％的促进α螺旋结构稳定的氨基酸；Hinge-5与Hinge-7的刚性增强氨基酸比例约为50％，且不含甘氨酸，被归类为刚性铰链序列。以克隆H.2346B13为例，采用不同的铰链序列进行C端延伸，其具体序列如表所示。

表3不同铰链(hinge)序列及其特性

表4具有不同C端延伸序列的抗CD117 VHH氨基酸序列

改造后的配体、连接子及二者偶联形成的配体-连接子偶联物的结构示意图如图6所示。具体的偶联步骤包括：首先使用2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，2-MEA)对修饰和未修饰的VHH进行还原处理，随后利用Zeba^TM脱盐柱(分子量截留7K MWCO)对还原后的VHH进行纯化；接着将纯化的VHH与连接子DBCO-PEG₄-马来酰亚胺(DBCO-PEG4-Maleimide)在室温条件下偶联反应3小时。偶联位点为新引入的半胱氨酸残基，且反应条件不破坏VHH自身的内部二硫键结构。反应完成后，采用分子量截留值为3kD的超滤方法除去游离的连接子分子，同时将偶联产物的缓冲液更换为10mM PBS(pH 7.4)。纯化后的配体-连接子偶联物在-80℃条件下保存。经尺寸排阻色谱(Size-Exclusion Chromatography，SEC)和液相色谱-质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)对偶联产物进行分析鉴定，确认产物具有良好的纯度，并特异地接入了DBCO基团。

实施例7锚定修饰脂质纳米颗粒的制备

本实施例示范了利用包含点击基团的聚乙二醇(PEG)衍生物作为锚定片段制备锚定修饰脂质纳米颗粒(LNP)的方法。锚定片段可以为包含点击基团的两亲性聚合物、包含点击基团的PEG-脂质偶联物，或包含点击基团的PEG-疏水性聚合物偶联物。通过引入含有点击反应基团的锚定片段，可以使这些锚定修饰的LNP与经过连接子修饰的配体发生偶联，从而高效形成所需的配体偶联脂质纳米颗粒。所述点击基团是指参与点击化学反应的特定基团。

本实施例中使用的包含点击基团的锚定片段为DSPE-PEG-N3，其为一种末端带叠氮基的聚乙二醇化脂质，能够参与点击化学反应。将DSPE-PEG-N3掺入用于LNP制备的脂质混合物中。脂质成分的乙醇相包括一种可电离阳离子脂质、中性脂质DSPC、胆固醇、DSPE-PEG2000及包含点击基团的脂质DSPE-PEG2000-N3。所有脂质材料购自Avanti PolarLipids。具体制备方法为，将上述脂质溶于乙醇中，RNA则以0.1mg/mL的浓度溶于50mM枸橼酸钠缓冲液(pH 4.0)，并保持RNA与可电离阳离子脂质的质量比为1:10。

利用微流控技术进行LNP的制备，脂质溶液(乙醇相)以1mL/min的流速注入微流控混合器，同时RNA的水相溶液以3mL/min的流速注入，水相与乙醇相的体积比保持为3:1。脂质纳米颗粒在混合后的溶液中形成。随后进行透析，以去除乙醇并将缓冲液更换为PBS(10mM，pH 7.4)。透析步骤在4℃条件下利用Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo FisherScientific Inc.，分子量截留值100KD)对PBS进行两次透析，每次2小时。透析后的LNP通过超高速离心浓缩。

脂质纳米颗粒的表征：采用Zetasizer Nano ZS仪器(BeNano,Bettersize)测定LNP的粒径及多分散指数(PDI)，分别在PBS和Tris-HCl缓冲液中进行测量以确认其在不同介质中的稳定性。利用紫外-可见分光光度法测定LNP中RNA的浓度，通过记录吸收光谱并基于特定的消光系数进行计算，特别关注260nm处的吸光度并以330nm为基线校准。同时采用QUANT-IT^TMRIBOGREEN RNA测定试剂盒(上海闪晶分子生物技术有限公司)评估RNA的包封效率。将配体偶联脂质纳米颗粒的样品稀释于TE缓冲液后置于聚苯乙烯96孔板中，于40℃孵育10分钟，加入1:200稀释的RIBOGREEN试剂，用Molecular Devices i3max微孔板读数仪分别在约488nm和525nm波长下测量荧光强度。通过比较完整配体偶联脂质纳米颗粒的样品与加入Triton X-100破坏颗粒后的样品荧光强度确定RNA的游离百分比，最终计算RNA的包封率。

实施例8通过生物正交点击反应制备靶向脂质纳米颗粒

本实施例示范了通过生物正交点击化学反应在脂质纳米颗粒(LNP)表面偶联配体制备靶向性脂质纳米颗粒(tLNP)的方法。工艺简单步骤包括将VHH-连接子偶联物与锚定修饰的LNP在溶液中混合并经超滤处理，以温和条件实现配体的偶联。具体制备流程如图7所示。

首先，将一定量的VHH-连接子偶联物加入预制的锚定修饰LNP溶液中，二者以特定比例混合，在室温下孵育3小时以完成偶联反应。孵育完成后，通过分子量截留值100KD的超滤装置进行三次超滤，以去除未结合的配体，并将缓冲液置换为20mM Tris-HCl(pH 7.4)。为实现长期保存，将40％的蔗糖溶液加入以调整缓冲液终浓度为20mM Tris-HCl(pH 7.4)，蔗糖浓度为8％。最后，将tLNP通过0.22μm滤膜进行无菌过滤处理，所得LNP分装后储存在-80℃条件下备用。

实施例9细胞系体外评价研究

本实施例示范了通过表达特定受体的细胞系与不表达该受体的细胞系的对比研究，评价靶向性脂质纳米颗粒(tLNP)的递送效率及脱靶效应。以HEL细胞系(一种人红白血病细胞系)及过表达CD117受体的CHO工程细胞为靶细胞，未改造的CHO细胞作为非靶细胞进行对比研究。HEL细胞培养于含L-谷氨酰胺(ThermoFisher)、10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中。CHO细胞培养于含10％胎牛血清及1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中。将细胞以每孔20万细胞/250μL的密度接种至24孔板中，随后每孔加入特定量的包封编码GFP或tdTomato的核酸的tLNP，孵育6小时后，以300g离心7分钟收集细胞沉淀，用100μL PBS重悬细胞，以备流式细胞术分析。采用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)进行分析，通过CytExpert软件处理流式数据，以确定不同细胞系中GFP或tdTomato阳性细胞的百分比。

实施例10表面偶联不同分子量配体的LNP比较研究

本实施例评估了本发明所公开的tLNP制备方法在表面偶联不同分子量配体的情况下的靶向递送效率。我们选用两种靶向CD117(c-kit)的抗体进行比较，CD117为高表达于造血干细胞(HSC)上的受体，适用于HSC的靶向递送。这两种抗体分别为VHH(约16kDa)和scFv(约30kDa)。按照实施例6所述方法制备配体-连接子偶联物，采用经过改造的anti-CD117 VHH和anti-CD117 scFv，具体氨基酸序列详见表5。所述VHH与scFv序列均在其C端进行改造，引入了组氨酸标签、非(G4S)n型铰链序列及半胱氨酸残基。

表5原始和改造后的抗体序列

随后，按照实施例7的方法制备封装有编码GFP蛋白的mRNA的锚定修饰脂质纳米颗粒，再按照实施例8的步骤配制出靶向CD117的tLNP。根据此前的优化配方经验，选用两种配方比例：配方C和配方E，其中PEG脂质总含量分别为1％和1.5％，且锚定脂质与PEG脂质的比率均为50％。可电离脂质采用Compound 062。在配体偶联步骤中，配体使用量范围为0.125％至0.5％。各配方及其理化表征参数信息详见表6。

表6不同LNP配方及其理化表征参数信息

按照实施例9的步骤，将上述制备的tLNP用于转染HEL细胞(人红白血病细胞)及hCD117过表达的CHO细胞(hCD117 CHO)。转染结果如图8所示。VHH和scFv偶联物均显著增强了靶细胞(表达CD117的细胞)的GFP基因表达水平。观察发现，在不同抗体-连接子偶联物的用量范围内，VHH表现始终优于scFv。例如，在HEL细胞中，背景扣除后的最佳VHH偶联LNP配方所得的平均荧光强度(MFI)达到scFv偶联LNP最佳配方所得MFI的10倍。此外，值得注意的是，对于scFv，配体量从0.125％增加至0.5％时，向靶细胞的递送效率呈逐步提升的趋势；而VHH则在0.125％的较低配体量即已展现出最佳的递送性能。上述研究结果表明，利用本发明所公开的制备技术，分子量更低的抗体形式(尤其是VHH)有望获得更佳的靶向递送效果。

实施例11评估铰链序列对靶向CD117的tLNP递送效率的影响

为了深入研究铰链序列对靶向递送效率的影响，我们采用了一种针对造血干细胞标记物CD117的单域抗体(VHH，clone H.2346B13)。所有构建体共享相同的VHH框架结构，并在C端引入了一个半胱氨酸残基，以实现位点特异性偶联。半胱氨酸与VHH的连接方式包括直接连接(不含铰链序列)或经由五种不同结构特征的铰链序列(分别命名为Hinge-1、Hinge-2、Hinge-4、Hinge-5和Hinge-7)中的一种进行连接，各铰链序列设计旨在体现不同的结构特性，如实施例6所示。所有VHH构建体均经过瞬时表达和纯化(具体氨基酸序列详见表3)。按照实施例6中所述方法，将VHH C端的半胱氨酸经还原处理后，通过硫醇-马来酰亚胺化学反应实现与DBCO-PEG₄-马来酰亚胺连接子的位点特异性偶联。随后，依据实施例7所述方法制备了封装有编码GFP蛋白的mRNA的锚定修饰脂质纳米颗粒，再按照实施例8的程序制备了靶向CD117的tLNP，所用配方为配方C(总PEG脂质含量为1％，锚定脂质与PEG脂质比例为50％)。最终LNP的组成及其理化特性详见表7。

表7不同LNP配方及其理化表征参数信息

我们以人源CD117表达的CHO细胞作为阳性靶细胞群，未改造的野生型CHO细胞作为阴性对照，评估了上述靶向CD117的LNP的递送效率。按照实施例9所述方法进行体外转染实验，结果如图9所示。所有经VHH偶联的tLNP在CD117阳性CHO细胞中的平均荧光强度(MFI)均显著高于野生型CHO细胞，证实了其特异性递送能力。值得注意的是，含G4S铰链序列的构建体的表现明显优于无铰链序列的构建体，表明即使是柔性的铰链序列也能提高C端半胱氨酸位点的可及性，有利于偶联反应的进行。此外，不同铰链序列的结构性质显著影响递送效率：含受限型或刚性铰链序列(Hinge-2、Hinge-4、Hinge-5、Hinge-7)的构建体在靶细胞中的转染效率持续高于无铰链或柔性G4S铰链的构建体。其中，含刚性铰链序列(Hinge-5与Hinge-7)的构建体实现了最高的递送水平，略优于含受限型铰链序列的构建体。这一结果表明刚性铰链所提供的空间约束可能更有助于将偶联的VHH在LNP表面展示位点进行优化，从而更有效地与受体相互作用。

实施例12.使用装载CRISPR/Cas12b的靶向性LNPs对HSC细胞进行体外基因编辑

在本实施例中，发明人使用本申请公开的靶向CD117的tLNP评估了tLNP的基因递送和编辑能力。这些tLNP被设计用于递送基因编辑的组分，其封装了靶向HBG1/2启动子的、编码CRISPR-AaCas12bMax和sgRNA的mRNA。对HBG1/2启动子进行编辑有望诱导插入突变，重新激活胎儿珠蛋白表达，这有可能作为治疗地中海贫血和镰状细胞病的一种新方法。

AaCas12bMax是嗜酸艾丽环杆菌衍生的Cas12b(AaCas12b)的一种高活性变体，可作为基因编辑酶。AaCas12bMax的氨基酸序列见表8。编码AaCas12bMax的mRNA通过体外转录(IVT)合成，方法如下：将AaCas12bMax的编码序列插入质粒形成DNA模板，模板包含目标蛋白序列、5'和3'UTR序列以及5'UTR上游的T7启动子；含有poly A尾的上述质粒的PCR产物用于体外转录。T7 RNA聚合酶识别DNA模板的T7启动子并启动体外mRNA转录；体外转录mRNA的5'帽结构在体外转录期间添加，并使用n1-甲基-假尿嘧啶代替尿嘧啶。所有体外转录反应均在37℃下进行2小时。DNase I在37℃下去除DNA模板30分钟，后进行柱纯化获得全长体外转录mRNA。

sgRNA被设计用于靶向HBG1/HBG2基因启动子上游200bp区域的LRF结合基序。通过化学修饰对sgRNA进行优化，并将靶向序列延长至23nt。优化后的sgRNA由金唯智公司合成，并用水溶解至100μM。

为了在HSC细胞中实现精确的基因编辑，制备了包裹CRISPR-AaCas12bMax mRNA和sgRNA的CD117靶向LNP。首先根据实施例6，使用修饰的抗CD117 VHH抗体制备配体-连接子偶联物。随后如实施例7所述，制备锚定修饰的LNP。最后按照实施例8所述制备包封CRISPRmRNA和sgRNA的tLNPs，其中保持AaCas12bMax mRNA与sgRNA的重量比为1:1。最终LNP浓度根据制剂中总RNA浓度确定。CD117靶向的LNP详细组成和物理化学性质见表9。

HEL细胞以4E+05/mL浓度暴露于LNP-922/923(1-4μg/mL)24小时。随后HEL细胞再培养48h并提取基因组DNA。通过扩增靶sgRNA结合位点周围的区域构建文库，并通过NGS进行测序。采用Cas-Analyzer(www.rgenome.net/cas-analyzer)对NGS结果进行分析。图10数据显示LNP-922和LNP-923均表现出高编辑效率且呈剂量依赖性，表明其在体内编辑的巨大潜力。

表8.AaCas12bMax和sgRNA序列

表9.不同HSC靶向LNPs所用的VHH抗体与配方

表10不同克隆的CDR序列

克隆名	CDR1(Kabat 31–35)	CDR2(Kabat 50–65)	CDR3(Kabat 95–102)
				H.2346B4	VVSGFTFGSYA	SSISGIDNGTYYADSVKG	AKDQEYSYDPYFFDY
H.2346B11	AASGFAFSDAW	GRIKGKTDGGTTDYAAPVK	THHSGYDFPDTFDI
				H.2346B13	AASGFTFSDAS	GRIKSQPDGGTIDYAAPVK	CSLDPTSTGEDFFDI

Claims

1.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人CD117，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)，所述重链可变区包括重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3选自以下任一组：

(1)所述HCDR1包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ

ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(2)所述HCDR1包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ

ID NO:7所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或

(3)所述HCDR1包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQID NO:11所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述VH包括如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或者包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为特异性结合人CD117的VH。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为单域抗体。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含Fc片段。

6.一种融合蛋白，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

7.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的融合蛋白的核苷酸序列。

8.一种载体，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子。

9.一种细胞，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子或权利要求8所述的载体。

10.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的融合蛋白、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体和/或权利要求9所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。

11.其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的融合蛋白、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的细胞和/或权利要求10所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病。

12.一种检测样品中CD117的试剂或试剂盒，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的融合蛋白、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的细胞和/或权利要求10所述的药物组合物。

13.一种检测样品中CD117的方法，所述方法包括使用权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的融合蛋白、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的细胞和/或权利要求10所述的药物组合物。