CN120310836A - 通过提高杨树中PtrWOX5.2基因的表达促进杨树单倍体的植株再生效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了通过提高杨树中PtrWOX5.2基因的表达促进杨树单倍体的植株再生效率的方法。本发明通过将PtrWOX5.2基因转入杨树单倍体细胞系或花药培养诱导的愈伤组织中，过量表达PtrWOX5.2的转基因杨树单倍体细胞系或愈伤组织与对照比较，细胞的增殖增加，愈伤组织生长加速，愈伤组织分化率提高，分化出更多丛生芽。这些结果表明PtrWOX5.2基因的过量表达能够提高杨树单倍体植株再生效率。

Description

通过提高杨树中PtrWOX5.2基因的表达促进杨树单倍体的植 株再生效率的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中通过提高杨树中PtrWOX5.2基因的表达促进杨树单倍体的植株再生效率的方法。

背景技术

植物单倍体育种一方面通过染色体加倍在一个世代就能迅速获得纯合的二倍体植株，能够有效控制后代性状分离，大大缩短育种周期，提高选择效率，加快育种进程；另一方面为遗传学研究和基因组学研究提供了背景纯合的植物材料，在遗传群体构建、基因功能鉴定、转基因植株快速稳定、基因组测序等领域中具有独特作用。

林木是基因组高度杂合的异交物种，其具有遗传杂合度高、体积大、交叉授粉严格等特点，很难通过传统多代自交手段获得纯合系。针对林木而言，利用单倍体诱导和加倍技术获得双单倍体(DH系)，是利用纯系进行林木良种培育的有效途径。

提高单倍体诱导效率和简化诱导程序是单倍体育种的关键。花药培养是应用最广泛的单倍体诱导技术。然而，许多具有优良农艺性状的杨树品种在花药培养中难以获得再生植株，亟需解析单倍体产生的分子机制，并通过优化花药培养的组织培养体系，来克服基因型带来的局限性造成的再生问题。在花药培养诱导形成单倍体的过程中，花粉母细胞经过减数分裂后会产生的单核花粉粒具有遗传多样性，每个花粉粒携带不同的遗传组合，不同花粉粒对培养条件的需求可能有所不同，这使得优化培养基条件变得更加复杂。

已有研究通过深入分析植物再生的细胞谱系和分子机理，鉴定了影响植物再生的关键发育调控因子，如LEAFY COTYLEDON1(LEC1)，LEC2、WUSCHEL(WUS)和BABY BOOM（BBM）,GROWTH-REGULATING FACTOR 4(GRF4)-GRF-INTERACTING FACTOR 1(GIF1)等。这些因子的过量表达促进了体细胞胚的生成或芽的再生。这些调控因子，能够有效提高植物的再生能力，解决基因型依赖性瓶颈问题，为提高花药培养单倍体植株再生效率提供了新的策略。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高杨树单倍体的植株再生效率。

为了解决以上技术问题，本发明提供了通过提高杨树中PtrWOX5.2基因的表达促进杨树单倍体的植株再生效率的方法，所述PtrWOX5.2基因为编码PtrWOX5.2蛋白的基因，所述PtrWOX5.2蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质；

A2、将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且功能类似的蛋白质；

A3、在A1或A2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述方法中，序列表中的SEQ ID No.2由182个氨基酸残基组成。

上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

上述方法中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85%、90%、91%、92%、95%、96%、98%、99%或100%的同一性。

上述方法中，所述PtrWOX5.2蛋白可来源于杨树。

上述方法中，所述PtrWOX5.2基因具体可为编码链的编码序列是序列表中SEQ IDNo.1的核酸分子。

上述方法中，所述杨树单倍体来源于杨树单倍体或非单倍体植株，例如杨树单倍体细胞系或来源于杨树花药培养诱导的愈伤组织。

上述方法中，所述促进杨树单倍体的植株再生效率表现为Y1-Y3中的任一种或多种的组合：

Y1促进细胞的增殖；

Y2加速愈伤组织的生长；

Y3促进分化出丛生芽。

上述方法中，包括将所述的PtrWOX5.2基因导入受体杨树单倍体细胞系或花药培养诱导的愈伤组织中，得到单倍体植株再生效率高的杨树；从而提高了单倍体诱导效率。（原先不分化或不再生的单倍体细胞系或花药培养诱导的愈伤组织，经过导入PtrWOX5.2基因后，能够再生出植株，从而获得了更多的单倍体植株，提高了单倍体诱导效率。）

上述方法中，其中所述的PtrWOX5.2基因可先进行如下修饰，再导入受体杨树中，以达到更好的表达效果：

1）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；本发明的一个实施例中采用启动子35S驱动PtrWOX5.2基因；

3）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

所述PtrWOX5.2基因可通过使用 Ti质粒，植物病毒栽体，直接 DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（ Weissbach, 1998， Method for PlantMolecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp.411-463; Geiserson andCorey , 1998 , Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

本发明还提供蛋白质，为所述PtrWOX5.2蛋白。

本发明还提供与所述PtrWOX5.2蛋白相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与所述PtrWOX5.2蛋白相关的生物材料，为下述B1至B5中的任一种：

B1、编码PtrWOX5.2蛋白的核酸分子；

B2、含有B1所述核酸分子的表达盒；

B3、含有B1所述核酸分子的重组载体、或含有B2所述表达盒的重组载体；

B4、含有B1所述核酸分子的重组微生物、或含有B2所述表达盒的重组微生物、或含有B3所述重组载体的重组微生物；

B5、含有B1所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3所述重组载体的转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1所述核酸分子为所述PtrWOX5.2基因，具体可为编码链的编码序列是序列表中SEQ ID No.1的核酸分子。

上述生物材料中，B2所述的表达盒（PtrWOX5.2基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达所述PtrWOX5.2基因的DNA，该DNA不但可包括启动所述PtrWOX5.2基因转录的启动子，还可包括终止所述PtrWOX5.2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子 35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶 ("LAP", Chao 等人（1999) PlantPhysiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关 1 (PR1) (由水杨酸和 BTH (苯并噻二唑 -7-硫代羟酸 S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂 II启动子(PIN2)或 LAP启动子 (均可用茉莉酮酸曱酯诱导)； 热休克启动子 (美国专利 5，187，267)；四环素诱导型启动子 (美国专利 5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子 (例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和 大豆 beta conglycin 的启动子（Beachy 等人 (1985) EMBO J. 4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、 豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见， 例如： Odell 等人 （I⁹⁸⁵) Nature 313:810；Rosenberg等人（1987) Gene, 56:125； Guerineau等人 (1991) Mol. Gen. Genet , 262:141 ; Proudfoot (1991) Cell, 64:671; Sanfacon等人 Genes Dev. , 5:141; Mogen等人 (1990) Plant Cell, 2:1261； Munroe等人 （1990) Gene, 91:151； Ballad等人(1989) Nucleic Acids Res. 17:7891； Joshi等人 (1987) Nucleic Acid Res., 15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述PtrWOX5.2基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pCAMBIA2301、pCAMBIA4301、pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的HPT基因、hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了提高杨树单倍体再生效率的植物试剂，所述植物试剂的活性成分为促进或提高所述PtrWOX5.2基因、提高所述PtrWOX5.2蛋白的丰度的物质。所述物质可包含所述PtrWOX5.2蛋白和/或所述生物材料。

上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据提高杨树单倍体再生效率的效果确定。

本发明还保护所述方法，或所述PtrWOX5.2蛋白，或所述生物材料在杨树育种中的应用。

本发明主要针对杨树单倍体细胞难以再生芽的问题，以鲁毛50 (LM50)花药培养诱导出的愈伤组织为受体材料，通过 PtrWOX5.2 基因的过量表达能够促进愈伤组织的生长速率，提高其芽再生效率。为进一步验证效果，以已经鉴定为花药培养来源的小黑杨单倍体细胞系 1588为受体材料，通过过量表达PtrWOX5.2基因，不仅能加速单倍体细胞系诱导形成的愈伤组织的生长，还能有效促进芽的再生。这些结果表明PtrWOX5.2基因的过量表达能够提高杨树单倍体再生效率。

附图说明

图1为本发明实施例1中PtrWOX5.2基因转化LM50花药培养诱导出的愈伤组织照片。具体为对照EHA105/pCAMBIA2301侵染愈伤组织后分化培养30 d (图1的a)，45 d (图1的c)和生根培养15 d (图1的e)的照片；EHA105/pCAMBIA4301-PtrWOX5.2侵染愈伤组织后分化培养15 d (图1的b)，30 d (图1的b)和生根培养15 d (图1的f)的照片。

图2为本发明实施例1中的GUS表达结果。图2的a, 3d，图2的b, 7d，图2的c, 14d，图2的d, 30d。

图3为本发明实施例1中愈伤组织的形成和芽再生情况。图3的a为转化含PtrWOX5.2基因的载体的小黑杨1588细胞系形成愈伤组织块,图3的b为转化对照载体pCAMBIA2301的小黑杨1588细胞系出现褐化现象，图3的c为转化含PtrWOX5.2基因的载体的愈伤组织块出现芽再生；图3的d为转化对照载体pCAMBIA2301的愈伤组织未能诱导出芽再生。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中毛白杨鲁毛50 (LM50)记载于非专利文献“苗得雨, 高凯, 黄赛,安新民. 毛白杨优良无性系‘LM50’花药培养植株再生体系建立. 中国生物工程杂志,2022, 42(5): 46-57.”，公众可从申请人处获得以重复本发明的试验。

下述实施例中毛果杨（PopulustrichocarpaNisqually-1）记载于非专利文献“Song J, Lu S, Chen Z, Lourenco R, Chiang V.Genetic Transformation ofPopulustrichocarpa Genotype Nisqually-1:A Functional Genomic Tool for WoodyPlants. Plant Cell Physiol, 2006, 47 (11): 1582-1589.”，公众可从申请人处获得以重复本发明的试验。

下述实施例中小黑杨1588单倍体细胞系由东北林业大学曲冠证教授提供，为以申请号为“CN202210847072.4”、名称为“一种小黑杨单倍体细胞系的获得方法”的中国专利申请中一种小黑杨单倍体细胞系的获得方法获取的小黑杨单倍体细胞系，以该方法获取的其它小黑杨单倍体细胞系也可用于进行本发明实施例2的试验。

下述实施例中pCAMBIA2301记载于非专利文献“李菲, 曹永琼, 王纲, 郭彦兵,李紫薇, 吴红芝. 根癌农杆菌介导彩色马蹄莲遗传转化体系的建立及优化. 南方农业学报, 2024, 55(6): 1692-1699.”，公众可从申请人处获得以重复本发明的试验。

下述实施例中pCAMBIA4301记载于非专利文献“王冰峰, 王宏芝, 魏建华. 杨树转录因子PtoMYB057的功能分析. 广东农业科学, 2015, 15: 105-109.”，公众可从申请人处获得以重复本发明的试验。

实施例1

1.PtrWOX5.2基因克隆

根据Phytozome数据库毛果杨WOX5.2基因CDS序列信息，用软件Primer5.0针对基因序列设计PCR特异引物，并导入EcoRⅠ酶切位点，具体所用引物序列如下：

WOX5-2-EcoRI-CDS-F:GAATTCATGGAAGAGAGAATGTCAGG（其中斜体指示的为EcoRⅠ酶识别序列）；

WOX5-2-EcoRI-CDS-R:GAATTCCTACACAAAGCTTAATCGCAG（其中斜体指示的为EcoRⅠ酶识别序列）。

以提取的毛果杨cDNA为模板，进行PCR扩增并回收扩增产物得到基因PtrWOX5.2基因片段，进行T载体连接和大肠杆菌感受态转化，送至擎科生物公司进行DNA测序。PtrWOX5.2基因的编码序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白PtrWOX5.2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.1

ATGGAAGAGAGAATGTCAGGCTTTTGTATCACAAAAGCTGGACGTGGTGGTGGCAGTGGCAATAACTGTGGCACAGGAACTAAATGTGGGCGTTGGAATCCTACTACCGAACAAGTTAAACTTCTAACTGACTTGTTCAGGTCTGGGCTTCGAACCCCAAGTACTGATGAGATCCAGAACATCTCCACCCAGCTTAGTTTTTATGGCAAGATCGAGAGCAAGAACGTTTTTTACTGGTTTCAAAATCATAAAGCTAGAGAAAGACAGAAGCGGCGCAGGGTTTCTGTTGATGAGAAGGATGCCATGATTCGTAGAGATGACAGATTTTCTTCTGCGCGATATTTTACTGAGATCAATCATGTGAACGAACCAGAAAGAGTGATTGAGACTCTTCAACTTTTCCCTTTAAACTCCTTTGATGAAGCGGGACCAGAGAAATTCAGGTTCCAAGCAAATGAATGCAATGAAGCTGCAGCTGCATTTTCTTATAAATTTGGTACAGAAATGGATCATCCACATTTAGATCTGCGATTAAGCTTTGTGTAG

SEQ ID No.2

MEERMSGFCITKAGRGGGSGNNCGTGTKCGRWNPTTEQVKLLTDLFRSGLRTPSTDEIQNISTQLSFYGKIESKNVFYWFQNHKARERQKRRRVSVDEKDAMIRRDDRFSSARYFTEINHVNEPERVIETLQLFPLNSFDEAGPEKFRFQANECNEAAAAFSYKFGTEMDHPHLDLRLSFV

2.花药培养诱导培养基和分化培养基

诱导培养基：MS+ 2mg/L 2,4-D +1mg/L KT +30g/L蔗糖+3g/L Gelrite

分化培养基：MS+6-BA0.5 mg/L +ZT1.0mg/L+IBA0.25 mg/L +30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉

3.PtrWOX5.2基因过量表达载体构建

利用GATEWAY的方法构建过量表达载体：用T₄DNA连接酶将EcoRⅠ酶酶切过的TOPO载体与上文获得的基因PtrWOX5.2基因片段（含有SEQ ID No.1所示序列）进行连接，16℃过夜，构建入门载体。利用LR反应将测序正确的入门载体上的目的基因PtrWOX5.2基因片段置换到植物目的表达载体pCAMBIA4301上，得到表达PtrWOX5.2蛋白的重组表达载体pCAMBIA4301-PtrWOX5.2。重组表达载体pCAMBIA4301-PtrWOX5.2中含有GUS基因，且GUS基因含有内含子，使得其不能再细菌中表达，只能在植物中表达，可利用GUS染色检测PtrWOX5.2表达载体是否整合进入植物基因组中。

将重组载体pCAMBIA4301-PtrWOX5.2转化大肠杆菌感受态细胞，利用attB1-F和attB1-R引物进行菌落PCR鉴定。提取质粒，送至擎科生物公司进行DNA测序。将测序正确的载体pCAMBIA4301-PtrWOX5.2保存于-20℃。

利用电击转化法将载体pCAMBIA4301-PtrWOX5.2和对照载体pCAMBIA4301分别导入农杆菌株EHA105中，得到农杆菌株EHA105/pCAMBIA4301-PtrWOX5.2和对照农杆菌株EHA105/pCAMBIA2301，-80℃保存。

4根癌农杆菌介导的转化

4.1 浸染液和培养基的配制

蘸取-80℃冻存的农杆菌株EHA105/pCAMBIA4301-PtrWOX5.2的菌液于含有卡那霉素（Kan）50 mg/μL、四环素（Tet）5 mg/L、利福平（Rif）50mg/L 的YEP固体培养基上，28℃，250 rpm培养2 d。挑取阳性单克隆菌落接种于10 mL 含有卡那霉素（Kan）50 mg/μL、四环素（Tet）5 mg/L、利福平（Rif）50mg/L 的YEP液体培养基中，28℃，250 rpm培养过夜，吸取2 mL菌液于80 mL YEP液体培养基28℃，250 rpm振荡培养5-6 h，检测OD值达到0.3-0.6左右，转移至50 mL离心管，6300 rpm离心10 min进行集菌，将YEP倒净，利用50 mL 含有100 μM乙酰丁香酮（AS）的1/2 MS液体培养基重悬菌体，获得农杆菌株EHA105/pCAMBIA4301-PtrWOX5.2侵染液，备用。

以农杆菌株EHA105/pCAMBIA2301的菌液替换农杆菌株EHA105/pCAMBIA4301-PtrWOX5.2的菌液，保持其他步骤不变获得农杆菌株EHA105/pCAMBIA2301侵染液，备用。

共培养培养基配方为：MS+ 2 mg/L 2,4-D +1mg/L KT + 100μM AS + 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂粉。

恢复培养基配方：MS+ 2mg/L 2,4-D +1mg/L KT +300mg/LTimentin+200mg/L头孢+30g/L蔗糖+3g/L Gelrite

筛选诱导培养基配方为：MS+ 2mg/L 2,4-D +1mg/L KT + 30mg/L kan +300mg/LTimentin+200mg/L头孢+30g/L蔗糖+3g/L Gelrite，pH值为5.8。

筛选分化培养基配方为：MS + 0.5 mg/L 6-BA + 1.0mg/L ZT + 0.25 mg/L IBA+ 30mg/L kan + 300mg/LTimentin+100mg/L头孢+30g/L蔗糖 + 7g/L琼脂粉，pH值为5.8。

筛选生根培养基配方为：MS+10mg/L VB1+0.25 mg/L IBA +30mg/L kan + 300mg/L Timentin+ 30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉。

其中，2,4-D为 2,4-二氯苯氧乙酸，KT为激动素，Gelrite为植物凝胶，kan为卡那霉素，Timentin为特美汀，6-BA为6-苄氨基嘌呤、ZT为玉米素（Zeatin）、IBA为3-吲哚丁酸。

4.2PtrWOX5.2提高毛白杨LM50花药培养诱导愈伤组织分化能力

以毛白杨基因型鲁毛50 (LM50)作为试验材料，花枝取自树龄15-20年，生长于山东冠县毛白杨基因库的健康毛白杨LM50雄株。取小孢子处于单核靠边期的花药进行接种培养，诱导愈伤组织，具体如下：

花芽经灭菌后剥去鳞片，将花药接种到诱导培养基上，每个培养皿接种30枚花药，每处理重复3次，在无菌环境中完成。接种后的培养皿密封好，放置于组培室进行暗培养，期间每周将花药诱导出的愈伤组织转移到新的诱导培养基上，培养时间为1个月左右，培养条件不变。

将愈伤组织转移至筛选分化培养基上光照培养，组培室温度为23± 2℃，相对湿度为60%–70%，16 h光照/8 h黑暗，光照强度约为200μmol/m²/s²。

结果，以LM50花药培养获得的愈伤组织经过分化培养后，未能获得再生芽苗，得到的是绿色愈伤块。以这些未能获得再生芽苗的绿色愈伤块为外植体，研究PtrWOX5.2基因的过量表达对杨树愈伤组织植株再生的影响，具体如下：

将外植体绿色愈伤块分切至长度约0.8-1cm的小愈伤块，放入农杆菌株EHA105/pCAMBIA4301-PtrWOX5.2侵染液侵染，以放入农杆菌株EHA105/pCAMBIA2301侵染液侵染作为空载体对照。

黑暗条件下25℃，120 rpm培养15 min。用灭菌过的吸水纸吸净外植体表面侵染液并将外植体放入共培养培养基中，23±2℃黑暗培养2-3 d。将共培养后的外植体转入恢复培养基于23±2℃黑暗条件下恢复培养7 d，继续转入筛选诱导培养基中黑暗条件下培养4-5周，随后将存活下来的愈伤组织转移至筛选分化培养基中，23±2℃光照下培养8周左右。

PtrWOX5.2基因转化后的愈伤组织生长速度较快，侵染后15 d左右出现丛生苗(图1的b)，继续培养15 d出现独立苗(图1的d)，将独立苗转移至筛选生根培养基后，培养15-20d能够生根，再生成完整植株(图1的f)。对照载体pCAMBIA2301侵染愈伤组织后能够形成丛生苗(图1的a)，但是丛生苗黄化弱小(图1的c)，最终不能继续生长而死亡(图1的e)。结果表明，PtrWOX5.2基因能够促进杨树花药培养愈伤组织的生长速率，提高其芽再生效率(见表1)。

表1PtrWOX5.2基因转化愈伤组织后的再生效率统计

4.3PtrWOX5.2促进小黑杨1588单倍体细胞系愈伤组织的形成与芽再生

将继代培养15-21天的小黑杨1588单倍体细胞系放入农杆菌株EHA105/pCAMBIA4301-PtrWOX5.2侵染液侵染，以放入农杆菌株EHA105/pCAMBIA2301侵染液侵染作为空载体对照。

黑暗条件下25℃，120 rpm培养15 min。用灭菌过的吸水纸吸净小黑杨1588单倍体细胞系表面侵染液并将外植体共培养培养基中，23±2℃黑暗培养2-3 d。将共培养后的小黑杨1588单倍体细胞系转入恢复培养基于23±2℃黑暗条件下恢复培养7 d，继续转入筛选诱导培养基中黑暗条件下培养4-5周。

在此过程中，在小黑杨愈伤组织经过农杆菌侵染和共培养后，选取培养3天，7天，14天，30天的愈伤组织样本，并对其进行GUS染色，以检测PtrWOX5.2表达载体是否整合进入植物基因组中。

结果显示(表2)，在所有时间点上，GUS基因均有所表达(图2的a, 图2的b,图2的c和图2的d)。随着培养时间的延长，GUS的表达水平呈现下降趋势，其中3天时表达水平最强(图2a)。即便在30天时，GUS基因依然能够被检测到(图2d)，这表明载体已经稳定地转化至愈伤组织中。

表2 GUS表达情况检测

农杆菌株EHA105介导的pCAMBIA4301-PtrWOX5.2侵染后，携带PtrWOX5.2基因的小黑杨1588单倍体细胞系表现出较快的生长速度，在筛选诱导培养基中黑暗培养7-15天出现愈伤组织，继续培养至40天后部分形成了大的黄绿色的愈伤组织块(图3的a)，而对照载体转化的细胞系生长缓慢，多数出现褐化现象 (图3的b)。这一结果说明PtrWOX5.2基因的过量表达能够促进细胞的增殖。进一步将黑暗培养40天的愈伤组织块转移到筛选分化培养基上继续培养约2个月，发现转化PtrWOX5.2基因的愈伤组织块中多处出现绿色叶状的从生芽(图3的c)，而对照载体转化的愈伤组织中未观察到绿色丛生芽的形成(图3的d)，此结果表明PtrWOX5.2基因的过量表达不仅促进了细胞增值，还能够促进芽的再生能力。

本发明主要针对杨树单倍体细胞难以再生芽的问题，以LM50 花药培养诱导出的愈伤组织为受体材料，通过 PtrWOX5.2 基因的过量表达能够促进愈伤组织的生长速率，提高其芽再生效率。为进一步验证效果，以已经鉴定为花药培养来源的小黑杨单倍体细胞系1588为受体材料，通过过量表达PtrWOX5.2基因，不仅能加速单倍体细胞系诱导形成的愈伤组织的生长，还能有效促进芽的再生。这些结果表明PtrWOX5.2基因的过量表达能够提高杨树单倍体植株再生效率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.通过提高杨树中PtrWOX5.2基因的表达促进杨树单倍体的植株再生效率的方法，其特征在于：所述PtrWOX5.2基因为编码PtrWOX5.2蛋白的基因，所述PtrWOX5.2蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质；

A2、将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且功能类似的蛋白质；

A3、在A1或A2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PtrWOX5.2基因为编码链的编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述促进杨树单倍体的植株再生效率表现为Y1-Y3中的任一种或多种的组合：

Y1促进细胞的增殖；

Y2加速愈伤组织的生长；

Y3促进分化出丛生芽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括将所述的PtrWOX5.2基因导入受体杨树单倍体细胞中，得到单倍体植株再生效率高的杨树；所述单倍体植株再生效率高的杨树的单倍体植株再生效率高于所述受体杨树单倍体的单倍体植株再生效率。

5.权利要求1中所述的PtrWOX5.2蛋白。

6.权利要求5所述PtrWOX5.2蛋白相关的生物材料，其特征在于：为下述B1至B5中的任一种：

B1、编码PtrWOX5.2蛋白的核酸分子；

B2、含有B1所述核酸分子的表达盒；

B3、含有B1所述核酸分子的重组载体、或含有B2所述表达盒的重组载体；

B4、含有B1所述核酸分子的重组微生物、或含有B2所述表达盒的重组微生物、或含有B3所述重组载体的重组微生物；

B5、含有B1所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3所述重组载体的转基因植物细胞系。

7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：B1所述核酸分子为编码链的编码序列是序列表中SEQ ID No.1的核酸分子。

8.植物试剂，其特征在于：所述试剂的活性成分为促进或提高权利要求1或2中所述的PtrWOX5.2基因、提高权利要求1或2中所述的PtrWOX5.2蛋白的丰度的物质。

9.权利要求1-4任一所述方法，或权利要求5所述PtrWOX5.2蛋白，或权利要求6或7所述生物材料，或权利要求8所述植物试剂在杨树育种中的应用。