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CN120303295A - 使用vista抗原结合分子治疗和预防癌症 - Google Patents

使用vista抗原结合分子治疗和预防癌症 Download PDF

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CN120303295A
CN120303295A CN202380080145.4A CN202380080145A CN120303295A CN 120303295 A CN120303295 A CN 120303295A CN 202380080145 A CN202380080145 A CN 202380080145A CN 120303295 A CN120303295 A CN 120303295A
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amino acid
acid sequence
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antigen binding
region
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O·扎尔科娃
D·雷
R·提拉多-马加拉内斯
D·塔卡尔
K·帕斯基维茨
J·博伊德-基尔库普
P·英格拉姆
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Hummingbird Biotechnology Pte Ltd
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Abstract

公开了VISTA抗原结合分子。还公开了编码VISTA抗原结合分子的核酸和表达载体，包括VISTA抗原结合分子的组合物以及使用VISTA抗原结合分子的方法。

Description

使用VISTA抗原结合分子治疗和预防癌症
本申请要求获得2022年9月22日提交的US63/409003号文件的优先权，其内容和要素通过引用并入本申请中。
技术领域
本公开涉及分子生物学领域，更具体地是抗体技术和医疗和预防方法。
背景
在多种实体瘤和淋巴瘤中发现了髓系衍生抑制性细胞(MDSC)介导的免疫反应抑制。MDSC在晚期结直肠癌中升高(Toor等人，《Front Immunol.》2016年；7:560)。在乳腺癌中也能观察到MDSC，晚期乳腺癌患者外周血中MDSC的比例会增加(Markowitz等人，《BreastCancer Res Treat.》2013年7月；140(1):13-21)。MDSC的丰度也与实体瘤的预后差有关(Charoentong等人，《Cell Rep.》2017年1月3日；18(1):248-262)。
MDSC通过多种机制抑制T细胞，包括产生活性氧、一氧化氮和精氨酸酶。这些机制最终会抑制DC、NK和T细胞的活性，增加肿瘤负荷(Umansky等人，《疫苗(巴塞尔)》(2016)4(4):36)。MDSC还通过产生可溶性因子，如基质金属蛋白酶、VEGF、bFGF、TGF-β和S100A8/A9，促进血管新生、侵袭、增殖和转移，从而导致肿瘤发展和转移。
含V型免疫球蛋白结构域的T细胞活化抑制因子(V-type immunoglobulindomain-containing suppressor of T-cell activation，VISTA)是一种主要在MDSC上表达的免疫检查点分子，以VISTA为靶点是消除MDSC介导的效应免疫细胞功能抑制的一种有吸引力的治疗策略。
WO 2017/137830 A1公开了抗VISTA抗体VSTB174，例如在第[00221]段落中公开了该抗体包括抗VISTA抗体VSTB112的可变区。第[00362]段落公开了VSTB123包括VSTB174的可变区。WO 2017/137830 A1实施例25的第[0417]段落和图42A公开了在MB49肿瘤模型中，mIgG2a抗体VSTB123能够抑制肿瘤生长。第[0418]段落和图42A指出，相比之下，VSTB124(以IgG2a LALA形式提供的相同抗体)不能抑制肿瘤生长(见第[0408]段落)。基于这些结果，实施例25在第[0419]段得出的结论，抗VISTA抗体治疗的疗效可能需要活性Fc。因此，图47(见第[0053]段落图47的图例)中示意性表示了抗VISTA抗体的提出作用机制，其涉及Fc介导的NK细胞表达的FcγRIII的接合。
Le Mercier等人《Cancer Res.》(2014)74(7):1933-44公开了仓鼠单克隆抗VISTA抗体mAb13F3，在B16OVA和B16-BL6黑色素瘤模型中抑制肿瘤生长。第1942页，横跨左右两栏的段落指出，VISTAmAb的免疫原性和FcR结合活性可能是实现最佳目标中和与疗效的关键限制因素。在如WO 2019/185879 A1中也公开了VISTA结合抗体。
概述
在第一方面，本公开提供了一种用于在治疗或预防受试者癌症方法中的与VISTA结合的抗原结合分子，其中所述治疗或预防包括：
(i)增加抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)增加CD8+T细胞活性；
(iii)减少T细胞耗竭水平；
(iv)减少肿瘤相关巨噬细胞(Tumour-associated macrophage，TAM)的数量和/或比例；
(v)增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)增加M1型巨噬细胞的活性。
本公开还提供了一种与VISTA结合的抗原结合分子在制备用于治疗或预防受试者癌症的药物中的用途，其中，所述治疗或预防包括：
(i)提高抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)提高CD8+T细胞活性；
(iii)减少T细胞耗竭水平；
(iv)减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)增加M1型巨噬细胞的活性。
本公开还提供了一种治疗或预防受试者癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的与VISTA结合的抗原结合分子，其中，所述治疗或预防包括：
(i)提高抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)提高CD8+T细胞活性；
(iii)减少T细胞耗竭水平；
(iv)减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)增加M1型巨噬细胞的活性。
在一些实施方案中，所述癌症包括含有表达VISTA的细胞的肿瘤。
本公开还提供了一种选择用与VISTA结合的抗原结合分子治疗的受试者的方法，包括：
(a)分析受试者的癌症，从而确定所述癌症是否具有以下特征：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例低；
(ii)CD8+T细胞活性低；
(iii)耗竭T细胞的存在和/或水平高；
(iv)TAM的存在和/或数量和/或比例高；
(v)M1型巨噬细胞的数量和/或比例低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性低；和
(b)在步骤(a)中确定受试者的癌症具有(i)至(vi)中一项或多项时，选择所述受试者用与VISTA结合的抗原结合分子进行治疗。
本公开还提供了一种确定患者对用与VISTA结合的抗原结合分子治疗的反应的方法，包括：
(a)在第一个时间点分析受试者的癌症，从而确定：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)CD8+T细胞的活性；
(iii)耗竭T细胞的水平；
(iv)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)M1型巨噬细胞的活性；
(b)在后续时间点分析受试者的癌症，从而确定(i)至(vi)中一项或多项；和
(c)确定(a)和(b)之间的差异，其中：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例提高；
(ii)CD8+T细胞的活性提高；
(iii)耗竭T细胞的水平降低；
(iv)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例降低；
(v)M1型巨噬细胞的数量和/或比例提高；和/或
(vi)M1型巨噬细胞的活性提高，
与(a)相比，(b)中的数值表示对与VISTA结合的抗原结合分子治疗的阳性反应。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变(VH)区：
具有如SEQ ID NO:305所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:306所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:307所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变(VL)区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:308所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变(VH)区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变(VL)区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:295所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括：
VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和
VL区，其包括与SEQ ID NO:297所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括：
包括以下框架区(FR)的VH区：
具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:292所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:293所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:281所示氨基酸序列的HC-FR4。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括：
包括以下框架区(FR)的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:284所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括含有如SEQ ID NO:331所示氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括含有如SEQ ID NO:317所示氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述癌症选自：血液肿瘤、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、上皮样间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃恶性肿瘤、结直肠癌、结直肠肿瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、三阴性浸润性乳腺癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
在一些实施方案中，所述癌症选自：结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和实体瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为上皮样间皮瘤。
说明
本公开涉及可改变肿瘤微环境的VISTA结合分子。
本公开的各方面和实施方案特别涉及与VISTA结合并影响肿瘤微环境重塑的抗原结合分子。这类抗原结合分子可用于治疗/预防癌症
VISTA、相互作用伴侣和VISTA介导的信号
含V型免疫球蛋白结构域的T细胞活化抑制因子(VISTA；也被称为如B7-H5、SISP1、PD-1H)是由UniProt Q9H7M9鉴定的蛋白，具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列(Q9H7M9-1，v3)。VISTA的结构和功能如Lines等人在《Cancer Res.》(2014)74(7):1924-1932中的描述，其全部内容并入本文作为参考。VISTA是一种约50kDa的单通道I型跨膜，具有免疫检查点的功能，由C10orf54基因编码。VISTA的细胞外结构域与PD-L1同源。
SEQ ID NO:1的N末端32个氨基酸构成信号肽，因此，成熟形式的VISTA(即加工后移除信号肽)具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。SEQ ID NO:1的第33至194位形成细胞外结构域(SEQ ID NO:3)，第195至215位形成跨膜结构域(SEQ ID NO:4)，第216至311位形成胞质结构域(SEQ ID NO:5)。细胞外结构域包括一个Ig样V型结构域(SEQ ID NO:1的第33至168位，如SEQ ID NO:6所示)。
在本说明书中，“VISTA”指来自任何物种的VISTA，包括来自任何物种的VISTA同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
如本文所用，蛋白的“片段”、“变体”、“同源物”可任选地被表征为与参考蛋白(如参考同种型)的氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，参考蛋白的片段、变体、同种型和同源物可以通过行使参考蛋白所行使功能的能力来表征。
“片段”通常是指参考蛋白的一部分。“变体”通常是指一种蛋白，其氨基酸序列相对于参考蛋白氨基酸序列具有包含一个或多个氨基酸替代、插入、缺失或其他修饰，但与参考蛋白的氨基酸序列保持相当程度的序列同一性(如至少60％)。“同种型”通常是指与参考蛋白的物种相同的物种表达的参考蛋白变体。“同源物”通常是指与参考蛋白物种相比，由不同物种产生的参考蛋白变体。同源物包括直系同源物。
“片段”可以是任何长度(按氨基酸数量计算)，但可以任选地至少为参考蛋白(即，片段来源的蛋白)长度的20％，并且可以具有参考蛋白长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％任一的最大长度。VISTA片段可以具有10、20、30、40、50、100、150、200、250或300个氨基酸中任一的最小长度，并且可以具有20、30、40、50、100、150、200、250或300个氨基酸中任一的最大长度。
在一些实施方案中，所述VISTA为来自哺乳动物(如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人类)和/或啮齿动物(如大鼠或鼠)的VISTA)的VISTA。VISTA的同种型、片段、变体或同源物可以任选地被表征为与特定物种(如人类)未成熟或成熟VISTA同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地为功能性同种型、片段、变体或同源物，如，通过对功能特性/活性的适当检测分析确定，具有参考VISTA的功能特性/活性。例如，VISTA的同种型、片段、变体或同源物可显示与LRIG1、VSIG3、PSGL-1和/或VSIG8的关联。
在一些实施方案中，所述VISTA包括或由与SEQ ID NO:1或2具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，VISTA片段包括或由与SEQ ID NO:2、3或6中任一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
VISTA为B7蛋白家族的成员，主要由白细胞表达，特别是CD14+单核细胞(包括单核细胞衍生抑制细胞(MDSC))和CD33+髓系细胞。CD56+NK细胞、树突状细胞以及少量CD4+和CD8+T细胞也表达VISTA。VISTA在MDSC(特别是肿瘤浸润MDSC)、肿瘤浸润髓系DC(LeMercier等人，《Cancer Res.》(2014)74(7):1933-44)以及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和中性粒细胞上高度表达。
已有证据证明T细胞上的VISTA既可以作为配体也可以作为受体，从而抑制T细胞效应功能并维持外周耐受；过表达VISTA的编辑肿瘤可以逃避免疫控制，其生长速度快于未过表达VISTA的肿瘤(Wang等人，《实验医学杂志》(2011)208(3):577–92；Lines等人，《Cancer Res.》(2014)74(7):1924-1932)。研究表明，VISTA是CD4+T细胞的共抑制受体或T细胞的共抑制配体。据报道，与野生型CD4+T细胞相比，VISTA-/-CD4+T细胞显示出更强的抗原特异性增殖和细胞因子产生能力，这表明VISTA在CD4+T细胞上发挥着抑制受体的功能。使用单克隆抗VISTA抗体阻断VISTA功能已被证明能增强肿瘤微环境中肿瘤反应T细胞的浸润、增殖和效应功能(Le Mercier等人，《Cancer Res.》(2014)74(7):1933-4)。
VISTA已被提出与VSIG3(IGSF11)相互作用，见如Wang等人，《JImmunol》(2017),198(补充1)154.1中所述，将其全部内容并入本文作为参考。VSIG3通过VISTA与活化的T细胞结合，可抑制T细胞增殖，并减少细胞因子和趋化因子的产生，如IFN-γ、IL-2、IL-17、CCL5/RANTES、CCL3/MIP-1a和CXCL11/I-TAC。
VSIG3是由UniProt Q5DX21鉴定的蛋白。由人类IGSF11基因编码的mRNA的可变剪接产生了三种不同的同种型：同种型1(UniProt：Q5DX21-1，v3；SEQ ID NO:7)；同种型2(UniProt：Q5DX21-2；SEQ ID NO:8)，其在第1至17位包含与SEQ ID NO:7不同的序列；以及同种型3(UniProt：Q5DX21-3；SEQ ID NO:9)，其在第1至17位包含与SEQ ID NO:7不同的序列，其在第211至235位也包含与SEQ ID NO:7不同的序列。
SEQ ID NO:7、8和9的N末端22个氨基酸构成信号肽，因此，成熟形式的VSIG3同种型1、2和3(即加工后移除信号肽)分别具有如SEQ ID NO:10、11和12所示氨基酸序列。SEQID NO:7和8的第23至241位构成VSIG3同种型1和2的细胞外结构域(SEQ ID NO:13)，SEQ IDNO:9的第23至216位构成VSIG3同种型3的细胞外结构域(SEQ ID NO:14)。VSIG3的跨膜结构域如SEQ ID NO:15所示，并且胞质结构域如SEQ ID NO:16所示。细胞外结构域包括一个Ig样V型结构域(如SEQ ID NO:17所示)，并且VSIG3同种型1和2的细胞外结构域还包括一个Ig样C2型结构域(如SEQ ID NO:18所示)。
在本说明书中，“VSIG3”指来自任何物种的VSIG3，包括来自任何物种的VSIG3同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
VSIG3片段可以具有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸中任一的最小长度，并且可以具有20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸中任一的最大长度。
在一些实施方案中，所述VSIG3为来自哺乳动物(如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人类)和/或啮齿动物(如大鼠或鼠)的VSIG3)的VSIG3。VSIG3的同种型、片段、变体或同源物可以任选地被表征为与特定物种(如人类)未成熟或成熟VSIG3同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地为功能性同种型、片段、变体或同源物，如，通过对功能特性/活性的适当检测分析确定，具有参考VSIG3的功能特性/活性。例如，VSIG3的同种型、片段、变体或同源物可显示与VISTA的关联。
在一些实施方案中，所述VSIG3包括或由与SEQ ID NO:7至12中任一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，VSIG3片段包括或由与SEQ ID NO:10至14、17或18中任一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
VISTA已被提出与VSIG8相互作用，见如WO/2016/090347A1。VSIG8蛋白是由UniProt P0DPA2鉴定的蛋白(SEQ ID NO:19)。SEQ ID NO:19的N末端21个氨基酸构成信号肽，因此，成熟形式的VSIG8(即加工后移除信号肽)具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:19的第22至263位构成VSIG8的细胞外结构域(SEQ ID NO:21)。VSIG8的跨膜结构域如SEQ ID NO:22所示，胞质结构域如SEQ ID NO:23所示。细胞外结构域包括Ig样V型结构域1(如SEQ ID NO:24所示)和Ig样V型结构域2(如SEQ ID NO:25所示)。
在本说明书中，“VSIG8”指来自任何物种的VSIG8，包括来自任何物种的VSIG8同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
VSIG8片段可以具有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸中任一的最小长度，并且可以具有20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸中任一的最大长度。
在一些实施方案中，所述VSIG8为来自哺乳动物(如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人类)和/或啮齿动物(如大鼠或鼠)的VSIG8)的VSIG8。VSIG8的同种型、片段、变体或同源物可以任选地被表征为与特定物种(如人类)未成熟或成熟VSIG8同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地为功能性同种型、片段、变体或同源物，如，通过对功能特性/活性的适当检测分析确定，具有参考VSIG8的功能特性/活性。例如，VSIG8的同种型、片段、变体或同源物可显示与VISTA的关联。
在一些实施方案中，所述VSIG8包括或由与SEQ ID NO:19或20具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，VSIG8片段包括或由与SEQ IDNO:20、21、24或25中任一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
VISTA已被提出与PSGL-1相互作用，见如WO 2018/132476 A1。Johnston等人在《自然》(2019)574:565-570公开PSGL-1通过涉及PSGL-1的Y46、Y48、Y51、E56和T57位置与VISTA的H98、H100、H153、H154和H155位置的相互作用与VISTA结合在一起。
PSGL-1同种型1是由UniProt Q14242-1鉴定的蛋白(SEQ ID NO:323)。PSGL-1同种型2是由UniProt Q14242-2鉴定的蛋白(SEQ ID NO:324)，与PSGL-1同种型1的不同之处在于，其在SEQ ID NO:323的第1位之后包含额外的16个氨基酸。
SEQ ID NO:323的N端17个氨基酸构成信号肽，因此，成熟形式的PSGL-1(即加工后移除信号肽)具有如SEQ ID NO:325所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:323的第18至320位构成PSGL-1的细胞外结构域(SEQ ID NO:326)。PSGL-1的跨膜结构域如SEQ ID NO:327所示，胞质结构域如SEQ ID NO:328所示。细胞外结构域包括12个、10个氨基酸的串联重复序列；重复序列区域如SEQ ID NO:329所示。
在本说明书中，“PSGL-1”指来自任何物种的PSGL-1，包括来自任何物种的PSGL-1同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
PSGL-1片段可以具有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸中任一的最小长度，并且可以具有20、30、40、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸中任一的最大长度。
在一些实施方案中，所述PSGL-1为来自哺乳动物(如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人类)和/或啮齿动物(如大鼠或鼠)的PSGL-1)的PSGL-1。PSGL-1的同种型、片段、变体或同源物可以任选地被表征为与特定物种(如人类)未成熟或成熟PSGL-1同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地为功能性同种型、片段、变体或同源物，如，通过对功能特性/活性的适当检测分析确定，具有参考PSGL-1的功能特性/活性。例如，PSGL-1的同种型、片段、变体或同源物可显示与VISTA的关联。
在一些实施方案中，所述PSGL-1包括或由与SEQ ID NO:323或324具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PSGL-1片段包括或由与SEQID NO:325、326或329中任一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
VISTA已被提出与LRIG1相互作用，见如WO/2019/165233A1。WO/2019/165233A1公开了LRIG1通过涉及LRIG1的第245至260位与VISTA的第68至92位的相互作用与VISTA结合在一起。
LRIG1同种型1是由UniProt Q96JA1-1鉴定的蛋白(SEQ ID NO:332)。LRIG1同种型2是由UniProt Q96JA1-2鉴定的蛋白(SEQ ID NO:334)，与LRIG1同种型1的不同之处在于，其在SEQ ID NO:332的第387位之后包含额外的14个氨基酸，且在SEQ ID NO:332的第644至691位取代为Q。
SEQ ID NO:332的N端34个氨基酸构成信号肽，因此，成熟形式的LRIG1同种型1和2(即加工后移除信号肽)分别具有如SEQ ID NO:333和335所示的氨基酸序列。LRIG1同种型1的胞外结构域如SEQ ID NO:336所示，并且LRIG1同种型2的胞外结构域如SEQ ID NO:337所示,。LRIG1的跨膜结构域如SEQ ID NO:338所示，以及胞质结构域如SEQ ID NO:339所示。细胞外结构域包括15个，富含亮氨酸重复序列；之后在跨膜结构域的近端有三个Ig样结构域(见如Xu等人，《J Mol Biol.》(2015)427(10):1934-1948)。
在本说明书中，“LRIG1”指来自任何物种的LRIG1，包括来自任何物种的LRIG1同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
LRIG1片段可以具有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、500、600或700个氨基酸中任一的最小长度，并且可以具有20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、500、600或700个氨基酸中任一的最大长度。
在一些实施方案中，所述LRIG1为来自哺乳动物(如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人类)和/或啮齿动物(如大鼠或鼠)的LRIG1)的LRIG1。LRIG1的同种型、片段、变体或同源物可以任选地被表征为与特定物种(如人类)未成熟或成熟LRIG1同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可以任选地为功能性同种型、片段、变体或同源物，如，通过对功能特性/活性的适当检测分析确定，具有参考LRIG1的功能特性/活性。例如，LRIG1的同种型、片段、变体或同源物可显示与VISTA的关联。
在一些实施方案中，所述LRIG1包括或由与SEQ ID NO:332、333、334或335具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，LRIG1片段包括或由与SEQ ID NO:336或337中任一具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
如本公开的实验示例所述，VSIG3和LRIG1都被认为是通过与VISTA的C-C’环区(其氨基酸序列如SEQ ID NO:344所示)相互作用而与VISTA结合的。
靶分子上特别感兴趣区域
本公开的抗原结合分子是专门设计靶向特别感兴趣的VISTA区域。采用两步法，在对预测的抗原性、功能和安全性进行分析后，选择要靶向的VISTA区域。然后，使用与靶区域相对应的肽作为免疫原，制备针对VISTA靶区域的特异性抗体，以培养特异性单克隆抗体，并随后进行筛选，以确定能够与天然状态下与VISTA结合的抗体。这种方法可以精确控制抗体表位。
本公开的抗原结合分子可以参考其结合的VISTA区域来定义。本公开的抗原结合分子可以与VISTA的特定感兴趣区域结合。在一些实施方案中，抗原结合分子可以与VISTA的线性表位结合，该表位由连续的氨基酸序列(即氨基酸主要序列)组成。在一些实施方案中，抗原结合分子可以与VISTA的构象表位结合，该表位由氨基酸序列的不连续氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与VISTA的细胞外区域(如SEQ ID NO:3所示区域)结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与VISTA的Ig样V型结构域(如SEQ ID NO:6所示区域)结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子在对应于SEQ ID NO:1的第61至162位的区域(如SEQ ID NO:31所示)与VISTA结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:322所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:26所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:27所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:28所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:29所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:30所示VISTA区域结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与SEQ ID NO:271所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与SEQ ID NO:272所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与SEQ ID NO:273所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与SEQ ID NO:274所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与SEQ ID NO:275所示VISTA区域结合。
抗体与肽/多肽结合的区域可由技术人员使用本领域已知的各种方法确定，包括抗体-抗原复合物的X射线共晶体学分析、肽扫描、诱变图谱、氢氘交换质谱分析、噬菌体展示、竞争ELISA和基于蛋白水解的“保护”方法。这些方法在Gershoni等人，《生物药》2007年，21(3):145-156如中有描述，将其全部内容并入本文作为参考。
在优选的实施方案中，通过氢氘交换质谱(HDXMS)分析评估根据本公开的抗原结合分子与肽/多肽结合的区域，例如，如本公开的实验示例所述。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与VISTA的C-C’区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:344所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与包括或由SEQ ID NO:344所示氨基酸序列组成的多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:344所示VISTA区域接触。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与SEQ ID NO:344中所示区域的一个或多个氨基酸接触从而与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子的表位包括或由SEQ ID NO:344所示氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:340所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与包括或由SEQ ID NO:340所示氨基酸序列组成的多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:340所示VISTA区域接触。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与SEQ ID NO:340中所示区域的一个或多个氨基酸接触从而与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子的表位包括或由SEQ ID NO:340所示氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:341所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与包括或由SEQ ID NO:341所示氨基酸序列组成的多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:341所示VISTA区域接触。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与SEQ ID NO:341中所示区域的一个或多个氨基酸接触从而与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子的表位包括或由SEQ ID NO:341所示氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:342所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与包括或由SEQ ID NO:342所示氨基酸序列组成的多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:342所示VISTA区域接触。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与SEQ ID NO:342中所示区域的一个或多个氨基酸接触从而与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子的表位包括或由SEQ ID NO:342所示氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:341所示VISTA区域结合，和/或与SEQ ID NO:342所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与包括或由SEQ ID NO:341所示氨基酸序列组成的多肽结合，和/或与包括或由SEQ ID NO:342所示氨基酸序列组成的多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:341所示VISTA区域接触，和/或与SEQ ID NO:342所示VISTA区域接触。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与SEQ ID NO:341中所示区域的一个或多个氨基酸接触从而与VISTA结合，和/或与SEQ ID NO:342中所示区域的一个或多个氨基酸接触从而与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子的表位包括或由SEQ ID NO:341所示氨基酸序列，和/或SEQID NO:342所示氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过VISTA相互作用伴侣与VISTA结合区域结合，相互作用伴侣与VISTA的C-C’区域(如LRIG1或VSIG3)结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过LRIG1与VISTA结合区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过VSIG3与VISTA结合区域结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:343所示VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与包括或由SEQ ID NO:343所示氨基酸序列组成的多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与SEQ ID NO:343所示VISTA区域接触。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与SEQ ID NO:343中所示区域的一个或多个氨基酸接触从而与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子的表位包括或由SEQ ID NO:343所示氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够将VISTA的相同区域或VISTA的重叠区域与VISTA区域结合，VISTA区域与包括本文所述抗体克隆4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12中任一的VH和VL序列的抗体结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够将VISTA的相同区域或VISTA的重叠区域与VISTA区域结合，VISTA区域与包括抗体克隆4M2-C12、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31中任一的VH和VL序列的抗体结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够将VISTA的相同区域或VISTA的重叠区域与与包括V4-C26的VH和VL序列的抗体结合的VISTA区域结合。
如本文所用，“肽”是指由肽键连接的两个或多个氨基酸单体链。肽的长度通常在约2至50个氨基酸的范围内。“多肽”是两个或多个肽的多聚链。多肽的长度通常超过约50个氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够与包括或由SEQ ID NO:1、2、3、6或31任一氨基酸序列组成的多肽结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与包括或由SEQ ID NO:322所示氨基酸序列组成的肽/多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与包括或由SEQ IDNO:26所示氨基酸序列组成的肽/多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与包括或由SEQ ID NO:27所示氨基酸序列组成的肽/多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与包括或由SEQ ID NO:28所示氨基酸序列组成的肽/多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与包括或由SEQ ID NO:29所示氨基酸序列组成的肽/多肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与包括或由SEQ ID NO:30所示氨基酸序列组成的肽/多肽结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不能与由SEQ ID NO:271所示氨基酸序列组成的肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不能与由SEQ ID NO:272所示氨基酸序列组成的肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不能与由SEQ ID NO:273所示氨基酸序列组成的肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不能与由SEQ ID NO:274所示氨基酸序列组成的肽结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不能与由SEQ ID NO:275所示氨基酸序列组成的肽结合。
抗原结合分子与特定肽/多肽结合的能力可以通过技术人员熟知的方法进行分析，包括通过ELISA、免疫印迹(如Western印迹)、免疫沉淀、表面等离子体共振(SPR；见如Hearty等人，《Methods Mol Biol》(2012)907:411-442)或生物膜干涉(见如Lad等人，(2015)《J Biomol Screen》20(4):498-507)等方法进行分析。
在抗原结合分子能够与包括参考氨基酸序列的肽/多肽结合的实施方案中，所述肽/多肽可以在参考氨基酸序列的一端或两端包含一个或多个额外的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽/多肽在参考氨基酸序列的一端或两端包含如1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、5-10、5-20、5-30、5-40、5-50、10-20、10-30、10-40、10-50、20-30、20-40或20-50个额外的氨基酸。
在一些实施方案中，在参考序列一端或两端(即N末端和C末端)提供的额外氨基酸对应于VISTA氨基酸序列中参考序列两端的位置。举例来说，如果抗原结合分子能够与包括SEQ ID NO:26所示序列的肽/多肽结合，并且在SEQ ID NO:26的C末端有额外的两个氨基酸，则这额外的两个氨基酸可以是精氨酸和天冬酰胺，对应于SEQ ID NO:1的第90和91位。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合由包含本文所述的抗体克隆4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12中任一克隆的VH和VL序列的抗体结合的肽/多肽。
髓系衍生抑制细胞(MDSC)
髓系衍生抑制细胞(MDSC)是髓系细胞中的一类免疫细胞的异质群，具有免疫抑制表型。MDSC的生理习性在Kumar等人，《Trends Immunol.》(2016)；37(3):208–220中综述，将其全部内容并入本文作为参考。
MDSC具有许多生化和基因组特征，这些特征将这些细胞与成熟的髓系细胞(即巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞)区分开来，如NADPH氧化酶(Nox2)表达增加，活性氧(ROS)(如超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和过亚硝酸(PNT；ONOO-))产生增加；精氨酸酶1和一氧化氮合酶2(nos2)表达增加，一氧化氮(NO)产生增加；c/EBPβ和STAT3表达增加；IRF8表达减少；S100A8/9蛋白产生增加。
有两类不同的MDSC；多形核的MDSC(PMN-MDSC)，其形态和表型与中性粒细胞相似，单核MDSC(M-MDSC)与单核细胞更为相似。MDSC的形态和表型特征在如Marvel和Gabrilovich，《J Clin Invest.》2015年，9月1日；125(9):3356–3364中有描述，将其全部内容并入本文作为参考。在小鼠中，MDSC被普遍认为是CD11b+Gr1+细胞。Gr-1hi细胞大部分是PMN-MDSC，Gr-1lo细胞大部分是M-MDSC。根据Ly6C和Ly6G标志物可以更准确地识别这些亚群；M-MDSC是CD11b+Ly6ChiLy6G–，PMN-MDSC是CD11b+Ly6CloLy6G+。在人类中，在单核细胞中发现MDSC。PMN-MDSC为CD14–CD11b+CD33+CD15+或CD66b+细胞，M-MDSC为CD14+HLA-DR–/lo细胞。Lin–HLA-DR–CD33+MDSC群表示一个混合细胞群，富含髓系祖细胞。
与MDSC介导的免疫抑制有关的因素包括精氨酸酶(ARG1)、诱导性NOS(iNOS)、TGF-β、IL-10和COX2的表达、半胱氨酸的螯合、T细胞I型选择素表达的减少以及Tregs的诱导。M-MDSC和PMN-MDSC采用不同的免疫抑制机制。M-MDSC通过产生NO和细胞因子抑制抗原特异性和非特异性T细胞反应，其免疫抑制作用比PMN-MDSC更强。PMN-MDSC通过产生ROS以抗原特异性的方式抑制免疫反应。从病理学角度看，MDSC与癌症和传染病的发展和进展有关。MDSC在人类疾病中的作用在如Kumar等人，《Trends Immunol.》(2016)；37(3):208–220(并入本文作为参考)和Greten等人，《Int Immunopharmacol.》(2011)11(7):802–807中综述，将其全部内容并入本文作为参考。
MDSC在肿瘤组织中含量丰富，通过多种机制促进癌症的发展和恶化，如Umansky等人，《疫苗(巴塞尔)》(2016)4(4):36的综述。MDSC通过趋化因子的表达被招募到肿瘤部位，肿瘤微环境中的促炎因子导致MDSC的免疫抑制功能显著上调。MDSC通过抑制效应免疫细胞功能(如效应T细胞和NK细胞功能)、促进调节T细胞产生/活性、如VEGF和bFGF等生长因子的产生、如基质金属蛋白酶等ECM修饰因子的产生，从而造成肿瘤发展、血管新生和转移。
MDSC的特征可参考VISTA的表达。在本公开多个方面的实施方案中，MDSC可以是“表达VISTA的MDSC”或“VISTA+MDSC”。MDSC可以在细胞表面表达VISTA(即，VISTA可以在在细胞膜内或细胞膜上表达)。
抗原结合分子
本公开涉及与VISTA结合的抗原结合分子的治疗和预防的用途。
“抗原结合分子”是指能够结合靶抗原的分子。抗原结合分子包括如单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(如双特异性抗体)，和抗体片段(如Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab’)2、Fab2、双抗体、三抗体、scFv-Fc、微抗体、单结构域抗体(如VhH)等)，只要它们能与相关的靶分子结合。
根据本公开的抗原结合分子还包括抗体衍生分子，例如，包含从抗体衍生的抗原结合区/结构域的分子。抗体衍生的抗原结合分子可以包括抗原结合区/结构域，其包括或由抗体的抗原结合区(如抗体的抗原结合片段)组成。在一些实施方案中，所述抗体衍生的抗原结合分子的抗原结合区/结构域可以是或包括抗体的Fv(如以scFv形式提供)或Fab区，或整个抗体。例如，根据本公开的抗原结合分子包括含有(细胞毒性)药物部分(如下所述)的抗体-药物偶联物(ADC)。根据本公开的抗原结合分子还包括多特异性抗原结合分子，如包括用于募集(效应)免疫细胞的结构域的免疫细胞吸引分子(如在Goebeler和Bargou，《Nat.Rev.Clin.Oncol.》(2020)17:418–434和Ellerman，《方法》(2019)154:102-117中所综述，将两篇的全部内容并入本文作为参考)，包括BiTEs、BiKEs和TriKEs。根据本公开的抗原结合分子还包括嵌合抗原受体(CAR)，其是一种重组受体，同时具有抗原结合和T细胞激活功能(CAR的结构、功能和加工在如Dotti等人，《Immunol Rev》(2014)257(1)中有综述，将其全部内容并入本文作为参考)。
根据本公开的抗原结合分子包括能够结合靶抗原的部分。在一些实施方案中，所述能够结合靶抗原的部分包括抗体中能够特异性结合靶抗体的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，所述能够结合靶抗原的部分包括或由能够与靶抗原结合的适配体组成，如核酸适配体(如在Zhou和Rossi，《Nat Rev Drug Discov.》2017年16(3):181-202中的综述)。在一些实施方案中，所述能够结合靶抗原的部分包括或由抗原结合肽/多肽组成，如肽适配体、硫氧还蛋白、单抗体、anticalin、Kunitz结构域、avimer、knottin、fynomer、atrimer、DARPin、亲和体(affibody)、纳米抗体(即单结构域抗体(sdAb))、亲和素(affilin)、犰狳重复蛋白(ArmRP)、OBody或纤连蛋白，如Reverdatto等人，《Curr Top Med Chem.》2015；15(12):1082–1101中所综述，将其全部内容并入本文作为参考(还可参考如Boersma等人，《J Biol Chem》(2011)286:41273-85和Emanuel等人，《Mabs》(2011)3:38-48)。
本公开的抗原结合分子通常包括含有能够特异性结合靶抗原的抗体VH和VL的抗原结合结构域。由VH和VL形成的抗原结合结构域在本文中还可以指Fv区。
抗原结合分子可以是或可以包括抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。抗原结合分子可以包括一个以上的多肽，这些多肽共同形成一个抗原结合结构域。所述多肽可以以共价或非共价方式结合。在一些实施方案中，所述多肽形成了包括所述多肽的更大多肽的一部分(如包括VH和VL的scFv的情况，或包括VH-CH1和VL-CL的scFab的情况)。
抗原结合分子可以指一个以上多肽(如2、3、4、6或8个多肽)的非共价或共价复合物，如包括两条重链多肽和两条轻链多肽的IgG样抗原结合分子。
本公开的抗原结合分子可以使用能够与VISTA结合的单克隆抗体(mAb)序列来设计和制备。也可使用/提供抗体的抗原结合区，如单链可变片段(scFv)、Fab和F(ab’)2片段。“抗原结合区”是能够与给定抗体特异的靶标结合的抗体的任何片段。
抗体通常包括六个互补决定区CDR；三个位于重链可变(VH)区：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，三个位于轻链可变(VL)区：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。六个CDR共同决定抗体的互补位，其是抗体中与靶抗原结合的部分。
VH区和VL区包括每个CDR两侧的框架区(FR)，为CDR提供支架。从N端到C端，VH区包括以下结构：N端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C端；VL区包括以下结构：N端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C端。
定义抗体CDR和FR有几种不同的惯例，比如Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》，第五版，公共卫生服务，国家卫生研究院，贝塞斯达，MD(1991)、Chothia等人，《J.Mol.Biol.》196:901-917(1987)中的描述，以及VBASE2，如Retter等人，《Nucl.AcidsRes.》(2005)33(suppl 1):D671-D674中的描述。本文所述抗体克隆的VH区和VL区的CDR和FR是根据国际IMGT(ImMunoGeneTics)信息系统定义的(LeFranc等人，《Nucleic AcidsRes.》(2015)43(数据库号):D413-22)，其使用如Lefranc等人，《Dev.Comp.Immunol.》(2003)27:55-77中所述的IMGT V-DOMAIN编号规则。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括能够与VISTA结合的抗原结合分子的CDR。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括能够与VISTA结合的抗原结合分子的FR。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括能够与VISTA结合的抗原结合分子的CDR和FR。即是，在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括能够与VISTA结合的抗原结合分子的VH区和VL区。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括VH区和VL区，该VH区和VL区是或来源于本文所述的VISTA结合抗体克隆的VH/VL区(即抗VISTA抗体克隆4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12)。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(1)至(18)中的任一VH区：
(1)(4M2-C12衍生共有序列)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:305所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:306所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:307所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(2)(V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(3)(V4-C1)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:277所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(4)(V4-C9)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:286所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(5)(4M2-C12/V4H1/V4H2共有序列)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:244所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(6)(4M2-C12、4M2-B4、V4H2)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(7)(V4H1)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(8)(2M1-B12、2M1-D2)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(9)(4M2-C9、5M1-A11)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(10)(4M2-D9)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(11)(1M2-D2)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:121所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:122所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(12)(4M2-D5)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:145所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(13)(4M2-A8)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:158所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:159所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:160所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(14)(9M2-C12)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:169所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:170所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:171所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(15)(13D5衍生的)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:246所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(16)(13D5p)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:185所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(17)(13D5-1)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(18)(13D5-13)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(19)至(35)中的任一VH区：
(19)(V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:292所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:293所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:281所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(20)(V4-C1、V4-C9)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:279所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:280所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:281所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(21)(4M2-C12)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(22)(4M2-B4)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(23)(V4H1)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(24)(V4H2)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(25)(2M1-B12)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(26)(4M2-C9)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(27)(2M1-D2)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(28)(4M2-D9)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(29)(1M2-D2)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:123所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:124所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:125所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(30)(5M1-A11)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:134所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(31)(4M2-D5)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:147所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:148所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:149所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(32)(4M2-A8)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:161所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:162所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:163所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(33)(9M2-C12)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:172所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:173所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:174所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:175所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(34)(13D5p、13D5-1)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(35)(13D5-13)包括以下FR的VH区：
具有如SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:186所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:201所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括含有如上(1)至(18)中的任一CDR，和如上(19)至(35)中的任一FR的VH区。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(36)至(57)中的任一VH区：
(36)包括如(1)所示的CDR和如(19)、(20)、(21)、(22)、(23)或(24)所示的FR的VH区。
(37)包括如(2)所示的CDR和如(19)所示的FR的VH区。
(38)包括如(3)所示的CDR和如(20)所示的FR的VH区。
(39)包括如(4)所示的CDR和如(20)所示的FR的VH区。
(40)包括如(5)所示的CDR和如(21)、(22)、(23)或(24)所示的FR的VH区。
(41)包括如(6)所示的CDR和如(21)所示的FR的VH区。
(42)包括如(6)所示的CDR和如(22)所示的FR的VH区。
(43)包括如(6)所示的CDR和如(24)所示的FR的VH区。
(44)包括如(7)所示的CDR和如(23)所示的FR的VH区。
(45)包括如(8)所示的CDR和如(25)所示的FR的VH区。
(46)包括如(8)所示的CDR和如(27)所示的FR的VH区。
(47)包括如(9)所示的CDR和如(26)所示的FR的VH区。
(48)包括如(9)所示的CDR和如(30)所示的FR的VH区。
(49)包括如(10)所示的CDR和如(28)所示的FR的VH区。
(50)包括如(11)所示的CDR和如(29)所示的FR的VH区。
(51)包括如(12)所示的CDR和如(31)所示的FR的VH区。
(52)包括如(13)所示的CDR和如(32)所示的FR的VH区。
(53)包括如(14)所示的CDR和如(33)所示的FR的VH区。
(54)包括如(15)所示的CDR和如(34)或(35)所示的FR的VH区。
(55)包括如(16)所示的CDR和如(34)所示的FR的VH区。
(56)包括如(17)所示的CDR和如(34)所示的FR的VH区。
(57)包括如(18)所示的CDR和如(35)所示的FR的VH区。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(58)至(76)中的任一VH区：
(58)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:276所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(59)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:285所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(60)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(61)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(62)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:48所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(63)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:52所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(64)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:62所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(65)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:71所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(66)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:87所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(67)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:102所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(68)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:106所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(69)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:119所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(70)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:133所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(71)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:143所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(72)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:157所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(73)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:168所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(74)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:183所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(75)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:194所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(76)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:199所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(77)至(96)中的任一VL区：
(77)(4M2-C12衍生共有序列)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:308所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(78)(C24/C26/C27共有序列)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:309所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(79)(V4-C24、V4-C26)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:295所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(80)(V4-C27、V4-C30、V4-C31)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:300所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(81)(4M2-C12/V4H1/V4H2共有序列)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:245所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(82)(4M2-C12、4M2-B4、V4-C1、V4-C9、V4-C28)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(83)(V4H1)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(84)(V4H2)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(85)(2M1-B12、2M1-D2)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(86)(4M2-C9)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(87)(4M2-D9)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(88)(1M2-D2)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:127所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:128所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:129所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(89)(5M1-A11)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:137所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:138所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:139所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(90)(4M2-D5)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:151所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:152所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:153所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(91)(4M2-A8)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:165所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:152所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:153所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(92)(9M2-C12)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:177所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:179所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(93)(13D5p衍生的)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:247所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(94)(13D5p)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(95)(13D5-1)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(96)(13D5-13)包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(97)至(120)中的任一VL区：
(97)(V4-C1)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:284所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(98)(V4-C9)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:284所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(99)(V4-C24)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:296所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(100)(V4-C26)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:284所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(101)(V4-C27)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:284所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(102)(V4-C28)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:296所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(103)(V4-C30)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:296所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(104)(V4-C31)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:304所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(105)(4M2-C12)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(106)(4M2-B4)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(107)(V4H1)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(108)(V4H2)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(109)(2M1-B12)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(110)(4M2-C9)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(111)(2M1-D2)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(112)(4M2-D9)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(113)(1M2-D2)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:130所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:131所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:132所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(114)(5M1-A11)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:140所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:142所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(115)(4M2-D5)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:155所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:156所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(116)(4M2-A8)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:166所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:155所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:167所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(117)(9M2-C12)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:180所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:181所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:182所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(118)(13D5p)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(119)(13D5-1)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:198所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:193所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(120)(13D5-13)包括以下FR的VL区：
具有如SEQ ID NO:191所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:192所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:204所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括含有如上(77)至(96)中的任一CDR，和如上(97)至(120)中的任一FR的VL区。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(121)至(148)中的任一VL区：
(121)包括如(77)所示的CDR和如(97)、(98)、(99)、(100)、(101)、(102)、(103)、(104)、(105)、(106)、(107)或(108)所示的FR的VL区。
(122)包括如(78)所示的CDR和如(99)、(100)或(101)所示的FR的VL区。
(123)包括如(79)所示的CDR和如(99)所示的FR的VL区。
(124)包括如(79)所示的CDR和如(100)所示的FR的VL区。
(125)包括如(80)所示的CDR和如(101)所示的FR的VL区。
(126)包括如(82)所示的CDR和如(97)所示的FR的VL区。
(127)包括如(82)所示的CDR和如(98)所示的FR的VL区。
(128)包括如(82)所示的CDR和如(102)所示的FR的VL区。
(129)包括如(80)所示的CDR和如(103)所示的FR的VL区。
(130)包括如(80)所示的CDR和如(104)所示的FR的VL区。
(131)包括如(81)所示的CDR和如(105)、(106)、(107)或(108)所示的FR的VL区。
(132)包括如(82)所示的CDR和如(105)所示的FR的VL区。
(133)包括如(82)所示的CDR和如(106)所示的FR的VL区。
(134)包括如(83)所示的CDR和如(107)所示的FR的VL区。
(135)包括如(84)所示的CDR和如(108)所示的FR的VL区。
(136)包括如(85)所示的CDR和如(109)所示的FR的VL区。
(137)包括如(85)所示的CDR和如(111)所示的FR的VL区。
(138)包括如(86)所示的CDR和如(110)所示的FR的VL区。
(139)包括如(87)所示的CDR和如(112)所示的FR的VL区。
(140)包括如(88)所示的CDR和如(113)所示的FR的VL区。
(141)包括如(89)所示的CDR和如(114)所示的FR的VL区。
(142)包括如(90)所示的CDR和如(115)所示的FR的VL区。
(143)包括如(91)所示的CDR和如(116)所示的FR的VL区。
(144)包括如(92)所示的CDR和如(117)所示的FR的VL区。
(145)包括如(93)所示的CDR和如(118)、(119)或(120)所示的FR的VL区。
(146)包括如(94)所示的CDR和如(118)所示的FR的VL区。
(147)包括如(95)所示的CDR和如(119)所示的FR的VL区。
(148)包括如(96)所示的CDR和如(120)所示的FR的VL区。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如下(149)至(173)中的任一VL区：
(149)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:310所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(150)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:282所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(151)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:287所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(152)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:294所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(153)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:297所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(154)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:299所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(155)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:301所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(156)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:302所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(157)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:303所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(158)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:40所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(159)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:50所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(160)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:57所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(161)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:66所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(162)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:79所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(163)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:95所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(164)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:104所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(165)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:113所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(166)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:126所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(167)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:136所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(168)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:150所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(169)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:164所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(170)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:176所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(171)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:188所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(172)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:196所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(173)一种VL区，其包括与SEQ ID NO:202所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括如上(1)至(76)中的任一VH区，和如上(77)至(173)中的任一VL区。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括VISTA结合抗体克隆的CDR或包括VISTA结合抗体克隆的VH和VL，所述VISTA结合抗体克隆选自：4M2-C12、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30或V4-C31。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括V4-C26的CDR，或V4-C26的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括：
(A)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:305所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:306所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:307所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:308所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(B)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:295所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(C)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(D)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(E)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:277所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(F)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:286所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(G)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:300所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(H)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(I)包括以下CDR的VH区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
包括以下CDR的VL区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括：
(J)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:297所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(K)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:52所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:57所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(L)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:62所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:66所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(M)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:276所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:282所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(N)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:285所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:287所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(O)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:294所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(P)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:299所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(Q)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:301所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(R)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:302所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
(S)一种VH区，其包括与SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列；和一种VL区，其包括与SEQ ID NO:40所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，更优选地为至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括，或由以下组成：
(i)一个或多个(如两个)多肽，其包括或由与SEQ ID NO:331所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)一个或多个(如两个)多肽，其包括或由与SEQ ID NO:317所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在根据本公开的实施方案中，一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代，这些取代可以是保守取代，例如根据下表。在一些实施方案中，中间一列同一区块中的氨基酸被取代。在一些实施方案中，最右边一列中同一列的氨基酸被取代：
在一些实施方案中，取代可以是在功能上保守的。即是，在一些实施方案中，与等效的未取代分子相比，所述取代可能不会影响(或不会实质上影响)包含取代的抗原结合分子的一种或多种功能特性(如靶结合)。
抗体抗原结合区的VH和VL区共同构成Fv区。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子包括或由与VISTA结合的Fv区组成。在一些实施方案中，Fv的VH和VL区是由连接区连接的单个多肽，即单链Fv(scFv)。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为或衍生自IgG(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM的重链恒定序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为或衍生自IgG4的重链恒定序列。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为人免疫球蛋白G1恒定(IGHG1；UniProt：P01857-1，v1；SEQ ID NO:205)。SEQ ID NO:205的第1至98位形成CH1区(SEQ ID NO:206)。SEQ ID NO:205的第99至110位形成CH1和CH2区之间的铰链区(SEQ IDNO:207)。SEQ ID NO:205的第111至223位形成CH2区(SEQ ID NO:208)。SEQ ID NO:205的第224至330位形成CH3区(SEQ ID NO:209)。
示例性的抗原结合分子可以使用pFUSE-CHIg-hG1制备，其CH3区包括D356E、L358M(根据EU编号进行位置编号)的取代。pFUSE-CHIg-hG1编码的CH3区域的氨基酸序列如SEQID NO:210所示。可以理解的是，CH3区可以根据本文所述的对抗原结合分子的Fc区的修饰进行进一步的取取代。
在一些实施方案中，CH1区包括或由SEQ ID NO:206所示序列，或与SEQ ID NO:206所示氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的序列组成。在一些实施方案中，CH1-CH2铰链区包括或由SEQ ID NO:207所示序列，或与SEQ ID NO:207所示氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的序列组成。在一些实施方案中，CH2区包括或由SEQ ID NO:208所示序列，或与SEQ ID NO:208所示氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的序列组成。在一些实施方案中，CH3区包括或由SEQ ID NO:209或210所示序列，或与SEQ ID NO:209或210所示氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的序列组成。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括SEQ ID NO:345所示序列，或与SEQ ID NO:345所示氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括SEQ ID NO:346所示序列，或与SEQ IDNO:346所示氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括免疫球蛋白轻链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链恒定序列为人免疫球蛋白κ恒定(IGKC；Cκ；UniProt：P01834-1，v2；SEQ ID NO:211)。在一些实施方案中，所述疫球蛋白轻链恒定序列为人免疫球蛋白λ恒定(IGLC；Cλ)，如IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7。在一些实施方案中，CL区包括或由SEQ ID NO:211所示序列，或与SEQ ID NO:211所示氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的序列组成。
抗体抗原结合区的VL和轻链恒定(CL)区，和VH区和重链恒定1(CH1)区共同构成Fab区。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括含有VH、CH1、VL和CL(如Cκ或Cλ)的Fab区。在一些实施方案中，所述Fab区包括含有VH和CH1(如VH-CH1融合多肽)的多肽和含有VL和CL(如VL-CL融合多肽)的多肽。在一些实施方案中，所述Fab区包括含有VH和CL(如VH-CL融合多肽)的多肽和含有VL和CH(如VL-CH1融合多肽)的多肽；即是，在一些实施方案中，所述Fab区是一个CrossFab区。在一些实施方案中，Fab或CrossFab的VH、CH1、VL和CL区是由连接区连接的单个多肽，即单链Fab(scFab)或单链CrossFab(scCrossFab)。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括或由与VISTA结合的Fab区组成。
在一些实施方案中，本文所述抗原结合分钟包括或由与VISTA结合的完整抗体组成。如本文所用，“完整抗体”是指结构与免疫球蛋白(Ig)结构基本相似的抗体。不同类型的免疫球蛋白及其结构在如Schroeder和Cavacini《J Allergy ClinImmunol.》(2010)125(202):S41-S52中有描述，将其全部内容并入本文作为参考。
G型免疫球蛋白(即IgG)为～150kDa糖蛋白，其包括两条重链和两条轻链。从N到C端，所述重链包括一个VH，之后是一个包括三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)的重链恒定区，同样，轻链包括一个VL，之后是一个CL。根据重链，免疫球蛋白可以被分为IgG(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM。轻链可以是kappa(κ)或lambda(λ)。
在一些实施方案中，本文所述抗原结合分子包括或由与VISTA结合的IgG(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM组成。在优选的实施方案中，所述抗原结合分子为IgG4。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子对VISTA至少具有单价结合力。结合价是指抗原结合分子中特定抗原决定簇的结合位点数量。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括至少一个VISTA结合位点。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括一个以上的VISTA结合位点，如，2、3或4个结合位点。所述结合位点可以相同或不同。在一些实施方案中，所述抗原结合分子对VISTA为，如二价、三价或四价。
本公开的各个方面涉及多特异性抗原结合分子。所述“多特异性”是指抗原结合分子对一个以上的靶点具有特异性结合力。在一些实施方案中，所述抗原结合分子为双特异性抗原结合分子。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括至少两个不同的抗原结合结构域(即至少两个抗原结合结构域，例如包括非相同的VH和VL)。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与VISTA和另一个靶标(如VISTA以外的抗原)结合，因此其至少为双特异性的。术语“双体异性”是指抗原结合分子能够特异性地与至少两个不同的抗原决定簇结合。
可以理解的是，根据本公开的抗原结合分子(如多特异性抗原结合分子)可以包括能够与抗原结合分子特异的靶标结合的抗原结合分子。例如，能够与VISTA和VISTA以外的抗原结合的抗原结合分子，可以包括：(i)能够与VISTA结合的抗原结合分子，和(ii)能够与VISTA以外的抗原结合的抗原结合分子。
还可以理解的是，根据本公开的抗原结合分子(如多特异性抗原结合分子)可以包括能够与抗原结合分子特异的靶标结合的抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。例如，根据本公开的抗原结合分子可包括，如(i)能与VISTA结合的抗原结合多肽复合物，包括轻链多肽(包括VL-CL结构)和重链多肽(包括VH-CH1-CH2-CH3结构)；以及(ii)能与VISTA以外的抗原结合的抗原结合多肽复合物，包括轻链多肽(包括VL-CL结构)和重链多肽(包括VH-CH1-CH2-CH3结构)。
在一些实施方案中，更大抗原结合分子(如多特异性抗原结合分子)中的抗原结合分子组分可以是指如更大抗原结合分子的“抗原结合结构域”或“抗原结合区”。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括能够与VISTA结合的抗原结合分子，以及能够与VISTA以外抗原结合的抗原结合分子。在一些实施方案中，所述VISTA以外的抗原为免疫细胞表面分子。在一些实施方案中，所述VISTA以外的抗原为肿瘤细胞抗原。在一些实施方案中，所述VISTA以外的抗原为受体分子，如细胞表面受体。在一些实施方案中，所述VISTA以外的抗原为细胞信号分子，如细胞因子、趋化因子、干扰素、白细胞介素或淋巴因子。在一些实施方案中，所述VISTA以外的抗原为生长因子或激素。
癌细胞抗原是由癌细胞表达或过表达的抗原。癌细胞抗原可以是任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。癌细胞抗原的表达可能与癌症有关。癌细胞抗原可能由癌细胞异常表达(如，癌细胞抗原可能以异常定位方式表达)，或由癌细胞以异常结构表达。癌细胞抗原可以引起免疫反应。在一些实施方案中，所述抗原在癌细胞的细胞表面表达(即癌细胞抗原是癌细胞表面抗原)。在一些实施方案中，被本文所述抗原结合分子结合的抗原的部分位于癌细胞的外表面(即细胞外)。癌细胞抗原可以是癌症相关抗原。在一些实施方案中，所述癌细胞抗原是其表达与癌症的发展、进展或症状严重程度相关的抗原。所述癌症相关抗原可能与癌症的病因或病理有关，也可能因癌症而异常表达。在一些实施方案中，所述癌细胞抗原是癌症细胞表达上调(如在RNA和/或蛋白质水平)的抗原，如与可比非癌细胞(如来自相同组织/细胞类型的非癌细胞)的表达水平相比。在一些实施方案中，所述癌症相关抗原可以优先由癌细胞表达，而可比的非癌细胞(如来自相同组织/细胞类型的非癌细胞)不表达。在一些实施方案中，所述癌症相关抗原可能是突变的癌基因或突变的肿瘤抑制基因的产物。在一些实施方案中，所述癌症相关抗原可能是过表达的细胞蛋白、致癌病毒产生的癌症抗原、癌胚胎抗原或细胞表面糖脂或糖蛋白的产物。
免疫细胞表面分子可以是在免疫细胞的细胞表面中或细胞表面上表达的任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。在一些实施方案中，被本公开的抗原结合分子结合的免疫细胞表面分子部分位于免疫细胞的外表面(即细胞外)。所述免疫细胞表面分子可以在任何免疫细胞的细胞表面表达。在一些实施方案中，所述免疫细胞可以是造血细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞或单核细胞。所述淋巴细胞可以是如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)，或其前体(如胸腺细胞或前B细胞)。在一些实施方案中，所述免疫细胞表面分子可以是共刺激分子(如CD28、OX40、4-1BB、ICOS或CD27)或其配体。在一些实施方案中，所述免疫细胞表面分子可以是检查点分子(如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA)或其配体。
根据本公开的多特异性抗原结合分子可以以任何合适的形式提供，比如Brinkmann和Kontermann MAbs(2017)9(2):182-212中描述的哪些形式，将其全部内容并入本文作为参考。合适的形式包括Brinkmann和Kontermann MAbs(2017)9(2):182-212中图2所示的抗体偶联物，如IgG2、F(ab’)2或CovX-Body；IgG或IgG样分子，如IgG，嵌合IgG，κλ共体HC；CH1/CL融合蛋白，如scFv2-CH1/CL、VHH2-CH1/CL；“仅可变结构域”双特异性抗原结合分子，如串联scFv(taFV)、三联体、双体(Db)、dsDb、Db(kih)、DART、scDB、dsFv-dsFv、tandAbs、三头、串联dAb/VHH、四价dAb.VHH；非Ig融合蛋白，如scFv2-白蛋白、scDb-白蛋白、taFv-白蛋白、taFv-毒素、微抗体、DNL-Fab2、DNL-Fab2-scFv、DNL-Fab2-IgG-细胞因子2、ImmTAC(TCR-scFv)；修饰Fc和CH3融合蛋白，如scFv-Fc(kih)、scFv-Fc(CH3电荷对)、scFv-Fc(EW-RVT)、scFv-fc(HA-TF)、scFv-Fc(SEEDbody)、taFv-Fc(kih)、scFv-Fc(kih)-Fv、Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc(SEEDbody)、DART-Fc、scFv-CH3(kih)、TriFabs；Fc融合物，如双双抗体(Di-diabody)、scDb-Fc,taFv-Fc,scFv-Fc-scFv,HCAb-VHH,Fab-scFv-Fc,scFv4-Ig,scFv2-Fcab；CH3融合物，如Dia-diabody、scDb-CH3；IgE/IgM CH2融合物，如scFv-EHD2-scFv、scFvMHD2-scFv；Fab融合蛋白，如Fab-scFv(双抗体)、Fab-scFv2(三抗体)、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-VHH、正交Fab-Fab；非Ig融合蛋白，如DNL-Fab3、DNL-Fab2-scFv、DNL-Fab2-IgG-细胞因子2；不对称IgG或IgG样分子，如IgG(kih)、IgG(kih)通用LC、ZW1 IgG通用LC、Biclonics通用LC、CrossMab、CrossMab(kih)、scFab-IgG(kih)、Fab-scFab-IgG(kih)、正交Fab IgG(kih)、DuetMab、CH3电荷对+CH1/CL电荷对、铰链/CH3电荷对、SEED体、Duobody、四合一-CrossMab(kih)、LUZ-Y通用LC、LUZ-YscFab-IgG、FcFc*；附加和Fc修饰IgGs，如IgG(kih)-Fv、IgG HA-TF-Fv、IgG(kih)scFab、scFab-Fc(kih)-scFv2、scFab-Fc(kih)-scFv、半DVD-Ig、DVI-Ig(四合一)、CrossMab-Fab；修饰Fc和CH3融合蛋白，如Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc-SEEDbody、TriFab；附加IgGs-HC融合物，如IgG-HC、scFv、IgG-dAb、IgG-taFV、IgG-CrossFab、IgG-正交Fab、IgG-(CαCβ)Fab、scFv-HC-IgG、串联Fab-IgG(正交Fab)Fab-IgG(CαCβFab)、Fab-IgG(CR3)、Fab-铰链-IgG(CR3)；附加IgGs-LC融合物，如IgG-scFv(LC)、scFv(LC)-IgG、dAb-IgG；附加IgGs-HC和LC融合物，如DVD-Ig、TVD-Ig、CODV-Ig、scFv4-IgG、Zybody；Fc融合物，如Fab-scFv-Fc、scFv4-Ig；F(ab’)2融合物，如F(ab’)2-scFv2；CH1/CL融合蛋白，如scFv2-CH1-铰链/CL；修饰IgGs，如DAF(二合一IgG)、DutaMab、Mab2；和非Ig融合物，如DNL-Fab4-IgG。
技术人员能够设计和制备双特异性抗原结合分子。制备双特异性抗原结合分子的方法包括抗原结合分子或抗体片段的化学交联，如使用可还原的二硫键或不可还原的硫醚键，如Segal和Bast，2001年，《双特异性抗原结合分子的生产》，《当前免疫学协议》，14:IV:2.13:2.13.1–2.13.16中所综述，将其全部内容并入本文作为参考。例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)可用于通过铰链区SH-基团化学交联Fab片段，以产生二硫键连接的双特异性F(ab)2异源二聚体。
产生双特异性抗原结合分子的其他方法包括将产生抗体的杂交瘤与如聚乙二醇融合，从而产生能够分泌双特异性抗体的细胞杂交瘤细胞，例如D.M.和Bast,B.J.2001年，《双特异性抗原结合分子的生产》，《当前免疫学协议》，14:IV:2.13:2.13.1–2.13.16中所描述。
根据本公开的双特异性抗原结合分子还可以通过重组的方式生产，例如通过编码抗原结合分子多肽的核酸构建物表达，如《抗体工程：方法与规程》，第二版(Humana出版社，2012年)，第40章：生产双特异性抗原结合分子：双抗体和串联scFv(Hornig和 )，或French，《如何制备双体异性抗原结合分子》，《Methods Mol.Med.》2000年；40:333-339，这两本书的全部内容并入本文作为参考。例如，可以通过分子克隆技术制备编码两个抗原结合片段的轻链和重链可变结构域(即能与VISTA结合的抗原结合片段的轻链和重链可变结构域，以及能与另一靶蛋白结合的抗原结合片段的轻链和重链可变结构域)的DNA构建体，并包括编码抗原结合片段之间的适当连接体或二聚化结构域的序列。之后，可以通过在合适的宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中表达(如体外表达)该构建体来生产重组双特异性抗体，然后可选地对表达重组双特异性抗体进行纯化。
Fc区
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括Fc区。
在IgG、IgA和IgD同种型中，Fc区由一个多肽的CH2和CH3区以及另一个多肽的CH2和CH3区组成。来自两个多肽的CH2和CH3区域共同构成Fc区域。在IgM和IgE同种型中，Fc区包含三个恒定结构域(CH2、CH3和CH4)，并且来自两个多肽的CH2至CH4共同构成Fc区。
Fc区可以与Fc受体和免疫系统的其他分子相互作用，从而产生功能效应。IgG Fc介导的效应功能在如Jefferis等人，《Immunol Rev》1998年，163:59-76(将其全部内容并入本文作为参考)中有综述，并通过Fc区与免疫细胞表达的Fc受体之间的相互作用由Fc介导的免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞和T细胞)的招募和激活、通过Fc区与补体蛋白C1q的结合招募补体途径成分，以及随后的补体级联激活来实现。
Fc介导的功能包括Fc受体结合、抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、攻膜复合物(MAC)的形成、细胞脱颗粒、细胞因子和/或趋化因子的产生以及抗原加工和呈递。
影响Fc介导功能的抗体Fc区的修饰是本领域已知的，如在Wang等人，《蛋白细胞》(2018)9(1):63-73等中的描述，将其全部内容并入本文作为参考。特别是，Wang等人，《蛋白细胞》(2018)9(1):63-73的表1中总结了已知的影响抗体效应功能的Fc区修饰示例。影响抗体效应活性的Fc区的修饰如下所述。
当Fc区/CH2/CH3被描述为包含“对应于”参考取代的修饰时，可认为是同源Fc/CH2/CH3中的等取代同取代。例如，人IgG1中的L234A/L235A取代(如Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》，第五版，公共卫生服务，国家卫生研究院，贝塞斯达，MD，1991年中的描述，根据EU编号进行位置编号)对应于小鼠Ig gamma-2A链C区A等位基因第117和118位的L到A的取代，根据SEQ ID NO:256进行编号。
当Fc区被描述为包含修饰时，所述修饰可能存在于共同构成Fc区的一条或两条多肽链中。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括含有修饰的Fc区。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括在一个或多个CH2和/或CH3区中含有修饰的Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc区包括提高Fc介导功能的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括提高ADCC的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括提高ADCP的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括提高CDC的修饰。与包括相应未修饰Fc区的抗原结合分子相比，包括Fc区的抗原结合分子，其Fc区包括提高Fc介导功能(如ADCC、ADCP、CDC)的修饰，从而诱导相关效应器功能水平的提高。
在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与Fc受体结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与Fcγ受体结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中一个或多个结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与FcγRIIIa结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与FcγRIIa结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与FcγRIIb结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与FcRn结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与补体蛋白结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括增加与C1q结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括提高抗原结合分子六聚化的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括提高抗原结合分子半衰期的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括提高共结合的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Stavenhagen等人《Cancer Res.》(2007)67:8882–8890中所述取代组合F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Lazar等人《Proc Natl Acad Sci USA.》(2006)103:4005–4010中所述取代组合S239D/I332E或S239D/I332E/A330L的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Shields等人《J Biol Chem.》(2001)276:6591–6604中所述取代组合S298A/E333A/K334A的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Mimoto等人《MAbs.》(2013):5:229–236所述的取代组合L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A的修饰，和对应于取代组合D270E/K326D/A330M/K334E的其他重链多肽的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Richards等人《Mol Cancer Ther.》(2008)7:2517–2527所述取代组合G236A/S239D/I332E的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Idusogie等人《J Immunol.》(2001)166(4):2571-5中所述取代组合K326W/E333S的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Moore等人《MAbs.》(2010)2(2):181-9中所述取代组合S267E/H268F/S324T的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Natsume等人《Cancer Res.》(2008)68(10):3863-72中所述取代组合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Diebolder等人《科学》(2014)343(6176):1260-3中所述取代组合E345R/E430G/S440Y的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Dall’Acqua等人《J Immunol.》(2002)169:5171–5180中所述取代组合M252Y/S254T/T256E的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Zalevsky等人《Nat Biotechnol.》(2010)28:157–159中所述取代组合M428L/N434S的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Chu等人《Mol Immunol.》(2008)45:3926–3933中所述取代组合S267E/L328F的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Shang等人《Biol Chem.》(2014)289:15309–15318中所述取代组合N325S/L328F的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括降低/阻止Fc介导功能的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括降低/阻止ADCC的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括降低/阻止ADCP的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括降低/阻止CDC的修饰。与包含相应未修饰Fc区的抗原结合分子相比，包含经修饰的Fc区的抗原结合分子可降低/阻止Fc介导的功能(如ADCC、ADCP、CDC)，从而降低相关效应器功能的水平。
在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与Fc受体结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与Fcγ受体结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中一个或多个结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与FcγRIIIa结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与FcγRIIa结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与FcγRIIb结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与补体蛋白结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止与C1q结合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括减少/阻止N297对应的氨基酸残基糖基化的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区无法减少一个或多个Fc介导的功能(即缺乏激发相关Fc介导功能的能力)。因此，包括这种Fc区的抗原结合分子也缺乏诱导相关功能的能力。这种抗原结合分子可以被描述为不具备相关功能。
在一些实施方案中，所述Fc区无法诱导ADCC。在一些实施方案中，所述Fc区无法诱导ADCP。在一些实施方案中，所述Fc区无法诱导CDC。在一些实施方案中，所述Fc区无法诱导ADCC和/或无法诱导ADCP和/或无法诱导CDC。
在一些实施方案中，所述Fc区无法结合Fc受体。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合FcγRIIIa。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合FcγRIIa。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合FcγRIIb。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合FcRn。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合补体蛋白。在一些实施方案中，所述Fc区无法结合C1q。在一些实施方案中，所述Fc区N297对应的氨基酸残基未被糖基化。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Leabman等人《MAbs.》(2013)5:896–903中所述N297A或N297Q或N297G的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Alegre等人《J Immunol.》(1992)148:3461–3468中所述L235E的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Xu等人《Cell Immunol.》(2000)200:16–26中所述取代组合L234A/L235A或F234A/L235A的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Schlothauer等人《蛋白工程、设计和筛选》(2016),29(10):457–466中所述P329A或P329G的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Lo等人《J.Biol.Chem》(2017)292(9):3900-3908中所述取代组合L234A/L235A/P329G的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Rother等人《NatBiotechnol.》(2007)25:1256–1264中所述取代组合的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Newman等人《Clin.Immunol.》(2001)98:164–174中所述取代组合S228P/L235E的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于An等人《MAbs.》(2009)1:572–579中所述取代组合H268Q/V309L/A330S/P331S的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Vafa等人《方法》(2014)65:114–126中所述取代组合V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于US2015/0044231 A1中所述取代组合L234A/L235E/G237A/A330S/P331S的修饰。
已知取代组合“L234A/L235A”和相应取代(如人IgG4中F234A/L235A)会破坏Fc与Fcγ受体的结合，抑制ADCC、ADCP，并减少C1q的结合从而抑制CDC(Schlothauer等人《蛋白工程、设计和筛选》(2016),29(10):457–466，将其全部内容并入本文作为参考)。取代“P329G”和“P329A”减少C1q的结合(从而抑制CDC)。已知用“A”、“G”或“Q”取代“N297”可以消除糖基化，减少Fc与C1q和Fcγ受体结合，从而抑制CDC和ADCC。Lo等人《J.Biol.Chem》(2017)292(9):3900-3908(将其全部内容并入本文作为参考)报道取代组合L234A/L235A/P329G消除小鼠IgG2a和人IgG1的补体结合和固定以及Fcγ受体依赖性、抗体依赖性和细胞介导的细胞毒性。
US2015/0044231 A1公开了IgG1 Fc中L234A/L235E/G237A/A330S/P331S的取代组合，以消除吞噬、ADCC和CDC的诱导。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于Silva等人《J Biol Chem.》(2015)290(9):5462-5469中所述S228P取代的修饰。IgG4 Fc中的S229P取代减少Fab臂的交换(Fab臂交换可能不可取)。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于取代组合L234A/L235A相应的修饰。在一些实施方案中所述Fc区包括对应于P329G取代相应的修饰。在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于N297Q取代相应的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于取代组合L234A/L235A/P329G相应的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于取代组合L234A/L235A/P329G/N297Q相应的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于取代组合L234A/L235E/G237A/A330S/P331S相应的修饰。
在一些实施方案中，所述Fc区包括对应于S228P取代相应的修饰，如在IgG4中。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括在CH2和CH3区中含有一个或多个修饰的Fc区，从而提高Fc区的结合。抗原结合分子的组成多肽的重组共表达和随后的结合会产生几种可能得组合。为了提高重组产物中抗原结合分子所需多肽组合的产率，在Fc区引入促进所需重链多肽组合结合的修饰是有利的。例如，修饰可以促进不同多肽链的CH2和/或CH3区之间的疏水和/或静电相互作用。合适的修饰如Ha等人《Front.Immnol》(2016)7:394中所述，将其全部内容并入本文作为参考。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括在Fc区的CH3区含有配对取代的Fc区，所述取代如以下一种形式，如Ha等人《Front.Immnol》(2016)7:394中的表1所示：KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s、SEED或A107。
在一些实施方案中，所述Fc区包括“旋钮入孔(knob-into-hole)”或“KiH”修饰，如US 7,695,936和Carter《J Immunol Meth》248,7-15(2001)中所述。在这些实施方案中，Fc区的一个CH3区包括一个“旋钮”修饰，其他CH3区包括一个“孔”修饰。“旋钮”和“孔”修饰各自位于CH3区内，因此“旋钮”可以位于“孔”中，从而促进多肽的异源二聚化(并抑制同源二聚化)和/或稳定异源二聚体。通过用具有较大侧链的氨基酸(如酪氨酸或色氨酸)取代具有侧链较小的氨基酸，可以形成knob。用侧链较小的氨基酸(如丙氨酸或苏氨酸)取代侧链较大的氨基酸，可形成孔。
在一些实施方案中，本公开抗原结合分子Fc区的CH3区其中之一包括T366W取代(本文中Fc、CH2和CH3区域中位置/取代的编号是根据Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》，第五版，公共卫生服务，国家卫生研究院，贝塞斯达，MD，1991中所述的EU编号系统进行的。)，以及Fc区的其他CH3区包括Y407V取代。在一些实施方案中，抗原结合分子Fc区的CH3区其中之一包括T366W取代，以及Fc区的其他CH3区包括T366S和L368A取代。在一些实施方案中，抗原结合分子Fc区的CH3区其中之一包括T366W取代，以及Fc区的其他CH3区包括Y407V、T366S和L368A。
在一些实施方案中，所述Fc区包括如WO 2014/131694 A1中所述的“DD-KK”修饰。在一些实施方案中，CH3区其中之一包括K392D和K409D取代，以及Fc区的其他CH3区包括E356K和D399K取代。所述修饰提高CH3区之间的静电相互作用。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括如Labrijn等人《Proc NatlAcadSci U S A.》(2013)110(13):5145-50中所述的修饰为“双体(Duobody)”形式的Fc区。在一些实施方案中，CH3区其中之一包括K409R取代，以及Fc区的其他CH3区包括K405L取代。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括含有如Strop等人《J Mol Biol.》(2012)420(3):204-19中所述“EEE-RRR”修饰的Fc区。在一些实施方案中，CH3区其中之一包括D221E、P228E和L368E取代，以及Fc区的其他CH3区包括D221R、P228R和K409R取代。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括含有如Choi等人《Mol Cancer Ther》(2013)12(12):2748–59所述“EW-RVT”修饰的Fc区。在一些实施方案中，CH3区其中之一包括K360E和K409W取代，以及Fc区的其他CH3区包括Q347R、D399V和F405T取代。
在一些实施方案中，CH3区其中之一包括S354C取代，以及Fc区的其他CH3区包括Y349C取代。引入这些半胱氨酸残基可以在Fc区的两个CH3区域之间形成二硫键，进一步稳定异源二聚体(Carter(2001),《免疫方法杂志》248,7-15)。
在一些实施方案中，所述Fc区包括“KiHS-S”取代。在一些实施方案中，CH3区其中之一包括T366W和S354C取代，以及Fc区的其他CH3区包括T366S、L368A、Y407V和Y349C取代。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括含有如Davis等人《Protein EngDes Sel》(2010)23(4):195–202所述“SEED”修饰的Fc区，其中人IgG1 CH3和IgACH3的β折叠片段发生交换。
在一些实施方案中，CH3区其中之一包括S364H和F405A取代，以及Fc区的其他CH3区包括Y349T和T394F取代(见如Moore等《MAbs》(2011)3(6):546–57)。
在一些实施方案中，CH3区其中之一包括T350V、L351Y、F405A和Y407V取代，以及Fc区的其他CH3区包括T350V、T366L、K392L和T394W取代(见如Von Kreudenstein等人《MAbs》(2013)5(5):646–54)。
在一些实施方案中，CH3区其中之一包括K360D、D399M和Y407A取代，以及Fc区的其他CH3区包括E345R、Q347R、T366V和K409V取代(见如Leaver-Fay等人《结构》(2016)24(4):641–51)。
在一些实施方案中，CH3区其中之一包括K370E和K409W，以及Fc区的其他CH3区包括E357N、D399V和F405T(见如Choi等人《PLoS One》(2015)10(12):e0145349)。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括不结合Fcγ受体的Fc区。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括不结合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中一个或多个的Fc区。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括不结合FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa中一个或多个的Fc区。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括不结合FcγRIIa和FcγRIIb中一个或两个的Fc区。
Fc区或包含Fc区的抗原结合分子与参考蛋白结合的能力可以根据本领域已知的方法进行分析，比如ELISA，免疫印迹、免疫沉淀、表面等离子体共振(SPR；见如Hearty等人《Methods Mol Biol》(2012)907:411-442)或生物膜干涉(BLI；见如Lad等人(2015)《JBiomol Screen》20(4):498-507)。
如本文所用，与参考蛋白“不结合”的Fc区可以显示为与参考蛋白基本不结合，如通过ELISA、免疫印迹(如蛋白免疫印迹)、免疫沉淀、SPR或BLI等确定。“基本不结合”可以是指相互作用水平不明显高于在特定检测中不相互结合的蛋白质所确定的相互作用水平。“基本不结合”可以是指在特定的检测中，相互作用水平≤5倍，如≤4倍、≤3倍、≤2.5倍、≤2倍或≤1.5倍于不相互结合的蛋白质所确定的相互作用水平。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括结合FcRn的Fc区。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括结合FcRn但不结合FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa中一个或多个的Fc区。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括结合FcRn但不结合FcγRIIa和FcγRIIb中一个或两个的Fc区。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括不诱导ADCC的Fc区。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括不诱导ADCP的Fc区。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括不诱导CDC的Fc区。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括不诱导ADCC、ADCP或CDC的Fc区。
如本文所用，不诱导(即不能诱导)ADCC/ADCP/CDC的Fc区/抗原结合分子基本上不引起ADCC/ADCP/CDC活性，根据相关活性的适当检测分析确定。“基本无ADCC/ADCP/CDC活性”是指在特定检测中，ADCC/ADCP/CDC水平不明显高于适当阴性对照分子测定的ADCC/ADCP/CDC水平(如缺少Fc区的抗原结合分子，或含有“沉默”Fc区(如Schlothauer等人《蛋白工程、设计和筛选》(2016),29(10):457–466中所述，将其全部内容并入本文作为参考)的抗原结合分子)。“基本无活性”可以是相关活性水平≤5倍，例如≤4倍、≤3倍、≤2.5倍、≤2倍或≤1.5倍于在特定检测中适当阴性对照分子测定的活性水平。
Fc区或包含Fc区的抗原结合分子诱导ADCC的能力可以根据Yamashita等人《科学报道》(2016)6:19772(将其全部内容并入本文作为参考)中所述方法，或通过如Jedema等人《血液》(2004)103:2677–82(将其全部内容并入本文作为参考)中所述51Cr释放试验进行分析。Fc区或包含Fc区的抗原结合分子诱导ADCP的能力可以根据Kamen等人《J Immunol》(2017)198(补充1)157.17(将其全部内容并入本文作为参考)中所述方法进行分析。Fc区或包含Fc区的抗原结合分子诱导CDC的能力可以使用如Schlothauer等人《蛋白工程、设计和筛选》(2016),29(10):457–466(将其全部内容并入本文作为参考)中所述C1q结合试验进行分析。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子含有的Fc区包括与SEQ ID NO:254具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合分子含有的Fc区包括与SEQ ID NO:257具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合分子含有的Fc区包括与SEQ ID NO:259具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合分子含有的Fc区包括与SEQID NO:260具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子含有的Fc区包括与SEQ ID NO:347具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子缺少Fc区。
Fc受体
Fc受体为与免疫球蛋白Fc区结合的多肽。Fc受体结构和功能在Masuda等人《炎症过敏药物靶点》(2009)8(1):80–86和Bruhns《血液》(2012)119:5640-5649中综述，将其全部内容并入本文作为参考。
Fc受体表达于造血细胞表面，包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和NK细胞。它们包括与IgG结合的Fcγ受体、IgE的高亲和力受体(FcεRI)、IgA受体以及IgA和IgM的聚合Ig受体。新生儿Fc受体(FcRn)是IgG的另一种Fc受体，参与IgG跨上皮屏障的转运(转胞吞作用)、防止IgG降解以及抗原递呈。
人有六种不同类型的Fcγ受体(括号内味小鼠同源物)：FcγRI(mFcγRI)、FcγRIIa(mFcγRIII)、FcγRIIb(mFcγRIIb)、FcγRIIc、FcγRIIIa(mFcγRIV)和FcγRIIIb
FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc和FcγRIIIa的细胞内结构域包括免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，与
Fc结合从而激活表达受体的细胞。FcγRIIb的细胞内结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，与
Fc结合可以负向调节细胞活化和脱颗粒、细胞增殖、内吞和吞噬作用。
在本说明书中，“Fcγ受体”可以来自任何组分，包括任何组分的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。与之相似，“FcγRI”、“FcγRIIa”、“FcγRIIb”、“FcγRIIc”、“FcγRIIIa”和“FcγRIIIb”分别指来自任何组分的FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb，以及包括来自任何组分的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
在一些实施方案中，所述Fcγ受体(如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)来自哺乳动物(如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人)和/或啮齿类动物(如大鼠或小鼠))。同种型、片段、变体或同源物可选地表征为与来自特定物种(如人)Fcγ受体(如FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb)的未成熟或成熟同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可选地为功能性同种型、片段、变体或同源物，如具有参考Fcγ受体的功能特性/活性，可通过适当的功能特性/活性检测分析去顶。例如，FcγRI的同种型、片段、变体或同源物可显示与人IgG1 Fc相结合。
在本说明书中，“FcRn受体”可以来自任何组分，包括来自任何组分的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
在一些实施方案中，所述FcRn受体来自哺乳动物(如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人)和/或啮齿类动物(如大鼠或小鼠))。同种型、片段、变体或同源物可选地表征为与来自特定物种(如人)FcRn受体的未成熟或成熟同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性。
同种型、片段、变体或同源物可选地为功能性同种型、片段、变体或同源物，如具有参考FcRn受体的功能特性/活性，可通过适当的功能特性/活性检测分析去顶。例如，FcRn的同种型、片段、变体或同源物可显示与人IgG1 Fc相结合。
多肽
本公开还提供了抗原结合分子的多肽组分。所述多肽可以以分离或基本纯化的形式提供。
本公开的抗原结合分子可以是或可以包括多肽复合物。
在本说明书中，当多肽包括多于一个结构域或区域，可以理解为同一条多肽链中优选存在多个结构域/区域。即，包括多于一个结构域或区域的多肽是包括多个结构域/区域的融合多肽。
在一些实施方案中，根据本公开的多肽包括或由本文所述的VH组成。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包括或由本文所述的VL组成。
在一些实施方案中，所述多肽还包括一个或多个抗体重链恒定区(CH)。在一些实施方案中，所述多肽还包括一个或多个抗体轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，所述多肽包括免疫球蛋白(Ig)的CH1、CH2区和/或CH3区。
在一些实施方案中，所述多肽包括一个或多个免疫球蛋白重链恒定序列区域。在一些实施方案中，所述多肽包括本文所述的CH1区域。在某些实施方案中，多肽包括本文所述的CH1-CH2铰链区。在一些实施方案中，所述多肽包括本文所述的CH2区域。在某些实施方案中，多肽包括本文所述的CH3区域。
在一些实施方案中，包括CH2和/或CH3区的多肽包括以下任一个氨基酸取代/氨基酸取代组合：F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；S239D/I332E；S239D/I332E/A330L；S298A/E333A/K334A；L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A；D270E/K326D/A330M/K334E；G236A/S239D/I332E；K326W/E333S；S267E/H268F/S324T；E345R/E430G/S440Y；M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；S267E/L328F；N325S/L328F；N297A；N297Q；N297G；L235E；L234A/L235A；F234A/L235A；P329A；P329G；L234A/L235A/P329G；H268Q/V309L/A330S/P331S；和V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S。
在一些实施方案中，包括CH3区的多肽包括以下任一个氨基酸取代/氨基酸取代组合(如《Front.Immnol》(2016)7:394中表1所示，将其全部内容并入本文作为参考)：T366W；T366S、L368A和Y407V；T366W和S354C；T366S、L368A、Y407V和Y349C；S364H和F405A；Y349T和T394F；T350V、L351Y、F405A和Y407V；T350V、T366L、K392L和T394W；K360D、D399M和Y407A；E345R、Q347R、T366V和K409V；K409D和K392D；D399K和E356K；K360E和K409W；Q347R、D399V和F405T；K360E、K409W和Y349C；Q347R、D399V、F405T和S354C；K370E和K409W以及E357N、D399V和F405T。
在一些实施方案中，多肽的CH2和/或CH3区包括一个或多个氨基酸取代，用于促进多肽与另一个包含CH2和/或CH3区域的多肽的结合。
在一些实施方案中，所述多肽包括免疫球蛋白轻链恒定序列中的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述多肽包括本文所述CL区。
在一些实施方案，所述多肽缺少免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述多肽缺少CH2区域。在一些实施方案中，所述多肽缺少CH3区域。在一些实施方案中，所述多肽缺少CH2区域，也缺少CH3区域。
在一些实施方案中，根据本公开的多肽从N端到C端包括以下结构之一：
(i)VH
(ii)VL
(iii)VH-CH1
(iv)VL-CL
(v)VL-CH1
(vi)VH-CL
(vii)VH-CH1-CH2-CH3
(viii)VL-CL-CH2-CH3
(ix)VL-CH1-CH2-CH3
(x)VH-CL-CH2-CH3
本公开还提供了由本公开多肽组成的抗原结合分子。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括以下多肽组合之一：
(A)VH+VL
(B)VH-CH1+VL-CL
(C)VL-CH1+VH-CL
(D)VH-CH1-CH2-CH3+VL-CL
(E)VH-CL-CH2-CH3+VL-CH1
(F)VL-CH1-CH2-CH3+VH-CL
(G)VL-CL-CH2-CH3+VH-CH1
(H)VH-CH1-CH2-CH3+VL-CL-CH2-CH3
(I)VH-CL-CH2-CH3+VL-CH1-CH2-CH3
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括以上(A)至(I)所示多于一个多肽的组合。举例来说，参考上述(D)，在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括两个由VH-CH1-CH2-CH3结构组成的多肽和两个由VL-CL结构组成的多肽。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包括以下多肽组合之一：
(J)VH(抗-VISTA)+VL(抗-VISTA)
(K)VH(抗-VISTA)-CH1+VL(抗-VISTA)-CL
(L)VL(抗-VISTA)-CH1+VH(抗-VISTA)-CL
(M)VH(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CL
(N)VH(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CH1
(O)VL(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3+VH(抗-VISTA)-CL
(P)VL(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3+VH(抗-VISTA)-CH1
(Q)VH(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3
(R)VH(抗-VISTA)-CL-CH2-CH3+VL(抗-VISTA)-CH1-CH2-CH3
其中：“VH(抗-VISTA)”是指抗原结合分子的VH能够与本文所述VISTA结合，如(1)至(76)中任一所定义；“VL(抗-VISTA)”是指抗原结合分子的VL能够与本文所述VISTA结合，如(77)至(173)中任一所定义。
在一些实施方案中，所述多肽包括或由与SEQ ID NO:212至243、248至250、258、266或311至321中任一氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
接头和附加序列
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子和多肽包括铰链区。在一些实施方案中，CH1区和CH2区之间有铰链区。在一些实施方案中，CL区和CH2区之间有铰链区。在一些实施方案中，所述铰链区包括或由与SEQ ID NO:207所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子和多肽包括氨基酸序列之间的一个或多个连接序列。可以在抗原结合分子/多肽的一个或多个VH、VL、CH1-CH2铰链区、CH2区和CH3区的一端或两端提供连接序列。
连接序列为技术人员所知，例如Chen等人《Adv Drug Deliv Rev》(2013)65(10):1357-1369所述，将其全部内容并入本文作为参考。在一些实施方案中，连接序列可以是柔性连接序列。柔性连接序列允许被连接序列连接的氨基酸序列相对移动。柔性接头为技术人员所知，在Chen等人《Adv Drug Deliv Rev》(2013)65(10):1357-1369中确认了几种。柔性连接序列通常包括高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。
在一些实施方案中，所述连接序列包括至少一个甘氨酸和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方案中，所述连接序列有甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，所述连接序列的长度为1-2、1-3、1-4、1-5或1-10个氨基酸。
本公开的抗原结合分子和多肽还可以包括更多氨基酸或氨基酸序列。例如，所述抗原结合分子和多肽可以包括氨基酸序列，以促进抗原结合分子/多肽的表达、折叠、运输、加工、纯化或检测。例如，抗原结合分子/多肽可以包括编码His(如6XHis)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素标签的序列，可选择位于抗原结合分子/多肽的N端或C端。在一些实施方案中，所述抗原结合分子/多肽包括可检测的部分，如荧光、发光、免疫检测、放射性、化学、核酸或酶标记。
本公开的抗原结合分子和多肽还可以包括信号肽(也被称为引导序列或信号序列)。信号肽通常由5-30个疏水氨基酸序列组成，这些氨基酸形成单个α螺旋。分泌蛋白和在细胞表面表达的蛋白通常由信号肽组成。
所述信号肽可以位于抗原结合分子/多肽的N端，并可以存在于新合成的抗原结合分子/多肽。信号肽有助于抗原结合分子/多肽的有效运输和分泌。信号肽通常通过裂解去除，因此不包含在表达抗原结合分子/多肽的细胞分泌的成熟抗原结合分子/多肽中。
许多蛋白的信号肽都是已知的，并记录在GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源(ProteinInformation Resource)、蛋白质数据库(Protein Data Bank)、Ensembl和InterPro等数据库中，和/或可以通过SignalP(Petersen等，2011《自然方法》8:785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl，2008《生物信息学》24:2172-2176)等氨基酸序列分析工具进行识别/预测。
标记和偶联物
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子还包括可检测部分。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括可检测部分，如荧光标记、磷光标记、发光标记、免疫检测标记(例如表位标签)、放射性标记、化学标记、核酸标记或酶标记。所述抗原结合分子可以与可检测分子共价或非共价标记。
荧光标记包括如荧光素、罗丹明、别藻蓝素、曙红和NDB，稀土(如铕(Eu)、铽(Tb)和钐(Sm))的绿色荧光蛋白(GFP)螯合物，四甲基罗丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3和Cy5。放射性标记包括放射性同位素，如碘123、碘125、碘131、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞207、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、铜67、氟18、钇90、钯100、铋217、锑211。发光标记包括放射发光、化学发光(如吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)和生物发光标签。可检测的免疫标签包括半抗原、肽/多肽、抗体、受体和配体，如生物素、亲和素、链霉亲和素或地高辛。核酸标签包括适配体。酶标签包括过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶等。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与化学部分偶联。所述化学部分可以是提供治疗效力的部分。抗体-药物偶联物在如Parslow等人《生物医药》2016Sep；4(3):14中综述。在一些实施方案中，所述化学部分可以是药物部分(如细胞毒性制剂)。在一些实施方案中，所述药物部分可以是化疗制剂。在一些实施方案中，所述药物部分可以选自刺孢霉素、DM1、DM4、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、SN-38、阿奇霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、D6.5和PBD。
抗原结合分子的具体示例性实施方案
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:212所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:213所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:214所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:215所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:216所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:217所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:218所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:219所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:220所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:221所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:222所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:223所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:224所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:225所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:226所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:227所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:228所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:229所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:230所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:231所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:232所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:233所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:234所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:235所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:236所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:237所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:238所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:239所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:240所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:241所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:242所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:243所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:248所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:250所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:249所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:250所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:258所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:250所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:266所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:250所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包括或由以下组成：
(i)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:330所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成；和
(ii)两条多肽，其包括或由与SEQ ID NO:213所示氨基酸序列具有至少70％，优选地为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。
抗原结合分子的功能特性
本文所述抗原结合分子可以通过特定的功能特性进行表征。在一些实施方案中，本文所述抗原结合分子可以具有以下一种或多种特性：
与VISTA结合(如人、鼠和/或食蟹猴VISTA)；
不与PD-L1和/或HER3结合；
不与Fcγ受体结合；
不与C1q结合；
不诱导ADCC；
不诱导ADCP；
不诱导CDC；
与FcRn受体结合；
与VISTA结合，在pH 5.5至pH 7.5有相似的亲和力；
与表达VISTA的细胞结合；
抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用(如LRIG1、PSGL-1、VSIG3或VSIG8)；
抑制VISTA介导信号；
抑制VISTA介导信号，不依赖于Fc介导功能；
提高表达VISTA的细胞的杀伤；
不诱导/提高表达VISTA的细胞的杀伤；
减少表达VISTA的细胞的数量/比例；
不减少表达VISTA的细胞的数量/比例；
提高效应免疫细胞的数量/活性；
减少抑制性免疫细胞的数量/活性；
减少抑制性免疫细胞的增殖；
降低表达VISTA的细胞介导的免疫抑制；
提高抗原呈递细胞的抗原呈递；
增加免疫细胞的IL-6的产生；
在混合淋巴细胞反应(MLR)实验中，增加IFN-γ、IL-2和/或IL-17的产生；
提高T细胞的增殖、IFN-γ的产生、TNFa的产生和/或T细胞介导的肿瘤细胞裂解；
在体内抑制癌症的发展和/或进展；
在体内不诱导细胞因子释放综合征；
提高抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
提高CD8+T细胞活性；
上调一个或多个细胞毒性相关标志物(如颗粒酶B、CX3CR1、ICOS、CD27)；
上调一个或多个与促炎巨噬细胞激活相关的基因；
上调一个或多个与T细胞细胞毒性活性相关的基因；
增加颗粒酶B的生产；
减少T细胞耗竭水平；
减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
减少肿瘤相关巨噬细胞的活性；
增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；
增加M1型巨噬细胞的活性。
如本文所用，术语细胞类型/亚型的“比例”可以是一个细胞群中该细胞类型/亚型的比例，如CD45+细胞，如获取自肿瘤的CD45+细胞。
可以理解的是，特定的抗原结合分子可能显示出不止一种前段所述的特性。可以使用合适的检测方法对特定的抗原结合分子进行前段所述特性的评估。这些检测方法可以是体外检测，可以是无细胞或基于细胞的检测。或者，也可以是体内检测，即在非人类动物体内进行的试验。
当检测是基于细胞的检测，其可以包括将细胞与特定的抗原结合分子接触，从而确定该抗原结合分子是否显示一种或多种所列举的特性。检测可采用标记有可检测实体的组分，以便于检测。检测可以包括用一定数量/浓度的抗原结合分子(如稀释系列)分别处理细胞后，评估所列举的特性。应理解，细胞优选地是表达VISTA的细胞，如MDSCs。
对此类检测结果的分析可以包括确定达到相关活性最大值50％的浓度。抗原结合分子达到相关活性最大值50％的浓度可以称为抗原结合分子与相关活性有关的“半数效应浓度”，也可称为“EC50”。举例来说，特定抗原结合分子与VISTA结合的EC50可以是达到与相关物种结合的最大水平的50％时的浓度。
根据特性，EC50也可称为“半数最大抑制浓度”或“IC50”，其是抗原结合分子的浓度，在此浓度下可观察到特定性质最大抑制水平的50％。举例来说，特定抗原结合分子抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣(如LRIG1、PSGL-1、VSIG3或VSIG8)之间相互作用的IC50可以是达到最大抑制水平50％的浓度。
本文所述抗原结合分子与VISTA结合。在优选的实施方案中，所述抗原结合分子显示与VISTA特异性结合。如本文所用，“特异性结合”是指抗原选择性的结合，可以与非靶标抗原的非特异性结合区分。特异性结合VISTA的抗原结合分子，优选地比其他非靶标分子与VISTA结合的亲和力更强和/或持续时间更长。
特定多肽与特定分子的特异性结合能力可以根据本领域已知的方法进行测定，比如ELISA，表面等离子体共振(SPR；见如Hearty等人《Methods Mol Biol》(2012)907:411-442)或生物膜干涉(BLI；见如Lad等(2015)《J Biomol Screen》20(4):498-507)、流式细胞术，或通过放射性标记抗原结合检测(RIA)、酶联免疫吸附检测。通过这种分析，可以测量和量化与特定分子的结合。在一些实施方案中，结合可以是在特定试验中检测到的反应。
在一些实施方案中，抗原结合分子与非靶标分子的结合程度小于抗体与靶标分子结合程度的约10％，如通过ELISA、SPR、生物膜干涉或RIA测定。或者，结合特异性可以用结合亲和力来反映，即抗原结合分子的结合解离常数(KD)至少比抗原结合分子对非靶标分子的KD大0.1个数量级(即0.1x 10n，其中n是代表数量级的整数)。可以选择至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0之一。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与VISTA结合的亲和力在微摩尔范围内，即KD＝9.9x 10-4至1x 10-6M。在一些实施方案中，抗原结合分子与VISTA结合的亲和力在亚微摩尔范围内，即KD<1x 10-6M。在一些实施方案中，抗原结合分子与VISTA结合的亲和力在纳摩尔范围内，即KD＝9.9x 10-7至1x 10-9M。在一些实施方案中，抗原结合分子与VISTA结合的亲和力在亚纳摩尔范围内，即KD<1x 10-9M。在一些实施方案中，抗原结合分子与VISTA结合的亲和力在皮摩尔范围内，即KD＝9.9x 10-10至1x 10-12M。在一些实施方案中，抗原结合分子与VISTA结合的亲和力在亚皮摩尔范围内，即KD<1x 10-12M。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与VISTA结合的KD为10μM或更小，优选地为≤5μM、≤2μM、≤1μM、≤500nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤200pM、≤100pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤10pM或≤1pM中任一。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与VISTA结合的KD(如通过SPR(Biocore)测定，如本公开所述实施例中的SPR分析)≤1nM(如≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM、≤400pM、≤300pM中任一)。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与VISTA结合的KD(如通过SPR(Biocore)测定，如本公开所述实施例中的SPR分析)≤1nM(如≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM中任一)。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与食蟹猴VISTA结合的KD(如通过SPR(Biocore)测定，如本公开所述实施例中的SPR分析)≤1nM(如≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM、≤400pM中任一)。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与大鼠VISTA结合的KD(如通过SPR(Biocore)测定，如本公开所述实施例中的SPR分析)≤1nM(如≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM、≤400pM中任一)。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与小鼠VISTA结合的KD(如通过SPR(Biocore)测定，如本公开所述实施例中的SPR分析)≤1nM(如≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM中任一)。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与VISTA结合的EC50(如通过ELISA测定，如本公开所述实施例中的ELISA)为1μM或更小，如≤500nM、≤100nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤10nM、≤5nM、≤4nM≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤200pM、≤100pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM、≤5pM或≤1pM中任一。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子显示结合人VISTA，鼠类(如小鼠)VISTA、大鼠VISTA，和/或食蟹猴(Macaca fascicularis)VISTA。在一些实施方案中，所述抗原结合分子结合人VISTA和小鼠VISTA和大鼠VISTA和食蟹猴VISTA。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与人VISTA、小鼠VISTA、大鼠VISTA和食蟹猴VISTA具有交叉反应性。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与非人灵长类动物的VISTA具有交叉反应性。在模式物种中与VISTA的交叉反应允许在体内探索合成模型的疗效，而无需依赖代用分子。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与人VISTA结合的EC50(如通过ELISA测定，如本公开所述实施例中的ELISA)≤20pM(如≤15pM、≤12.5pM、≤10pM、≤7.5pM中任一)。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与大鼠VISTA结合的EC50(如通过ELISA测定，如本公开所述实施例中的ELISA)≤20pM(如≤15pM、≤12.5pM、≤10pM、≤7.5pM中任一)。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与小鼠VISTA结合的EC50(如通过ELISA测定，如本公开所述实施例中的ELISA)≤20pM(如≤15pM、≤12.5pM、≤10pM、≤7.5pM、≤5pM中任一)。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子与VISTA(如人VISTA)结合，在pH5.5至pH 7.5有相似的亲和力。例如，在一些实施方案中，所述抗原结合分子在pH 5.5的VISTA亲和力与在pH 7.5的VISTA亲和力相似。
在此，与参考结合亲和力“相似”的结合亲和力是指在可比条件下测定的结合亲和力在参考结合亲和力的50％以内，如40％、45％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％之一以内。
结合VISTA(如人VISTA)的KD在pH 5.5至pH 7.5可能相似。结合VISTA(如人VISTA)的EC50在pH 5.5至pH 7.5可能相似。
在此，与参考值“相似”的KD或EC50可以是≥0.5倍且≤2倍，如≥0.7倍且≤1.5倍，≥0.75倍且≤1.25倍，≥0.8倍且≤1.2倍，≥0.85倍且≤1.15倍，≥0.9倍且≤1.1倍，≥0.91倍且≤1.09倍，≥0.92倍且≤1.08倍，≥0.93倍和≤1.07倍，≥0.94倍和≤1.06倍，≥0.95倍和≤1.05倍，≥0.96倍和≤1.04倍，≥0.97倍和≤1.03倍，≥0.98倍和≤1.02倍，或≥0.99倍和≤1.01倍中任一于参考值。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不显示与PD-L1(如人PD-L1)的特异性结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不显示与HER3(如人HER3)的特异性结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不显示与B7蛋白家族另一成员(如人HER3)的特异性结合(即不与其进行交叉反应)。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不显示与PD-L1、PD-L2CD80、CD86、ICOSLG、CD276、VTCN1、NCR3LG1、HHLA2和/或CTLA4的特异性结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不显示与PD-1、PD-L1、B7H3、VTCN1(B7H4)、NCR3LG1(B7H6)、HHLA2(B7H7)和/或CTLA4的特异性结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子无法诱导一个或多个Fc介导的功能(即缺少激发相关Fc介导功能的能力)。这种抗原结合分子可以被描述为不具备相关功能。
如上文所述，无法诱导(即不能诱导)ADCC/ADCP/CDC的Fc区/抗原结合分子基本不引起ADCC/ADCP/CDC活性，例如，通过相关活性的适当检测分析确定。与之相同，“不结合”参考蛋白(如特定的Fc受体或补体蛋白)的抗原结合分子，在适当的检测中也可能表现出基本不与参照蛋白结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不诱导ADCC。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不诱导ADCP。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不诱导CDC。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不诱导ADCC和/或不诱导ADCP和/或不诱导CDC。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合Fc受体。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合Fcγ受体。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合FcγRIII(如FcγRIIIa和/或FcγRIIIb)。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合FcγRIIIa。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合FcγRIIa。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合FcγRIIb。在一些实施方案中，所述抗原结合分子结合FcRn。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合补体蛋白。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合C1q。在一些实施方案中，所述抗原结合分子N297对应的氨基酸残基未被糖基化。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与人VISTA、鼠VISTA和/或食蟹猴VISTA结合；且不结合PD-L1、PD-1、B7H3、VTCN1(B7H4)、NCR3LG1(B7H6)、HHLA2(B7H7)和/或CTLA4(如人PD-L1/PD-1/B7H3/VTCN1/NCR3LG1/HHLA2/CTLA4)。
在一些实施方案中，本文所述抗原结合分子与VISTA(如人VISTA、小鼠VISTA)结合的KD为10μM或更小，优选地为≤5μM、≤2μM、≤1μM、≤500nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM≤3nM、≤2nM、≤1nM或≤500pM中任一。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与VISTA(如人VISTA、小鼠VISTA)结合的KD＝≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM或≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM或≤1nM。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与VISTA(如人VISTA、小鼠VISTA)结合的KD＝≤500pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM或≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤10pM、≤9pM、≤8pM、≤7pM或≤6pM、≤5pM、≤4pM、≤3pM、≤2pM或≤1pM。
本公开的抗原结合分子可以与VISTA的特定目的区域结合。根据本领域的抗原结合分子的抗原结合区可以与VISTA的线性表位结合，该表位由连续的氨基酸序列(即氨基酸一级序列)组成。在一些实施方案中，所述抗原结合区分子可一与VISTA的构象表位结合，该表位由氨基酸序列的不连续氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够在VISTA细胞外区域与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与VISTA的Ig样V型结构域(如SEQ ID NO:6所示区域)结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与VISTA中如SEQ ID NO:31所示区域结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ IDNO:31所示氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:322所示氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:26所示氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:27所示氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:28所示氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:29所示氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:30所示氨基酸序列组成的肽或多肽。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与IGN175A(如中所述WO 2014/197849A2)结合的VISTA区域结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与由SEQ ID NO:267序列组成的多肽和由SEQ ID NO:268序列组成的多肽构成的抗原结合分子结合的VISTA区域结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与IGN175A(如中所述WO 2014/197849A2)竞争结合VISTA。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与由SEQ ID NO:267序列组成的多肽和由SEQ ID NO:268序列组成的多肽构成的抗原结合分子竞争结合VISTA。
特定抗原结合分子与IGN175A或由SEQ ID NO:267序列组成的多肽和由SEQ IDNO:268序列组成的多肽构成的抗原结合分子竞争结合VISTA的能力可以通过如竞争ELISA或表位分选(如Abdiche等人《J Immunol Methods》(2012)382(--2):101-116所述，将其全部内容并入本文作为参考)进行分析。表位分选可以通过BLI分析等方法进行，如本实施例8中所述。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子不能与由SEQ ID NO:275所示氨基酸序列组成的肽结合。
如本文所用，“肽”是指由两个或多个氨基酸单体通过肽键连接而成的链。肽的长度通常在2至50个氨基酸之间。“多肽”是由两个或多个肽组成的聚合链。多肽的长度通常大于约50个氨基酸。
抗原结合分子与特定肽/多肽结合的能力可通过技术人员熟知的方法进行分析，包括通过ELISA、免疫印迹(如Western印迹)、免疫沉淀、表面等离子体共振和生物膜干涉进行分析。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够将VISTA的相同区域或VISTA的重叠区域与包含4M2-C12、4M2-B4、4M2-C9、4M2-D9、4M2-D5、4M2-A8、V4H1、V4H2、V4-C1、V4-C9、V4-C24、V4-C26、V4-C27、V4-C28、V4-C30、V4-C31、2M1-B12、2M1-D2、1M2-D2、13D5p、13D5-1、13D5-13、5M1-A11或9M2-C12克隆中任一的VH和VL序列的抗体结合的VISTA的区域结合。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与VISTA的区域结合，该区域与VISTA结合IGN175A(如WO 2014/197849 A2中所述)的区域不同。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与VISTA的区域结合，该区域与VISTA结合包含由SEQ ID NO:267所示序列组成的多肽和由SEQ ID NO:268所示序列组成的多肽的抗原结合分子的区域不同。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与VISTA的区域结合，该区域与VISTA结合IGN175A(如WO 2014/197849 A2中所述)的区域不重叠。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与VISTA的区域结合，该区域与VISTA结合包含由SEQ ID NO:267所示序列组成的多肽和由SEQ ID NO:268所示序列组成的多肽的抗原结合分子的区域不重叠。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与VISTA的残基接触与VISTA结合，该残基与VSTB112(如WO 2015/097536 A2中所述)接触的VISTA残基不相同。在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过与VISTA的残基接触与VISTA结合，该残基与包含由SEQ ID NO:269所示序列组成的多肽和由SEQ ID NO:270所示序列组成的多肽的抗原结合分子接触的VISTA残基不相同。
在一些实施方案中，抗原结合分子的表位与VSTB112的表位不同。在一些实施方案中，抗原结合分子的表位与包含由SEQ ID NO:269所示序列组成的多肽和由SEQ ID NO:270所示序列组成的多肽的抗原结合分子的表位不同。
抗体与肽/多肽结合的区域可由技术人员使用本领域已知的各种方法确定，包括抗体-抗原复合物的X射线共晶体学分析、肽扫描、诱变图谱、质谱氢氘交换分析、噬菌体展示、竞争ELISA和基于蛋白水解的“保护”方法。这些方法在如Gershoni等人《BioDrugs》2007,21(3):145-156中有描述，将其全部内容并入本文作为参考。
在一些实施方案中，当VISTA在细胞表面(即细胞膜内或细胞膜上)表达时，本公开的抗原结合分子在抗原结合分子(即细胞外抗原结合分子)可进入的区域与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够与细胞表面表达的VISTA结合，该细胞为表达VISTA的细胞。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够结合表达VISTA的细胞(如CD14+单核细胞(比如单核细胞衍生抑制性细胞(MDSC))和/或CD33+髓系细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和中性粒细胞)。
分析抗原结合分子与特定细胞类型结合的能力时，可以将抗原结合分子与细胞接触，然后检测与细胞结合的抗原结合分子，例如在经过洗涤步骤去除未结合的抗原结合分子之后。抗原结合分子与免疫细胞表面分子表达细胞和/或癌细胞抗原表达细胞结合的能力可以通过流式细胞术和免疫荧光显微镜等方法进行分析。
本公开的抗原结合分子可以是VISTA的拮抗剂。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够抑制由VISTA和/或VISTA相互作用伴侣(如LRIG1、VSIG3、PSGL-1、VSIG8)介导的功能或过程(如相互作用、信号传导或其他功能)。在此，“抑制”是指相对于对照条件的减少、降低或减弱。抑制特定相互作用/活性/过程的抗原结合分子可以称为该相互作用/活性/过程的抑制剂或拮抗剂，也可以说是“阻断”或“中和”了该相互作用/活性/过程。
本文所述的结合VISTA的抗原结合分子能够通过无需Fc介导的功能(如ADCC、ADCP和CDC)的机制来抑制VISTA介导的功能/过程。这是指，本文所述的结合VISTA的抗原结合分子能够抑制VISTA表达细胞的免疫抑制活性，而无需诱导ADCC、ADCP和/或CDC。
特别地，本文所述的结合VISTA的抗原结合分子能够通过无需结合Fcγ受体和/或结合C1q的机制来抑制VISTA。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣(如LRIG1、VSIG3、PSGL-1、VSIG8)之间的相互作用。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够抑制VISTA与结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣之间的相互作用。
在一些实施方案中，结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣结合至SEQ IDNO:344所示的VISTA区域。在一些实施方案中，结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣结合至包括或由SEQ ID NO:344所示氨基酸序列构成的多肽。在一些实施方案中，结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣与SEQ ID NO:344所示的VISTA区域接触。在一些实施方案中，结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣通过接触SEQ ID NO:344所示区域中一个或多个氨基酸与VISTA结合。
在一些实施方案中，结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣选自：LRIG1和VSIG3。在一些实施方案中，VISTA相互作用伴侣为LRIG1。在一些实施方案中，VISTA相互作用伴侣为VSIG3。
在一些实施方案，本公开的抗原结合分子能够抑制VISTA与LRIG1之间的相互作用。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够抑制VISTA与PSGL-1之间的相互作用。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够抑制VISTA与VSIG3之间的相互作用。
抗原结合分子抑制两个因子间相互作用的能力可以通过分析抗体/片段存在时的相互作用，或一个或两个相互作用伴侣与抗体/片段孵育后的相互作用来确定。确定特定抗原结合分子是否能抑制两个相互作用伴侣之间相互作用的检测方法包括竞争ELISA和SPR分析。
抗原结合分子能够抑制特定的相互作用(例如VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用)，可以通过与在抗原结合分子不存在(或在适当的对照抗原结合分子存在)的相互作用水平相比，观察相互作用伴侣在抗原结合分子存在下，或在一个或两个相互作用伴侣与抗原结合分子孵育后，相互作用水平的降低/减少来确定。适当的分析可以在体外进行，例如使用重组相互作用伴侣或使用表达相互作用伴侣的细胞。表达相互作用伴侣的细胞可以是内源性表达，也可以是通过导入细胞的核酸表达。为进行此类检测，可对相互作用伴侣和/或抗原结合分子中的一种或两种进行标记，或与可检测实体结合使用，以检测和/或测量相互作用的水平。
抗原结合分子抑制两个结合伴侣之间相互作用的能力也可以通过分析这种相互作用的下游功能结果来确定。例如，VISTA与VISTA的相互作用伴侣之间相互作用的下游功能结果可能包括VISTA介导的信号传导。例如，抗原结合分子抑制VISTA与VISTA的相互作用伙伴的相互作用的能力可以通过分析MLR试验中IL-2、IFN-γ和/或IL-17的产生来确定。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将VISTA和VISTA相互作用伴侣之间的相互作用抑制至小于在不存在抗原结合分子(或在适当的对照抗原结合分子存在下)的情况下VISTA和VISTA结合伴侣之间相互作用水平的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案，VISTA介导的信号传导可以是包括VISTA的多肽复合物介导的信号传导。在一些实施方案中，VISTA介导的信号传导可以是包括VISTA和VISTA相互作用伴侣(如LRIG1、VSIG3、PSGL-1、VSIG8)的多肽复合物介导的信号传导。在一些实施方案中，VISTA介导的信号传导可以是包括VISTA和结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)的多肽复合物介导的信号传导。在一些实施方案，VISTA介导的信号传导可以是包括VISTA和LRIG1的多肽复合物介导的信号传导。在一些实施方案中，VISTA介导的信号传导可以是包括VISTA和VSIG3的多肽复合物介导的信号传导。
VISTA介导的信号传导可以通过效应免疫细胞数量/活性检测等方法进行分析，如本文示例性实施例中所述的MLR检测。抑制VISTA介导的信号传导可以通过检测效应免疫细胞数量和/或活性的增加来确定，例如通过IL-2、IFN-γ和/或IL-17产生的增加来确定。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需或不涉及Fc介导功能的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够不依赖于Fc介导功能抑制VISTA介导的信号传导。这是指，在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够以不依赖于Fc区的方式抑制VISTA介导的信号传导。
抗原结合分子通过无需/不涉及Fc介导功能的机制抑制VISTA介导的信号传导的能力可以通过，如分析以缺乏功能性Fc区的形式提供的抗原结合分子抑制VISTA介导的信号传导的能力进行评估。例如，可以使用包含“沉默”Fc区(如包含LALAPG取代)的抗原结合分子，或使用以缺乏Fc区的形式提供的抗原结合分子(如scFv、Fab等)，来研究对VISTA介导的信号传导的影响。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过不涉及ADCC的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过不涉及ADCP的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过不涉及CDC的机制抑制VISTA介导的信号传导。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与Fc受体结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与Fcγ受体结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中一个或多个结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与FcγRIIIa结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与FcγRIIa结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与FcγRIIb结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与补体蛋白结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需将抗原结合分子与C1q结合的机制抑制VISTA介导的信号传导。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过无需N297糖基化的机制抑制VISTA介导的信号传导。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够增加对VISTA表达细胞的杀伤力。通过抗原结合分子的效应功能可以增加对VISTA表达细胞的杀伤。在包括Fc区的抗原结合分子的实施方案中，抗原结合分子可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)中的一种或多种增加对VISTA表达细胞的杀伤。
能够增加对VISTA表达细胞的杀伤力的抗原结合分子，可以通过在适当的试验中，与在没有抗原结合分子(或有适当的对照抗原结合分子)的情况下检测到的细胞杀伤力相比，在有抗原结合分子存在的情况下，或在VISTA表达细胞与抗原结合分子孵育后，观察到对VISTA表达细胞的杀伤力增加来确定。CDC、ADCC和ADCP的检测方法是技术人员所熟知的。VISTA表达细胞的杀伤水平也可以通过测量暴露于不同处理条件后存活和/或未存活的VISTA表达细胞的数量/比例来确定。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将VISTA表达细胞(如VISTA表达MDSC)的杀伤水平增加至1倍以上，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍于在不存在抗原结合分子(或有适当的对照抗原结合分子)的情况下观察到的杀伤水平。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将VISTA表达细胞(如VISTA表达MDSC)的数量减少至1倍以下，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍于在可比实验中，在不存在抗原结合分子的情况下孵育后(或在有适当的对照抗原结合分子的情况下孵育后)检测到的VISTA表达细胞(如VISTA表达MDSC、TAM、中性粒细胞)数量。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子为非耗竭性抗原结合分子。这是指，在一些实施方案中，所述抗原结合分子不会造成VISTA表达细胞的大量耗竭。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不会引起/增加针对VISTA表达细胞的ADCC、ADCP和/或CDC。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子不会诱导/增加VISTA表达细胞的杀伤，如在抗原结合分子缺少Fc区的实施方案中，或在抗原结合分子包含无法诱导Fc介导抗体效应功能的Fc区的实施方案中。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子无法减少VISTA表达细胞的数量/比例。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子(i)抑制VISTA介导的信号传导，并(ii)无法诱导/增加VISTA表达细胞的杀伤。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子(i)抑制VISTA介导的信号传导，并(ii)不减少VISTA表达细胞的数量/比例。
这可能特别有利，因为VISTA是由不应耗竭的细胞表达的。例如，VISTA在免疫细胞(如某些类型的T细胞和树突状细胞)中的表达量较低，因此不宜杀死或减少其数量/比例。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加效应免疫细胞的数量和/或活性，如在适当的体外或体内实验中。通过解释，本公开的抗原结合分子可能能够使效应免疫细胞不受MDSC介导的对效应免疫细胞增殖和功能的抑制。在一些实施方案中，所述药性免疫细胞可以是如CD8+T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+CTL)、CD4+T细胞、CD4+T辅助细胞、NK细胞、IFNγ生成细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、抗原经历T细胞或CD45RO+T细胞。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将效应免疫细胞的数量增加至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的数量的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。在一些实施方案，本公开的抗原结合分子能够将效应免疫细胞活性的相关因子的水平提高到大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
细胞数量和比例可以通过流式细胞分析等方法确定，使用的抗体可检测细胞类型。细胞分裂可以通过体外分析3H-胸苷掺入或CFSE稀释试验等方法进行分析，如Fulcher和Wong《Immunol Cell Biol》(1999)77(6)：559-564中所述，将其全部内容并入本文作为参考。效应免疫细胞活性可以通过测量这种活性的相关因子来分析。在一些实施方案中，效应免疫细胞活性可以通过分析IL-2、IFN-γ和/或IL-17的产生来确定。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够增加VISTA表达细胞介导的免疫抑制水平。免疫抑制水平的变化可以通过测量精氨酸酶1的表达和/或VISTA表达细胞产生的活性氧分子(ROS)的方法来确定，如在Ochoa等人《Ann Surg.》2001，3月；233(3):393–399中和Dikalov和Harrison《Antioxid Redox Signal.》2014，1月10；20(2):372–382中所述。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够增加抗原呈递细胞的抗原呈递，如通过抗原提呈适当的检测方法确定。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够增加吞噬细胞(如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或树突状细胞)的吞噬作用，如使用合适的吞噬作用水平检测方法确定。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加抗原呈递细胞(如CD11b+MHCII+细胞)的数量和/或活性，如在适当的体外或体内(如在肿瘤中)实验中。在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加巨噬细胞(如CD11b+F4/80+细胞)的数量和/或活性，如在适当的体外或体内(如在肿瘤中)实验中。在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，所述抗原结合分子能够增加树突状细胞(如CD11c+细胞)的数量和/或活性，如在适当的体外或体内(如在肿瘤中)实验中。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将上段所述细胞类型的数量提高到大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的数量的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将上段所述细胞类型活性相关物质水平提高到大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够增加免疫细胞产生IL-6。所述免疫细胞可以是如PBMC，淋巴细胞、T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞。在一些实施方案，所述免疫细胞为单核细胞。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够在受到如LPS等刺激后增加免疫细胞产生IL-6。抗原结合分子增加免疫细胞产生IL-6的能力可以在体外实验中分析，如本文实施例10所述。这种方法可以包括用LPS刺激单核细胞(如THP1细胞)，并用抗原结合分子孵育受刺激的细胞。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将免疫细胞产生IL-6提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够提高Th1/Th17细胞的数量和/或活性。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够上调Th1/Th17的反应。在一些实施方案中，所述抗原结合分子有利于Th1/Th17反应而非Th2反应。在一些实施方案中，在混合淋巴细胞反应(MLR)实验中，本公开的抗原结合分子能够提高T细胞的增殖、IL-2的产生、IFN-γ的产生、TNFα的产生和/或IL-17A的产生。MLR实验可以按照Bromelow等人《J.ImmunolMethods》，2001，1月1日；247(1-2):1-8或本文示例性实施例所述进行。IL-2、IFNγ和/或IL-17的产生可通过技术人员熟知的基于抗体的方法进行分析，如免疫印迹法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、流式细胞术、ELISA法、ELISPOT法或基于报告因子的方法。
在一些实施方案中，在MLR实验中，本公开的抗原结合分子能够将T细胞(如Th1/Th17细胞)增殖、IL-2产生、IFN-γ产生和/或IL-17A产生提高1倍以上，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够提高T细胞(如Th1/Th17细胞)的增殖、IFN-γ的产生和/或TNFα的产生，如在VISTA/VISTA表达细胞存在的情况下。抗原结合分子的这些特性可在体外实验中进行评估，如本文示例性实施例中所述。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将T细胞(如Th1/Th17细胞)增殖、IFN-γ产生和/或TNFα产生提高(如在VISTA/VISTA表达细胞存在的情况下)大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，与现有技术中公开的VISTA结合抗体(如VSTB112，如WO 2015/097536A2中所述)相比，本公开的抗原结合分子能够更大程度地提高T细胞(如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞，如Th1/Th17细胞)增殖。T细胞增殖可以在体外实验中进行评估，如本文实施例9所述，可以在激动剂抗CD3抗体存在的情况下通过培养刺激T细胞增殖。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将这种实验中的T细胞增殖提高至大于由现有技术中VISTA结合抗体(如VSTB112)诱导的增殖水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将T细胞介导的癌细胞裂解提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够提高T细胞介导的癌细胞裂解，如在VISTA/VISTA表达细胞存在的情况下。抗原结合分子的这些特性可在体外实验中进行评估，如本文示例性实施例中所述。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将提高T细胞介导的裂解(如在VISTA/VISTA表达细胞存在的情况下)提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，与现有技术中公开的VISTA结合抗体(如VSTB112，如WO 2015/097536A2中所述)相比，本公开的抗原结合分子能够更大程度地提高THP1细胞产生IL-6。THP1细胞产生IL-6可以在体外实验中进行评估，如本文实施例10所述，可能涉及用LPS刺激THP1细胞。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将这种实验中的IL-6产生提高至大于由现有技术中VISTA结合抗体(如VSTB112)诱导的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够：减少抑制性免疫细胞的数量和/或活性、抑制抑制性免疫细胞的增殖、和/或相对于对照条件减少细胞群(如CD45+细胞，如从肿瘤中获得的CD45+细胞)中抑制性免疫细胞的比例，如在适当的体外或体内实验中确定。
所述抑制性免疫细胞可以是如VISTA表达细胞、Arg-1表达细胞、MDSC、粒细胞MDSC(g-MDSC)或单核细胞MDSC(m-MDSC)。在一些实施方案中，所述抑制性免疫细胞是CD11b+GR1+MHCII-细胞。
在一些实施方案中，减少数量/活性/增殖/比例至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的数量/活性/增殖/比例的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过不涉及Fc介导功能的机制减少抑制性免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过不依赖于Fc介导功能(如与Fc区无关的方式)减少抑制性免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过不涉及ADCC、ADCP和/或CDC的机制减少抑制性免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。在一些实施方案中，所述抗原结合分子能够通过不涉及VISTA表达细胞耗竭的机制减少抑制性免疫细胞的数量/活性/增殖/比例。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子抑制体内癌症的发展和/或进展。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子可以增加效应免疫细胞等对癌细胞的杀伤。在一些实施方案中，所述抗原结合分子可以减少体内癌细胞的数量，如与适当的对照条件相比。在一些实施方案中，所述抗原结合分子可以抑制肿瘤生长，如随着时间推移通过测量肿瘤大小/体积来确定。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够提高用所述抗原结合分子处理的小鼠血清中IFN-γ和/或IL-23的水平。血清中IFN-γ和/或IL-23的水平可以通过ELISA等方法对从所述小鼠中获取的血样中的血清进行分析。在一些实施方案中，施用本公开的抗原结合分子将血清中IFN-γ和/或IL-23的水平提高到大于在未施用所述抗原结合分子的情况下观察到的水平(或在施用适当对照抗原结合分子的情况下观察到的水平)的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
本可以在适当的体内模型中分析公开的抗原结合分子抑制癌症发展和/或进展的能力，例如细胞系衍生的异种移植模型，如CT26细胞衍生模型、4T-1细胞衍生模型、LL2细胞衍生模型、B16细胞衍生模型或EL4细胞衍生模型。所述癌症可以是表达VISTA的细胞和/或与MDSC(如表达VISTA的MDSC、TAM、中性粒细胞)在病理上相关的癌症。MDSC“病理上与之相关”的癌症包括MDSC或MDSC数量/比例的增加与癌症的发生、发展或进展和/或癌症的一种或多种症状的严重程度呈正相关的癌症，或MDSC或MDSC数量/比例的增加是癌症发生、发展或进展的危险因素的癌症。所述癌症可以包括受疾病影响的器官/组织(如表现出疾病/症状的器官/组织)或肿瘤中的MDSC。
在一些实施方案中，施用本公开的抗原结合分子可以造成以下一种或多种：抑制癌症的发展/进展、延缓/预防癌症的发生、减少/延缓/预防肿瘤生长、减少/延缓/预防转移、减轻癌症症状的严重程度、减少癌细胞数量、减少肿瘤大小/体积、和/或提高存活率(如无进展生存期)，如在CT26细胞、4T-1细胞、LL2细胞、B16细胞或EL4细胞衍生异种移植模型中所确定。
在一些实施方案中，施用本公开的抗原结合分子能够抑制到大于未施用所述抗原结合分子(或在施用适当对照抗原结合分子后)的情况下观察到的肿瘤生长情况的5％，如≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％或≥95％。
在一些实施方案中，在本公开示例性实施例的CT26细胞衍生模型中，以实施例中所述的剂量和周期施用抗原结合分子，抑制到大于未施用所述抗原结合分子(或在施用适当对照抗原结合分子后)的情况下观察到的肿瘤生长情况的5％，如≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％或≥80％。在一些实施方案中，在本公开示例性实施例的4T-1细胞衍生模型中，以实施例中所述的剂量和周期施用抗原结合分子，抑制到大于未施用所述抗原结合分子(或在施用适当对照抗原结合分子后)的情况下观察到的肿瘤生长情况的5％，如≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％或≥50％。
在一些实施方案中，施用根据本公开的抗原结合分子与细胞因子释放综合征无关。在一些实施方案中，施用根据本公开的抗原结合分子与白细胞(如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞和/或单核细胞)的系统性激活无关。在一些实施方案中，施用抗原结合分子与炎症细胞因子和/或趋化因子(如IL-6、IFN-γ、IL-8、IL-10、GM-CSF、MIP-1α/β、MCP-1、CXCL9和/或CXCL10)表达的系统性上调无关。
本公开的各方面和实施方案特别涉及能够抑制VISTA与结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(例如LRIG1或VSIG3)之间相互作用的抗原结合分子。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子在被结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)结合的区域与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子是结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)的VISTA竞争性抑制剂。在一些实施方案，所述抗原结合分子是结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)的VISTA别构抑制剂。在一些实施方案中，所述抗原结合分子取代结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不结合含有VISTA和结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)的复合物。
抗原结合分子抑制VISTA和结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)之间的相互作用的能力，可以通过例如在存在抗原结合分子的情况下或在一个或两个相互作用伙伴与抗原结合分子孵育后分析相互作用来确定。确定特定抗原结合分子是否能够抑制VISTA与结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)之间的相互作用的检测方法包括竞争ELISA检测和SPR分析。
能够抑制VISTA与结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)之间相互作用的抗原结合分子，可以通过与不存在所述抗原结合分子的情况下(或在已知无法抑制这种相互作用的适当对照抗原结合分子存在的情况下)的相互作用水平相比，在存在抗原结合分子的情况下或在一个或两个相互作用伙伴与抗原结合分子孵育后，观察相互作用伙伴之间相互作用水平的减少/降低来确定。适当的分析可以在体外进行，例如使用重组相互作用伙伴或使用表达相互作用伙伴的细胞。表达相互作用伙伴的细胞可以是内源性的，也可以是通过将核酸导入细胞。为进行此类检测，可以对相互作用伙伴和/或抗原结合分子中的一种或两种进行标记，或与可检测实体偶联使用，以检测和/或测量相互作用水平。
例如，本公开的实施例2描述了VISTA结合抗原结合分子的ELISA实验，分析了其抑制VISTA和LRIG1之间相互作用的能力。简言之，用Fc标记的人VISTA蛋白涂布平板孔，经封闭和与VISTA抗原结合分子孵育后，向孔中加入HIS标记的LRIG1。使用HRP偶联的抗HIS抗体检测捕获的HIS标记的LRIG1，然后用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色，以检测VISTA-LRIG1复合物。在这种检测方法中，根据检测到的HRP活性水平低于在对照条件下不与VISTA结合的同种型匹配的抗原结合分子观察到的HRP活性水平，就可以推断特定VISTA结合抗原结合分子抑制了VISTA和LRIG1之间的相互作用。
在一些实施方案中，在特定的检测中，根据本公开的抗原结合分子将VISTA与结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)之间的相互作用抑制至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下，或在已知无法抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间相互作用的等量的适当对照抗原结合分子存在的情况下观察到的相互作用水平的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子抑制VISTA与结合至VISTA的C-C’区域的VISTA相互作用伴侣(如LRIG1或VSIG3)之间相互作用的IC50(如由ELISA测定得到的，如本公开实施例中所述的ELISA)为1μM或更少，如≤500nM、≤100nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤10nM、≤5nM、≤4nM中任一。
本公开的各方面和实施方案特别涉及能够抑制VISTA和LRIG1之间相互作用的抗原结合分子。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子在被LRIG1结合的区域与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子是LRIG1与VISTA结合的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，所述抗原结合分子是LRIG1与VISTA结合的别构抑制剂。在一些实施方案中，所述抗原结合分子取代含有VISTA和LRIG1的复合物中的LRIG1。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与包含VISTA和LRIG1的复合物结合。
在一些实施方案中，在特定的检测中，根据本公开的抗原结合分子将VISTA与LRIG1之间的相互作用抑制至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下，或在已知无法抑制VISTA与LRIG1之间相互作用的等量的适当对照抗原结合分子存在的情况下观察到的相互作用水平的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案，根据本公开的抗原结合分子抑制VISTA与LRIG1之间相互作用的IC50(如由ELISA测定得到的，如本公开实施例中所述的ELISA)为1μM或更少，如≤500nM、≤100nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤10nM、≤5nM、≤4nM中任一。
本公开的各方面和实施方案特别涉及能够抑制VISTA和VSIG3之间相互作用的抗原结合分子。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子在被VSIG3结合的区域与VISTA结合。在一些实施方案中，所述抗原结合分子是VSIG3与VISTA结合的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，所述抗原结合分子是VSIG3与VISTA结合的别构抑制剂。在一些实施方案中，所述抗原结合分子取代含有VISTA和VSIG3的复合物中的VSIG3。在一些实施方案中，所述抗原结合分子不与包含VISTA和VSIG3的复合物结合。
在一些实施方案中，在特定的检测中，根据本公开的抗原结合分子将VISTA与VSIG3之间的相互作用抑制至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下，或在已知无法抑制VISTA与VSIG3之间相互作用的等量的适当对照抗原结合分子存在的情况下，观察到的相互作用水平的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子抑制VISTA与VSIG3之间相互作用的IC50(如由ELISA测定得到的，如本公开实施例中所述的ELISA)为1μM或更少，如≤500nM、≤100nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤10nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤900pM、≤800pM、≤700pM中任一。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加抗原特异性CD8+T细胞(如gp70+CD8+T细胞)的数量和/或比例，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子增加抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够增加抗原特异性CD8+T细胞的数量，使其超过在没有所述抗原结合分子(或在适当的对照抗原结合分子存在)的情况下观察到的数量。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将抗原特异性CD8+T细胞的数量或比例提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的抗原特异性CD8+T细胞的数量/比例的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥20倍、≥30倍、≥40倍或≥50倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将抗原特异性CD8+T细胞的数量或比例提高到大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的抗原特异性CD8+T细胞的数量/比例的1％，如至少2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
细胞数量和比例可以通过流式细胞分析等方法确定，该方法使用的抗体可检测细胞类型。抗原特异性CD8+T细胞可以通过一种或多种细胞标志物(如gp70+、CD8+)的存在和/或不存在来确定。举例来说，实施例8说明了通过流式细胞分析确定肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的比例。抗原特异性CD8+T细胞可以通过使用肽-MHC多聚物(pMHC多聚物)来鉴定，pMHC多聚物包含目的抗原，如预期在癌症/肿瘤中发现的抗原。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加抗原特异性CD8+T细胞(如细胞毒性CD8+T细胞)的数活性，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子增加CD8+T细胞活性的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将CD8+T细胞活性提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的CD8+T细胞活性的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将CD8+T细胞活性的相关因子水平提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。
在一些实施方案中，CD8+T细胞活性可以通过测量这种活性的相关因子来分析。在一些实施方案中，CD8+T细胞活性可以通过分析颗粒酶B、CX3CR1、ICOS、CD27的产生来确定。举例来说，实施例8说明了通过流式细胞分析法测量表达颗粒酶B、CX3CR1、ICOS和/或CD27的细胞比例来确定CD8+T细胞活性。
在一些实施方案，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够上调一种或多种细胞毒性相关标志物，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子上调一种或多种细胞毒性相关标志物的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将一种或多种细胞毒性相关标志物上调至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将一种或多种细胞毒性相关标志物的水平提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。
细胞毒性相关标志物为技术人员所熟知，包括颗粒酶B(即GZMB)、CX3CR1、ICOS、CD27、TNFa、INFγ、IL-2、CXCR3、TBX21、IL-4、CCR4、GATA3、IL-9、IL-10、IRF4、CCR6、KLRB1、IL-17、IRF4、RORc。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够上调一种或多种前炎症巨噬细胞激活相关基因，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子上调一种或多种前炎症巨噬细胞激活相关基因的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例9中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，分析肿瘤细胞系或肿瘤的转录组。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将一种或多种前炎症巨噬细胞激活相关基因上调至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。
在一些实施方案中，所述一种或多种前炎症巨噬细胞激活相关基因可以选自如图18所示的那些。基因表达可以通过技术人员熟知的方法来确定。可以通过RT-qPCR、northern印迹杂交等技术来确定编码一种或多种前炎症巨噬细胞激活相关基因的RNA水平。
在一些实施方案，本公开的抗原结合分子能够上调T细胞的一种或多种细胞毒性相关基因，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子上调T细胞的一种或多种细胞毒性相关基因的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例9中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，分析肿瘤细胞系或肿瘤的转录组。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将T细胞的一种或多种细胞毒性相关基因上调至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。
在一些实施方案中，所述T细胞的一种或多种细胞毒性相关基因可以选自如图18所示的那些。基因表达可以通过技术人员熟知的方法来确定。可以通过RT-qPCR、northern印迹杂交等技术来确定编码T细胞的一种或多种细胞毒性相关基因的RNA水平。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加免疫细胞产生的颗粒酶B，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子增加免疫细胞产生的颗粒酶B的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将免疫细胞产生的颗粒酶B提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的免疫细胞产生的颗粒酶B的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将免疫细胞产生的颗粒酶B水平提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的颗粒酶B水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够提高混合淋巴细胞反应(MLR)实验中颗粒酶B的产生。MLR实验可以按照Bromelow等人《J.Immunol Methods》，2001，1月1日；247(1-2):1-8(将其全部内容并入本文作为参考)中所述的方法进行。Granzyme B的产生可通过技术人员熟知的基于抗体的方法进行分析，如免疫印迹法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、流式细胞术、ELISA法、ELISPOT法或基于报告因子的方法。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够降低T细胞耗竭水平，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子降低T细胞耗竭水平的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例10中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将T细胞耗竭水平降低至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的T细胞耗竭水平的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将T细胞耗竭相关因子的水平降低至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的T细胞耗竭相关因子的水平的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案中，T细胞耗竭可以通过确定耗竭T细胞的数量和/或比例来分析。细胞数量和比例可以通过流式细胞仪分析等方法确定，流式细胞仪使用的抗体可检测细胞类型。耗竭T细胞可以通过一种或多种细胞标志物的存在和/或不存在来识别，例如gp70+、CD8+、PD-1+、IL-7Ra-。举例来说，实施例8说明了使用流式细胞分析检测gp70+、CD8+、PD-1+、IL-7Ra-细胞来确定耗竭T细胞的比例。
在一些实施方案中，T细胞耗竭可以通过测量T细胞耗竭相关因子来分析。在一些实施方案中，T细胞耗竭可以通过T细胞耗竭细胞标志物的存在和/或缺失来确定，如PD-1+、LAG-3+、TIM-3+、IL-7Ra-。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子减少肿瘤相关巨噬细胞的数量和/或比例的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将肿瘤相关巨噬细胞的数量减少至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的肿瘤相关巨噬细胞的数量的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将肿瘤相关巨噬细胞的比例减少至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的肿瘤相关巨噬细胞的比例的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
细胞数量和比例可通过流式细胞仪分析等方法确定，使用的抗体可检测细胞类型，肿瘤相关巨噬细胞可以通过一种或多种细胞标志物(如CD45+、F4/80+、MHCII-)的存在和/或不存在进行识别。TAM可以表现为M2型表型获得性巨噬细胞，如表现出M2型巨噬细胞(也称为替代性活化巨噬细胞)的特征。TAM可以分泌抗炎细胞因子(如IL-10、IL-13和IL-4)，表达精氨酸酶-1，表达甘露糖受体(MR，CD206)，和/或表达清道夫受体，如MARCO。肿瘤相关巨噬细胞如Lin等人《血液学与肿瘤学杂志》(2019)12:76(将其全部内容并入本文作为参考)中所述。举例来说，实施例8说明了使用流式细胞分析检测CD45+F4/80+MHCII-细胞来确定肿瘤相关巨噬细胞的比例。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够降低肿瘤相关巨噬细胞的活性。在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够降低肿瘤相关巨噬细胞的活性，如在适当的体外或体内实验中。
在一些实施方案，本公开的抗原结合分子能够将肿瘤相关巨噬细胞的活性降低至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的肿瘤相关巨噬细胞的活性的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将肿瘤相关巨噬细胞活性的相关因子的水平降低至小于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的肿瘤相关巨噬细胞活性的相关因子的水平的1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方案中，肿瘤相关巨噬细胞活性可以通过测量肿瘤相关巨噬细胞活性的相关因子来分析。在一些实施方案中，肿瘤相关巨噬细胞的活性可以通过分析如IL-10、IL-13、IL-4的产生来确定。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加M1型巨噬细胞(即M1巨噬细胞)的数量和/或比例，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将M1型巨噬细胞的数量增加至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的M1型巨噬细胞的数量的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将M1型巨噬细胞的比例增加至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的M1型巨噬细胞的比例的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥20倍、≥30倍、≥40倍或≥50倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将M1型巨噬细胞的比例增加至少于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的M1型巨噬细胞的比例的1％，如至少2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
细胞数量和比例可以通过流式细胞分析等方法确定，使用的抗体可检测细胞类型。M1型巨噬细胞可以通过一种或多种细胞标志物的存在和/或不存在来识别，如F4/80+、MHCII+、CD206-、TNFa+、MMP2/9-、B7-H4-、STAT-3-、iNOS+、HLA-DR+、CD68+、CD14+、CD163-、CD204。M1巨噬细胞的特点是能产生细胞因子，如IL-12、IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、活性氧(ROS)和/或一氧化氮(NO)和/或表现出MHC II类表达增加。M1型巨噬细胞如Lin等人《血液学与肿瘤学杂志》(2019)12:76中(将其全部内容并入本文作为参考)中所述。举例来说，实施例8说明了使用流式细胞分析检测F4/80+MHCII+CD206-TNFa+细胞来确定M1型巨噬细胞的比例。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够提高M1型巨噬细胞的活性，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子提高M1型巨噬细胞活性的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将M1型巨噬细胞活性提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的M1型巨噬细胞活性的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将M1型巨噬细胞活性的相关因子的水平提高至大于在不存在所述抗原结合分子的情况下(或在适当对照抗原结合分子存在的情况下)观察到的水平的1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方案中，M1型巨噬细胞活性可以通过测量这种活性的相关因子来分析。在一些实施方案中，M1型巨噬细胞的活性可以通过分析如TNFa、IL-12、CXCL-10、IFNγ、NOS的产生来确定。举例来说，实施例8说明了使用流式细胞分析检测TNFa来确定M1型巨噬细胞的活性。
在一些实施方案中，相对于阴性对照条件，本公开的抗原结合分子能够增加免疫细胞产生TNFa，如在适当的体外或体内实验中。抗原结合分子增加免疫细胞产生TNFa的能力可以通过检测方法进行分析，如本文实施例8中所述。这种方法可以包括在施用抗原结合分子或适当的对照抗原结合分子后，对非人类动物癌症模型(如细胞系衍生的小鼠模型)的肿瘤进行免疫谱分析。
嵌合抗原受体(CAR)
本公开还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含本公开的抗原结合分子或多肽。
CAR是一种重组受体，具有抗原结合和T细胞激活的功能。CAR结构和工程化在人Dotti等人《Immunol Rev》(2014)257(1)中综述，将其全部内容并入本文作为参考。CAR包括与细胞膜锚定区和信号区相连的抗原结合区。可选的铰链区可以在抗原结合区和细胞膜锚定区之间提供分隔，并可以充当柔性连接体。
本公开的CAR包括抗原结合区，该区域包括或由本公开的抗原结合分子组成，或包括或由根据本公开的多肽组成。
细胞膜锚定区位于CAR的抗原结合区和信号区之间，用于将CAR固定在表达CAR的细胞的细胞膜上，抗原结合区位于细胞外空间，信号区位于细胞内。在一些实施方案中，所述CAR包括细胞膜锚定区，该区域包括或由一个氨基酸序列组成，该氨基酸序列包括、或衍生自、或由CD3-ζ、CD4、CD8或CD28中一种的跨膜区氨基酸序列组成。如本文所用，“衍生自”参考氨基酸序列的区域包括与参考序列具有至少60％，如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一序列同一性的氨基酸序列。
CAR信号区可以激活T细胞。CAR信号区可一包括CD3-ζ细胞内结构域的氨基酸序列，其提供了免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，用于磷酸化和激活表达CAR的T细胞。CAR中还使用了由FcγRI等其他含ITAM蛋白序列组成的信号区域(Haynes等，2001年《J Immunol》166(1):182-187)。CAR的信号区还可以包括来自共刺激分子信号区的共刺激序列，以促进表达CAR的T细胞与靶蛋白结合后的活化。合适的共刺激分子包括CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27。在一些实例中，对CAR进行加工从而用于共同刺激不同的细胞内信号通路。例如，与CD28共刺激相关的信号优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)途径，而4-1BB介导的信号则通过TNF受体相关因子(TRAF)适配蛋白。CAR的信号区有时包含来自多个共刺激分子信号区的共刺激序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含一个或多个共刺激序列，该序列包含或由一个氨基酸序列组成，该氨基酸序列包括、或衍生自、或由CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27中的一个或多个的胞内结构域的氨基酸序列组成。
可选的铰链区可以隔开抗原结合域和跨膜域，并可以作为柔性连接体。铰链区可以衍生自IgG1。在一些实施方案中，本公开的CAR包括一个铰链区，该铰链区包括或由一个氨基酸序列组成，该氨基酸序列包括、或衍生自、或由IgG1铰链区的氨基酸序列组成。
还提供了一种包含根据本公开CAR的细胞。根据本公开的CAR可以用于生成表达CAR的免疫细胞，如CAR-T或CAR-NK细胞。可以在体外培养过程中将CAR工程转化如免疫细胞。
本公开CAR的抗原结合区可以以任何适当的形式提供，如scFV、scFab等。
核酸和载体
本公开提供了编码根据本公开的抗原结合分子、多肽或CAR的一种核酸或多种核酸。
在一些实施方案中，所述核酸是纯化或分离的，例如从其他核酸或天然存在的生物材料中分离。在一些实施方案中，所述核酸包括或由DNA和/或RNA组成。
本公开还提供了包括根据本公开的核酸或多种核酸的一种载体或多种载体。
所述核苷酸序列可以包含在载体中，如表达载体。本文所用的“载体”是一种核酸分子，用作将外源核酸转入细胞的载体。所述载体可以是用于在细胞中表达核酸的载体。这种载体可以包括与编码待表达序列的核苷酸序列可操作连接的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子都可用来表达来自根据本公开的载体的肽或多肽。
术语“可操作连接”可以包括所选核酸序列与调控核酸序列(如启动子和/或增强子)共价连接，从而使核酸序列的表达受调控序列的影响或控制(从而形成表达盒)的情况。因此，如果调控序列能够影响核酸序列的转录，则调控序列与所选核酸序列可操作连接。由此产生的转录本可以被翻译成所需的多肽/多肽。
合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(如伽马逆转录病毒载体(如小鼠白血病病毒(MLV)衍生载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体和孢疹病毒载体)、基于转座子的载体和人工染色体(如酵母人工染色体)。
在一些实施方案中，所述载体可以是真核载体，如包含在真核细胞中表达来自载体的蛋白质所需的元件的载体。在一些实施方案中，所述载体可以是哺乳动物载体，如包含巨细胞病毒(CMV)或SV40启动子以驱动蛋白质表达的载体。
根据本公开的抗原结合分子的组成多肽可由多种核酸中的不同核酸编码，或由多种载体中的不同载体编码。
包括/表达抗原结合分子和多肽的细胞
本公开还提供了包括或表达根据本公开的抗原结合分子、多肽或CAR的细胞。还提供了包括或表达根据本公开的一种核酸、多种核酸、一种载体或多种载体的细胞。
所述细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞。所述哺乳动物可以是灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人)或非人哺乳动物(如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿类动物(包括任何啮齿目动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括母牛，如奶牛，或牛目中的任何动物)、马(包括马科的任何动物)、驴和非人灵长类动物)。
本公开还提供了一种生产包含根据本公开的核酸或载体的细胞的方法，包括将根据本公开的一种核酸、多种核酸、载体或多种载体导入细胞。在一些实施方案中，将根据本公开内容分离的核酸或载体导入细胞包括转化、转染、电穿孔或转导(如逆转录病毒转导)。
本公开还提供了一种生产表达/包含根据本公开的抗原结合分子、多肽或CAR的细胞的方法，该方法包括在细胞中导入根据本公开的核酸、多种核酸、载体或多种载体。在一些实施方案中，这些方法还包括在适合细胞表达核酸或载体的条件下培养细胞。在一些实施方案中，所述方法在体外进行。
本公开还提供了根据本公开获得的或可获得的细胞。
生产抗原结合分子和多肽
根据本公开的抗原结合分子和多肽可以按照技术人员已知的多肽生产方法制备。
多肽可以通过化学合成的方法制备，如液相或固相合成。例如，肽/多肽可以使用如Chandrudu等人《分子》(2013),18:4373-4388中所述方法合成，将其全部内容并入本文作为参考。
可选地，抗原结合分子和多肽也可以通过重组表达产生。适用于多肽重组生产的分子生物学技术是本领域众所周知的，如Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册(第四版)》，冷泉港出版社，2012年，以及《Nat Methods》(2008)；5(2):135-146，这两本书的全部内容并入本文作为参考。Frenzel等人《Front Immunol.》(2013)；4:217以及Kunert和Reinhart《Appl Microbiol Biotechnol.》(2016)100:3451-3461，这两篇文章的全部内容并入本文作为参考。
在一些实例中，本公开的抗原结合分子由一条以上的多肽链组成。在这种情况下，抗原结合分子的生产可能包括一个以上多肽的转录和翻译，以及随后多肽链的结合以形成抗原结合分子。
根据本公开内容进行重组生产时，可以使用任何适合表达多肽的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原核细胞，如古生菌或细菌的细胞。在一些实施方案中，所述细菌可以是革兰氏阴性菌，如肠杆菌科细菌，例如大肠杆菌。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞，如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，如CHO、HEK(如HEK293)、HeLa或COS细胞。在一些实施方案中，所述细胞是瞬时或稳定表达多肽的CHO细胞。
在一些实例中，所述细胞不是原核细胞，因为有些原核细胞不能像真核细胞那样折叠或翻译后修饰。此外，真核细胞的表达水平非常高，使用适当的标签更容易从真核细胞中纯化蛋白质。还可以利用特定的质粒来提高蛋白质在培养基中的分泌量。
在一些实施方案中，多肽可以通过无细胞蛋白合成(CFPS)的方法制备，如根据使用Zemella等人《Chembiochem》(2015)16(17):2420-2431中所述的系统，将其全部内容并入本文作为参考。
生产可以包括培养或发酵经修饰的真核细胞，以表达目的多肽。培养或发酵可以在生物反应器中进行，并提供适当的营养物质、空气/氧气和/或生长因子。可以通过将培养基/发酵液从细胞中分离出来，提取其中的蛋白质成分，并分离单个蛋白质以分离分泌的多肽，从而收集分泌的蛋白质。培养、发酵和分离技术为本领域技术人员所熟知，例如Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册(第四版；本如上文作为参考)》。
生物反应器包括一个或多个可以培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续进行，反应物连续流入反应器，培养细胞连续流出反应器。可选地，可以分批进行培养。生物反应器监测和控制环境条件，如pH值、氧气、流入和流出的流速以及容器内的搅拌情况，从而为正在培养的细胞提供最佳条件。
培养表达抗原结合分子/多肽的细胞后，可以分离出目的多肽。可以使用本领域已知的任何合适的从细胞中分离蛋白质的方法。为了分离多肽，可能需要将细胞从营养培养基中分离出来。如果所述多肽是从细胞中分泌出来的，则可以通过离心将细胞与含有分泌的目的多肽的培养基分离。如果目的多肽聚集在细胞内，蛋白质分离可以包括通过离心将细胞从细胞培养基中分离出来，用裂解缓冲液处理细胞团，以及通过超声、快速冻融或渗透裂解等方法破坏细胞。
然后可能需要从上清液或培养基中分离出目的多肽，因为上清液或培养基中可能含有其他蛋白质和非蛋白质成分。从上清液或培养基中分离蛋白质成分的常用方法是沉淀法。不同浓度的沉淀剂(如硫酸铵)可以沉淀出不同溶解度的蛋白质。例如，当沉淀剂浓度较低时，水溶性蛋白质会被提取出来。因此，通过添加不同浓度的沉淀剂，可以区分不同溶解度的蛋白质。随后可用透析法从分离出的蛋白质中去除硫酸铵。
区分不同蛋白质的其他方法是本领域已知的，例如离子交换色谱法和体积排除色谱。这些方法可以作为沉淀的替代方法，也可以在沉淀之后进行。
从培养物中分离出目的多肽后，可能需要或必需浓缩多肽。浓缩蛋白质的多种方法是本领域所知的，如超滤或冻干等。
组合物
本公开还提供了包括本文所述抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体和细胞的组合物。
本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体和细胞可以配制成临床使用的药物组合物或药物，并可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。所述组合物可以配制成局部、肠外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌肉内、鞘内、眼内、结膜内、瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或透皮等给药途径，其中可包括注射或输注。
合适的制剂可以包括无菌或等渗介质中的抗原结合分子。药物和药物组合物可以配制成流体(包括凝胶)形式。液体制剂可以配制成注射或输液(如通过导管)的形式，在人体或动物体内的选定区域给药。
在一些实施方案中，所述组合物被配制用于注射或输注，例如注入血管或肿瘤。
根据本公开内容，还提供了生产药用组合物的方法，该生产方法可以包括一个或多个选自以下的步骤：生产本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种载体)或细胞；分离本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种载体)或细胞；和/或将本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种载体)或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如，本公开的另一方面涉及一种配制或生产用于治疗疾病/病症(如癌症)的药物或药物组合物的方法，该方法包括通过将本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种载体)或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合，配制药物组合物或药物。
治疗和预防应用
本文所述抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体、细胞和组合物在治疗和预防方法中的用途。
本公开提供了本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或其多种载体)、细胞或组合物，用于医疗或预防方法。还提供了本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种载体)、细胞或组合物在制备治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。还提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本文所述抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种载体)、细胞或组合物。
这些方法可以有效减少疾病/病症的发展或进展，减轻疾病/病症的症状，或减少疾病/病症的病理变化。这些方法可以有效防止疾病/病症的进展，例如防止疾病/病症恶化或减缓疾病/状况的发展速度。在一些实施方案中，所述方法可以导致疾病/病症的改善，例如，疾病/病症症状的减轻或疾病/病症严重程度/活性的某些其他相关因素的减轻。在一些实施方案中，这些方法可以防止疾病/病症发展到后期阶段(如慢性阶段或转移)。
可以理解，本公开的物品可以用于治疗/预防任何可以从减少VISTA表达细胞(如MDSC)的数量和/或活性中获得治疗或预防益处的疾病/病症。同样清楚的是，本公开内容的治疗和预防效用基本上适用于任何可以从减少表达VISTA的MDSC和/或其他细胞(如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和中性粒细胞)的数量或活性中获益的疾病/病症。拮抗VISTA能有效释放效应免疫细胞，使其免受MDSC和/或其他表达VISTA的细胞的抑制。
例如，所述疾病/病症可以是表达VISTA的细胞(如MDSC)在病理上与之相关的疾病/病症，如表达VISTA的细胞(如MDSC)的数量/比例增加与疾病/病症的发病、发展或进展和/或一种或多种症状的严重程度呈正相关的疾病/病症，或表达VISTA(如MDSC)的细胞的数量/比例增加是疾病/病症的发病、发展或恶化的风险因素。
在一些实施方案中，根据本公开内容待治疗/预防的疾病/病症是一种疾病/病症，其特征是表达VISTA的细胞(例如MDSC)的数量/比例/活性增加，例如与没有该疾病/病症时表达VISTA的细胞(例如MDSC)的数量/比例/活性相比。
在一些实施方案中，可以根据检测到表达VISTA的细胞(例如MDSC)的数量/比例/活性增加，例如在外周中，或在受疾病/病症影响的器官/组织(例如表现出疾病/病症症状的器官/组织)中，或通过肿瘤中表达VISTA的细胞(例如MDSC或肿瘤相关巨噬细胞)的存在，选择受试者进行本文所述的治疗。所述疾病/病症可以影响任何组织或器官或器官系统。在一些实施方案中，所述疾病/症状可以影响多个组织/器官/器官系统。
在一些实施方案中，可以根据本公开内容选择受试者进行治疗/预防，其依据是确定受试者外周或器官/组织中表达VISTA(例如MDSC)的细胞的数量/比例/活性相对于健康受试者中此类细胞的数量/比例/活性有所增加，或者确定受试者患有包含表达VISTA(例如MDSC)的细胞的肿瘤。
还可以理解的是，本公开的物品可以用于治疗/预防任何可以从以下方面获得治疗或预防益处的疾病/病症：
(i)提高抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)提高CD8+T细胞活性；
(iii)减少T细胞耗竭水平；
(iv)减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)增加M1型巨噬细胞的活性。
在一些实施方案，所述疾病/病症是癌症/肿瘤，且所述治疗或预防益处可以来自肿瘤微环境中的上述(i)至(vi)中一项或多项。
关于前段，可以理解的是，相关细胞类型/亚型的数量/比例或相关活性水平的“增加”或“减少”是相对于未进行此类治疗/预防性干预时观察到的数量/比例/水平(即未治疗状态下观察到的数量/比例/水平)而言的。
例如，所述疾病/病可能是：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量/比例减少或较低；
(ii)CD8+T细胞活性减少或较低；
(iii)耗竭T细胞出现或数量/比例上升或偏高；
(iv)TAM出现或数量/比例上升或偏高；
(v)M1型巨噬细胞的数量/比例减少或较低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性减少或较低；
在病理上与之相关的疾病/病症，如上述(i)至(vi)中的一种或多种与疾病/病症的发生、发展或进展和/或疾病/病症的一种或多种症状的严重程度呈正相关，或者上述(i)至(vi)中的一种或多种是疾病/病症发生、发展或进展的风险因素。在一些实施方案中，上述(i)至(vi)中的一项或多项是在肿瘤中，例如在肿瘤微环境中。
根据本公开内容，特定细胞类型/亚型的“减少”或“较低”数量/比例，或特定活性的“减少”或“较低”水平，是指特定细胞类型/亚型的数量/比例，或相关活性的水平，低于特定细胞类型/亚型的数量/比例的参考值，或低于相关活性水平的参考值。在一些实施方案中，特定细胞类型/亚型的“减少”或“较低”数量/比例，或特定活性的“减少”或“较低”水平可以小于参考值1倍，如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。相反，根据本公开内容，特定细胞类型/亚型的“增加”或“较高”数量/比例，或特定活性的“增加”或“较高”水平，是指特定细胞类型/亚型的数量/比例，或相关活性的水平，高于特定细胞类型/亚型的数量/比例的参考值，或低于相关活性水平的参考值。在一些实施方案中，特定细胞类型/亚型的“减少”或“较低”数量/比例，或特定活性的“增加”或“较高”水平可以大于参考值1倍，如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
根据前段所述，所述参考值可以是在相关疾病/病症背景下该特定细胞类型/亚型的平均值(如均值)。在一些实施方案中，所述参考值可以是受疾病/病症影响的组织/器官(例如表现出疾病/病症的一种或多种症状的组织/器官)中特定细胞类型/亚型的平均值(如均值)。在一些实施方案中，所述参考值可以是特定细胞类型/亚型在癌症(即一般癌症)、有代表性的癌症子集、特定类型的癌症或特定类型的肿瘤中的平均值(如均值)。
上述特定细胞类型/亚型的存在与否，可以通过适当的方法进行分析确定，例如使用可检测特定细胞类型/亚型的抗体进行流式细胞术分析。
在一些实施方案中，所述待治疗/预防的疾病/病症是癌症。
可以理解，本公开的抗原结合分子可以用于治疗一般癌症，因为本公开的抗原结合分子可以使效应免疫细胞摆脱MDSC介导的抑制或表达VISTA细胞的抑制，从而增强抗癌免疫反应。
癌症可以是任何有害的细胞增殖(或任何通过有害的细胞增殖表现出来的疾病)、肿瘤或瘤。癌症可以是良性或恶性的，可以是原发性或继发性(转移性)的。瘤或肿瘤可能是任何异常生长或增殖的细胞，可能位于任何组织中。癌症可以是来自以下部位的组织/细胞，如肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、大脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括大脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(如肾上皮细胞)、胆囊、食道、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾脏、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽部、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、外周神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴和/或白细胞。
待治疗的肿瘤可以是神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可以起源于中枢或周围神经系统，例如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可以起源于任何其他非神经组织，例如黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液肿瘤和肉瘤。
MDSC在晚期结直肠癌中升高(Toor等，《Front Immunol.》2016年；7:560)。在乳腺癌中也能观察到MDSC，晚期乳腺癌患者外周血中MDSC的比例会增加(Markowitz等，《BreastCancer Res Treat.》2013年7月；140(1):13-21)。MDSC的丰度也与实体瘤的预后差有关(Charoentong等，《Cell Rep.》2017年1月3日；18(1):248-262)，且MDSC在肝癌模型中富集(Connolly等，《J Leukoc Biol.》(2010)87(4):713-25)。据报道，前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌和Lewis肺癌会产生趋化因子，吸引MDSC并导致免疫抑制(Umansky等，《疫苗(巴塞尔)》(2016)4(4):36)，且胰腺癌患者中的MDSC与肿瘤负荷呈正相关(Xu等，《Hepatobiliary Pancreat Dis Int.》(2016)15(1):99-105)。据报道，VISTA也是治疗卵巢癌(见如US 9,631,018 B2)和淋巴瘤(见如WO 2017/023749 A1)的靶点。
Blando等人《Proc NatlAcad Sci U S A.》(2019)116(5):1692-1697最近报道在胰腺癌中发现了表达VISTA的髓系细胞大量浸润，在前列腺癌中使用CTLA4拮抗剂治疗后，以及在黑色素瘤中使用PD-L1拮抗剂治疗前后均观察到表达VISTA的髓系细胞扩增。
在一些实施方案中，癌症选自：包括表达VISTA细胞的癌症、包括表达VISTA细胞浸润的癌症、包括表达VISTA癌细胞的癌症、血液癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃瘤、结直肠癌、结直肠瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、三阴性乳腺浸润癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌(如结肠癌、结肠腺癌)、胰腺癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部癌、白血病(如T细胞白血病)、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和/或实体瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为上皮样间皮瘤。
治疗/预防的目的可以是以下一种或多种：延缓/预防癌症症状的发生/进展、减轻癌症症状的严重程度、减少癌细胞的存活/生长/侵袭/转移、减少癌细胞的数量和/或提高受试者的存活率。
本公开物品(即抗原结合分子、组合物等)特别适用于治疗/预防具有以下特征的疾病/病症(如癌症/肿瘤)：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量/比例减少或较低；
(ii)CD8+T细胞活性减少或较低；
(iii)耗竭T细胞出现或数量/比例上升或偏高；
(iv)TAM出现或数量/比例上升或偏高；
(v)M1型巨噬细胞的数量/比例减少或较低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性减少或较低。
本公开的物品(即抗原结合分子、组合物等)特别适用于治疗/预防以存在表达VISTA的细胞为特征的疾病/病症(如癌症)和/或以包含VISTA的复合物介导的信号为特征的疾病/病症(如癌症)。
以存在表达VISTA的细胞为特征的癌症可以包括表达VISTA的癌细胞。即是，癌细胞可以表达VISTA。
可选地，或者此外，以“存在”表达VISTA的细胞为特征的癌症可以是在癌细胞邻近(即附近)存在表达VISTA的细胞。所述癌症可以包括表达VISTA的细胞浸润。所述癌症可以包括显示表达VISTA的细胞浸润的肿瘤。在这种实施方案的情况下，所述表达VISTA的细胞不一定是癌细胞，也可能是如非癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为免疫细胞。所述表达VISTA的免疫细胞可以是或包括造血细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方案中，所述表达VISTA的免疫细胞可以是或包括淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、先天淋巴细胞(ILC)或其前体。在一些实施方案中，所述表达VISTA的免疫细胞为效应免疫细胞(如CD8+T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+CTLs)、CD4+T细胞、CD4+T辅助细胞、NK细胞、IFNγ-生产细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、抗原经历T细胞和/或CD45RO+T细胞)。在一些实施方案中，所述表达VISTA的免疫细胞为抗原呈递细胞(APC)、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞(如CD8+T细胞)和/或MDSC。在癌症包括表达VISTA的免疫细胞浸润或癌症包括显示这种免疫细胞浸润的肿瘤的实施方案中，所述免疫细胞可以称为肿瘤浸润免疫细胞。
例如，以存在表达VISTA的细胞为特征的癌症可以包括含有表达VISTA的细胞(如非癌细胞，如肿瘤浸润免疫细胞)的肿瘤。
可以理解，所述与癌细胞“邻近”或“附近”的细胞是指与癌细胞物理距离接近的细胞，例如，在患有这种癌症的受试者体内。在一些实施方案中，与癌细胞邻近/的细胞与癌细胞位于同一器官/组织中。在一些实施方案中，与癌细胞邻近/附近的细胞存在于癌症肿瘤中。在一些实施方案中，与癌细胞邻近/附近的细胞与癌细胞接触。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达VISTA的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达VISTA的癌细胞。在一些实施方案中，表达VISTA的细胞为MDSC(如g-MDSC和/或m-MDSC)。在一些实施方案中，所述癌症包括含有表达VISTA的细胞(如MDSC)的肿瘤。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括含有MDSC的肿瘤。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达VISTA的细胞(如MDSC)浸润。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括显示表达VISTA的细胞(如MDSC)浸润的肿瘤。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括含有CD45+细胞群的肿瘤，其含有大于1％，如≥2％、≥5％、≥10％、≥15％、≥20％、≥25％或≥30％的MDSC(如由免疫检测确定的肿瘤)。
本文所述的VISTA-结合抗原-结合分子被证明可抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的VISTA相互作用伴侣，如LRIG1和VSIG3)之间的相互作用。使用本文所述的抗原结合分子抑制VISTA与其相互作用伴侣之间的相互作用，还能使效应免疫细胞摆脱MDSC介导的对其活性的抑制。
因此，本公开的物品(即抗原结合分子、组合物等)特别适用于治疗/预防以存在表达VISTA相互作用伴侣(如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞为特征的疾病/病症(如癌症)，和/或以含有VISTA和VISTA相互作用伴侣(如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的复合物介导的信号为特征的疾病/病症(如癌症)。
以存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞为特征的癌症可以包括表达VISTA相互作用伴侣的癌细胞。即时，癌细胞可以表达VISTA相互作用伴侣。
可选地，或者此外，以“存在”表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞为特征的癌症，其特征可以是在癌细胞邻近(即附近)存在表达VISTA相互作用伴侣的细胞。所述癌症可以包括表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞浸润。所述癌症可以包括显示表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞浸润的肿瘤。在这种实施方案的情况下，所述表达VISTA相互作用伴侣的细胞不一定是癌细胞，也可能是如非癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为免疫细胞。表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的免疫细胞可以是或包括造血细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方案中，所述表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的免疫细胞可以是或包括淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、先天淋巴细胞(ILC)或其前体。在一些实施方案中，所述表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的免疫细胞为效应免疫细胞(如CD8+T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+CTLs)、CD4+T细胞、CD4+T辅助细胞、NK细胞、IFNγ-生产细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、抗原经历T细胞和/或CD45RO+T细胞)。在一些实施方案中，所述表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的免疫细胞为抗原呈递细胞(APC)、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞(如CD8+T细胞)和/或MDSC。在癌症包括表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的免疫细胞浸润或癌症包括显示这种免疫细胞浸润的肿瘤的实施方案中，所述免疫细胞可以称为肿瘤浸润免疫细胞。
例如，以存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞为特征的癌症可以包括含有表达VISTA相互作用伴侣的细胞(如非癌细胞，如肿瘤浸润免疫细胞)的肿瘤。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达与VISTA的C-C’区域结合的VISTA的相互作用伴侣的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达LRIG1的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达VSIG3的细胞。
可以理解在本文的实施方案中，含有具有特定特征的细胞的癌症可以是或包括含有具有这些特征的细胞的肿瘤。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括以存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞(可以是如非癌细胞，如肿瘤浸润免疫细胞)为特征的肿瘤。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括以存在表达与VISTA的C-C'区域结合的VISTA相互作用伴侣为特征的细胞的肿瘤。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括以存在表达LRIG1的细胞为特征的肿瘤。在某些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括以存在表达VSIG3的细胞为特征的肿瘤。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞浸润。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括显示表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞浸润的肿瘤。
在一些实施方案中，表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞，在非病理条件下，相对于参考表达水平，如相同类型(如来自相同器官/组织)的细胞，相互作用伙伴的表达可能会增加。
在一些实施方案中，表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞可能过表达VISTA相互作用伴侣。这种细胞表达相关分子水平可能高于同等非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。
细胞可以显示VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的表达增加或过表达，例如，由于遗传变异导致相互作用伴侣的表达增加。因此，在一些实施方案中，癌症包括携带基因变异(如突变)的细胞，或包括携带遗传变异(如突变)细胞的肿瘤，该遗传变异导致VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的(基因和/或蛋白质)表达量相对于携带不含基因变异的参考等位基因(如非突变或“野生型”等位基因)的可比细胞的表达量增加。相对于参考等位基因，遗传变异可以是或包括核苷酸序列的插入、缺失、取代或更大规模的易位/重排。
“导致”VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)表达增加的遗传变异可以是已知或预测导致相关分子的基因/蛋白表达增加，或可能有关相关分子的基因/蛋白表达增加。在一些实施方案中，导致VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)表达增加的遗传变异可以导致包含该遗传变异的细胞的细胞表面上或细胞表面中的VISTA相互作用伴侣的水平相对于不包含该遗传变异的等效细胞的水平增加。在一些实施方案中，导致VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)表达增加的遗传变异可以导致包含该遗传变异的细胞相对于不包含该遗传变异的等效细胞分泌VISTA相互作用伴侣的水平增加。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为由包括VISTA和VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的复合物介导的信号传导。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为VISTA/LRIG1介导的信号传导。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为VISTA/VSIG3介导的信号传导。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为包括VISTA和VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的复合物介导的信号传导水平升高，即相较于没有癌症时相关复合物的信号传导水平。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为存在(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为存在(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达LRIG1和/或VSIG3的细胞。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达LRIG1和/或VSIG3的细胞。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括以存在(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞为特征的肿瘤。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括以存在(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达LRIG1和/或VSIG3的细胞为特征的肿瘤。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括含有(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞的肿瘤。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括含有(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达LRIG1和/或VSIG3的细胞的肿瘤。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞浸润。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达LRIG1和/或VSIG3的细胞浸润。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括显示(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞浸润的肿瘤。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包括显示(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达LRIG1和/或VSIG3的细胞浸润的肿瘤。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症为以包括VISTA和VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的复合物介导的信号传导为特征的癌症。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为VISTA/LRIG1介导的信号传导。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为VISTA/VSIG3介导的信号传导。
在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症为以包括VISTA和VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的复合物介导的信号传导水平上升为特征的癌症，如相较于没有癌症时相关细胞类型/组织/器官中该复合物的信号水平。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为VISTA/LRIG1介导的信号传导水平上升，相较于没有癌症时相关细胞类型/组织/器官中VISTA/LRIG1介导的信号水平。在一些实施方案中，在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症的特征为VISTA/VSIG3介导的信号传导水平上升，相较于没有癌症时相关细胞类型/组织/器官中VISTA/VSIG3介导的信号水平。
在一些实施方案中，VISTA表达细胞在病理上与之相关的疾病/病症是一种传染性疾病，例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。在一些实施方案中，治疗慢性/顽固性感染尤为可取，例如这种感染与T细胞功能障碍或T细胞耗竭有关。众所周知，T细胞耗竭是一种T细胞功能障碍状态，在许多慢性感染(包括病毒、细菌和寄生虫感染)以及癌症中都会出现(《Wherry天然免疫学》Vol.12,No.6,p492-499，6月，2011年)。
可治疗的细菌感染实例包括芽孢杆菌属、百日咳杆菌、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、霍乱弧菌、葡萄球菌属、链球菌属、埃希菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、耶尔森氏菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属、李斯特菌属、幽门螺旋杆菌、分歧杆菌属(如结核分歧杆菌)和铜绿假单胞菌。例如，细菌感染可以是败血症或结核病。可以治疗的病毒感染实例包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞绒毛膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒和人类乳头瘤病毒(HPV)感染。可以治疗的真菌感染示例包括链格孢属、曲霉属、假丝酵母菌属和荚膜组织胞浆菌属。真菌感染可以是真菌败血症或组织胞浆菌病。可以治疗的寄生虫感染实例包括疟原虫属物种(如恶性疟原虫、约氏疟原虫(Plasmodium yoeli)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)或卡鲍迪-卡鲍迪疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi))感染。寄生虫感染可以是疟疾、利什曼病和弓形虫病等疾病。
在一些实施方案中，根据本公开的待治疗/预防的疾病/病症为以抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例减少或较低为特征的癌症。
在一些实施方案中，根据本公开的待治疗/预防的疾病/病症为以CD8+T细胞活性减少或较低为特征的癌症。
在一些实施方案中，根据本公开的待治疗/预防的疾病/病症为以耗竭T细胞水平上升或偏高为特征的癌症。
在一些实施方案中，根据本公开的待治疗/预防的疾病/病症为以肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例上升或偏高为特征的癌症。
在一些实施方案中，根据本公开的待治疗/预防的疾病/病症为以M1型巨噬细胞的数量和/或比例减少或较低为特征的癌症。
在一些实施方案中，根据本公开的待治疗/预防的疾病/病症为以M1型巨噬细胞活性减少或较低为特征的癌症。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子通过一种不涉及Fc区介导的效应器功能(如ADCC、ADCP、CDC)的分子机制发挥其治疗/预防作用。在一些实施方案中，所述分子机制不涉及抗原结合分子与Fcγ受体(如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一种或多种)的结合。在一些实施方案中，所述分子机制不涉及抗原结合分子与补体蛋白(如C1q)的结合。
在一些实施方案中(如实施方案中抗原结合分子缺少Fc区，或实施方案中抗原结合分子包括无法诱导Fc介导抗体效应功能的Fc区)，治疗无法诱导/增加VISTA表达细胞的杀伤。在一些实施方案中，治疗无法减少VISTA表达细胞的数量/比例。
在一些实施方案中，治疗(i)抑制VISTA介导的信号传导，和(ii)无法诱导/增加VISTA表达细胞的杀伤。在一些实施方案中，治疗(i)抑制VISTA介导的信号传导，和(ii)无法减少VISTA表达细胞的数量/比例。
在一些实施方案中，可以根据如从受试者获得的样本中对包括表达VISTA的细胞(例如MDSC)的癌症的检测，或对包括表达VISTA的细胞(例如MDSC)的肿瘤的检测，选择受试者进行本文所述的治疗。在一些实施方案中，可以根据如从受试者获得的样本中对包括表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞的癌症检测，或对包括表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞的肿瘤检测，选择受试者进行本文所述的治疗。
在一些实施方案中，可以根据以下检测结果选择受试者进行本文所述的治疗：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例较低；
(ii)CD8+T细胞活性较低；
(iii)耗竭T细胞出现或数量/比例上升或偏高；
(iv)TAM出现或数量/比例上升或偏高；
(v)M1型巨噬细胞的数量/比例减少或较低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性减少或较低；
例如在外周，或在受疾病/病症影响的器官/组织(例如表现出疾病/病症症状的器官/组织)，或在肿瘤内(例如在肿瘤微环境中)。所述疾病/病症可以影响任何组织或器官或器官系统。在一些实施方案中，所述疾病/病症可以影响多个组织/器官/器官系统。
在一些实施方案中，可以根据确定受试者外周中或器官/组织或肿瘤中(如肿瘤微环境中)的上述(i)至(vi)一项或多项相对于参考水平，如具有相同类型癌症的受试者中的相应数量/比例/活性，选择受试者进行本文所述的治疗/预防。
最好以“治疗有效”或“预防有效”的量施用本公开的物品，这足以对受试者产生治疗或预防效果。实际给药量、给药速度和给药时间将取决于疾病/病症的性质和严重程度以及给药的特定物品。开具治疗处方，如决定用量等，属于全科医生和其他医生的职责范围，通常要考虑到待治疗的疾病/病症、单个受试者的状况、给药部位、给药方法和医生已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以参见《雷明顿制药科学》，2000年第20版，Lippincott，Williams&Wilkins出版社。
可以单独给药，也可以与其他治疗方法联合给药，可以同时给药或顺序给药，这取决于待治疗的病症。本文所述的抗原结合分子或组合物与治疗剂可以同时或顺序给药。
在一些实施方案中，所述方法包括额外的治疗或预防干预，如用于治疗/预防癌症。在一些实施方案中，治疗或预防干预选自化疗、免疫治疗、放疗、手术、疫苗接种和/或激素治疗。在一些实施方案中，治疗或预防干预包括白细胞单采技术。在一些实施方案中，治疗或预防干预包括干细胞移植。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子与能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的制剂联合给药。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子是PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT或BTLA等。在一些实施方案中，所述抗原结合分子与能够促进共刺激受体介导的信号传导的制剂联合给药。在一些实施方案中，所述共刺激受体为CD28、CD80、CD40L、CD86、OX40、4-1BB、CD27或ICOS等。
因此，本公开提供了包含根据本公开的物品(例如根据本公开的抗原结合分子)和能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号的制剂的组合物。还提供了包含本公开的物品和能够促进共刺激受体介导的信号传导的制剂的组合物。还提供了此类组合物在本文所述疾病/病症的医疗和预防方法中的用途。
还提供了治疗/预防本文所述疾病/病症的方法，包括施用根据本公开的物品(例如根据本公开的抗原结合分子)和能够抑制由VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导的制剂。还提供了治疗/预防本文所述疾病/病症的方法，包括施用根据本公开的物品(例如根据本公开的抗原结合分子)和能够促进共刺激受体介导的信号传导的制剂。
本领域已知能够抑制免疫检查点分子介导的信号传导的制剂，包括能够与免疫检查点分子或其配体结合并抑制免疫检查点分子介导的信号传导的抗体等。其他能够抑制免疫检查点分子介导的信号传导的制剂包括能够减少免疫检查点分子或免疫检查点分子配体的基因/蛋白表达的制剂(例如，通过抑制编码免疫检查点分子/配体的基因转录，抑制编码免疫检查点分子/配体的RNA的转录后加工，降低编码免疫检查点分子/配体的RNA的稳定性、促进编码免疫检查点分子/配体的RNA降解、抑制免疫检查点分子/配体的翻译后加工、降低免疫检查点分子/配体的稳定性或促进免疫检查点分子/配体的降解)，以及小分子抑制剂。
本领域已知能够促进共刺激受体介导的信号传导的制剂，包括能够与共刺激受体结合并触发或增加共刺激受体介导的信号传导的激动剂抗体等。其他能够促进共刺激受体介导的信号传导的制剂包括能够增加共刺激受体或共刺激受体配体的基因/蛋白表达的制剂(例如，通过促进编码成本调控受体/配体的基因转录、促进编码共刺激受体/配体的RNA的转录后加工、增加编码共刺激受体/配体的RNA的稳定性、抑制编码共刺激受体/配体的RNA的降解，促进共刺激受体/配体的翻译后加工，提高共刺激受体/配体的稳定性，或抑制共刺激受体/配体的降解)，以及小分子激动剂。
VISTA表达MDSC的免疫抑制与利用能够抑制免疫检查点分子介导的信号传导的制剂进行治疗的失效和耐药性发展有关。Gao等，《自然医学》(2017)23:551-555近期说明VISTA可能是伊匹木单抗(即抗CTLA-4抗体)作用于前列腺肿瘤后的一种代偿性抑制途径。
在特定的实施方案中，本公开的抗原结合分子与能够抑制PD-1介导的信号传导的制剂联合给药。能够抑制PD-1介导的信号传导的制剂可以是PD-1或PD-L1靶向制剂。能够抑制PD-1介导的信号传导的制剂可以是如能够与PD-1或PD-L1结合并抑制PD-1介导的信号传导的抗体。在一些实施方案中，所述制剂是一种拮抗剂抗PD-1抗体。在一些实施方案中，所述制剂是一种拮抗剂抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与能够抑制CTLA-4介导的信号传导的制剂联合给药。所述能够抑制CTLA-4介导的信号传导的制剂可以是CTLA-4靶向制剂，或靶向CTLA-4配体(如CD80或CD86)的制剂。在一些实施方案中，所述能够抑制CTLA-4介导的信号传导的制剂可以是能够与CTLA-4、CD80或CD86结合并抑制CTLA-4介导的信号传导的抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与能够抑制LAG-3介导的信号传导的制剂联合给药。所述能够抑制LAG-3介导的信号传导的制剂可以是LAG-3靶向制剂，或靶向LAG-3配体(如II型MHC)的制剂。在一些实施方案中，所述能够抑制LAG-3介导的信号传导的制剂可以是能够与LAG-3或如II型MHC结合并抑制LAG-3介导的信号传导的抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与能够抑制TIM-3介导的信号传导的制剂联合给药。所述能够抑制TIM-3介导的信号传导的制剂可以是TIM-3靶向制剂，或靶向TIM-3配体(如半乳糖凝集素9)的制剂。在一些实施方案中，所述能够抑制TIM-3介导的信号传导的制剂可以是能够与TIM-3或如半乳糖凝集素9结合并抑制TIM-3介导的信号传导的抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与能够抑制TIGIT介导的信号传导的制剂联合给药。所述能够抑制TIGIT介导的信号传导的制剂可以是TIGIT靶向制剂，或靶向TIGIT配体(如CD113、CD112或CD155)的制剂。在一些实施方案中，所述能够抑制TIGIT介导的信号传导的制剂可以是能够与TIGIT、CD113、CD112或CD155结合并抑制TIGIT介导的信号传导的抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与能够抑制BTLA介导的信号传导的制剂联合给药。所述能够抑制BTLA介导的信号传导的制剂可以是BTLA靶向制剂，或靶向BTLA配体(如HVEM)的制剂。在一些实施方案中，所述能够抑制BTLA介导的信号传导的制剂可以是能够与BTLA或HVEM结合并抑制BTLA介导的信号传导的抗体。
在一些实施方案中，采用本公开的抗原结合分子和能够抑制由免疫检查点分子(如PD-1和/或PD-L1)介导的信号传导的制剂联合的方法，与作为单一疗法使用其中一种制剂时观察到的效果相比，治疗效果有所改善。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子与能够抑制由免疫检查点分子(如PD-1和/或PD-L1)介导的信号传导的制剂联合使用，可以提供协同(即超加性)治疗效果。
在一些实施方案中，使用包含(i)本公开的抗原结合分子和(ii)能够抑制由免疫检查点分子(如PD-1和/或PD-L1)介导的信号传导的制剂的组合进行治疗可能与以下一种或多种情况有关：
·与单独使用组合中任何一种成分的治疗效果相比，治疗效果有所改善；
·与单独使用组合中任何一种成分的治疗效果相比，治疗效果具有协同作用(即超加性)；
·与单独使用组合中任何一种成分的治疗效果相比，对肿瘤生长的抑制有所增加；
·与单独使用组合中任何一种成分的治疗效果相比，对肿瘤生长的抑制具有协同作用(即超加性)；
·与单独使用组合中任何一种成分所减少的抑制性免疫细胞的数量/活性相比，进一步减少抑制性免疫细胞的数量/活性；
·与单独使用组合中任何一种成分所减少的抑制性免疫细胞的数量/活性相比，对抑制性免疫细胞数量/活性的减少具有协同作用(即超加性)；
·与单独使用组合中任何一种成分所减少的抑制性免疫细胞的增殖相比，进一步减少抑制性免疫细胞的增殖；
·与单独使用组合中任何一种成分所减少的抑制性免疫细胞的增殖相比，对抑制性免疫细胞增殖的减少具有协同作用(即超加性)；
·与单独使用组合中任何一种成分所减少的抑制性免疫细胞的比例相比，进一步减少细胞群(如CD45+细胞，如获取自肿瘤的CD45+细胞)中抑制性免疫细胞的比例；和
·与单独使用组合中任何一种成分所减少的抑制性免疫细胞的比例相比，对细胞群(如CD45+细胞，如获取自肿瘤的CD45+细胞)中抑制性免疫细胞比例的减少具有协同作用(即超加性)；
·与单独使用组合中任何一种成分所增加的抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例和/或活性相比，进一步增加抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例和/或活性；
·与单独使用组合中任何一种成分所增加的抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例和/或活性相比，对抗原特异性CD8+T细胞数量和/或比例和/或活性的增加具有协同作用(即超加性)；
·与单独使用组合中任何一种成分所降低的T细胞耗竭水平相比，进一步降低T细胞耗竭水平；
·与单独使用组合中任何一种成分所降低的T细胞耗竭水平相比，对T细胞耗竭水平的降低具有协同作用(即超加性)。
同时给药是指将抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种表达载体)、细胞或组合物和治疗剂一起给药，例如作为含有两种制剂的药物组合物(联合制剂)，或紧接着给药，并可选择通过相同的给药途径，例如同一动脉、静脉或其他血管。顺序给药是指在给定时间间隔后，先施用一种抗原结合分子/组合物或治疗剂，然后单独施用另一种药剂。这两种药剂的给药途径并不要求相同，尽管在一些实施方案中会出现这种情况。时间间隔可以是任何时间间隔。
化疗和放疗分别指用药物或电离辐射(如使用X射线或γ射线的放疗)治疗癌症。所述药物可以是化学实体，如小分子药物、抗生素、DNA中间体、蛋白质抑制剂(如激酶抑制剂)，或生物制剂，如抗体、抗体片段、核酸适配体、核酸(如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白质。所述药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可以包括一种或多种药物(如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
治疗可能涉及施用一种以上的药物。药物可以单独施用，也可以与其他疗法联合施用，可以同时施用，也可以顺序施用，这取决于待治疗的病症。例如，化疗可以是一种联合疗法，涉及两种药物的施用，其中一种或多种药物可以用于治疗癌症。
化疗可以通过一种或多种给药途径进行给药，如肠外、静脉注射、口服、皮下、皮内或瘤内。
化疗可以根据治疗方案进行。所述治疗方案可以是预先确定的化疗时间表、计划、方案或日程表，可以由医生或执业医师制定，并可以根据需要治疗的患者量身定制。治疗方案可以说明以下一项或多项内容：对患者进行化疗的类型；每种药物或放射线的剂量；给药之间的时间间隔；每次治疗的时间长度；任何间断治疗(如有)的次数和性质等。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，说明每种药物的给药方式。
化疗药物可以选自：阿贝西利、醋酸阿比特龙、Abitrexate(甲氨蝶呤)、白蛋白紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿可替尼、AC-T、本妥昔单抗(维布妥昔单抗)、ADE、恩美曲妥珠单抗、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、Akynzeo(奈妥匹坦和盐酸帕洛诺司琼)、Aldara(咪喹莫特)、阿地白介素、Alecensa(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿仑单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、库潘尼西(盐酸可泮利塞)、马法兰注射剂(盐酸美法仑)、马法兰片(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、布吉他滨(布格替尼)、苯丁酸氮芥(氯恩巴锡)、苯丁酸氮芥(氯恩巴锡)、氨磷汀、氨酮戊酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、Aredia(帕米膦酸二钠)、Arimidex(阿那曲唑)、Aromasin(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(奥法妥木单抗)、门冬酰胺酶、阿替利珠单抗、Avastin(贝伐珠单抗)、阿维单抗、阿基仑赛、阿西替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维单抗)、BEACOPP、Becenum(卡莫斯汀)、Beleodaq(贝林司他)、贝林司他、盐酸苯达莫斯汀、BEP、Besponsa(奥加伊妥珠单抗)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(碘[131I]托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫斯汀)、博来霉素、贝林妥欧单抗、Blincyto(贝林妥欧单抗)、硼替佐米、Bosulif(伯舒替尼)、伯舒替尼、维布妥昔单抗、布格替尼、BuMel、白消安、白消安(Busulfan)、卡巴他赛、卡博替尼(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、Calquence(阿可拉布替尼)、Campath(阿仑单抗)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、氟尿嘧啶(外用氟尿嘧啶)、卡铂、CARBOPLATIN-TAXOL、卡非佐米、Carmubris(卡莫斯汀)、卡莫斯汀、移植卡莫斯汀、Casodex(比卡鲁胺)、CEM、赛瑞替尼、Cerubidine(盐酸柔红霉素)、Cervarix(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、CHLORAMBUCIL-PREDNISONE、CHOP、顺铂、克拉屈滨、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、可美替尼、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、盐酸可泮利塞、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(放线菌素D)、Cotellic(可美替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫西尤单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、甲磺酸达拉非尼、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷妥尤单抗、Darzalex(达雷妥尤单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素2、地舒单抗、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、右雷佐生、达妥昔单抗、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗、Efudex(外用氟尿嘧啶)、Elitek(拉布立海)、Ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、Eloxatin(奥沙利铂)、艾曲波帕乙醇胺、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸恩地西平、恩扎卢胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾立布林、Erivedge(维莫他吉)、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(门冬酰胺酶)、Ethyol(氨磷汀)、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射剂)、5-FU(外用氟尿嘧啶)、Fareston(托瑞米芬)、Farydak(乳酸帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludar(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(外用氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶注射剂、外用氟尿嘧啶、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-BEVACIZUMAB、FOLFIRI-CETUXIMAB、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、Gardasil(重组HPV四价疫苗)、Gardasil9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(奥妥珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、GEMCITABINE-CISPLATIN、GEMCITABINE-OXALIPLATIN、吉妥珠单抗、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(移植卡莫斯汀)、Gliadel wafer(移植卡莫斯汀)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾立布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、Herceptin(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸托泊替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(哌柏西利)、替伊莫单抗、伊布替尼、ICE、Iclusig(盐酸普纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾德拉尼、Idhifa(甲磺酸恩地西平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(伊布替尼)、Imfinzi(度伐利尤单抗)、咪喹莫特、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿西替尼)、奥加伊妥珠单抗、重组干扰素Alfa-2b、白细胞介素-2(阿地白介素)、Intron A(重组干扰素Alfa-2b)、碘[131I]托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹木单抗、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、枸橼酸伊沙佐米、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸卢克替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(恩美曲妥珠单抗)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(帕博利珠单抗)、Kisqali(瑞波西利)、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸帕拉替尼、Lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸仑伐替尼、Lenvima(甲磺酸仑伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(盐酸氨酮戊酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶)、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、LupronDepot(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(二甲基亚砜曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲铜、exate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、Myleran(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥珠单抗)、NanoparticlePaclitaxel(紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂)、Navelbine(长春瑞滨双酒石酸盐)、奈妥木单抗、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、Neulasta(培非格司亭)、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(枸橼酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕利、纳武利尤单抗、Nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、奥妥珠单抗、Odomzo(磷酸索立德吉)、OEPA、奥法妥木单抗、OFF、奥拉帕利、奥拉单抗、高山尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素2)、Opdivo(纳武利尤单抗)、OPPA、甲磺酸奥希替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂、PAD、哌柏西利、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、乳酸帕比司他、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、培唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、培非格司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、PEG-Intron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸普纳替尼、Portrazza(奈妥木单抗)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(地舒单抗)、Promacta(艾曲波帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、普列威(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯嘌呤)、Purixan(巯嘌呤)、[无项目]、二氯化镭、盐酸雷洛昔芬、雷莫西尤单抗、拉布立海、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、琥珀酸瑞波西利、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦水合物、罗米地辛、罗米司亭、Rubidomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(芦卡帕利)、芦卡帕利、磷酸芦可替尼、Rydapt(米哚妥林)、Sclerosol Intrapleural Aerosol(Talc)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、Somatuline Depot(醋酸兰瑞肽)、磷酸索立德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、Sterile Talc Powder(Talc)、Steritalc(Talc)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高山尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(甲磺酸达拉非尼)、Tagrisso(甲磺酸奥希替尼)、Talc、Talimogene Laherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Tecentriq(阿替利珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、塞替派、Tisagenlecleucel、Tolak(外用氟尿嘧啶)、盐酸托泊替康、托瑞米芬、Torisel(替西罗莫司)、托西莫单抗和碘[131I]托西莫单抗、Totect(右雷佐生)、TPF、曲贝替定、二甲基亚砜曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫斯汀)、曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(达妥昔单抗)、尿苷三乙酸酯、VAC、戊柔比星、Valstar(戊柔比星)、凡德他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉匹坦水合物)、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼、Venclexta(维奈克拉)、维奈克拉、Verzenio(阿贝西利)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、长春瑞滨双酒石盐酸、VIP、维莫地吉、Vistogard(尿苷三乙酸酯)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(培唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(亚叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地舒单抗)、Xofigo(二氯化镭)、Xtandi(恩扎卢胺)、Yervoy(伊匹木单抗)、Yescarta(阿基仑赛)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕利)、Zelboraf(维莫非尼)、Zevalin(替伊莫单抗)、Zinecard(右雷佐生)、阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zydelig(艾德拉尼)、Zykadia(塞瑞替尼)和Zytiga(醋酸阿比特龙)。
可以提供多种剂量的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种表达载体)、细胞或组合物。在提供一个或多个剂量或每个剂量的同时，可以同时或顺序施用另一种治疗剂。
多个剂量之间可以有一个预定的时间间隔，所述时间间隔选自下组之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天，或1、2、3、4、5、或6个月。举例来说，可以每7天、14天、21天或28天(正负3天、2天或1天)给药一次。
本公开还提供了用于确定受试者对本文所述治疗/预防干预的反应的方法，例如，受试者对干预的反应包括向受试者施用根据本公开的抗原结合分子。
执行这些方法的目的可以是确定受试者对干预做出反应(例如正向反应)。执行这些方法的目的可以是确定受试者对干预没有反应。
在一些方面和实施方案中，所述方法包括分析受试者的癌症/肿瘤从而确定：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量/比例；
(ii)CD8+T细胞活性；
(iii)耗竭T细胞水平；
(iv)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量/比例；
(v)M1型巨噬细胞的数量/比例减少或较低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性减少或较低。
在一些实施方案中，所述方法包括在第一个时间点和后续的时间点对上述(i)至(vi)中的一项或多项进行分析。在一些实施方案中，所述方法包括在多个时间点分析受试者的癌症/肿瘤，以确定上述(i)至(vi)中的一项或多项。
在一些实施方案中，根据前段所述的第一个时间点是在根据本公开的抗原结合分子给药之前。在一些实施方案中，所述第一个时间点是在根据本公开的抗原结合分子给药之时或给药过程中。在一些实施方案中，所述后续的时间点是在根据本公开的抗原结合分子给药之后(如一剂或多剂抗原结合分子给药后)。在一些实施方案中，所述后续的时间点是用根据本公开的抗原结合分子治疗之后(如最后一剂抗原结合分子给药后)。一些实施方案在，一剂或多剂根据本公开的抗原结合分子(如结合VISTA的抗原结合分子)在第一个时间点和后续的时间点之间施用于受试者。
在一些实施方案中，所述时间间隔选自下组之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天，或1、2、3、4、5、或6个月。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定在第一时间点和后续时间点确定的上述(i)至(vi)中的一项或多项之间的差异。
在一些实施方案中，相对于第一时间点，在后续时间点确定的一项：
(vii)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例提高；
(viii)CD8+T细胞的活性提高；
(ix)耗竭T细胞的水平降低；
(x)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例降低；
(xi)M1型巨噬细胞的数量和/或比例提高；和/或
(xii)M1型巨噬细胞的活性提高，
表明对根据本公开的抗原结合分子的干预有正向反应。
在一些实施方案中，在后续时间点确定的(i)至(vi)中的一项或多项相对于第一时间点无差异(例如无显著差异)表明对根据本公开的抗原结合分子的治疗无反应。
在一些实施方案中，相对于第一时间点，在后续时间点确定的一项：
(xiii)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例降低；
(xiv)CD8+T细胞的活性降低；
(xv)耗竭T细胞的水平提高；
(xvi)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例提高；
(xvii)M1型巨噬细胞的数量和/或比例降低；和/或
(xviii)M1型巨噬细胞的活性提高，
表明对根据本公开的抗原结合分子的治疗无反应。
检测方法
本公开还提供了用于检测、定位或成像VISTA或表达VISTA的细胞(如MDSC)的方法的本公开物品。本文所述的抗原结合分子可以用于结合抗原结合分子与VISTA的方法中。此类方法可能涉及抗原结合分子与VISTA结合复合物的检测。
特别是，VISTA的检测可以用于诊断/预后与表达VISTA的细胞(如MDSC)有病理牵连的疾病/病症、识别有患此类疾病/病症风险的受试者，和/或可以用于预测受试者对治疗干预的反应的方法。
因此，提供了一种方法，包括将含有或疑似含有VISTA的样品与本文所述的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与VISTA形成的复合物。还提供了一种方法，包括将含有或怀疑含有表达VISTA的细胞的样品与本文所述的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子和表达VISTA的细胞形成的复合物。
样本可以取自任何组织或体液。所述样本可以包括或来源于：一定量的血液；一定量的血清，该血清来源于个体血液，可以包括去除纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液中的液体部分；组织样本或活检；胸腔积液；脑脊液(CSF)；或从所述个体分离的细胞。在一些实施方案中，所述样本可以从组织或受疾病/病症影响的组织(如表现出疾病症状的组织，或参与疾病/病症发病机制的组织)中获取或衍生。在一些实施方案中，所述样本可以从癌症、肿瘤或其细胞中获取或衍生。
适当的方法形式是本领域众所周知的，包括免疫谱分析，如夹心测定法，如ELISA。所述方法可以涉及用可检测的分子标记抗原结合分子或靶标，或两者，如本文所述的荧光标记、磷光标记、发光标记、免疫检测标记、放射性标记、化学标记、核酸标记或酶标记。检测技术为本领域技术人员所熟知，可以根据标记试剂的不同选择相应的检测技术。
此类方法可以为疾病或病症(如癌症)的诊断和/或预后评估方法提供基础。此类方法可以在体外对患者样本进行检测，或在对患者样本进行处理后进行检测。一旦采集到样本，体外方法的实施就不需要患者在场，因此该方法可以不在人体或动物身上实施。在一些实施方案中，该方法在体内进行。
样品中的检测可以用于疾病/病症(如癌症)的诊断、疾病/病症的易感性或提供疾病/病症(如本文所述的疾病/病症)的预后(预测)。诊断或预后可能与现有(先前诊断出的)疾病/状况有关。
本公开内容还提供了选择/分层受试者以接受VISTA靶向药物治疗的方法。在一些实施方案中，根据本公开内容选择受试者进行治疗/预防，或根据从受试者获得的样本中检测/量化VISTA或表达VISTA的细胞，确定受试者将从这种治疗/预防中获益。
此类方法可以包括检测或量化如患者样本中的VISTA和/或表达VISTA的细胞(如MDSC)。如果该方法包括量化相关因子，则所述方法可以进一步包括将确定的量与标准值或参考值进行比较，作为诊断或预后评估的一部分。其他诊断/预后检测可与本文所述检测结合使用，以提高诊断或预后的准确性，或确认通过本文所述检测获得的结果。
如果在从受试者获得的样本中检测到VISTA水平升高，或检测到表达VISTA的细胞(如MDSC)的存在--或数量/比例升高，则该受试者可以被诊断为患有与MDSC在病理上相关的疾病/病症，或有罹患此类疾病/病症的风险。在这种方法中，细胞表达水平或数量/比例的“增加”是指其水平/数量/比例高于为适当的对照条件确定的水平/数量/比例，例如在可比样本(例如同类样本，如从相同的液体、组织、器官等中获得的样本)中检测到的水平/数量/比例，例如取自健康受试者。
与在可比样本(例如同类样本，如从相同的液体、组织、器官等中获得的样本)中确定具有较低水平的VISTA，或表达VISTA的细胞(如MDSC)数量/比例减少的受试者相比，当检测到VISTA水平升高，或从受试者获取的样本中检测到表达VISTA的细胞(如MDSC)的存在或数量/比例升高时，该受试者的预后可能较差。
本公开的抗原结合分子还可以用于预测对免疫疗法反应的方法。“免疫疗法”一般是指旨在利用免疫系统治疗疾病/病症的治疗干预。免疫疗法包括增加受试者体内效应免疫细胞(如效应T细胞(如抗原特异性T细胞、CAR-T细胞)、NK细胞)数量/比例/活性的治疗干预。增加效应免疫细胞数量/比例/活性的免疫疗法包括促进效应免疫细胞增殖和/或存活、抑制免疫检查点分子介导的信号传导、促进共刺激受体介导的信号传导、增强抗原递呈细胞的抗原递呈等。增加效应免疫细胞数量/比例/活性的免疫疗法还包括通过干预增加受试者体内具有所需特异性或活性的效应免疫细胞的频率，例如通过过继性细胞转移(ACT)。ACT一般包括从受试者体内获取免疫细胞，通常是抽取血液样本，从中分离出免疫细胞。然后，通常会以某种方式处理或改变这些细胞，然后将其施用给相同受试者或不同的受试者。ACT的目的通常是为受试者提供具有某些所需特征的免疫细胞群，或增加受试者体内具有这些特征的免疫细胞的频率。在一些实施方案中，ACT可以是包含靶向目标抗原或相关细胞类型的特异性嵌合抗原受体(CAR)的细胞。免疫疗法还包括减少受试者体内抑制性免疫细胞(如调节性T细胞、MDSC)数量/比例/活性的治疗干预。免疫疗法还包括减少受试者中抑制性免疫细胞(如调节T细胞，MDSC)数量/比例/活性的治疗干预。减少抑制性免疫细胞数量/比例/活性的免疫疗法包括干预以造成或增强细胞对抑制性免疫细胞的杀伤力，并抑制免疫检查点分子介导的信号传导。
在检测到VISTA水平升高的情况下，或在从受试者获取的样本中检测到存在表达VISTA细胞(如MDSC)的存在或其数量/比例升高的情况下，与在可比样本(例如同类样本，如从相同的液体、组织、器官等中获得的样本)中确定具有较低水平的VISTA，或表达VISTA的细胞(如MDSC)数量/比例减少的受试者相比，可以预测所述受试者对旨在增加受试者体内效应免疫细胞的数量/比例/活性的免疫疗法的反应较差。在检测到VISTA水平升高的情况下，或在从受试者获取的样本中检测到存在表达VISTA细胞(如MDSC)的存在或其数量/比例升高的情况下，与在可比样本(例如同类样本，如从相同的液体、组织、器官等中获得的样本)中确定具有较低水平的VISTA，或表达VISTA的细胞(如MDSC)数量/比例减少的受试者相比，可以预测所述受试者对旨在减少受试者体内抑制性免疫细胞的数量/比例/活性的免疫疗法的反应有所改善。
在一些实施方案中，所述方法包括确定抑制免疫细胞区和效应免疫细胞区的相对大小/活性。例如，在一些实施方案中，所述方法采用本文所述的抗原结合分子来确定表达VISTA的细胞(如MDSC、TAM、中性粒细胞)与效应免疫细胞的比例。与比率较低的受试者相比，比率升高的受试者对旨在减少抑制性免疫细胞数量/比例/活性的免疫疗法的反应有所改善，和/或对旨在增加效应免疫细胞数量/比例/活性的免疫疗法的反应较差。
本公开内容的诊断和预后方法可以在疾病和/或治疗过程中的多个时间点对取自受试者的样本执行，并可以用于监测疾病/病症随时间的发展，例如对所述受试者所接受治疗的反应。根据这些方法得出的表征结果可以用于为临床决策提供信息，以决定何时以及对受试者进行何种治疗。
可以在体外对取自受试者的样本进行诊断或预后的方法，也可以在对取自受试者的样本进行处理之后进行。样本采集完成后，患者无需在场即可进行体外诊断或预后方法，因此该方法可以不在人体或动物身上进行。
诊断和患者选择
本公开内容还提供了与本文所述癌症的治疗和预防有关的诊断、预后和预测方法。
这些方法可以用于诊断癌症(如本文所述的癌症)。可以为确定/选择本文所述的治疗/预防干预对象而执行所述方法。
在一些方面和实施方案中，所述方法包括分析受试者的癌症，以确定该癌症是否为本文所述的癌症，例如，以存在表达VISTA的细胞为特征的癌症，和/或以存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞为特征的癌症。
在一些实施方案中，所述方法包括评估癌症，以确定其是否包含表达VISTA的细胞和/或表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。在一些实施方案中，所述方法包括评估受试者说取自受试者的样本，以确定所述受试者是否包含癌细胞邻近或附近的表达VISTA的细胞和/或表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。
经上述分析确定为存在表达VISTA的细胞和/或存在表达VISTA的相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞的癌症，可以确定为适合用本公开的抗原结合分子(例如抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间相互作用的抗原结合分子)进行干预的癌症。
在一些方面和实施方案中，所述方法包括分析受试者的癌症(例如受试者的肿瘤)，以确定所述癌症是否为本文所述的癌症，例如具有以下特征的癌症：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例降低或较低；
(ii)CD8+T细胞活性降低或较低；
(iii)耗竭T细胞出现或数量/比例较高；
(iv)TAM出现或数量/比例较高；
(v)M1型巨噬细胞的数量/比例减少或较低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性减少或较低。
在一些实施方案中，所述方法包括评估受试者的癌症(例如受试者的肿瘤)，以确定其是否包括/以上述(i)至(vi)中一项或多项为特征。通过上述分析确定为具有上述(i)至(vi)中一项或多项特征的癌症，可以确定为适合用本公开的抗原结合分子进行干预的癌症。
本公开的多个方面和实施方案还包括选择受试者接受根据本公开的治疗或预防干预。
在一些实施方案中，根据对癌症的分析结果，确定癌症是否以存在表达VISTA的细胞和/或存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)为特征，根据本公开内容选择/不选择受试者进行治疗干预。
具有经过这种分析被确认为以存在表达VISTA的细胞和/或存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)为特征的癌症的受试者，可以选择使用根据本公开的抗原结合分子(例如，抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用的抗原结合分子)进行治疗。
在一些实施方案中，方法包括根据本公开内容，选择受试者用与VISTA结合的抗原结合分子进行治疗，该受试者的癌症特征是存在表达VISTA的细胞和/或存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。
在一些方面和实施方案中，所述方法包括：
(a)分析受试者的癌症，以确定癌症的特征是否为存在表达VISTA的细胞和/或存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞；和
(b)根据本公开的抗原结合分子(例如抑制VISTA和VISTA相互作用伴侣之间相互作用的抗原结合分子)选择受试者进行治疗，其中受试者的癌症在步骤(a)中被确定为以存在表达VISTA的细胞和/或存在表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞为特征的癌症。
在一些实施方案中，所述方法还包括：
(c)向步骤(b)中选定的接受治疗的受试者施用根据本公开的抗原结合分子(例如，抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用的抗原结合分子)。
对受试者或癌症的分析可以包括分析取自受试者的样本，以确定所述样本是否包括表达VISTA的细胞和/或表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。分析可以包括对样本进行分析，以确定其是否包括在细胞表面中或细胞表面上表达VISTA的细胞和/或在细胞表面中或细胞表面上表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。
可以理解，所述样本是含有细胞的样本。所述样本可以是受试者的组织/器官，例如，受癌症影响的器官(例如，出现癌症症状的组织/器官)。所述样本可以是肿瘤。所述样本可以是活组织切片。这种分析优选在体外进行，但也可以选择在人体或动物体内进行。
分析特定蛋白质表达的适当方法为技术人员所熟知，包括通过基于抗体的方法进行分析，例如通过Western印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学和流式细胞术。根据包括与本文所述诊断方法和患者选择方法有关的样本分析方法，样本分析可以采用免疫组织化学、免疫细胞化学或流式细胞术方法，以检测表达VISTA的细胞和/或表达VISTA相互作用伴侣(例如与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣，如LRIG1或VSIG3)的细胞。
在一些实施方案中，根据对癌症的分析结果，以确定癌症是否具有以下一项或多项特征，从而根据本公开内容选择/不选择受试者进行治疗干预：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例降低或较低；
(ii)CD8+T细胞活性降低或较低；
(iii)耗竭T细胞出现或数量/比例较高；
(iv)TAM出现或数量/比例较高；
(v)M1型巨噬细胞的数量/比例减少或较低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性减少或较低。
可以选择具有上述(i)至(vi)中一项或多项特征的癌症受试者，从而使用根据本公开的抗原结合分子进行治疗。
在一些实施方案中，方法包括选择受试者，根据确定所述受试者患有以上述(i)至(vi)中的一项或多项为特征的癌症，选择受试者接受根据本公开的与VISTA结合的抗原结合分子的治疗。
在一些方面和实施方案中，所述方法包括：
(a)分析受试者的癌症，从而确定所述癌症的特征是否为上述(i)至(vi)中的一项或多项；和
(b)在步骤(a)中确定受试者的癌症为具有上述(i)至(vi)中一项或多项特征的癌症时，选择受试者用根据本公开的抗原结合分子进行治疗。
在一些实施方案中，所述方法还包括：
(c)向步骤(b)中选定的受试者施用根据本公开的抗原结合分子(如于VISTA结合的抗原结合分子)进行治疗。
对受试者或癌症的分析可以包括分析取自受试者的样本(如受试者的癌症/肿瘤样本)，以确定该样本是否包含上述(i)至(vi)中的一项或多项。分析可以包括对样本进行免疫谱分析，例如使用抗体检测细胞类型进行流式细胞术分析。
可以理解，所述样本是含有细胞的样本。所述样本可以是受试者的组织/器官，例如，受癌症影响的器官(例如，出现癌症症状的组织/器官)。所述样本可以是肿瘤。所述样本可以是活组织切片。这种分析优选在体外进行，但也可以选择在人体或动物体内进行。
适当的分析方法包括如样本的免疫谱分析。
受试者
根据本公开的各个方面，受试者可以是任何动物或人类。所述受试者优选地是哺乳动物，更优选地是人类。所述受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选地是人类。所述受试者可以是雄性或雌性。所述受试者可以是病人。受试者可能已被诊断出患有需要治疗的疾病或病症(如癌症)，可能被怀疑患有此类疾病/病症，或可能有罹患/感染此类疾病/病症的风险。
根据本公开内容的实施方式，所述受试者优选地为人类受试者。在一些实施方案中，根据本公开的治疗或预防方法进行治疗的所述受试者为或具有患癌风险。根据本公开内容的实施方式，可以根据此类疾病/病症的特定标志物的特征选择受试者进行治疗。受试者可能患有(例如，可能已被确定患有)本文所述的癌症。
试剂盒
在本公开的一些方面中提供了一种试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒可以有至少一个容器，所述容器含有预定量的本文所述抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种表达载体)、细胞或组合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括生产本文所述抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种表达载体)、细胞或组合物的材料。
所述试剂盒可以提供抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种表达载体)、细胞或组合物，以及向患者给药从而治疗特定疾病/病症的说明书。
在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括至少一个容器，所述容器含有预定量的其他治疗试剂(如抗感染试剂或化疗试剂)。在这种实施方式中，所述试剂盒还可以包括第二药物或药物组合物，两种药物或药物组合物可以同时或分别给药，从而为特定的疾病或病症提供联合治疗。所述治疗试剂还可以配制成适合注射或输注到肿瘤或血液中。
序列同一性
如本文所用，“序列同一性”是指对序列进行比对，必要时引入空位，以达到序列间最大的序列同一性百分比后，主体序列中与参考序列中核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸残基百分比。为了确定两条或多条核酸或氨基酸序列之间序列同一性的百分比，本领域的技术人员已知道多种实现双重和多重序列比对的方法，例如，使用公开的计算机软件如ClustalOmega(J.《生物信息学》(2005)21,951-960)、T-coffee(Notredame等人《J.Mol.Biol.》(2000)302,205-217)、Kalign(Lassmann和Sonnhammer 2005,《BMC生物信息学》,6(298))和MAFFT(Katoh和Standley,《分子生物学和进化》(2013)30(4)772–780))软件。当使用这种软件时，使用默认参数，优选使用如空位罚分和扩展罚分。
序列
编号段落
以下编号段落(段)进一步说明了与本公开内容相关的特征和特征组合：
1.一种任选分离的抗原结合分子，其能够结合VISTA并抑制VISTA介导的信号传导，与Fc介导的功能无关。
2.如段1所述抗原结合分子，其能够在Ig样V型结构域结合VISTA。
3.根据段1或段2，其中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成的多肽。
4.根据段1至3中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子能够结合包括或由SEQ ID NO:31所示氨基酸序列组成的多肽。
5.根据段1至4中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子不与IGN175A竞争结合VISTA。
6.根据段1至5中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子无法与由SEQID NO:275所示氨基酸序列组成的肽结合。
7.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:305所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:306所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:307所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:308所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
8.根据段1至7中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:295所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
9.根据段1至8中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:295所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
10.根据段1至8中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:300所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
11.根据段1至8中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:277所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
12.根据段1至8中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:286所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
13.根据段1至8中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
14.根据段1至8中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:300所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
15.根据段1至7中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
16.根据段1至7中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
17.根据段1至7中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
18.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的LC-CDR3。
19.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的LC-CDR3。
20.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:137所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:138所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:139所示氨基酸序列的LC-CDR3。
21.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的LC-CDR3。
22.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:121所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:122所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:127所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:128所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:129所示氨基酸序列的LC-CDR3。
23.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:145所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:151所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:152所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:153所示氨基酸序列的LC-CDR3。
24.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:158所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:159所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:160所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:165所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:152所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:153所示氨基酸序列的LC-CDR3。
25.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:169所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:170所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:171所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:177所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:179所示氨基酸序列的LC-CDR3。
26.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:246所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:247所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3。
27.根据段1至6或段26中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:185所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:189所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3。
28.根据段1至6或段26中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:195所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:197所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3。
29.根据段1至6或段26中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:200所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:203所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的LC-CDR3。
30.根据段1至6中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:310所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:294所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:297所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:299所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:301所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:302所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:303所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:276所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:282所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:285所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:287所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
包括与SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:40所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:52所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:57所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:62所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:66所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:48所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:50所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:87所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:95所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:106所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:113所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:143所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:150所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:157所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:164所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:71所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:79所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:102所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:104所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:119所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:126所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:183所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:188所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:194所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:196所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:199所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:202所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:133所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:136所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区；
或
包括与SEQ ID NO:168所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:176所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
31.根据段1至30中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子能够结合人VISTA和以下一种或多种：小鼠VISTA和食蟹猴VISTA。
32.一种任选分离的抗原结合分子，其包括(i)根据段1至31中任一项所述的抗原结合分子，和(ii)能够结合VISTA以外抗原的抗原结合分子。
33.根据段1至32中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子能够结合细胞表面表达VISTA的细胞。
34.根据段1至33中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子能够抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用。
35.根据段1至34中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子能够抑制VISTA介导的信号传导。
36.根据段1至35中任一项所述抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子能够提高效应免疫细胞的增殖和/或细胞因子的产生。
37.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括根据段1至36中任一项所述抗原结合分子。
38.一种任选分离的核酸或多种核酸，编码根据段1至36中任一项所述抗原结合分子或根据段37所述的CAR。
39.一种表达载体或多种表达载体，包括根据段38所述的核酸或多种核酸。
40.一种细胞，其包括根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸或根据段39所述的表达载体或多种表达载体。
41.一种方法，其包括在适合表达来自核酸(多种核酸)或表达载体(或多种表达载体)的抗原结合分子或CAR的条件下，培养包含根据段38所述核酸或多种核酸或根据段39所述表达载体或多种表达载体的细胞。
42.一种组合物，其包括根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体或根据段40的细胞。
43.根据段42所述的组合物，其还包括一种能够抑制VISTA以外的免疫检查点分子介导的信号传导，任选地，其中VISTA以外的免疫检查点分子选自PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA。
44.根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体、根据段40的细胞或根据段42或段43所述的组合物在医疗或预防方法中的用途。
45.根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体、根据段40的细胞或根据段42或段43所述的组合物在癌症或传染性疾病治疗或预防方法中的用途。
46.根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体、根据段40的细胞或根据段42或段43所述的组合物的用途，用于制造治疗或预防癌症或传染性疾病的药物。
47.一种治疗或预防癌症或传染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体、根据段40的细胞或根据段42或段43所述的组合物。
48.根据段45所述抗原结合分子、CAR、核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物的用途、段46所述的用途或段47所述的方法，其中，所述癌症选自：包括表达VISTA的细胞的癌症、包括表达VISTA的细胞浸润的癌症、包括表达VISTA的癌细胞的癌症、血液肿瘤、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃瘤、结直肠癌、结直肠瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、三阴性浸润性乳腺癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
49.根据段45至48中任一项所述抗原结合分子、CAR、核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物的用途，其中，所述癌症选自：结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和实体瘤。
50.根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体、根据段40的细胞或根据段42或段43所述的组合物用于治疗或预防与髓系衍生抑制性细胞(MDSC)在病理上相关的疾病的方法。
51.根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体、根据段40的细胞或根据段42或段43所述的组合物的用途，用于制造一种药物，该药物用于治疗或预防与髓系衍生抑制性细胞(MDSC)在病理上相关的疾病。
52.一种治疗或预防与髓系衍生抑制性细胞(MDSC)在病理上相关的疾病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据段1至36中任一项所述抗原结合分子、根据段37所述的CAR、根据段38所述的核酸或多种核酸、根据段39所述的表达载体或多种表达载体、根据段40的细胞或根据段42或段43所述的组合物。
53.根据段45至52任一项所述抗原结合分子、CAR、核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物、其用途或方法，其中，所述方法还包括施用能够抑制VISTA以外免疫检查点分子介导的信号传导的制剂，任选地，其中VISTA以外的免疫检查点分子选自PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA。
54.一种抑制VISTA介导的信号传导的方法，包括将表达VISTA的细胞与根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子接触。
55.一种抑制髓系衍生抑制性细胞(MDSC)活性的方法，所述方法包括将MDSC与根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子接触。
56.一种增加效应免疫细胞数量或活性的方法，所述方法包括用根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子抑制VISTA表达细胞的活性。
57.一种任选分离的体外复合物，包括与VISTA结合的根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子。
58.一种方法，包括将含有或疑似含有VISTA的样品与根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子接触，并检测所述抗原结合分子与VISTA形成的复合物。
59.一种选择或分层受试者以接受VISTA靶向制剂治疗的方法，所述方法包括在体外将取自受试者的样本与根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子接触，并检测所述抗原结合分子与VISTA形成的复合物。
60.根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子作为体外或体内诊断或预后制剂的用途。
61.根据段1至36中任一项所述的抗原结合分子在肿瘤检测、定位或成像方法中的用途，任选地，其中，所述癌症选自：包括表达VISTA的细胞的癌症、包括表达VISTA的细胞浸润的癌症、包括表达VISTA的癌细胞的癌症、血液肿瘤、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃瘤、结直肠癌、结直肠瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、三阴性浸润性乳腺癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
62.根据段61所述用途，其中，所述癌症选自：结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和实体瘤。
以下编号段落(段)进一步说明了与本公开内容相关的特征和特征组合：
1b.结合VISTA的抗原结合分子在治疗或预防受试者癌症的方法中的用途，其中，所述癌症的特征是存在：(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣的细胞；其中，所述抗原结合分子抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用。
2b.结合VISTA的抗原结合分子在制造用于治疗或预防受试者癌症药物中的用途，其中，所述癌症的特征是存在(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣的细胞；其中，所述抗原结合分子抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用。
3b.一种治疗或预防受试者癌症的方法，其中，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的结合VISTA的抗原结合分子，其中，所述癌症的特征是存在(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣的细胞；其中，所述抗原结合分子抑制VISTA与VISTA相互作用伴侣之间的相互作用。
4b.根据段1b所述的抗原结合分子的用途，根据段2b所述用途或根据段3所述方法，其中，所述癌症包括含有：(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达VISTA相互作用伴侣的细胞的肿瘤。
5b.一种选择受试者的方法，用抑制VISTA和与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣之间的相互作用的抗原结合分子进行治疗，包括：
(a)分析受试者的癌症，以确定所述癌症的特征是否为存在：(i)表达VISTA的细胞，和(ii)表达与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣的细胞；和
(b)选择受试者进行抗原结合分子治疗，该抗原结合分子抑制VISTA和与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣之间的相互作用，其中，所述受试者的癌症在步骤(a)中被确定为包括表达VISTA的细胞，和表达与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣的细胞。
6b.根据段5b所述方法，其中，所述方法还包括：
(c)向步骤(b)中选定的受试者施用根据本公开的抗原结合分子(如于VISTA结合的抗原结合分子)进行治疗。
7b.根据段1b至6b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述与VISTA的C-C’区域结合的相互作用伴侣选自：LRIG1和VSIG3。
8b.根据段1b至7b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子通过与SEQ ID NO:340所示中一个或多个氨基酸区域与VISTA结合。
9b.根据段1b至8b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:305所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:306所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:307所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:308所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
10b.根据段1b至9b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链(VH)可变区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链(VL)可变区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:295所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
11b.根据段1b至10b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子包括：
包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VH区；和
包括与SEQ ID NO:297所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
12b.根据段1b至11b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子包括：
包含以下骨架区(FR)的VH区：
具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:292所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:293所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:281所示氨基酸序列的HC-FR4。
13b.根据段1b至12b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子包括：
包含以下骨架区(FR)的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:284所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4。
14b.根据段1b至13b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子包括含有SEQ ID NO:331所示氨基酸序列的重链。
15b.根据段1b至14b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述抗原结合分子包括含有SEQ ID NO:317所示氨基酸序列的轻链。
16b.根据段1b至15b中任一项所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述癌症选自：血液肿瘤、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃瘤、结直肠癌、结直肠瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、三阴性浸润性乳腺癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
17b.根据段16中所述抗原结合分子、其用途或方法，其中，所述癌症选自：结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和实体瘤。
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本公开包括所述方面和优选特征的组合，除非这种组合明显不允许或明确避免。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为对所述主题的限制。
现在将以举例的方式，参照附图说明本公开的各个方面和实施例。对于本领域的技术人员来说，更多的方面和实施例将是显而易见的。文中提及的所有文件均通过引用并入本文作为参考。
在本说明书(包括后面的权利要求书)中，除非上下文另有所指，否则“包括”一词以及“其包括”和“包括了”等变体应理解为包含所述整数或步骤或整数组或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数组或步骤组。
必须注意的是，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。此处的范围可表述为从“大约”一个特定值，和/或到“大约”另一个特定值。当表示这样一个范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。同样，当数值表示为近似值时，通过使用前置词“大约”，可以理解为特定值构成另一个实施方案。
如果本文公开了核酸序列，也可明确考虑其反向互补。
本文所述方法最好在体外进行。术语“体外”是指在细胞培养过程中进行的操作，而术语“体内”是指在完整的多细胞生物体内进行的操作。
附图简述
现在将参照附图讨论说明本公开原理的实施方案和实验。
图1.生物膜干涉法测定的抗VISTA抗体V4-C26、13F3和VSTB112与人VISTA和小鼠VISTA的背景减弱结合信号传感器图。
图2A和2B.施用V4-C26.hIgG4对CT26细胞衍生的结肠癌小鼠模型中肿瘤体积和小鼠存活率的影响图。(2A)显示的是肿瘤体积随时间变化的情况，(2B)显示的是施用抗VISTA抗体V4-C26h IgG4或药物对照的小鼠随时间变化的存活率。
图3A至3H.散点图和图像显示健康组织和特定癌症中VISTA的表达情况，以及特定癌症中VSIG3的表达情况。(3A)通过对包含68,000个健康PBMC的10X Genomics数据进行RNA单细胞分析，识别免疫细胞群。(3B,3C)不同细胞群中VISTA表达的UMAP和单细胞RNA-seq数据汇总图，其中cDC指典型树突状细胞，pDC指质体树突状细胞，HSPC指造血干细胞和祖细胞。(3D)用0.02mg/ml的4M2-C12-mIgG2a染色的健康脾脏、骨髓、乳腺和肺TMA(n＝99)的代表性免疫组化染色结果；放大200倍。(3E)用0.02mg/ml的4M2-C12-mIgG2a染色的三阴性乳腺癌(TNBC；n＝126)和非小细胞肺癌(NSCLC；n＝140)TMA中VISTA的代表性染色，放大200倍；以及(3F)VISTA染色强度为阴性(0)、低(1)、中(2)或高(3)的TNBC、NSCLC、肝细胞癌(HCC)和间皮瘤患者的百分比。(3G)用0.003mg/ml抗VSIG3抗体染色的TNBC(n＝126)和NSCLC(n＝140)TMA中VSIG3的代表性染色结果；放大200倍，以及(3H)VSIG3染色强度为阴性(0)、低(1)、中(2)或高(3)的TNBC、NSCLC、HCC和间皮瘤患者的百分比。
图4A至4G.显示相互作用伴侣与抗体V4-C26 hIgG4结合区域的VISTA蛋白结构。(4A)VISTA同源模型与PDB:5IUS中PD-L1与其配体PD-1结合的复合物叠加。(4B)VISTA蛋白的前C-C’β折叠和环状构成生理相关结合伴侣的预测结合界面。(4C)小鼠、大鼠、食蟹猴和人VISTA蛋白的三维叠加模型，显示C-C’β折叠和环状的序列保守性。(4D)通过计算预测的VISTA抗体阻断靶区的三维模型。(4E)预测的VISTA同源模型，其残基与VSIG3结合相关。(4F)利用氢氘交换质谱(HDXMS)对与VISTA结合的V4-C26 hIgG4进行表位图谱分析。
图5A至5D.显示V4-C26 hIgG4结合特异性的图像。(5A)通过ELISA测定V4-C26hIgG4与所示人B7家族抗原、PD-1和CTLA-4的结合情况(所示数据为n＝2次测量的平均值，误差条为SEM)。(5B)通过ELISA测定V4-C26 hIgG4与人类、非人灵长类(NHP)、大鼠或小鼠VISTA同源物的结合情况(所示数据为n＝3次测量的平均值，误差条为SEM)。(5C)通过流式细胞术测定V4-C26 hIgG4与过表达人、非人灵长类(NHP)、大鼠或小鼠VISTA同源物的HEK293T细胞的结合情况(所示数据为n＝3次测量的平均值，误差条为SEM)。(5D)V4-C26hIgG4与从人、NHP、大鼠或小鼠PBMC分离出来的CD11b+髓系细胞的结合情况(所示数据为n＝3次测量的平均值，误差条为SEM)。
图6A至6E.图表和条形图显示V4-C26 hIgG4抑制VISTA与关键结合伴侣之间的相互作用以及抑制下游活性的能力分析结果。(6A)通过竞争ELISA测定的VISTA-VSIG3相互作用抑制情况(所示数据为n＝3次测量的平均值，误差条为SEM)。(6B)分析VSIG3对IFN-γ水平的抑制作用(24小时后通过ELISA测定)，该抑制作用来自在涂有αCD3单克隆抗体(OKT3)和VSIG3-Fc的平板中培养的PBMC，两者的比例为0:1或1:2(所示数据为n＝3次测量的平均值；误差条为SEM，通过配对t检验获得P值，*p<0.05)。(6C)分析VSIG3对IFN-γ水平的抑制作用(24小时后通过ELISA测量)，该抑制作用来自在涂有αCD3单克隆抗体(OKT3)和VSIG3-Fc的平板上培养的PBMC，比例为1:2，在有V4-C26 hIgG4(HMBD-002)、VSTB112或IgG4同种型对照存在的情况下(所示数据为n＝3次测量的平均值；误差条为SEM，通过单因素方差分析(Tukey多重比较检验)获得P值，**P<0.01)。(6D)在存在或不存在V4-C26 hIgG4(HMBD-002)、VSTB112或IgG4同种型对照的情况下，MDSC与自体PBMC共培养96小时后抗CD3抗体诱导的IFN-γ分泌，用ELISA测量(所示数据为n＝6次测量的平均值，误差条为SEM，通过双因素方差分析(Tukey多重比较检验)获得P值，****p<0.0001)。(6E)使用CellTiter-Glo测定中性粒细胞向涂有C5a的transwell底室迁移的抑制率(所示数据为n＝3次测量的平均值，误差条为SEM)。
图7A和7B.图表和条形图显示V4-C26 hIgG4阻断VISTA对免疫激活的影响分析结果。(7A)利用Luminex在96小时从同种异体混合淋巴细胞反应的上清液中测量了所示细胞因子的水平。V4-C26 hIgG4和抗PD-1抗体帕博利珠单抗(注释为Pembro)的浓度以μg/ml为单位。数据与同种型对照进行了归一化处理。所示数据为n＝10的平均值，误差条为SEM。通过单因素方差分析(Tukey多重比较检验)获得P值，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。(7B)从MLR样本的批量RNA序列中分析得到的Speed2通路(n＝10)。数据归一化至同种型对照，以平均值+SD表示，校正p值来自常规RNA-seq分析，**p<0.01，***p<0.001。
图8A至8G.图表和条形图显示在细胞衍生异种移植(CDX)模型中V4-C26 hIgG4的抗肿瘤反应。对小鼠进行随机分组，并在指定的时间点施用一定浓度的试验品。每周测量两次肿瘤体积。每个数据点代表n＝10只小鼠的平均肿瘤体积+/-SEM。(8A)雌性BALB/c小鼠皮下移植CT26细胞的同源CDX模型结果。(8B)雌性BALB/c小鼠皮下移植CT26细胞，并按所示剂量注射不同剂量V4-C26 hIgG4的同源CDX模型结果。(8C)雌性BALB/c小鼠原位植入过表达VISTA的4T-1细胞的同源CDX模型结果。(8D)皮下移植HCT15细胞的CD34移植人源化雌性HiMice的CDX模型结果。(8E)皮下移植A549细胞的CD34移植人源化雌性HiMice的CDX模型结果。(8F)流式细胞术的细胞谱分析结果，显示CT26CDX模型中肿瘤微环境中的肿瘤浸润白细胞(TIL)群(所示数据为n＝3的平均值，误差条为SEM)。(8G)CT26抗原召回检测的结果，通过TIL(CD45+)与CT26细胞的体外培养来测量裂解情况，或通过肿瘤富集T细胞(CD4+/CD8+)与CT26细胞的培养来测量T细胞的活化，使用ELISA检测IFN-γ的分泌情况(所示数据为n＝3的平均值，误差条为SEM。所有p值均通过非配对t检验得出，*p<0.05，**p<0.01；每个数据点代表一只小鼠)。
图9A和9B.序列比对和VISTA蛋白结构显示(9A)人VISTA(SEQ ID NO:1)与食蟹猴(SEQ ID NO:348)、大鼠(SEQ ID NO:349)和小鼠(SEQ ID NO：350)同源物，以及(9B)VISTA蛋白结构，突出显示了与VSIG3(Arg86、Phe94、Gln95)、PSGL1(His98、His100、His153、His154、His155)和LRIG1(Thr82、Arg87)结合的残基。
图10A至10C.图示4M2-C12-mIgG2a的结合特异性和抗肿瘤功效。(10A)通过ELISA测定，4M2-C12-mIgG2a与所示人B7家族抗原、PD-1和CTLA-4的结合情况。(10B)在小鼠皮下植入EL4细胞的同源CDX模型中，用4M2-C12-mIgG2a(V4P mIgG2A)、在Fc区含有Fc沉默LALAPG取代(V4PmIgG2A-LALAPG)的4M2-C12-mIgG2a(V4PmIgG2A-LALAPG)、或载体(载体对照)处理小鼠的相关结果。(10C)在小鼠皮下植入CT26细胞的同源CDX模型中，用4M2-C12-mIgG2a(V4PmIgG2A)、在Fc区含有Fc沉默LALAPG取代的4M2-C12-mIgG2a(V4PmIgG2A-LALAPG)或载体(载体对照)治疗小鼠的相关结果。
图11A和11B.图示V4-C26 hIgG4(HMBD-002)与(11A)FcγRIII和(11B)C1q蛋白的结合亲和力，由ELISA测定。所示数据为n＝3次测量的平均值，误差条为SEM。
图12A至12G.有关V4-C26 hIgG4与VISTA和同源物结合特性的传感图和表格。(12A)通过生物膜干涉法进行表位分选分析的结果，研究V4-C26 hIgG4、VSTB112和IGN175A与人VISTA的结合情况。信号与基线对齐。(12B)生物膜干涉发进行表位分选分析的结果，研究V4-C26 hIgG4、13F3和MH5A与小鼠VISTA的结合情况。信号与基线对齐。(12C至12F)V4-C26 hIgG4结合(12C)人VISTA、(12D)非人哺乳动物(NHP)、(12E)大鼠VISTA和(12F)小鼠VISTA的计算Kon、Koff和KD传感图。(12G)通过ELISA测定的V4-C26h IgG4与人VISTA在5.5-7.5的pH范围内的关系图和表(所示数据为n＝3次测量的平均值，误差条为SEM)。
图13A至13C.图示(13A)VSIG3和VISTA之间的相互作用，以及(13B)LRIG1和VISTA之间的相互作用，以及(13C)ELISA测定V4-C26 hIgG4(HMBD-002)对LRIG1和VISTA之间相互作用的抑制作用。
图14A和14B.条形图和图表显示V4-C26 hIgG4(HMBD-002)处理对参与免疫反应的基因在PBMC中表达的影响。(14A)对在V4-C26h IgG4或IgG4同种型对照存在下培养96小时的PBMC的常规RNA-seq数据进行KEGG通路分析的结果，显示与TLR、TNFα、JAK-STAT和IL-17信号通路相关的基因的转录水平富集。(14B)在V4-C26 hIgG4(HMBD-002)、IgG4同种型对照或帕博利珠单抗存在的情况下进行的反应中，MLR样品的常规RNA测序显示与I型和II型干扰素基因相关的基因转录本水平的富集(n＝10；数据以平均值+SD表示，常规RNA序列分析得出的p校正值为*p<0.05，***p<0.001)。
图15A至15G.有关V4-C26 hIgG4药代动力学和毒性的图像。(15A至15C)荷瘤和非荷瘤(15A)Balb/c小鼠、(15B)Sprague Dawley大鼠和(15C)食蟹猴的V4-C26 hIgG4血清浓度。V4-C26 hIgG4通过腹腔注射以指定浓度单剂量给药。(15D至15G)用(15D和15E)人全血或(15F和15G)从健康捐献者(n＝10)处分离的PBMC进行体外细胞因子释放测定的结果，显示了用指定量的V4-C26 hIgG4、IgG4同种型对照、(15D和15E)葡萄球菌肠毒素B(SEB)或(15F和15G)抗CD3抗体刺激24小时后(15D、15F)IL-2和(15E，15G)IL-6的水平。
图16A和16B.条形图显示V4-C26 hIgG4(HMBD-002)对CT26细胞衍生异种移植(CDX)模型中肿瘤微环境中肿瘤浸润CD8+T细胞群的影响。(16A)通过多色流式细胞术进行细胞分析的结果，显示CD8+T细胞(左)和肿瘤抗原特异性CD8+T细胞(右)的水平。通过MuLVenv gp70 423–431五聚体(ProImmune Ltd.)确定肿瘤中gp70抗原特异性CD8 T细胞的频率。(16B)通过多色流式细胞术进行细胞分析的结果，显示CD8+T细胞的细胞毒性反应和活化。
图17A和17B.条形图显示V4-C26 hIgG4(HMBD-002)对CT26细胞衍生异种移植(CDX)模型中肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)群的影响。(17A)通过多色流式细胞术进行细胞分析的结果，显示MHCII-巨噬细胞的水平。(17B)多色流式细胞术的细胞谱分析的结果，显示M1巨噬细胞的活化情况。
图18.V4-C26 hIgG4(HMBD-002)对CT26肿瘤中与促炎巨噬细胞活化、T细胞细胞毒性正向调控和T细胞细胞溶解活性相关基因转录的影响图。基因排序从左侧的最高增加倍数到右侧的最高减少倍数。
图19A和19B.图像和条形图显示V4-C26 hIgG4(HMBD-002)与aPD-1联用的效果。(19A)雌性BALB/c小鼠皮下移植CT26细胞，并按所示剂量给予不同剂量的V4-C26 hIgG4、aPD-1或V4-C26 hIgG4与aPD-1联合给药的同源CDX模型结果。(19B)流式细胞术细胞谱分析结果，显示CT26 CDX模型中肿瘤微环境中的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞和肿瘤抗原特异性耗竭CD8+T细胞。
图20.图示V4-C26 hIgG4在患者衍生异种移植(PDX)恶性胸膜上皮样间皮瘤模型中的抗肿瘤反应的图表。
实施例
WO 2019/185879 A1的实施例和附图
WO 2019/185879 A1的全部公开内容并入本文作为参考。特别是WO 2019/185879A1中的实施例1至16和相应的图1至65C，它们说明了WO 2019/185879 A1中公开的VISTA结合抗原分子的结构和功能特性，特此并入作为参考。
实施例1:V4-C26
1.1WO 2019/185879 A1中V4-C26的表征
指定为V4-C26的VISTA结合抗体克隆在WO2019/185879A1中进行了描述，现将其并入本文作为参考。
V4-C26包括如SEQ ID NO:289所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:297所示的轻链可变区。WO 2019/185879 A1的实施例13描述了一种分子(分子[24])，该分子包含人IgG1/Vκ格式的V4-C26的VH和VL区，由SEQ ID NO:315和SEQ ID NO:317组成。
WO2019/185879A1的实施例13和图53显示了使用IMGT DomainGapAlign(Ehrenmann等，《Nucleic Acids Res.》38,D301-307(2010))和IEDB deimmunization(Dhanda等，《免疫学》(2018)153(1):118-132)工具对V4-C26进行分析的结果，发现V4-C26与人类种系重链和轻链有足够的同源性，可被视为人源化(即>85％)，而潜在免疫原性肽的数量很少，足以被视为安全且不会产生可开发性问题。
WO 2019/185879 A1的实施例13.1和图45、46和47显示了通过生物膜干涉法分析V4-C26与各种不同蛋白质结合的结果。图45D、46B和47C显示，V4-C26与人VISTA和小鼠VISTA都有高亲和力的结合，图45C显示，V4-C26与人PD-L1没有交叉反应。
WO 2019/185879 A1的实施例13.2和图49、50、51、56和57显示了通过ELISA分析V4-C26与各种不同蛋白质结合的结果。图49C、50C和51C显示，V4-C26与人VISTA和小鼠VISTA结合的EC50很低。图56C、57C和57I显示，V4-C26与人类、小鼠、大鼠和食蟹猴VISTA都有结合，但与其他人B7蛋白家族成员(B7H3、B7H4、B7H6、B7H7、PD-1、CTLA-4)没有交叉反应。
WO 2019/185879 A1的实施例13.3和图58B和58C显示通过流式细胞分析确定V4-C26结合表达人VISTA或鼠VISTA的细胞。
WO 2019/185879 A1的实施例13.4和图52J显示，V4-C26具有热稳定性，通过差示扫描荧光法测定，其熔化温度为72.9℃。
1.2比较V4-C26、VSTB112和mAb13F3与人类和小鼠VISTA的结合情况
对抗VISTA抗体V4-C26(即WO 2019/185879 A1实施例13中的分子[24])、VSTB112IgG1(包括VSTB112 HC(SEQ ID NO:269)+VSTB112 LC(SEQ ID NO:270)和mAb 13F3(BioXCell Cat.No.BE0310))与人VISTA和小鼠VISTA的结合进行分析。
使用Octet QK384系统(ForteBio)进行生物膜干涉实验。所有测量均在25℃下进行。
简言之，在PBS缓冲液(pH 7.2)中将涂有抗-5-HIS(HIS1K)的生物传感器末梢(Pall ForteBio，美国)孵育60秒以获得第一条基线，然后在PBS(pH 7.2)中将末梢装入270nM HIS标记的人VISTA或小鼠VISTA中120秒。
加载后，生物传感器在pH值为7.2的PBS缓冲液中孵育60秒，以获得第二条基线，然后在pH值为7.2的PBS缓冲液中与测试抗体(浓度分别为250nM、125nM、62.5nM和31.3nM)的4点2倍稀释系列孵育120秒，以获得结合曲线。最后，生物传感器在pH值为7.2的PBS中孵育120秒，以获得解离曲线。
结果如图1所示。发现V4-C26与人VISTA和小鼠VISTA都有结合。相比之下，mAb13F3与小鼠VISTA有结合，但与人VISTA没有结合；VSTB112与人VISTA有结合，但与小鼠VISTA没有结合。
1.3V4-C26 hIgG4对肿瘤生长的抑制
包括SEQ ID NO:331的重链和SEQ ID NO:317的轻链的抗原结合分子V4-C26hIgG4在结肠癌同源细胞系衍生小鼠模型中进行了评估，以确定其抑制体内肿瘤生长的能力。
CT26细胞取自ATCC，在补充有10％胎牛血清和1％ Pen/Strep的RPMI-1640培养液中培养，培养温度为37℃，培养箱为5％ CO2。
在大约6-8周大的雌性BALB/c小鼠右侧腹部皮下注射1x105 CT26细胞，建立CT26细胞衍生肿瘤。
植入后3天，此后每两周给小鼠腹腔注射25mg/kg V4-C26 hIgG4或等量的载体作为对照条件(每个治疗组8只小鼠)。
使用数显卡尺每周测量3次肿瘤体积，计算公式为[L x W2/2]。对照组的肿瘤长度＞1.5厘米，即认为达到了研究终点。
结果如图2A和2B所示。与使用载体的小鼠相比，使用V4-C26 hIgG4的小鼠显著抑制了肿瘤的生长并提高了存活率。
实施例2：实施例3至7的材料和方法
ELISA结合试验
用1μg/ml在PBS中稀释的靶抗原涂布384孔板，4℃下16小时。在室温下用含有1％BSA的Tris缓冲盐水(TBS)阻断1小时后，在中性pH 7下使用与1xPBS配制的1％ BSA进行连续稀释，将V4-C26 hIgG4或人IgG4同种型对照(Biolegend#403702)加入孔板。为了测试不同pH值下检测物的结合情况，使用1xPBS在pH值为7.5、6.5、6、5.5或5时配制1％的BSA。室温孵育1小时后，用含0.05％吐温20的TBS(TBS-T)洗板三次，然后用1:7000的山羊抗人IgGFc-HRP(Abcam#ab97225)室温孵育1小时。洗板后，用比色检测底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(Turbo-TMB；Pierce)显色10分钟。用2M H2SO4停止反应，在450nm波长的BioTek SynergyHT上测量OD值。
流式细胞术和分析
使用流式细胞术测量了V4-C26 hIgG4与PBMC或经过加工以表达VISTA的HEK293T细胞的细胞表面结合情况。使用lipofectamine 2000(赛默飞世尔科技，#11668019)，按照生产商的操作规程将编码人、NHP、大鼠和小鼠VISTA(Sinobiological)的VISTAcDNA表达质粒瞬时转染野生型HEK293T细胞。人、NHP、大鼠和小鼠的PBMC均购自商业供应商(Accegen)，染色前用Fc阻断剂(人TruStain FcX，Biolegend#422302；小鼠TruStain Fcx，Biolegend#101320；抗大鼠CD32，BD Pharmingen#550270；食蟹猴FcR结合抑制剂，赛默飞世尔#14-9165-42)阻断。V4-C26 hIgG4或同种型对照抗体按生产商规定与APC偶联。
如图所示，对于FACS，用不同浓度的APC标记V4-C26 hIgG4或同种型对照与细胞在4℃孵育40分钟。为识别髓系细胞，将PBMC与CD45 FITC和CD11b PE进一步孵育。细胞再次洗涤后，重悬于200μL FACS流式缓冲液(PBS，含5mM EDTA)中，使用MACSQuant 10(Miltenyi)进行流式细胞分析。采集后，使用Flowlogic软件分析所有原始数据。使用前向和侧向散射对细胞进行分选，并确定阳性细胞的百分比。
免疫组织化学
对TNBC、NSCLC、间皮瘤和肝癌患者的组织微阵列(TMA)(USBiomax，产品目录#BR1301、#LC1401、#MS481d、#LV8013a)和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织进行VISTA(4M2-C12-mIgG2a；稀释度1:800)和VSIG3(LS Biosciences#LS-C338858；稀释度1:300)染色，对正常TMA(USBiomax，产品目录#FDA999q)也进行了VISTA(4M2-C12-mIgG2a)染色。载玻片在干燥器中干燥15分钟-1小时，然后放入EnVisionTMFLEX低pH靶标回收液(Dako，K8005/DM829)中97℃下20分钟进行抗原回收。将载玻片放入Envision Flex缓冲液(1X)中10分钟，然后转移到Omnis仪器中进行染色。在Dako Link Omnis上使用Envision Flex+检测系统(试剂盒K800)，按照试剂盒中的方案对玻片进行染色和复染色，然后冲洗、脱水和添加盖玻片。用光学显微镜对TMA进行半定量评分，以确定正常组织和肿瘤组织中VISTA和VSIG3蛋白表达的相对染色强度(0-3+强度等级)、分布和定位情况。
VISTA-VSIG3抑制试验
使用重组人VISTA-Fc蛋白(R&D#7126-B7)或无关抗原(人重组CD47蛋白，Sinobiological#112283-HCH)，用标准ELISA方法确认VISTA-VSIG3的结合。在抑制试验中，用2μg/ml人VISTA-Fc重组蛋白(R&D#7126-B7)在PBS中稀释后涂布384孔板，在4℃下放置24小时。在室温下用1％ BSA阻断2小时后，用V4-C26 hIgG4或同种型对照在室温下孵育平板30分钟。30分钟后，加入浓度为24nM(VISTA-VSIG3结合的EC50)生物素化的重组人VSIG3-Fc(使用Invitrogen试剂盒#21455进行生物素化的重组人VSIG3.Fc)，孵育2小时。孵育后，用TBST洗板三次，在室温下用链霉亲和素HRP(R&D#DY998)抗体孵育1小时，然后再洗三次。比色反应按上述ELISA的标准方案进行。
V4-C26 hIgG4阻断VISTA-VSIG3后的细胞因子释放
在涂有αCD3单克隆抗体(eBioscience#16-0037)和VSIG3-Fc(R&D#9229-VS)的平板上培养PBMC，两者的比例为1:0(仅2μg/mlαCD3)和1:2(2μg/ml的αCD3:4μg/ml的VSIG3-Fc)。然后用指定浓度的V4-C26 hIgG4、VSTB112或IgG4同种型对照(Biolegend#403702)处理细胞，37℃孵育平板。24小时后收集上清液，使用人IFN-γ非涂布ELISA试剂盒(Invitrogen#88-7316)测定IFN-γ水平。
MDSC-T细胞共培养
使用经典单核细胞分离试剂盒(Miltenyi，德国，#130-117-337)通过阴性富集从新鲜人PBMC中分离出单核细胞。随后，在GM-CSF(10ng/ml)(PeproTech，美国，#300-03)和IL-6(10ng/ml)(PeproTech，美国，#200-06)的存在下，将单核细胞分化为MDSC，为期7天。收集MDSC，在人抗CD3抗体(OKT3，1μg/ml)(BioLegend，USA，#317326)存在的情况下，在有或没有检测物的情况下，按3:1的比例与新鲜分离的自体PBMC共同培养。96小时后收集上清液，通过ELISA(赛默飞世尔，美国，#88-7316-88)测定IFN-y水平。
中性粒细胞趋化试验
使用全血中性粒细胞分离试剂盒(Miltenyi#130-104-434)从全血中分离出中性粒细胞，并与V4-C26 hIgG4、VSTB112或同种型对照以指定浓度在37℃孵育60分钟。孵育后，将中性粒细胞接种到24孔transwell平板(赛默飞世尔#1406287)的上层室(300μl/孔)中，并将含或不含50ng/ml C5a(百普赛斯#C5A-H5116)的培养基添加到下层室(600μl)中。然后用CellTiter-Glo(Promega#G7571)测量下层室中迁移的中性粒细胞的ATP水平，并用Victor Nova(Perkin Elmer)测量发光。
人同种异体混合淋巴反应(MLR)
使用Lymphoprep(干细胞技术公司，#07861)从人全血(共5名供体)中分离出新鲜的PBMC，按照生产商提供的方案，用CellGenix GMP DC培养基重新悬浮至5×106个细胞/ml。在96孔圆底板的每个孔中加入50μl的DC培养基，然后按1:1的比例加入50μl来自两名供体的PBMC，同时加入50μl V4-C26 hIgG4或30、10和1μg/mL的同种型对照hIgG4(InvivoGen#bgal-mab114)。共使用了10对供体。在37℃孵育细胞96小时。96小时后收集上清液，用Luminex(R&D#LXSAHM-04/07)检测上清液细胞因子水平。从测试样本中减去同种型对照值，将数据归一化为hIg4同种型对照值。
动物实验
Balb/c小鼠购自InVivos或杰克逊(Jackson)实验室，CD34移植人源化HiMice小鼠购自Invivocue。所有动物均在特定的无病原体条件下饲养，并严格遵守机构动物护理和使用委员会的指导方针。
体内肿瘤生长试验
将肿瘤细胞(CT26为105个，HCT15为106个，A549为5x106个)皮下注射到小鼠右侧腹部，或对于原位乳腺模型，将肿瘤细胞植入乳房脂肪垫(2x104个4T1细胞)。植入后3-6天，用指定剂量和间隔时间的检测物对小鼠进行处理，每周两次。所有皮下模型都是腹腔给药，而原位模型则是肿瘤内给药。按照Thakkar等人《Mol Cancer Ther》(2020)19:490-501中的描述，使用卡尺测量肿瘤体积。
统计学分析
使用GraphPad Prism进行统计分析。对两个变量(剂量滴定)的数据进行双因素方差分析，然后进行Tukey's多重比较检验。两组间的比较采用非配对t检验。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001，则认为差异显著。
抗体分离
用定制的免疫原和佐剂反复免疫6至8周大的雌性BALB/c小鼠。最后一次免疫24小时后，分离总脾细胞，并按照制造商的说明使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒(干细胞技术公司)与骨髓瘤细胞系P3X63.Ag8.653(ATCC)融合。7至10天后，分离出单个杂交瘤克隆，使用ELISA和流式细胞术筛选上清液中的抗原结合，从而筛选出产生抗体的杂交瘤。对所选克隆的可变区进行扩增(SMARTer RACE 5'/3'试剂盒，Clontech公司)、测序并克隆到表达载体中，然后在哺乳动物细胞中表达，以进行体外功能测试。
杂交瘤生产
约6周大的雌性BALB/c小鼠来自InVivos公司(新加坡)。动物饲养在特定的无病原体条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指导方针进行处理。使用专有的免疫方案(mAbHits)，用定制免疫原的专有混合物对小鼠进行免疫。按照生产商的说明，使用聚乙二醇(PEG)和ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒(干细胞技术公司，加拿大)分离总脾细胞并与骨髓瘤细胞系P3X63.Ag8.653(ATCC，美国)融合。筛选单克隆杂交瘤，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光活化细胞分选(FACS)筛选所产生克隆的上清液。
抗体可变区克隆和测序
根据生产商的说明，使用TRIzol试剂(生命技术公司，美国)从杂交瘤中提取总RNA。使用SMARTer RACE 5'/3'试剂盒(ClontechTM，美国)合成双链cDNA。使用SeqAmp DNA聚合酶(ClontechTM，美国)和引物混合物扩增测序就绪的cDNA。使用CloneJET PCR克隆试剂盒(赛默飞世尔，美国)将得到的可变重链(VH)和轻链(VL)扩增子克隆到pJET1.2/blunt载体中，并通过AITBiotech Pte.Ltd.(新加坡)对纯化PCR扩增子进行测序。测序数据使用国际IMGT(ImMunoGeneTics)信息系统(Lefranc等，《Nucleic Acids Res》(2015)43:D413-D422)进行分析，以确定各个互补决定区(CDR)和骨架序列的特征。
小鼠抗体的人源化和亲和力成熟
通过将CDR引入人骨架序列中，并对经典位置的残基进行反向突变以保持抗原结合，从而实现了小鼠序列可变区的人源化。通过使用酵母scFv表面展示随机诱变技术，人源化抗体与小鼠VISTA的亲和力进一步成熟，从而提高了跨物种亲和力。简言之，通过诱变PCR(安捷伦科技公司的GeneMorph II随机诱变试剂盒)扩增单链中含有亲本VH和VL的ScFv，以创建文库，进一步扩增文库并克隆到酵母表达载体pCTcon2(Addgene)中，通过电穿孔进行酵母表面表达。用FACS对转染细胞进行小鼠VISTA结合力筛选，并用BD FACS Aria II细胞分拣仪对高结合力细胞进行分拣。选出的高结合力克隆再经过两轮分选。将细胞在SDCAA中培养，分离出单个克隆，然后进行DNA提取和测序。
细胞系
所有细胞系均购自ATCC，并按建议进行培养。细胞在添加了10％ FBS和1％ Pen/Strep(赛默飞世尔)的培养基中培养，培养温度为37℃，培养箱为5％CO2。使用前，解冻新瓶细胞并传代2-5次。通过PCR(DreamTaq Green PCR主混合物，K1081，赛默飞世尔)并使用Agilent Mycosensor检测试剂盒，按照制造商的说明进行支原体检测。
稳定细胞系生成
使用4D-Nucleofector试剂盒(Lonza)，按照生产商提供的方案，将5μg线性化IgG表达质粒电穿孔到最佳密度为1x106个细胞/ml的CHO-K1细胞中。在静态细胞培养箱中含有2ml生长培养基的6孔平板培养电穿孔后的细胞24小时。随后，将培养基更换为含有250nM甲氨蝶呤(Sigma)和200μg/ml Zeocin(InvivoGen)的选择培养基。将细胞旋转沉淀，重新悬浮在新鲜的选择培养基中，并以5x105细胞/毫升的密度重新接种，每周一次。当细胞活力恢复到95％时，选择结束。将细胞转移到摇床-培养箱中。
抗体生产和纯化
抗体是在摇床-培养箱中以流加式模式(Fed-Batch mode)培养稳定细胞后产生的，然后通过亲和力、体积排除或混合模式阴离子交换从培养上清液中纯化，最后进行阴离子交换色谱。抗体纯度通过体积排除色谱法和SDS-PAGE进行评估。
VISTA序列分析和可视化
多序列比对使用MultAlign(Corpet,《Nucleic Acids Res》(1988)16:10881-10890)，且可视化使用EPScript(Robert和Gouet，《Nucleic Acids Res》(2014)42:W320–W324)。使用UCSF Chimera生产三维模型(Pettersen等，《J Comput Chem》(2004)25:1605-1612)。
VISTA-LRIG1抑制试验
使用重组人VISTA-Fc蛋白(R&D#7126-B7)或无关抗原(人重组CD47蛋白，Sinobiological#112283-HCH)，用标准ELISA方法确认VISTA-LRIG1的结合。在抑制试验中，用5μg/ml人VISTA-Fc重组蛋白(R&D#7126-B7)在PBS中稀释后涂布384孔板，在4℃下放置24小时。在室温下用1％ BSA阻断2小时后，用V4-C26 hIgG4或同中型对照(Biolegend#403702)在室温下孵育60分钟。60分钟后，加入1μg/ml(VISTA-LRIG1结合EC50)的重组人LRIG1.HIS，持续2小时。孵育后，用TBST洗板三次，在室温下用抗HIS HRP(Abcam#ab1187)抗体孵育1小时，然后再洗三次。比色反应按上述ELISA的标准方案进行。
通过氢氘交换质谱(HDXMS)绘制表位图谱
使用HIS标记的人VISTA(残基33-194，Sino Biological#13482-H08H)和V4-C26hIgG4，按照Wales等，《Anal Chem》(2008)80:6815-6820中描述的程序，通过HDXMS进行表位图谱绘制。简言之，游离VISTA在氘代PBS中稀释，最终氧化氘(D2O)浓度为90％。对于VISTA/V4-C26 hIgG4复合物，VISTA和V4-C26 hIgG4按2:1的比例混合，在氘标记前于25℃孵育15分钟。在25℃下分别在1、10、30和100分钟时间点进行氘标记反应。然后对样品进行胃蛋白酶蛋白水解裂解，再用nanoACQUITY UPLC(沃特世公司，曼彻斯特，英国)的ACQUITYC18色谱柱(1.0x100mm)分离，并用Synapt G2-Si质谱仪(沃特世公司，曼彻斯特，英国)以HDMSE模式进行检测。分别使用Protein Lynx Global Server3.0.1和DynamX 3.0(沃特世公司)进行多肽鉴定和氘摄取监测。肽段的氘摄取量按氘代和未氘代样品中心点的质量差计算(Wales等，《Methods Mol Biology》(2013)1007:263-288)，并以3次测量结果的平均值报告(Masson等，《Nat Methods》(2019)16:595-602)。
表位分选
对于表位分选，在Octet QK384(Molecular Device)设备中，将PBS中的人VISTA-HIS或小鼠VISTA-HIS重组蛋白(Sino Biological Inc.)固定到抗-5HIS传感器(HIS1K，Molecular Device)上，持续5分钟。用PBS短暂冲洗传感器30秒，之后加入溶于PBS的400nM饱和抗体，以1,000rpm的振荡速度混合10分钟。随后，将生物传感器清洗2分钟，之后在溶于PBS的400nM饱和抗体中浸泡7.5分钟，振荡速度为1,000rpm。结合事件与传感器图中报告的波长变化(纳米位移)相关，并在监测器上实时监测。
跨物种抗体结合亲和力测量
通过Biacore表面等离子共振(SPR)测定V4-C26 hIgG4的亲和力。使用CM5传感器芯片(Cytiva#29104988)进行检测。使用Biacore HIS捕获试剂盒(GE Healthcare#28-9950-56)将人、NHP、大鼠和小鼠VISTA-HIS固定在芯片表面，或单独用于背景信号校正。简言之，以5μl/分钟的流速捕获VISTA-HIS，接触时间为60秒。对于人、NHP和大鼠VISTA，V4-C26 hIgG4以50E-9M至390E-12M的两倍连续稀释液流动；对于小鼠VISTA，则以2.5E-9M至390E-12M的两倍连续稀释液流动；在室温(RT)下，流速为30μl/分钟，接触90秒，解离3000秒。使用Biacore T200软件分析所获得的传感图，并通过拟合1:1结合动力学模型计算KD。
抗体依赖的细胞细胞毒性和补体依赖的细胞毒性
用1μg/孔的人C1q蛋白或0.5μg/孔的人CD16a的PBS在4℃中涂布96孔板。孵育过夜后，洗板三次，在室温下用阻断缓冲液阻断1小时。用V4-C26h IgG4或同种型对照在室温下孵育1小时，然后用1:7000稀释的HRP偶联的抗人Fc抗体在室温下孵育1小时。比色反应按上述ELISA的标准方案进行。
sc-RNA-seq
为了确定VISTA转录本表达量最高的细胞类型，从10X Genomics网站(Stuart等，《Biorxiv》(2018)，460147)检索了一个公开可用的68k PBMC数据集，并使用Seurat v3.2(Stuart等，《细胞》(2019)177:1888-1902.e21)进行了处理。线粒体转录本超过6％或不同转录本少于200个的细胞被排除在外。使用默认参数对数据进行归一化处理，并使用具有20,000个特征的VST方法识别可变特征。随后对数据进行缩放，然后用15个主成分进行PCA分解。使用默认参数进行UMAP投影，并运行分辨率为0.8的FindClusters功能。为了标注聚类，以SeuratData软件包中的PBMC3k数据集(Hafemeister和Satija，《Biorxiv》(2019)，576827)为参考，绘制细胞标识图。
常规RNA-seq
每个条件(V4-C26、V9、抗PD1和IgG4)10个样本，在处理96小时后从MLR检测中获取。使用NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒(NEB#E7770S)准备RNA-seq，并在IlluminaNovaSeq S4流式细胞上运行，使用v1.5化学试剂。使用FASTQC和MultiQC(Ewels等，《生物信息学》(2016)32:3047-3048)对适配器修剪和过滤数据进行评估，并使用Kallisto v0.46(Bray等，《Nat Biotechnol》(2016)34:525-527)将读段与GRC37人类参考转录组进行比对。使用TxImport(Soneson等，《F1000research》(2015)4:1521)将数据导入R。使用DESeq2(Love等，《Genome Biol》(2014)15:550)获得归一化基因计数和基因水平差异表达。使用SPEED2(Rydenfelt等，《Nucleic Acids Res》(2020)48:W307-W312)软件包估算通路活性，使用默认参数。
CT26肿瘤特征分析
用0.1mg/ml的DNaseI(Sigma，美国，#11284932001)和1mg/ml的胶原蛋白酶(Sigma，美国，#1108866001)在37℃下消化细切的肿瘤组织45分钟，生成单细胞悬浮液。用人TruStain FcX(BioLegend，美国，#422302)阻断Fc受体。用荧光团偶联的免疫细胞标记抗体(表S4)对细胞进行染色，洗涤并重悬于缓冲液(1xPBS+0.5％BSA+1mM EDTA)中。通过流式细胞仪测定免疫细胞群的频率。在MACSQuant 10(美天旎生物技术公司，德国，#130-096-343)上采集数据，并使用FlowLogic软件V7进行分析。
CT26抗原召回试验
单细胞肿瘤悬液的生成方法如前所述。按照生产商的方案，使用CD45 MicroBeads(美天旎生物技术公司，德国，#130-110-618)或CD4/CD8 MicroBeads(美天旎生物技术公司，德国，#130-116-480)从细胞悬液中富集TILs(CD45+)或T细胞(CD4+/CD8+)。按指定的效应细胞与靶细胞(E:T)的比例，将提前24小时接种的CT26细胞(T：靶细胞)与肿瘤中富集的TIL或T细胞(E：效应细胞)共培养72小时。所有条件均为三次重复。细胞活力由CellTiterGlo(Promega，美国，#G7571)测定。上清液中的IFN-γ水平用ELISA(Invitrogen，美国，#BMS606)测定。裂解率计算公式为裂解率＝((T–E:T)/T)*100。
药代动力学
在雄性和雌性Balb/c小鼠、Sprague Dawley大鼠和食蟹猴体内评估了V4-C26hIgG4的单剂量药代动力学特征。通过小鼠腹腔注射、大鼠尾静脉注射和猴外周静脉注射，以指定浓度单剂量给药V4-C26 hIgG4。在给药后的不同时间点抽血，用ELISA方法定量检测血清中的抗体浓度。药代动力学分析的参数来自非房室模型：最大浓度(Cmax)、AUC(0-336小时)、AUC(0-无穷大)、半衰期(t1/2)、清除率(CL)和稳态分布容积(Vss)。
实施例3：VISTA表达的分布
3.1VISTA主要在健康组织的髓系衍生细胞中表达
研究了健康组织中VISTA的表达分布，以评估VISTA拮抗剂的最佳策略。分析了来自10X Genomics的单细胞(sc)RNA-seq数据集，其中包括68,000个PBMC[www.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]。结果显示存在14个主要细胞群(图3A)。虽然在许多细胞群中都发现了低水平的VISTA转录本，但在健康人供体中，高表达仅限于髓系衍生单核细胞和树突状细胞，T细胞中的表达有限(图3B、3C)。
在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织芯片(TMA)切片上使用免疫组织化学(IHC)进一步鉴定了健康人体组织中VISTA蛋白的表达情况(图3D)。在淋巴器官(如脾脏和骨髓)和有大量白细胞浸润的组织(如乳腺和肺)中检测到的VISTA含量最高。VISTA在健康组织和各种免疫细胞中的分布有力地证明，需要在不耗竭VISTA表达细胞的情况下拮抗VISTA，以获得最佳治疗效果和可耐受的安全性。
3.2包括TNBC和NSCLC在内的实体瘤显示出VISTA和VSIG3的大量表达
在四种实体癌(包括三阴性乳腺癌(TNBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)和间皮瘤)的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织芯片(TMA)切片中，通过免疫组化评估了VISTA和VSIG3的表达。免疫组化使用了4M2-C12-mIgG2a(由SEQ ID NOs:248和250的多肽组成)或抗VSIG3抗体。
TNBC和NSCLC患者的VISTA表达量最高，分别有89％和85％的核芯显示中度-高度染色强度(图3F)。进一步评估了VSIG3的表达。在间皮瘤(90％)、NSCLC(84％)和TNBC(74％)中，VSIG3呈中度至高度染色(图3H)。在TNBC和NSCLC中观察到的VISTA和VSIG3的高表达，与VISTA的共抑制功能可能是通过VISTA-VSIG3相互作用抑制T细胞功能的报道一致(Wang等，《免疫学》(2019)156：74-85)，并表明这些可能是研究VISTA拮抗作用益处的优先适应症。
实施例4：通过相互作用伴侣和V4-C26抗体分析VISTA的结合情况
鉴于健康细胞中VISTA的表达模式，V4-C26被开发为IgG4同种型抗VISTA抗体，通过阻断与其结合伴侣的相互作用来抑制VISTA的功能，而不会通过Fc介导的效应功能耗竭VISTA表达细胞。抗体V4-C26 hIgG4包括SEQ ID NO:331的重链和SEQ ID NO:317的轻链。
4.1相互作用伴侣结合VISTA
VISTA是一种B7家族受体，因此假设VISTA与其结合伴侣的相互作用面在其他B7受体中是保守的，包括PD1/PD-L1(图4A)。为了证实这一点，将PD1/PD-L1复合物(PDB：5IUS)作为预测算法的输入结构，然后将VISTA结构(6OIL)叠加到复合物上。
该算法将输入的结构数据与人类和模式物种中VISTA的现有序列数据进行整合，突出了F、D、C、C’β折叠和C-C’环中可能参与介导与VISTA同源受体/配体相互作用的抗体可用区域(图4B)，并优先选择了C-C’环中VISTA在人类蛋白质组中独有且在模式物种中高度保守的靶区域(图4C、4D)。
该区域的功能特征由VSIG3的已知相互作用残基支持，该残基位于该C-C’环区，即残基R86、F94和Q95(图4E)。
此外，拟议的VISTA-LRIG1相互作用残基也位于该区域内。WO/2019/165233A1公开了LRIG1与VISTA结合的位置在VISTA的氨基酸位置68-92附近(SEQ ID NO:343)，同源建模预测VISTA的残基T82和R87是与LRIG1相互作用的关键位置(图9B)。
参与与PSGL1相互作用的VISTA残基距离更远；Johnston等人，《自然》(2019)574:565-570公开VISTA残基H98、H100、H153、H154和H155是VISTA与PSGL1相互作用的关键位置(图9B)。
4.2V4-C26 hIgG4表位图谱分析
通过氢氘交换质谱(HDXMS)对VISTA-V4-C26 hIgG4复合物进行了表位图谱分析，以确认V4-C26 hIgG4结合区。比较V4-C26 hIgG4结合的VISTA和游离的VISTA之间的氘交换，结果表明，在残基范围69-85(SEQ ID NO:342)和85-97(SEQ ID NO:341)的两个位点上观察到氘摄取量显著减少，见图4F，这表明这些区域通过蛋白质与蛋白质相互作用受到保护，避免了氘交换。此外，肽85-97在早期时间点的氘交换减少表明，这是V4-C26 hIgG4的主要表位。在肽69-85的后期时间点观察到的氘交换减少可能表明是主要表位结合后的次要结合事件。
将这些鉴定出的多肽映射到VISTA结构后证实，这些位点与预测的靶区域重叠(见图5D)，并且包括VSIG3结合的三个关键氨基酸残基(R86、F94和Q95，图9B)。
因此，V4-C26 hIgG4能以皮摩尔级的亲和力与VISTA(SEQ ID NO:344)的预测功能C-C’区域内的物种保守表位结合，该表位与VSIG3和LRIG1结合的关键残基重叠，并能够阻断其与VISTA的相互作用。
然后，将V4-C26 hIgG4的结合位点与其他已发表的VISTA抗体进行表位分选，并与人VISTA特异性VSTB112和IGN175A抗体(分别在WO 2015/097536 A2和WO2014/197849A2中描述)以及小鼠VISTA同源物特异性13F3和MH5A抗体进行比较。
结合中缺乏干扰表明，V4-C26 hIgG4和IGN175A与人类VISTA上拓扑学上相距较远的表位结合(图12A)。同样，13F3、MH5A和V4-C26 hIgG4与小鼠VISTA的结合基本上没有竞争关系(图12B)。在VSTB112和V4-C26 hIgG4之间观察到的部分结合干扰表明，VSTB112的表位不同于IGN175A，但比IGN175A更接近V4-C26 hIgG4的表位。图1表明，VSTB112结合的表位与V4-C26的表位不同，因为VSTB112无法与小鼠VISTA结合。
目前处于早期开发阶段的唯一一种鼠源性交叉反应抗VISTA抗体SG7与一个不同的区域结合，与人VISTA相比，对鼠VISTA的亲和力要低得多((N.Mehta等，《Sci Rep-uk》10,15171(2020))。
综上，V4-C26 hIgG4与人和小鼠VISTA同源物上独特表位结合。
4.3ADCC和CDC功能性分析
为了排除V4-C26 hIgG4引起ADCC和CDC反应的可能性，对其与相应的FcγRIII和C1q蛋白的结合亲和力进行了评估。通过ELISA，没有观察到FcγRIII和C1q蛋白之间的结合(图11A和11B)，可以排除ADCC或CDC机制VISTA表达细胞的耗竭。
这一特点使V4-C26 hIgG4有别于之前开发的VISTA靶向抗体，后者使用的是IgG1Fc同种型，已知会通过ADCC和CDC引起细胞耗竭。
实施例5：V4-C26hIgG4的生物物理性质分析
评估了V4-C26 hIgG4的生物物理性质。
通过ELISA测量了V4-C26hIgG4对VISTA的结合特异性。
图5A显示，在B7家族的其他相关成员(B7H1/PDL-1、B7H3、B7H4、B7H6、B7H7)以及PD-1和CTLA-4中，V4-C26 hIgG4与VISTA的结合具有高度特异性。
为了支持将啮齿动物和非人灵长类动物(NHP)用于疗效、安全性和PK模型，使用ELISA和SPR(Biacore)评估了V4-C26 hIgG4与VISTA同源物结合的能力。
图5B显示，通过ELISA，V4-C26h IgG4与人类、NHP、大鼠和小鼠VISTA-HIS蛋白的结合具有剂量依赖性，EC50分别为5.117pM、12.15pM、6.689pM和3.549pM。使用SPR(Biacore)，还观察到V4-C26 hIgG4与人类、NHP、大鼠和小鼠VISTA同源物结合的皮摩尔亲和力(Kd)相似，分别为407pM、367pM、382pM和549pM，见图12C至12F。
FACS进一步证实了V4-C26 hIgG4与表达重组VISTA同源物的HEK293T细胞以及相关临床前物种PBMC中的髓系细胞的细胞表面结合。
图5C显示，V4-C26 hIgG4与所有实验物种的VISTA同源物均表现出剂量依赖性结合，对表达人、NHP、大鼠和小鼠VISTA的HEK293T细胞的EC50值相似，分别为3.738nM、2.571nM、4.133nM和8.94nM。在不表达VISTA的野生型HEK293T细胞中没有观察到非特异性结合。
图5D显示，V4-C26 hIgG4与所有临床前受试物种髓系细胞上表达的内源性VISTA也表现出相似的剂量依赖性结合，对人、NHP、大鼠和小鼠VISTA的EC50分别为108nM、67.6nM、48.6nM和111nM。
据报道，一些肿瘤环境缺氧，pH值相对较低。由于VISTA含有许多暴露的组氨酸残基，容易发生质子化并可能影响抗体结合，因此评估了pH对V4-C26 hIgG4结合的影响。图12G显示，根据ELISA的评估，V4-C26 hIgG4在pH值为5.5-7.5时与VISTA的结合亲和力相当，这证实了V4-C26 hIgG4在生理相关的pH值范围内都能与VISTA结合，而且结合位点与富含组氨酸的区域不同。
因此，V4-C26 hIgG4的结合具有高度选择性，即使在低pH值条件下(可能代表肿瘤微环境中的pH值)也能保持结合。
实施例6：V4-C26hIgG4阻断VISTA功能性的能力
6.1V4-C26 hIgG4抑制VISTA与关键相互作用伴侣之间的结合
V4-C26 hIgG4与VISTA的C-C’区域结合(见实施例3)，据推测这是VISTA与多个伴侣结合的共同功能区域。因此，对V4-C26hIgG4抑制这些相互作用的能力进行了评估。开发了基于ELISA的重组蛋白结合试验，模拟VISTA与其结合伴侣VSIG3和LRIG1之间的结合。
图6A显示了V4-C26 hIgG4可以以剂量依赖的方式拮抗VISTA-VSIG3相互作用，IC50为673pM。
同样，图13C显示了V4-C26 hIgG4对VISTA-LRIG1结合具有剂量依赖性，IC50值为3.4nM。
为评估用V4-C26 hIgG4抑制VISTA-VSIG3相互作用的功能效果，进行了杀瘤T细胞活性替代试验(如J.Terhune等，《Nato Adv Sci Inst Se》1,527-549(2013)中所述)。在该试验中，抗CD3抗体模仿T细胞受体连接，导致IFN-γ分泌，通过ELISA量化上清液中的IFN-γ。如预期，用VSIG3孵育人PBMC会显著抑制IFN-γ的释放(图6B)。值得注意的是，如果在培养基中加入V4-C26 hIgG4，而不是VSTB112，就能以剂量依赖的方式有效地抑制IFN-γ的释放(图6C)。
这些数据支持了V4-C26 hIgG4在功能上阻断VISTA与VSIG3和LRIG1等关键蛋白伴侣相互作用的假设，并进一步提示了V4-C26 hIgG4的潜在作用机制，阻断VISTA-VSIG3介导的抑制活化T细胞分泌促炎性IFN-γ的作用。
6.2V4-C26 hIgG4调节髓系细胞功能
为了研究VISTA阻断对VISTA表达水平最高的髓系细胞的影响，在几种髓系细胞功能体外模型中对V4-C26 hIgG4的处理进行了评估。
首先，评估了V4-C26 hIgG4阻断VISTA对人类单核细胞MDSC功能的影响。先前的研究报告称，MDSC对抑制TME中的T细胞功能有显著贡献(L.Wang等，《肿瘤免疫学》7，e1469594(2018))。用GM-CSF和IL-6将单核细胞分化成MDSC，持续7天，将其与自体PBMC共同培养。然后用抗CD3抗体刺激T细胞，并通过ELISA检测培养上清液中的IFN-γ水平。
图6D显示，添加V4-C26 hIgG4而不是VSTB112成功逆转了MDSC介导的T细胞对抗CD3刺激的抑制，这体现在IFN-γ水平的提高上。
中性粒细胞等粒细胞是先天性免疫反应不可或缺的一部分，但也会对癌症进展产生不利影响。虽然在体外模拟粒细胞(g)-MDSC的功能具有挑战性，但已知g-MDSC可由浸润肿瘤微环境的中性粒细胞产生(G.E.Kaiko等，《免疫学》123，326-338(2008))。通过迁移试验(transwell assay)探究V4-C26 hIgG4介导的VISTA阻断对中性粒细胞趋化性的影响。在该试验中，中性粒细胞在小室间向生理相关的趋化诱导剂C5a迁移，通过荧光读数量化迁移到下层室细胞百分比。
图6E显示，V4-C26 hIgG4能以剂量依赖的方式有效抑制中性粒细胞的迁移。相比之下，VSTB112只能在更高浓度下抑制中性粒细胞迁移。这些结果综合证明，V4-C26 hIgG4能有效中和髓系细胞上的VISTA，导致促炎细胞因子分泌增加和中性粒细胞迁移减少。
因此，V4-C26 hIgG4通过抑制VISTA-LRIG1和VISTA-VSIG3的结合、减弱VSIG3介导的对活化T细胞释放IFN-γ的抑制、减少MDSC介导的T细胞抑制和抑制中性粒细胞趋化来中和VISTA的活性。
6.3V4-C26 hIgG4使免疫细胞环境向TH1/TH17免疫反应极化
为了在更复杂的体外免疫激活模型中研究VISTA受V4-C26 hIgG4阻断的功能效应，采用了同种异源混合淋巴细胞反应(MLR)试验。简而言之，将来自5个独立健康供体的PBMC成对混合以模拟自体/反自体免疫反应，然后在存在或不存在V4-C26 hIgG4的情况下培养长达96小时，然后分析上清液中的细胞因子水平。还通过常规RNA-seq分析细胞的转录组。通过Luminex检测法量化上清液中的细胞因子水平。
图7A显示，V4-C26 hIgG4在96小时诱导的IFN-γ、TNF-α和IL-17A水平出现了显著的剂量依赖性增加，与抗PD-1抗体帕博利珠单抗阻断PD-1/PD-L1的效果相当，但IL-4、IL-10和IL-13(Th2细胞因子)或IL-6的水平没有显著变化。细胞因子水平的这些变化表明了向Th1/Th17反应的转变。
常规RNA-seq分析进一步证实了这一结论，该分析突出显示了与TLR、TNF-α、IL-1、JAK-STAT和IL-17信号通路相关基因的转录本水平的富集(图7B、14A)，以及Th1相关基因(如IFN-γ、TNF-α和IL-12A)转录本水平的升高和Th2相关基因(IL-4、IL-10、IL-13和IL-9)转录本水平的降低(图14B)。
总之，这些结果表明，V4-C26 hIgG4对VISTA的阻断可以使免疫细胞环境极化为增强的Th1/Th17免疫反应。这与之前报道的导致银屑病和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠VISTA敲除模型一致，后者的特点是Th1/Th17反应(N.Li等，《Sci Rep-uk》7,1485(2017))。
6.4V4-C26 hIgG4治疗在多种具有免疫能力的鼠CDX实体瘤模型中诱导强烈的抗肿瘤反应
为了探索V4-C26 hIgG4在体内的促炎和抗肿瘤作用，在多种实体瘤模型中进行了肿瘤生长抑制研究，其中包括结肠癌(CT26)的同源鼠细胞衍生异种移植(CDX)皮下模型、检查点抑制剂耐受的VISTA表达乳腺癌(4T1)原位CDX模型，以及人肺癌(A549)和结直肠癌(HCT15)CD34移植人源化小鼠模型。
首先，在Balb/c小鼠皮下(右翼)植入CT26肿瘤，植入后3天起每两周腹腔注射500μg(约25mg/kg)V4-C26 hIgG4。
图8A显示，与载体相比，V4-C26 hIgG4具有显著的单剂疗效，肿瘤生长抑制率(TGI)为84％。
在CT26 CDX模型的单独实验中，小鼠从植入后3天开始每两周接受一次较低剂量的V4-C26 hIgG4(200μg、100μg或40μg)治疗，以确定V4-C26 hIgG4在体内有效的最低剂量。图8B显示，V4-C26 hIgG4在所有测试剂量下都有效，在100μg(约5mg/kg)及以上剂量下观察到了强大的肿瘤生长抑制作用。
其次，通过将过表达VISTA的4T1细胞植入Balb/c小鼠的乳房脂肪垫，建立了鼠乳腺癌原位模型。植入后第7、9、12、14、16天，用50μg的V4-C26 hIgG4或抗小鼠VISTA抗体13F3对小鼠进行瘤内处理。13F3经常被用作研究抗VISTA抗体体内疗效的小鼠替代物。
图8C再次显示，V4-C26 hIgG4显示出显著的TGI(53％)，与13F3相当，表明这两种抗体可能有共同的作用机制。
最后，在移植了CD34+脐带血造血干细胞的人源化小鼠中测试了V4-C26 hIgG4的疗效。这些人源化小鼠在肿瘤植入前两天接受了GM-CSF/IL3强化，在器官和血液中稳定重组了多种人体细胞系，如T、B和髓系细胞(表S1)。重组3-4个月后，小鼠皮下植入人HCT15结直肠癌细胞或人A549肺癌细胞，并从植入后5天开始每两周腹腔注射500μg(约25mg/kg)V4-C26 hIgG4或载体对照(表S1)。
图8D和8E显示，与在同源模型中观察到的结果一样，V4-C26 hIgG4在这些HCT15结直肠癌和A549肺癌人源化CDX模型中显示出显著的单剂抗肿瘤疗效，TGI分别为65％和62％。
因此，V4-C26 hIgG4作为一种单药，在多种实体瘤CDX模型中显示出强大的抗肿瘤反应。V4-C26 hIgG4治疗完全免疫功能正常的鼠肿瘤模型和概括人类免疫功能的鼠肿瘤模型后观察到的类似肿瘤抑制作用表明，小鼠和人类的抗肿瘤免疫反应之间存在一种保守的、潜在可转化的作用机制。
6.5V4-C26 hIgG4治疗重塑鼠CDX模型的肿瘤微环境，增加活化的效应免疫细胞，减少抑制性细胞
为了解V4-C26 hIgG4在鼠模型中的抗肿瘤疗效机制，使用FACS进一步分析了来自同源CT26结肠癌模型的肿瘤。
图8F显示，V4-C26 hIgG4治疗显著增加了肿瘤微环境中CD11b+MHCII+(抗原呈递细胞)、CD11b+F4/80+(巨噬细胞)和CD11c+(DC)的百分比。此外，还观察到CD8+T细胞的增加，但没有统计学意义。相比之下，与载体对照组相比，接受治疗的小鼠肿瘤中广泛抑制性MDSC(CD11b+GR1+MHCII-)的频率明显降低。
为了进一步评估免疫细胞数量的这些变化与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)功能状态相关的机制，通过体外共培养CT26细胞和从CDX模型中分离出的TIL进行了抗原召回试验。
图8G显示，共培养72小时后，从经V4-C26 hIgG4处理的肿瘤中分离出的TIL对CT26细胞的裂解率明显提高。浸润T细胞与CT26细胞的体外共培养试验进一步证实了这种活性的提高，与未处理的小鼠相比，经ELISA检测，处理小鼠的T细胞显示出更高的IFN-γ水平。
这些结果表明，V4-C26 hIgG4对VISTA的阻断提高了肿瘤微环境中炎症效应细胞的水平，同时减少了免疫抑制性MDSC，并增强了TIL的抗原特异性细胞毒性活性，这可能是V4-C26 hIgG4抗肿瘤疗效的原因之一。V4-C26 hIgG4能够将肿瘤微环境重塑为抗肿瘤、促炎表型，其主要作用机制与操纵高度VISTA阳性的髓细胞区系一致。
实施例7：V4-C26 hIgG4在多个物种中表现出良好的药代动力学特征
治疗性抗体在血浆中的半衰期应与适当的剂量方案相匹配。以前的抗VISTA抗体表现出以快速血清清除为特征的不良PK(R.J.Johnston等人，《自然》574，565-570(2019))，其原因可能是Fc效应功能，如ADCC，特别是中性粒细胞的ADCC，导致VISTA表达细胞的快速细胞更替，并造成显著的抗体沉降。因此，在健康小鼠和荷瘤小鼠、健康大鼠和NHP中评估了V4-C26 hIgG4的药代动力学特征。
图15A显示了腹腔注射剂量不断增加的V4-C26 hIgG4(5-20mg/kg)后，荷瘤和非荷瘤Balb/c小鼠的代表性药代动力学特征。非荷瘤小鼠的PK呈线性，而有荷瘤小鼠的PK则呈非线性，这可能是由于靶标水平较高，靶标介导的药物处置(TMDD)增加所致。根据计算，不同剂量的V4-C26 hIgG4在荷瘤小鼠体内的血清半衰期为26.9至57.2小时，而在非荷瘤小鼠体内的血清半衰期为61.1至80.8小时。
在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中，通过对雄性和雌性动物进行测量确定了PK曲线。V4-C26 hIgG4施用的单剂量为1mg/kg、10mg/kg和100mg/kg，大鼠以静脉注射方式注入尾静脉，猴以静脉注射方式注入外周静脉。在这两种动物中，V4-C26 hIgG4的PK曲线在性别上没有差异，而且在所有剂量下都能观察到Cmax值按剂量比例增加。V4-C26hIgG4的血清半衰期随各给药组的增加而延长。在大鼠体内，1、10和100mg/kg剂量的两性平均半衰期分别为6.3、25.5和67.5小时，而在食蟹猴体内，1、10和100mg/kg剂量的两性平均半衰期分别为8.6、41.3和34.9小时(图15B和15C)。
总之，这些结果表明，V4-C26 hIgG4在多个物种中具有良好的PK特性，而不会像其他具有耗竭IgG1 Fc结构域的抗VISTA抗体那样被迅速清除。
最佳的治疗性抗体应显示出对正常组织的最小毒性，并避免细胞因子释放综合征等有害副作用(如其他IgG1同种型抗VISTA耗竭抗体在亚治疗剂量下的报道(NCT02671955))。由于V4-C26 hIgG4显示出与VISTA同源物的物种保守结合，作为同时进行的耐受性研究的一部分，上述PK研究中的动物也受到了V4-C26 hIgG4用药不良反应的监测。对Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴进行单次静脉注射后，两种动物均未出现与治疗相关的发病率/死亡率或临床症状，体重、食量、临床生化指标或血液学指标也未出现与治疗相关的变化，且在28天的观察期内均未发生变化。
此外，还利用健康供体的人全血和分离的PBMC进行了体外细胞因子释放测定，通过细胞计数珠阵列方法评估培养上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的水平，从而评估V4-C26 hIgG4的潜在免疫毒性。用V4-C26 hIgG4、阳性对照(抗-CD3或葡萄球菌肠毒素B)或可溶性刺激形式的阴性同种型对照刺激24小时后，测量细胞因子水平。V4-C26hIgG4在血液或纯化的PBMC中没有引起任何明显的细胞因子释放(图15D至15G)。
这些结果表明，V4-C26 hIgG4在大鼠和食蟹猴体内具有良好的耐受性，并进一步表明细胞因子释放导致潜在免疫毒性的风险很低。
实施例8：V4-C26hIgG4增强CD8+T细胞的活化并对肿瘤相关巨噬细胞进行重编程
为了进一步了解在鼠模型中观察到的V4-C26 hIgG4的抗肿瘤疗效机制，用流式细胞术对来自同源CT26结肠癌模型的肿瘤进行了分析，以更详细地评估V4-C26 hIgG4重塑肿瘤微环境的能力。使用小鼠结肠癌模型，是因为该模型表现出多种免疫细胞对肿瘤的强力浸润，可同时研究VISTA介导的多种细胞亚群的免疫调节。
图16A显示，观察到V4-C26 hIgG4治疗显著增加了肿瘤微环境中CD45+CD8+T细胞和gp70+CD8+T细胞(肿瘤抗原特异性CD8+T细胞)的比例。
图16B显示，V4-C26 hIgG4处理可显著增加肿瘤微环境中GZMB+CD8+T细胞、CX3CR1+CD8+T细胞和ICOS+CD27+CD8+T细胞的比例。
这些结果表明，V4-C26 hIgG4对VISTA的阻断增加CD8+T细胞和肿瘤抗原特异性CD8+T细胞亚群的水平。与此同时，CD8+T细胞活化水平也有所提高，包括颗粒酶B在内的几种细胞毒性相关标志物也上调。
图17A显示，V4-C26 hIgG4治疗显著降低了肿瘤微环境中CD45+F4/80+MHCII-细胞(MHCII-巨噬细胞)的百分比。
图17B显示，观察到V4-C26 hIgG4处理显著增加了F4/80+MHCII+CD206-TNFα+细胞(M1型巨噬细胞)的百分比，并显著增加了TNFα的平均荧光强度。
这些结果表明，V4-C26 hIgG4阻断VISTA使巨噬细胞极化为激活的促炎抗肿瘤表型，TNFα和MHCII表达巨噬细胞亚群显著增加。
实施例9：V4-C26 hIgG4处理促进抗肿瘤免疫反应相关转录进程
为了确定V4-C26 hIgG4(HMBD-002)介导的分子变化，通过RNA-seq分析了用载体对照或V4-C26 hIgG4治疗的CT26肿瘤的转录组。
简而言之，小鼠肿瘤(150-200mm2)使用gentleMACSTM组织解离器(美天旎)按照生产商的方案进行解离。使用RNAeasy mini试剂盒(Qiagen)按照生产商的方案提取RNA。使用Illumina Stranded total RNA prep kit with Ribo-zero plus在去除rRNA后制备标准RNA-seq文库。在Illumina的Novaseq平台上进行双端测序，每个样本获得4000万(12Gb)个读段。由nf-core RNA-seq管道对得到的读段进行处理。读段与从iGenomes(GRCm38Ensemblrelease 81)下载的小鼠参考基因组进行了比对。使用Salmon获得基因计数，将计数矩阵加载到R中，使用DESeq2进行差异表达分析。
图18显示，观测到V4-C26 hIgG4处理显著上调CT26肿瘤中与促炎巨噬细胞活化正向调节T细胞细胞毒性和T细胞细胞溶解活性相关的多个基因的转录。除了Apobec3、Ptgs2、P2rx7和Pvr没有变化或略有下调外，所测得的每个基因都出现了上调。
这些结果表明，V4-C26 hIgG4对VISTA的阻断导致了参与巨噬细胞介导的促炎免疫反应和T细胞细胞毒活性的多个基因上调。这些结果与基于流式细胞术的CT26肿瘤分析结果一致(见实施例8)，因为包括TNFα和颗粒酶B在内的许多基因在蛋白质和RNA水平上都出现了上调。
实施例10：V4-C26hIgG4与aPD-1联合治疗诱导抗肿瘤反应增强
为了探索V4-C26 hIgG4与aPD-1联用的促炎和抗肿瘤作用，在结肠癌(CT26)的同源鼠细胞衍生异种移植(CDX)皮下模型中进行了肿瘤生长抑制研究。还使用FACS对模型中的肿瘤进行了分析，以了解抗肿瘤功效的机制。
给Balb/c小鼠皮下注射CT26肿瘤，并在肿瘤植入后3天起每两周腹腔注射一次：
·PBS(载体)
·25mg/kg的V4-C26 hIgG4
·10mg/kg的aPD-1(Bioxcell,BE0033-2)
·25mg/kg的V4-C26 hIgG4和10mg/kg的aPD-1(Bioxcell,BE0033-2)。
图19A显示，V4-C26 hIgG4和aPD-1作为单药具有很强的疗效。与单药治疗V4-C26hIgG4或aPD-1相比，V4-C26 hIgG4和aPD-1的组合增强抗肿瘤疗效。
图19B显示，V4-C26 hIgG4和aPD-1作为单药治疗提高gp70+CD8+T细胞(肿瘤抗原特异性T细胞)的水平，并降低gp70+CD8+PD-1+IL-7Ra-T细胞(肿瘤抗原特异性耗竭T细胞)的水平。与单药治疗V4-C26 hIgG4或aPD-1相比，V4-C26 hIgG4和aPD-1联合疗法进一步提高gp70+CD8+T细胞(肿瘤抗原特异性T细胞)的水平，并显著降低gp70+CD8+PD-1+IL-7Ra-T细胞(肿瘤抗原特异性耗竭T细胞)的水平。
这些结果表明，V4-C26 hIgG4联合aPD-1作用阻断VISTA增强抗肿瘤效果，并提高抗原特异性CD8+T细胞的水平，并减少耗竭。
实施例11：在人源化间皮瘤PDX模型中进行V4-C26hIgG4治疗
间皮瘤是VISTA高表达癌症之一，据报道，在间皮瘤亚型中，上皮样间皮瘤的VISTA表达最高。为了探索V4-C26 hIgG4在间皮瘤中的抗肿瘤功效，在人源化VISTA阳性恶性胸膜上皮样间皮瘤患者异种移植(PDX)模型中进行了肿瘤生长抑制研究。
在第-60天，人源化CD34+NCG小鼠(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl)(Charles River实验室)皮下植入PNX0411 PDX肿瘤。
当肿瘤平均体积达到约90–100mm3时，开始使用PBS(载体)或25mg/kg的V4-C26hIgG4治疗(第0天)。每两周进行一次腹腔注射治疗。
研究结束时(约治疗开始后6-8周)，收集血液和肿瘤样本，分别用于细胞因子和FACS分析。使用经过验证的基于免疫测定的MesoScale(MSD)试剂盒进行细胞因子分析，检测IL1b、IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、IL12/p70、IL13、TNF-α、IFN-β水平。对活细胞/死细胞、huCD45、huCD3、huCD8、huCD4、huCD56、HLA-DR、PD-1、huCD14和huVISTA等人类标志物进行流式细胞术分析。
图20显示，使用V4-C26 hIgG4治疗的小鼠的肿瘤生长明显减少，这表明V4-C26hIgG4作为一种单药疗法对恶性胸膜上皮样间皮瘤PDX具有很强的抗肿瘤疗效。

Claims (16)

1.一种用于在治疗或预防受试者癌症方法中的与VISTA结合的抗原结合分子，其特征在于，所述治疗或预防包括：
(i)提高抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)提高CD8+T细胞活性；
(iii)减少T细胞耗竭水平；
(iv)减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)增加M1型巨噬细胞的活性。
2.一种与VISTA结合的抗原结合分子在制备用于治疗或预防受试者癌症的药物中的用途，其特征在于，所述治疗或预防包括：
(i)提高抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)提高CD8+T细胞活性；
(iii)减少T细胞耗竭水平；
(iv)减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)增加M1型巨噬细胞的活性。
3.一种治疗或预防受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的与VISTA结合的抗原结合分子，其特征在于，所述治疗或预防包括：
(i)提高抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)提高CD8+T细胞活性；
(iii)减少T细胞耗竭水平；
(iv)减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)增加M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)增加M1型巨噬细胞的活性。
4.根据权利要求1所述的用于抗原结合分子、根据权利要求2所述用途或根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述癌症包括含有表达VISTA细胞的肿瘤。
5.一种选择用与VISTA结合的抗原结合分子治疗受试者的方法，包括：
(a)分析受试者的癌症，从而确定所述癌症是否具有以下特征：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例低；
(ii)CD8+T细胞活性低；
(iii)耗竭T细胞的存在和/或水平高；
(iv)TAM方存在和/或数量和/或比例高；
(v)M1型巨噬细胞的数量和/或比例低；和/或
(vi)M1型巨噬细胞活性低；和
(b)在步骤(a)中确定受试者的癌症具有(i)至(vi)中一项或多项时，选择所述受试者用与VISTA结合的抗原结合分子进行治疗。
6.一种确定患者对用与VISTA结合的抗原结合分子治疗的反应的方法，包括：
(a)在第一个时间点分析受试者的癌症，从而确定：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例；
(ii)CD8+T细胞的活性；
(iii)耗竭T细胞的水平；
(iv)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例；
(v)M1型巨噬细胞的数量和/或比例；和/或
(vi)M1型巨噬细胞的活性；
(b)在后续时间点分析受试者的癌症，从而确定(i)至(vi)中一项或多项；和
(c)确定(a)和(b)之间的差异，其中：
(i)抗原特异性CD8+T细胞的数量和/或比例提高；
(ii)CD8+T细胞的活性提高；
(iii)耗竭T细胞的水平降低；
(iv)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量和/或比例降低；
(v)M1型巨噬细胞的数量和/或比例提高；和/或
(vi)M1型巨噬细胞的活性提高，
与(a)相比，(b)中的数值表示对与VISTA结合的抗原结合分子治疗的阳性反应。
7.根据权利要求1至6所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变(VH)区：
具有如SEQ ID NO:305所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:306所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:307所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变(VL)区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:308所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
8.根据权利要求1至7所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变(VH)区：
具有如SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有如SEQ ID NO:291所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有如SEQ ID NO:278所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变(VL)区：
具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有如SEQ ID NO:295所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR3。
9.根据权利要求1至8所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述抗原结合分子包括：
VH区，其包括与SEQ ID NO:289所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和
VL区，其包括与SEQ ID NO:297所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述抗原结合分子包括：
包含以下框架区(FR)的VH区：
具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的HC-FR1
具有如SEQ ID NO:292所示氨基酸序列的HC-FR2
具有如SEQ ID NO:293所示氨基酸序列的HC-FR3
具有如SEQ ID NO:281所示氨基酸序列的HC-FR4。
11.根据权利要求1至10所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述抗原结合分子包括：
包含以下框架区(FR)的VL区：
具有如SEQ ID NO:288所示氨基酸序列的LC-FR1
具有如SEQ ID NO:283所示氨基酸序列的LC-FR2
具有如SEQ ID NO:284所示氨基酸序列的LC-FR3
具有如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的LC-FR4。
12.根据权利要求1至11所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述抗原结合分子包括含有SEQ ID NO:331所示氨基酸序列的重链。
13.根据权利要求1至12所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述抗原结合分子包括含有SEQ ID NO:317所示氨基酸序列的轻链。
14.根据权利要求1至13所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述癌症选自：血液肿瘤、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、上皮样间皮瘤、实体瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃恶性肿瘤、结直肠癌、结直肠肿瘤、结直肠腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、三阴性浸润性乳腺癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、甲状腺癌、胸腺瘤、皮肤癌、黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌、肾乳头状细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、卵巢癌、卵巢瘤、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌和/或前列腺腺癌。
15.根据权利要求14所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述癌症选自：结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胸腺瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和实体瘤。
16.根据权利要求14所述抗原结合分子、其用途或方法，其特征在于，所述癌症为上皮样间皮瘤。
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