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CN120366305A - 一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA及其应用 - Google Patents

一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA及其应用

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CN120366305A
CN120366305A CN202510538471.6A CN202510538471A CN120366305A CN 120366305 A CN120366305 A CN 120366305A CN 202510538471 A CN202510538471 A CN 202510538471A CN 120366305 A CN120366305 A CN 120366305A
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seq
sirna
nucleic acid
acid molecule
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CN202510538471.6A
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朱婷婷
杜宏
段春晓
张佩琢
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Suzhou Genepharma Co ltd
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Suzhou Genepharma Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种用于抑制白细胞介素‑1α的siRNA及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种用于抑制白细胞介素‑1α的siRNA，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～17任一项所示的核酸分子；所述siRNA的反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.18～34任一项所示的核酸分子。实验证明，所述siRNA均对白细胞介素‑1α具备高抑制活性。本发明还提供了用于抑制白细胞介素‑1α的经修饰的siRNA，所述修饰包括甲氧基修饰、氟代修饰和/或硫代磷酸酯基连接。实验证明，经修饰的siRNA在0.1～10nM的浓度下均对白细胞介素‑1α具备高抑制活性。

Description

一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA及其应用
本申请是“申请日为2024年10月25日，申请号为：202411499440.6，发明名称为一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
白细胞介素-1α(Interleukin-1α，IL-1α)由IL1A基因转录编码，是趋化因子家族的一种细胞因子，具有多种生物学功能。白细胞介素-1α是一种多功能信号分子，广泛存在于机体中，在细胞内，它作为转录因子，能够调控细胞的生长和分化，而在细胞外，它参与机体的炎症应答。白细胞介素-1α的前体和成熟形式都具有生物活性，但成熟形式的白细胞介素-1α生物活性更强。
研究表明，白细胞介素-1α能够驱动类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身炎症性疾病，这类由白细胞介素-1α介导的自身炎症性疾病最一致的临床特征是发作性或慢性的全身或组织炎症，常见受累区域包括皮肤和肌肉骨骼系统，因此，白细胞介素-1α能够作为自身炎症性疾病的治疗靶点，白细胞介素-1α抑制剂能够有效治疗包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮在内的多种由白细胞介素-1α介导的自身炎症性疾病。
除驱动自身炎症性疾病的发生以外，白细胞介素-1α还参与肿瘤的发生和发展。例如，白细胞介素-1α已被证实长期以来一直与炎症诱导的癌变有关，并且，白细胞介素-1α已被证明可以促进黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤的生长和转移。进一步研究发现，白细胞介素-1α的促肿瘤机制十分复杂，包括髓系细胞的招募和免疫抑制，促进血管生成和内皮细胞的激活，以及淋巴样细胞分化倾斜等。现阶段，已经许多新的研究证明，在肿瘤的发展早期使用白细胞介素-1α抑制剂进行阻断可以有效减缓肿瘤的生长。因此，白细胞介素-1α抑制剂能够用于肿瘤的治疗。
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)是一个长20～25个核苷酸的双链RNA，它能够通过RNA干扰(RNAi)机制介导特异性基因的沉默。在RNAi通路中，siRNA通过与互补mRNA分子杂交干扰基因表达，这种干扰会触发mRNA降解，进而抑制特定基因的基因表达。这种带有专一性的调节基因表达的方式，使得siRNA可以作为一种靶向治疗药物，特异性调控与疾病相关基因的表达，进而实现治疗疾病的目的。若能开发出能够有效抑制白细胞介素-1α表达的siRNA，将是一种更加有效且更加具有针对性的炎症性疾病治疗药物及癌症治疗药物。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链；所述正义链和反义链至少部分地反向互补形成双链区；所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～17任一项所示的核酸分子；所述siRNA的反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.18～34任一项所示的核酸分子。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的核酸分子。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；
或者，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为经修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链和/或反义链中的全部核苷酸均为经修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制白细胞介素-1α基因表达的功能明显削弱或丧失。
在本发明的一种实施方式中，所述修饰包括甲氧基修饰、氟代修饰和/或硫代磷酸酯基连接。
在本发明的一种实施方式中，所述“硫代磷酸酯基连接”是指siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。
在本发明的一种实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
在本发明的一种实施方式中，经氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，所述反义链的至少第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸；
经甲氧基修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的至少第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸；
所述硫代磷酸酯基连接的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接，所述反义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位、第19位与第20位、第20位与第21位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒表达上述siRNA。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体包括病毒载体或非病毒载体中的至少一种；所述病毒载体包括黄病毒载体、逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、杂合病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体或慢病毒载体中的至少一种；所述非病毒载体包括质粒载体。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体包括pUC质粒、pUC质粒的衍生质粒、pAAV质粒、pAAV质粒的衍生质粒、PGEM质粒和/或PGEM质粒的衍生质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的制备方法为：根据siRNA设计shRNA；将shRNA与线性化的载体连接，得到重组质粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，所宿主细胞的基因组整合有上述siRNA；或者，所述宿主细胞携带上述重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞包括真菌、细菌、植物细胞和/或动物细胞。
本发明还提供了上述siRNA、上述重组质粒或上述宿主细胞在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为与白细胞介素-1α的表达相关的疾病。
在本发明的一种实施方式中，所述与白细胞介素-1α的表达相关的疾病包括癌症和/或炎症性疾病。
在本发明的一种实施方式中，所述癌症包括黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌和/或乳腺癌。
在本发明的一种实施方式中，所述炎症性疾病包括自身炎症性疾病；所述自身炎症性疾病包括类风湿性关节炎和/或系统性红斑狼疮。
本发明还提供了一种白细胞介素-1α抑制剂，所述抑制剂的成分包含上述siRNA、上述重组质粒和/或上述宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述抑制剂的成分还包含药学上可接受的辅料；所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、粘合剂和/或润滑剂。
本发明还提供了一种预防和/或治疗疾病的药物，所述疾病为与白细胞介素-1α的表达相关的疾病；所述药物的成分包含上述siRNA、上述重组质粒和/或上述宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述与白细胞介素-1α的表达相关的疾病包括癌症和/或炎症性疾病。
在本发明的一种实施方式中，所述癌症包括黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌和/或乳腺癌。
在本发明的一种实施方式中，所述炎症性疾病包括自身炎症性疾病；所述自身炎症性疾病包括类风湿性关节炎和/或系统性红斑狼疮。
在本发明的一种实施方式中，所述药物的成分还包含药学上可接受的辅料；所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、粘合剂和/或润滑剂。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～17任一项所示的核酸分子；所述siRNA的反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.18～34任一项所示的核酸分子。实验证明，所述siRNA均对白细胞介素-1α具备高抑制活性，因此，所述siRNA在制备预防和/或治疗与白细胞介素-1α的表达相关的疾病(例如癌症和炎症性疾病等)的药物中极具应用前景。
进一步地，所述siRNA的正义链的第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，第1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，第1位与第2位、第2位与第3位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接；所述siRNA的反义链的第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，第1位与第2位、第2位与第3位、第19位与第20位、第20位与第21位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接。实验证明，经修饰的siRNA在0.1～10nM的浓度下均对白细胞介素-1α具备高抑制活性，因此，经修饰的siRNA在制备预防和/或治疗与白细胞介素-1α的表达相关的疾病(例如癌症和炎症性疾病等)的药物中极具应用前景。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中大写字母C、G、U、A表示核糖核苷酸；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基修饰。
实施例1：一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA
本实施例提供了一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列基于靶mRNA设计得到，见表1。
表1.抑制白细胞介素-1α的siRNA及其序列
实施例2：一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA
本实施例提供了一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA，所述siRNA为在实施例1的基础上，将siRNA的正义链的第7、8、9位的核苷酸替换为经氟代修饰的核苷酸，第1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸替换为经甲氧基修饰的核苷酸，第1位与第2位、第2位与第3位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接，将siRNA的反义链的第2、6、14、16位的核苷酸替换为经氟代修饰的核苷酸，第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21位的核苷酸替换为经甲氧基修饰的核苷酸，第1位与第2位、第2位与第3位、第19位与第20位、第20位与第21位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接，见表2。
表2.抑制白细胞介素-1α的siRNA及其序列
实验例1：用于抑制白细胞介素-1α的siRNA的抑制活性检测
本实验例提供了用于抑制白细胞介素-1α的siRNA的抑制活性检测实验，实验过程如下：
将Hey细胞(人卵巢癌细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0671)接种至含10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％(v/v)青霉素链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin，购自Gibco，货号15140122)的DMEM培养基(购自Transgen Biotech，货号FI101-01)中，于5％(v/v)CO2、37℃细胞培养箱中培养48h；培养结束后，使用胰酶(购自GIBCO，货号25200-072)消化培养所得的Hey细胞；消化结束后，先使用PBS缓冲液润洗，再使用DMEM培养基重悬消化后的Hey细胞，得到细胞浓度为3×105个/mL的细胞悬液；
使用opti-MEM(购自Gibco，货号31985-070)分别稀释不同的siRNA，得到含不同siRNA的siRNA稀释液；将25μL opti-MEM与0.25μL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(购自赛默飞，货号11668-019)混合，得到转染试剂稀释液；取25μL含不同siRNA的siRNA稀释液分别与转染试剂稀释液混合后，室温(25℃)静置15min，得到含不同siRNA的转染液；
将细胞悬液以50μL/孔的接种量接种至96孔板中后，在96孔板中设置转染试剂对照组(MOCK)、IL1A-1M1实验组、IL1A-2M1实验组、IL1A-3M实验组、IL1A-4M1实验组、IL1A-5M1实验组、IL1A-6M1实验组、IL1A-7M1实验组、IL1A-8M1实验组、IL1A-9M1实验组、IL1A-10M1实验组、IL1A-11M1实验组、IL1A-12M1实验组、IL1A-13M1实验组、IL1A-14M1实验组、IL1A-15M1实验组、IL1A-16M1实验组和IL1A-17M1实验组，每组设置4个复孔；
设置完毕后，在实验组的孔中分别添加50μL含不同siRNA的转染液(IL1A-1M1实验组给予含IL1A-1M1的转染液，IL1A-2M1实验组给予含IL1A-2M1的转染液，以此类推，其中，siRNA在孔中的终浓度为10nM)，在转染试剂对照组(MOCK)的孔中添加50μL不含任何siRNA的转染液，于5％(v/v)CO2、37℃细胞培养箱中培养48h进行转染；转染结束后，弃去孔中液体，收集细胞，并采用磁珠法细胞总RNA提取试剂盒(吉玛基因-E31008-96)提取细胞中的总RNA，得到RNA提取液；
按照表3配置基因组DNA去除反应体系以去除RNA提取液中的基因组DNA，得到经处理的RNA提取液(去基因组DNA的反应程序为：42℃，2min)；按照表4配置cDNA合成反应体系，对经处理的RNA提取液中的总RNA进行反转录，得到cDNA溶液(反转录的条件为：50℃，15min；85℃，2min)；将cDNA溶液使用无酶水稀释5倍后，以稀释后的cDNA溶液作为模板，以编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因(HGAPDH基因)作为内参基因，按照表5配置RT-qPCR探针法反应体系(反应体系中使用的引物见表6)，并使用配置得到的RT-qPCR探针法反应体系在上进行荧光定量PCR反应(荧光定量PCR反应的扩增程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因IL1A和内参基因GAPDH的产物W；产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育程序，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因IL1A和内参基因GAPDH的溶解曲线)，得到测试组目标基因(IL1AmRNA)和测试组内参基因(GAPDH)的Ct值；采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中的目标基因(IL1AmRNA)进行相对定量计算，计算结果见表7；
其中，相对定量的计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)；
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)；
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)；
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)；
进行计算时，以转染试剂对照组为基准，对测试组IL1AmRNA的表达水平进行归一化，定义转染试剂对照组IL1AmRNA的表达水平为100％；
测试组IL1AmRNA的相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％；
对于同一测试组siRNA，每一浓度下的测试组IL1A mRNA相对表达水平平均值为该浓度3个培养孔的相对表达水平的算术平均值；
siRNA对IL1A mRNA表达量的抑制率按如下等式计算：抑制率＝(1-测试组IL1AmRNA相对表达水平)×100％。
由表7可知，与转染试剂对照组(MOCK)相比，除IL1A-9M1以外，IL1A-1M1～IL1A-8M1和ILlA-10M1～IL1A-17M1均对白细胞介素-1α具备抑制活性，其中，IL1A-1M1、IL1A-2M1、IL1A-3M1、IL1A-4M1、IL1A-5M1、IL1A-6M1、IL1A-7M1、IL1A-10M1、IL1A-11M1、IL1A-12M1、IL1A-16M1和IL1A-17M1等对白细胞介素-1α的抑制活性较高。
表3.基因组去除反应体系
试剂名称 单孔体积(μL)
4×gDNA去除预混液/4×gDNA wiper Mix 4
RNA提取液 12
表4 cDNA合成反应体系
试剂名称 单孔体积(μL)
5×反转录预混液/5×RT Mix 4
RNA提取液 16
表5.RT-qPCR探针法反应体系
试剂名称 单孔体积(μL)
2×染料法荧光定量PCR预混液/2×SYBR Mix 6.5
上游引物(10μM) 0.26
下游引物(10μM) 0.26
无酶水/RNase-free ddH2O 0.78
模板 5.2
总体积 13
表6.引物信息
表7.不同siRNA(IL1A-1M1～IL1A-21M1)对IL1A mRNA表达量的抑制率
组别 IL1A mRNA相对表达水平
转染试剂对照组 1.00
IL1A-1M1实验组 0.20
IL1A-2M1实验组 0.31
IL1A-3M1实验组 0.30
IL1A-4M1实验组 0.25
IL1A-5M1实验组 0.35
IL1A-6M1实验组 0.47
IL1A-7M1实验组 0.28
IL1A-8M1实验组 0.63
IL1A-9M1实验组 1.16
IL1A-10M1实验组 0.45
IL1A-11M1实验组 0.48
IL1A-12M1实验组 0.19
IL1A-13M1实验组 0.74
IL1A-14M1实验组 0.73
IL1A-15M1实验组 0.80
IL1A-16M1实验组 0.24
IL1A-17M1实验组 0.23
实验例2：用于抑制白细胞介素-1α的siRNA在不同浓度下的抑制活性检测
本实验例提供了用于抑制白细胞介素-1α的siRNA在不同浓度下的抑制活性检测实验，实验过程如下：
在实验例1的基础上，增加空白对照组(BLANK)和阴性对照组(NC)，并选取抑制活性较高的IL1A-1M1、IL1A-2M1、IL1A-3M1、IL1A-4M1、IL1A-5M1、IL1A-7M1、IL1A-12M1、IL1A-16M1和IL1A-17M1作为研究对象，实验过程中，通过调整siRNA经opti-MEM稀释后的浓度，将siRNA在孔中的浓度分别由10nM替换为0.1nM及1nM，其中，空白对照组(BLANK)即在孔中不添加任何试剂以作为空白对照，在阴性对照组(NC)即在孔中添加50μL含NC的转染液(NC在孔中的终浓度为10nM)作为阴性对照，实验结果见表8。
由表8可知，与空白对照组(BLANK)和转染试剂对照组(MOCK)相比，IL1A-1M1、IL1A-2M1、IL1A-3M1、IL1A-4M1、IL1A-5M1、IL1A-7M1、IL1A-12M1、IL1A-16M1和IL1A-17M1在0.1～1nM的更低浓度下均对白细胞介素-1α具备高抑制活性。
表8.不同siRNA
(IL1A-1M1/IL1A-2M1/IL1A-3M1/IL1A-4M1/IL1A-5M1/IL1A-7M1/IL1A-12M1/IL1A-16M1/IL1A-17M1)在不同浓度(0.1nM、1nM及10nM)下对IL1AmRNA表达水平的抑制率
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种用于抑制白细胞介素-1α的siRNA，其特征在于，所述siRNA含有正义链和反义链；所述正义链和反义链至少部分地反向互补形成双链区；所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2～17任一项所示的核酸分子；所述siRNA的反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.19～34任一项所示的核酸分子。
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQID NO.2所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的核酸分子；
或者，所述siRNA的正义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的核酸分子，反义链包含核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的核酸分子。
3.如权利要求1或2所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为经修饰的核苷酸。
4.如权利要求3所述的siRNA，其特征在于，所述修饰包括甲氧基修饰、氟代修饰和/或硫代磷酸酯基连接。
5.如权利要求4所述的siRNA，其特征在于，经氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，所述反义链的至少第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸；
经甲氧基修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的至少第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸；
所述硫代磷酸酯基连接的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接，所述反义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位、第19位与第20位、第20位与第21位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接。
6.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒表达权利要求1～5任一项所述的siRNA。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所宿主细胞的基因组整合有权利要求1～5任一项所述的siRNA；或者，所述宿主细胞携带权利要求6所述的重组质粒。
8.权利要求1～5任一项所述的siRNA、权利要求6所述的重组质粒或权利要求7所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为与白细胞介素-1α的表达相关的疾病。
9.一种白细胞介素-1α抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的成分包含权利要求1～5任一项所述的siRNA、权利要求6所述的重组质粒和/或权利要求7所述的宿主细胞。
10.一种预防和/或治疗疾病的药物，其特征在于，所述疾病为与白细胞介素-1α的表达相关的疾病；所述药物的成分包含权利要求1～5任一项所述的siRNA、权利要求6所述的重组质粒和/或权利要求7所述的宿主细胞。
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