CN120285149A

CN120285149A - Pou2f2蛋白或其突变体在预防和治疗感染中的用途

Info

Publication number: CN120285149A
Application number: CN202410029751.XA
Authority: CN
Inventors: 彭敏
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2024-01-09
Filing date: 2024-01-09
Publication date: 2025-07-11
Also published as: WO2025148787A1

Abstract

本发明公开了POU2F2蛋白或其突变体在预防和治疗感染中的用途。本发明提供了POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂的以下任一项用途：(A)在制备用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途；(B)在制备用于增强免疫细胞抗感染能力的产品中的用途；(C)在制备用于预防和/或逆转免疫细胞耗竭的产品中的用途。

Description

POU2F2蛋白或其突变体在预防和治疗感染中的用途

技术领域

本发明属于免疫细胞技术领域，具体涉及POU2F2蛋白或其突变体在预防和治疗感染中的用途。

背景技术

在病原体感染过程中，免疫细胞(例如T细胞)扩增不足，消退过快，不能形成有效免疫记忆，或进入耗竭状态，是病原体不能被彻底清除并形成长期免疫记忆的重要原因。目前增加免疫细胞(例如T细胞)扩增，促进免疫记忆形成和抑制耗竭的方法非常有限，需要进一步研究。

POU结构域,2类,转录因子2(POU domain,class 2,transcription factor 2,POU2F2)是一种调控基因表达的转录因子。引用文献1公开了一种预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的分子靶标，包含：抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4的基因的活性的试剂，和/或增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。引用文献2公开了高表达的POU2F2与胶质母细胞瘤(GBM)患者的不良预后显著相关。POU2F2促进细胞增殖并调节糖酵解重编程。

然而，POU2F2在T细胞中的生理和病理功能，以及抗感染的作用尚不清楚。

引用文献

引用文献1：CN105793279A

引用文献2：Yang,Rui et al.“POU2F2 regulates glycolytic reprogrammingand glioblastoma progression via PDPK1-dependent activation of PI3K/AKT/mTORpathway.”Cell death&disease vol.12,5 433.30Apr.2021,doi:10.1038/s41419-021-03719-3

发明内容

发明要解决的问题

感染过程中免疫细胞(例如T细胞)扩增不足，快速进入收缩期，无法形成记忆性T细胞是目前的难题。本发明通过在病原体(例如病毒和细菌)感染过程中提高POU2F2蛋白水平或功能，显著加强T细胞扩增能力、抑制T细胞进入收缩期、增强T细胞的持久性和/或增强记忆T细胞的形成，从而提升了T细胞抗感染的能力。

用于解决问题的方案

在本发明的第一方面中，提供了POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂的以下任一项用途：

(A)在制备用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途；

(B)在制备用于增强免疫细胞抗感染能力的产品中的用途；

(C)在制备用于预防和/或逆转免疫细胞耗竭的产品中的用途。

在一些实施方案中，所述POU2F2蛋白选自：

(a)具有SEQ ID NO:2或12所示氨基酸序列的多肽；或

(b)与SEQ ID NO:2或12所示的氨基酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的蛋白质或多肽；或

(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。

在一些实施方案中，所述核酸分子选自：

(i)具有SEQ ID NO:9或11所示核苷酸序列的核酸分子；或

(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交的分子；

(iii)与SEQ ID NO:9或11所示的核苷酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)、且编码具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的蛋白质或多肽的核酸分子；

(iv)由(i)或(ii)或(iii)的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的蛋白质或多肽的核酸分子。

在一些实施方案中，所述促进剂选自：提高POU2F2蛋白水平或促进POU2F2蛋白功能的物质；外源性POU2F2蛋白；POU2F2蛋白编码序列的裸DNA；POU2F2蛋白编码序列的脂质体包裹DNA；能够在体内转化为POU2F2蛋白的POU2F2蛋白前体蛋白或偶联物或复合物。

在一些实施方案中，POU2F2蛋白突变体选自：

(1)如SEQ ID NO:2所示的POU2F2的第184位和185位氨基酸双突变为丙氨酸所获得的突变体；

(2)如SEQ ID NO:2所示的POU2F2缺失第281至340位氨基酸所获得的突变体；

(3)如SEQ ID NO:2所示的POU2F2的第335位和339位氨基酸双突变为丙氨酸所获得的突变体。

在一些具体的实施方案中，POU2F2蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、5或7所示。

在一些实施方案中，所述感染包括病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染、寄生虫感染或其组合。

在一些实施方案中，所述与感染相关的疾病和/或征状为选自下组中的一种或多种：

感染引起的病理损伤；感染后免疫细胞耗竭，包括免疫细胞的增殖能力降低、杀伤能力减弱、分泌细胞因子减少；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭，感染导致的急性和/或慢性炎症性疾病。

在一些实施方案中，所述免疫细胞包括T细胞、NKT细胞、NK细胞、天然淋巴细胞(ILC)和嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)中的至少一种。

在一些具体的实施方案中，所述T细胞包含原初T细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、耗竭的T细胞、耐受T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、T细胞受体T细胞(TCR-T细胞)和抗原特异性T细胞中的至少一种。

在一些任选的实施方案中，所述的T细胞包含活化的T细胞。

在一些任选的实施方案中，所述的T细胞包含抗原特异性T细胞，优选地，所述抗原特异性T细胞是针对引起感染的病原体的抗原特异性T细胞。

在一些任选的实施方案中，所述的T细胞包含CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，所述产品为药物组合物、药盒、试剂或试剂盒。

在本发明的第二方面中，提供了一种重组免疫细胞，相较于未重组的免疫细胞，所述重组免疫细胞具有提高的POU2F2蛋白水平或功能。

在一些具体的实施方案中，所述的T细胞包含原初T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、耗竭的T细胞、耐受T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、T细胞受体T细胞(TCR-T细胞)和抗原特异性T细胞中的至少一种。

在一些具体的实施方案中，所述的T细胞包含活化的T细胞。

在一些具体的实施方案中，所述的T细胞包含抗原特异性T细胞，优选地，所述抗原特异性T细胞是针对引起感染的病原体的抗原特异性T细胞。

在一些具体的实施方案中，所述的T细胞包含CD8⁺T细胞。

在本发明的第三方面中，提供了如本发明的第二方面中所述的重组免疫细胞在制备用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途。

在本发明的第四方面中，提供了一种药物组合物或药盒，其包含：

(A)治疗或预防有效量的POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子和/或其促进剂，和/或如本发明的第二方面中所所述的重组免疫细胞；

(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。

发明的效果

本发明揭示了过表达POU2F2及其突变体能够显著增强感染过程中T细胞的扩增能力和持久性，并且拮抗免疫细胞耗竭，因而增加T细胞的抗感染能力。因此，过表达POU2F2及其突变体能够有效预防或治疗感染以及感染相关疾病。

附图说明

图1、过表达POU2F2显著增加了LCMV克隆13慢性病毒感染过程中CD8⁺T细胞的扩增能力和持久性。

图1中的A为实验设计示意图。P14细胞被激活并用具有GFP标记物的过表达空载体的逆转录病毒(图中表示为Control)和具有GFP标记物的POU2F2过表达载体的逆转录病毒(图中表示为Pou2f2)转导。将GFP阳性的P14细胞分别过继回输至B6小鼠体内，12至24小时后，用LCMV克隆13病毒以尾静脉注射的方式感染B6小鼠。用流式细胞仪检测血液中的GFP阳性P14细胞。图1中的B显示了GFP阳性P14细胞中的POU2F2表达量。图1中的C和D显示了LCMV克隆13病毒感染期间血液中GFP阳性P14细胞的代表图和动力学曲线(每组n＝5只小鼠)。图1中的E显示了LCMV克隆13病毒感染30天后对照组和实验组小鼠血清中病毒滴度的统计分析结果(每组n＝4只小鼠)。图1中的D和E，数据表示平均值±标准误(mean±SEM)；图1中的D为双因素方差分析比较检验(two-way ANOVA multiple-comparisons test)，图1中的E为双尾非配对Student’s t检验(two-tailed unpaired Student’s t test)。

图2、在LCMV克隆13慢性病毒感染过程中，过表达POU2F2对CD8⁺T细胞的扩增能力和持久性的正调控不依赖于POU2F2的转录活性。

P14细胞被激活并用具有GFP标记物的过表达空载体的逆转录病毒(图中表示为Control)和具有GFP标记物的POU2F2或其突变体过表达载体的逆转录病毒转导。将GFP阳性的P14细胞分别过继回输至B6小鼠体内，12至24小时后，用LCMV克隆13病毒以尾静脉注射的方式感染B6小鼠。用流式细胞仪检测血液中的GFP阳性P14细胞。图2中的A和B显示了LCMV克隆13病毒感染期间血液中GFP阳性P14细胞的代表图和动力学曲线(每组n＝5只小鼠)。图2中的B，数据表示平均值±标准误(mean±SEM)，双因素方差分析比较检验(two-way ANOVAmultiple-comparisons test)。

图3、过表达POU2F2显著增加了LCMV Armstrong急性病毒感染过程中CD8⁺T细胞的扩增能力和持久性。

图3中的A为实验设计示意图。P14细胞被激活并用具有GFP标记物的过表达空载体的逆转录病毒(图中表示为Control)和具有GFP标记物的POU2F2过表达载体的逆转录病毒(图中表示为Pou2f2)转导。将GFP阳性的P14细胞分别过继回输至B6小鼠体内，12至24小时后，用LCMV Armstrong病毒以尾静脉注射的方式感染B6小鼠。用流式细胞仪检测血液中的GFP阳性P14细胞。图3中的B和C显示了LCMV Armstrong病毒感染期间血液中GFP阳性P14细胞的代表图和动力学曲线(每组n＝5只小鼠)。图3中的C，数据表示平均值±标准误(mean±SEM)，双因素方差分析比较检验(two-way ANOVA multiple-comparisons test)。

图4、过表达POU2F2显著增加了LM-OVA急性细菌感染过程中CD8⁺T细胞的扩增能力和持久性。

图4中的A为实验设计示意图。OT-1细胞被激活并用具有GFP标记物的过表达空载体的逆转录病毒(Control)和具有GFP标记物的POU2F2过表达载体的逆转录病毒(图中表示为Pou2f2)转导。将GFP阳性的OT-1细胞分别过继回输至B6小鼠体内，12至24小时后，用LM-OVA细菌以尾静脉注射的方式感染B6小鼠。用流式细胞仪检测血液中的GFP阳性OT-1细胞。图4中的B和C显示了LM-OVA细菌感染期间血液中GFP阳性OT-1细胞的代表图和动力学曲线(每组n＝5只小鼠)。图4中的C，数据表示平均值±标准误(mean±SEM)，双因素方差分析比较检验(two-way ANOVA multiple-comparisons test)。

具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。

本说明书中，术语“免疫细胞”是指在免疫应答中发挥作用的任何细胞。免疫细胞属于造血来源，并且包含淋巴细胞，如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。

本说明书中，术语“淋巴细胞”是指所有未成熟、成熟、未分化和已分化的白色淋巴细胞群体，其包含组织特异性种类和专门种类。通过非限制性实例的方式，所述淋巴细胞涵盖B细胞、T细胞、NKT细胞和NK细胞。

本说明书中，“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

本说明书中，“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的重组免疫细胞，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。

在本说明书中，术语“预防”是指对现在没有和过去没有疾病但有发展成疾病的风险或过去患有疾病，现在没有疾病但有疾病复发风险的受试者的预防性治疗。

本说明书中，“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

在本说明书中，“治疗有效量”是足以在病症的治疗中提供治疗益处或足以延迟或最小化与病症有关的一种或多种症状的量。治疗有效量是指单独或与其他疗法组合的治疗剂的量，其在病症的治疗中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以包括改善总体疗法；减少或避免病症的症状、体征或原因；和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。

在本说明书中，“预防有效量”是足以预防病症或与病症相关的一种或多种症状或预防其复发的量。预防有效量是指单独或与其它药剂组合的治疗剂的量，其在预防病症中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。

在本说明书中，术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”、“可药用的”)是指适当时在施用于动物或人时不产生不利反应，过敏反应或其他不良反应的分子实体及组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包含可以使用作为药学可接受物质之介质的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂及吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。

本说明书中，“受试者”或“宿主”是指人类或非人类动物，包括哺乳动物。例如，灵长类动物(如人、猴)、牛、绵羊、山羊、羊驼、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠之类。“受试者”或“宿主”包括治疗型和非治疗型。“受试者”或“宿主”包括实验用动物模型或用于生产表达治疗疾病的生物分子的动物，即“非治疗型宿主”或“非治疗型受试者”。

本发明技术方案详述：

本发明的主要目的之一在于提供POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂在抗感染中的用途，并进一步提供它们在治疗或预防感染性疾病以及相关的疾病或征状中的用途。本发明的药物、药物组合物或试剂、试剂盒可用于有效抵抗感染、控制感染性疾病的发生。

本发明的一些方面中，提供POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂在预防和/或逆转免疫细胞耗竭或增强免疫细胞抗感染能力中的用途。

在一些实施方式中，POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂用于预防和/或逆转免疫细胞耗竭或增强免疫细胞抗感染能力以提高受试者抗感染能力、预防和/或治疗感染。

本发明的一些方面中，提供了POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂在制备用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途。

本发明的一些方面中，提供了POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂在制备用于预防和/或逆转免疫细胞耗竭或增强免疫细胞抗感染能力的产品中的用途。

本发明的一些方面中，还提供了一种预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状的方法，所述方法包括给予有需要的对象预防和/或治疗有效量的POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂。

本发明的一些方面中，还提供了一种预防和/或逆转免疫细胞耗竭或增强免疫细胞抗感染能力的方法，所述方法包括使免疫细胞中具有提高的POU2F2蛋白水平或功能，例如通过POU2F2蛋白或其突变体的促进剂或编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子的促进剂处理免疫细胞。

本发明的一些方面中，还提供了POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂，其用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状。

本发明的一些方面中，还提供了POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂，其用于预防和/或逆转免疫细胞耗竭或增强免疫细胞抗感染能力。

POU2F2蛋白(多肽)

本说明书中，术语“POU2F2蛋白(多肽)”、“POU2F2”可互换使用，是指POU domain,class 2,transcription factor 2，其Gene ID：5452，Uniprot参考号：P09086。本发明的POU2F2蛋白可为由SEQ ID NO:11(人cDNA全长序列)或SEQ ID NO:9(小鼠CDS序列)所编码的蛋白质或这些蛋白质具有抗感染作用的同源序列(例如可通过本领域已知的数据库或比对软件获得POU2F2的同源序列)、突变体或修饰形式。例如，所述POU2F2蛋白可选自：(a)SEQID NO:2或12所示的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗感染、预防和/或逆转免疫细胞耗竭和/或增强免疫细胞抗感染能力的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。

本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中POU2F2蛋白或多肽优选由人或小鼠Pou2f2基因或其同源基因或家族基因编码。

在一些实施方案中，Pou2f2基因的示例性信息可参见下表1。

表1Pou2f2基因信息

在本发明中，具体来说，人Pou2f2基因(Gene ID:5452，2023年11月23日更新，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5432)和鼠Pou2f2基因(Gene ID:18987，2023年11月23日更新，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/18987)编码细胞中POU2F2。以上基因通过引用的方式全部并入到本发明中。

本发明蛋白质或多肽的变异形式(例如突变体)包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的POU2F2蛋白或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有抗感染、预防和/或逆转免疫细胞耗竭和/或增强免疫细胞抗感染能力的活性。

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。示例性地，可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因动物，并观察该转基因动物对病原体感染是否具有抵抗作用或对病原体感染的抵抗性是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋白质或多肽。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括POU2F2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与POU2F2蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗POU2F2蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含POU2F2蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了POU2F2蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有POU2F2蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在一些具体的实施方案中，POU2F2蛋白的突变体选自：

(1)POU2F2的第184位和185位氨基酸双突变为丙氨酸所获得的突变体(即POU2F2-184A185A)，POU2F2-184A185A的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(2)POU2F2缺失第281至340位氨基酸所获得的突变体(即POU2F2△281-340aa)，POU2F2△281-340aa的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

(3)POU2F2的第335位和339位氨基酸双突变为丙氨酸所获得的突变体(即POU2F2-335A 339A)，POU2F2-335A339A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子

在本说明书中，术语“POU2F2基因”、“POU2F2编码基因”、“POU2F2蛋白编码基因”或“编码POU2F2的核酸分子”可互换使用，均是指一种编码本发明所述的POU2F2蛋白或多肽(或POU2F2蛋白突变体)的核苷酸序列，其可为例如SEQ ID NO:11人CDS序列、SEQ ID NO:9(小鼠CDS)序列所示的核苷酸序列、在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对抗感染、预防和/或逆转免疫细胞耗竭和/或增强免疫细胞抗感染能力具有一定的促进作用。POU2F2基因在人与小鼠中高度保守。人的Gene ID是5452，鼠的Gene ID是18987。

本发明的POU2F2基因可选自：(i)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有抗感染活性、预防和/或逆转免疫细胞耗竭和/或增强免疫细胞抗感染能力的活性的分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。

本发明的POU2F2基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的POU2F2基因优选获自人或小鼠，获自其它动物的与人或小鼠POU2F2基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体编码序列的促进剂

本发明中还涉及POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体POU2F2编码序列的“促进剂”。术语“促进剂”或“POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体编码序列的促进剂”可互换使用，是指可提高POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体编码核酸分子的水平或活性的物质。可用于本发明中的促进剂包括但不限于：POU2F2蛋白或其突变体表达载体、外源性POU2F2蛋白或其突变体、POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体编码序列的裸DNA、POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体编码序列的脂质体包裹DNA、POU2F2蛋白或其突变体。

本发明的POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体或其促进剂可抗感染，从而可进一步用于预防或治疗与病原体感染相关的疾病、和/或病原体感染引发的相关征状，以及感染导致的急、慢性炎症性疾病、和/或其征状。

感染

本说明书中，术语“感染”是指病原体如细菌、病毒、真菌、蠕虫或原生动物侵入受试者的细胞、组织和/或器官。在一些实施例中，病原体可在受试者的细胞、组织和/或器官中生长、繁殖和/或产生毒素。在一些实施例中，受试者可对病原体产生反应(即，过敏反应或免疫应答)。感染的实例包括但不限于细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染和原生动物感染。

在一些实施方案中，所述感染是急性感染。在另一些实施方案中，所述感染是慢性感染。

在一些的实施方案中，所述感染是病毒感染，在另一些实施方案中，所述感染是细菌感染。

在一些的实施方案中，所述与感染相关的疾病和/或征状为选自下组中的一种或多种：感染引起的病理损伤；感染后免疫细胞耗竭，包括免疫细胞的增殖能力降低、杀伤能力减弱、分泌细胞因子减少；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭，例如所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠；感染导致的急性和/或慢性炎症性疾病(例如自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病)。

在一些实施方案中，POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂可以增强受试者抗感染能力，包括增强受试者中免疫细胞抗感染能力，和/或预防和/或逆转受试者中免疫细胞耗竭。

免疫细胞

在本发明中，所述免疫细胞包括T细胞、NKT细胞、NK细胞、天然淋巴细胞(ILC)或其它具备抗感染能力的免疫细胞，以及，嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)或其它表达非天然抗原受体的治疗性免疫细胞，但不限于此。

在本发明中，术语“T细胞”包含原初T细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、耗竭的T细胞、耐受T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、T细胞受体T细胞(TCR-T细胞)和抗原特异性T细胞，但不限于此。

在一些具体的实施方案中，T细胞包含活化的T细胞。

在一些具体的实施方案中，T细胞包含抗原特异性T细胞。

在一些具体的实施方案中，抗原特异性T细胞是针对引起感染的病原体的抗原特异性T细胞。

在一些实施方案中，所述T细胞来自受试者。在一些具体实施方案中，所述受试者是人或非人动物。

在一些具体实施方案中，所述受试者被病原体感染。

在一些具体的实施方案中，T细胞包含被病原体感染的受试者中，针对引起感染的病原体的抗原特异性T细胞。

在一些具体的实施方案中，T细胞包含CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，T细胞包含耗竭的T细胞。

在本发明中，免疫细胞耗竭(immune cell depletion)是指机体免疫系统中的某些免疫细胞数量显著减少或功能受损，导致机体免疫功能下降的一种病理状态。

在本发明中，术语“耗竭的T细胞”或“T细胞耗竭”是指功能失调的T细胞，耗竭的T细胞在慢性感染期间效应功能的逐渐丧失。

在一些具体的实施方案中，预防和/或逆转免疫细胞耗竭包括：抑制T细胞进入收缩期、保持T细胞处于扩张期、增强T细胞扩增能力、增强T细胞的持久性和/或增强记忆T细胞的形成。

在本发明中，“扩张期”指T细胞在接触抗原或其他刺激因素后，发生免疫应答的阶段。在这个阶段，T细胞的数量会迅速增加，以对抗抗原的刺激。这个阶段是T细胞免疫应答的关键环节之一。

在本发明中，“收缩期”指在T细胞在免疫应答中存在一个阶段，在这个阶段，T细胞的数量会大幅度减少。这个阶段通常发生在T细胞扩张期后，是T细胞分化的关键阶段。

在本发明中，“持久性”指T细胞的寿命和稳定性。持久性强的T细胞能够长期存活并保持其一定的免疫功能，这有助于维持长期的免疫记忆。持久性弱的T细胞则容易死亡，需要不断补充新的T细胞来维持免疫系统的功能。

产品

在本发明中，所述产品可以是药物组合物、药盒、试剂或试剂盒。

<重组免疫细胞及其抗感染的用途>

本发明的一些方面中，提供了一种重组免疫细胞，相较于未重组的免疫细胞，所述重组免疫细胞具有提高的POU2F2蛋白水平或功能。

在一些实施方案中，未重组的免疫细胞可以是受试者中天然存在的、未经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，未重组的免疫细胞可以是未通过本发明所述的POU2F2蛋白或其突变体的促进剂，或者编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子的促进剂处理的免疫细胞。

在一些具体的实施方案中，重组免疫细胞可以具有增强的POU2F2蛋白或其突变体的活性和/或增强的POU2F2蛋白或其突变体编码序列的表达水平。

本发明的一些方面中，提供了重组免疫细胞在制备用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途，其中，所述重组免疫细胞具有提高的POU2F2蛋白水平或功能。

在一些实施方案中，POU2F2蛋白或其突变体、POU2F2蛋白或其突变体编码序列如前文所述。

在一些实施方案中，T细胞包含活化的T细胞。

在一些实施方案中，T细胞包含CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，T细胞包含抗原特异性T细胞。

在一些实施方案中，抗原特异性T细胞是针对引起感染的病原体的抗原特异性T细胞。其中，感染是如前文所述的感染。

在一些实施方案中，T细胞包含耗竭的T细胞。

在一些具体实施方案中，所述受试者患有感染。在一些具体的实施方案中，T细胞包含患有感染的受试者中，针对引起感染的病原体的抗原特异性T细胞。

在一些实施方案中，所述的重组免疫细胞可以是通过POU2F2蛋白或其突变体的促进剂，或者编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子的促进剂处理的免疫细胞，其中经处理的免疫细胞中具有提高的POU2F2蛋白水平或功能(例如，具有增强的POU2F2蛋白或其突变体的活性和/或增强的POU2F2蛋白或其突变体编码序列的表达水平)。

在一些具体实施方案中，与未使用所述促进剂处理的免疫细胞(非重组免疫细胞)相比，使用所述促进剂处理的免疫细胞(重组免疫细胞)中的POU2F2蛋白或其突变体的表达或功能增加了至少10％、20％、30％、40％50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。

(处理方法)

在本发明中，所述促进剂处理免疫细胞的方法没有特殊的限制，例如可以是将所述促进剂导入免疫细胞中。在一些示例性的实施方案中，所述促进剂处理免疫细胞可以是将携带能够表达所述促进剂的一种或多种组分的核苷酸，通过本领域技术人员已知的技术，导入免疫细胞中。

在一些实施方案中，使用的载体为是病毒载体、类病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，包含编码所述促进剂的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于基于以下的病毒载体：痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒、和衍生自逆转录病毒的载体，例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。合适的非病毒载体选自转座子、脂质纳米颗粒、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。

在一些实施方案中，编码所述促进剂的多核苷酸序列可操作地连接到控制元件，例如转录控制元件，诸如启动子。转录控制元件在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)或原核细胞(例如，细菌或古细菌细胞)中可以是功能性的。在一些实施方案中，编码所述促进剂的多核苷酸序列可操作地连接到多个控制元件，其允许多核苷酸在原核和真核细胞中都表达。根据所使用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一个(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中。

在一些实施方案中，合适的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白1的那些。合适的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内。表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。表达载体还可包含编码与定点修饰多肽融合的蛋白质标签(例如，6×His标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生嵌合多肽。

(获得免疫细胞的方法和培养)。

在本发明中，对于获得免疫细胞的方法，原则上没有特别的限制。示例性的，可以从受试者外周血中分离外周血单核细胞，并通过例如磁珠分选、流式细胞术分选技术，分离特定表型的免疫细胞。

在一些实施方案中，在本公开中，对于培养免疫细胞的方法，原则上没有特别的限制。在一些实施方案中，可以将免疫细胞植入到受试者体内进行扩增，并获取体内扩增后的重组免疫细胞。从第一代受试者体内扩增后获取重组免疫细胞，可用于受试者的自体治疗或用于其他受试者的异体治疗。在一些实施方案中，免疫细胞对于受试者是自体的免疫细胞，或同种异体的免疫细胞。在一些实施方案中，也可以将免疫细胞在体外进行扩增。

载体、宿主及转基因动物

本发明还涉及包含POU2F2蛋白或其突变体编码基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达POU2F2蛋白或其突变体的转基因动物。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的POU2F2蛋白或其突变体。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码POU2F2蛋白或其突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。

本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含POU2F2蛋白或其突变体编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pMIGW载体表达系统。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本发明中，优选采用大肠杆菌细菌细胞、人的肝脏细胞作为宿主细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明中术语“转基因动物”、或“转化动物”可互换使用，均指通过常规转基因的方法获得的转入本发明POU2F2基因并稳定高表达POU2F2蛋白或多肽的细胞、器官、组织或个体。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

<药物组合物或药盒>

本发明还提供了一种产品，其可为例如试剂、药物、药物组合物或试剂盒/药盒，其中含有有效量的本发明的POU2F2蛋白或其突变体或编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂，或者本发明的重组免疫细胞，以及药学上或免疫学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”或“本发明的活性物质”可互换使用，是指POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体编码序列或其促进剂、或者重组免疫细胞。

在较佳的实施方案中，所述产品可用于预防或治疗与感染相关的疾病、感染导致的急、慢性炎症性疾病、和/或其征状；例如，本发明的药物组合物可用于预防或治疗与现有技术中已知可治疗或预防感染性疾病，例如感染引起的组织损伤；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭。

在一些实施方案中，所述产品为药物组合物或药盒，例如其形式适于通过选自下组方式给予的药物组合物或药盒：口服、注射(例如直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药、瘤内给药。

本发明的产品中的活性物质占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的产品制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

应理解，所用POU2F2蛋白或其突变体或POU2F2蛋白或其突变体编码序列、重组免疫细胞等活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本发明的产品可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸DNA或者蛋白质注射法；(2)将POU2F2的cDNA、mRNA和蛋白质与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)cDNA、mRNA和蛋白质与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹cDNA、mRNA和蛋白质后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)cDNA、mRNA和蛋白质与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运cDNA、mRNA和蛋白质可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将cDNA、mRNA和蛋白质体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将POU2F2相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将cDNA、mRNA和蛋白质导入靶细胞；(9)细胞免疫疗法，将重组免疫细胞输入人体。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、过表达POU2F2及其突变体的重组T细胞制备

1、基因过表达载体的构建

本实施例构建了基于逆转录病毒的过表达载体，即pMIGW-GFP、pMIGW-POU2F2-GFP、pMIGW-POU2F2-184A 185A-GFP、pMIGW-POU2F2△281-340aa-GFP和pMIGW-POU2F2-335A339A-GFP。

其中，载体pMIGW-GFP(Addgene,plasmid#12282)，为不编码过表达基因的空载体序列。

载体pMIGW-POU2F2-GFP(SEQ ID NO:1)，第6622-8013位为POU2F2的全长编码序列。

POU2F2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MVHSSMGAPEIRMSKPLEAEKQSLDSPSEHTDTERNGPDINHQNPQNKASPFSVSPTGPSTKIKAEDPSGDSAPAAPPPPQPAQPHLPQAQLMLTGSQLAGDIQQLLQLQQLVLVPGHHLQPPAQFLLPQAQQSQPGLLPTPNLFQLPQQTQGALLTSQPRAGLPTQPPKCLEPPSHPEEPSDLEELEQFARTFKQRRIKLGFTQGDVGLAMGKLYGNDFSQTTISRFEALNLSFKNMCKLKPLLEKWLNDAETMSVDSSLPSPNQLSSPSLGFDGLPGRRRKKRTSIETNVRFALEKSFLANQKPTSEEILLIAEQLHMEKEVIRVWFCNRRQKEKRINPCSAAPMLPSPGKPTSYSPHLVTPQGGAGTLPLSQASSSLSTTVTTLSSAVGTLHPSRTAGGGGGGGGAAPPLNSIPSVTPPPPATTNSTNPSPQGSHSAIGLSGLNPSAGPGLWWNPAPYQP

载体pMIGW-POU2F2-184A 185A-GFP，SEQ ID NO:1的第6622-8013位替换为POU2F2的第184位和185位氨基酸双突变为丙氨酸(即POU2F2-184A 185A)的编码序列(SEQ ID NO:4)。

POU2F2-184A 185A的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：MVHSSMGAPEIRMSKPLEAEKQSLDSPSEHTDTERNGPDINHQNPQNKASPFSVSPTGPSTKIKAEDPSGDSAPAAPPPPQPAQPHLPQAQLMLTGSQLAGDIQQLLQLQQLVLVPGHHLQPPAQFLLPQAQQSQPGLLPTPNLFQLPQQTQGALLTSQPRAGLPTQPPKCLEPPSHPEEPSDAAELEQFARTFKQRRIKLGFTQGDVGLAMGKLYGNDFSQTTISRFEALNLSFKNMCKLKPLLEKWLNDAETMSVDSSLPSPNQLSSPSLGFDGLPGRRRKKRTSIETNVRFALEKSFLANQKPTSEEILLIAEQLHMEKEVIRVWFCNRRQKEKRINPCSAAPMLPSPGKPTSYSPHLVTPQGGAGTLPLSQASSSLSTTVTTLSSAVGTLHPSRTAGGGGGGGGAAPPLNSIPSVTPPPPATTNSTNPSPQGSHSAIGLSGLNPSAGPGLWWNPAPYQP

其中下划线处为突变位点。

编码POU2F2-184A 185A的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：ATGGTTCATTCCAGCATGGGGGCTCCAGAAATAAGAATGTCTAAGCCCCTGGAGGCCGAGAAGCAAAGTCTGGACTCCCCGTCAGAGCACACAGACACCGAAAGAAATGGACCCGACATTAACCATCAGAACCCCCAGAATAAAGCGTCCCCATTCTCTGTGTCCCCAACTGGCCCCAGCACCAAGATCAAGGCTGAAGACCCCAGTGGCGATTCAGCCCCAGCAGCACCCCCGCCCCCCCAGCCGGCTCAGCCTCATCTGCCCCAGGCCCAACTCATGCTGACGGGCAGCCAGCTAGCTGGGGACATACAGCAACTCCTCCAGCTCCAGCAGCTGGTGCTTGTCCCCGGCCACCACCTCCAGCCACCTGCTCAGTTCCTGCTGCCACAGGCACAGCAGAGTCAGCCAGGCCTGCTACCAACGCCAAATCTATTCCAGCTACCTCAACAAACCCAGGGAGCTCTCCTGACCTCCCAGCCCCGGGCTGGGCTTCCTACACAGCCCCCGAAATGCTTGGAGCCGCCCTCCCACCCGGAGGAGCCCAGCGATGCAGCAGAGCTGGAACAGTTTGCTCGCACCTTCAAGCAACGCCGCATCAAGCTGGGCTTCACACAGGGTGATGTGGGCCTGGCCATGGGCAAGCTCTATGGCAACGACTTCAGCCAAACGACCATTTCCCGCTTCGAGGCCCTCAACCTGAGCTTCAAGAACATGTGTAAACTCAAGCCCCTCCTGGAGAAGTGGCTCAACGACGCAGAGACTATGTCTGTGGATTCAAGCCTACCCAGCCCAAACCAGCTGAGCAGCCCCAGCCTGGGTTTCGACGGGCTGCCGGGGCGGAGACGCAAGAAGAGGACCAGCATCGAGACGAATGTCCGCTTCGCCTTAGAGAAGAGTTTCCTAGCGAACCAGAAGCCTACCTCAGAGGAGATCCTGCTGATCGCAGAGCAGCTGCACATGGAGAAGGAAGTGATCCGCGTCTGGTTCTGCAACCGGCGCCAGAAGGAGAAACGCATCAACCCTTGCAGTGCGGCCCCCATGCTGCCCAGCCCGGGAAAGCCGACCAGCTACAGCCCTCACCTGGTCACACCCCAAGGGGGCGCAGGGACCTTACCATTGTCCCAAGCTTCTAGCAGTCTGAGCACAACAGTTACTACCTTATCCTCAGCTGTGGGGACGCTCCATCCCAGCCGGACAGCAGGAGGGGGTGGGGGTGGGGGCGGAGCTGCGCCCCCCCTCAATTCCATCCCCTCTGTCACTCCCCCACCCCCGGCCACCACCAACAGCACAAACCCGAGCCCTCAAGGCAGCCACTCGGCTATTGGCTTGTCGGGCCTGAACCCCAGCGCGGGCCCTGGCCTCTGGTGGAACCCTGCCCCTTACCAGCCTTGA

其中下划线标注的是突变位点。

载体pMIGW-POU2F2△281-340aa-GFP，SEQ ID NO:1的第6622-8013位替换为POU2F2缺失第281至340位氨基酸(即POU2F2△281-340aa)的编码序列(SEQ ID NO:6)。

POU2F2△281-340aa的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：

MVHSSMGAPEIRMSKPLEAEKQSLDSPSEHTDTERNGPDINHQNPQNKASPFSVSPTGPSTKIKAEDPSGDSAPAAPPPPQPAQPHLPQAQLMLTGSQLAGDIQQLLQLQQLVLVPGHHLQPPAQFLLPQAQQSQPGLLPTPNLFQLPQQTQGALLTSQPRAGLPTQPPKCLEPPSHPEEPSDLEELEQFARTFKQRRIKLGFTQGDVGLAMGKLYGNDFSQTTISRFEALNLSFKNMCKLKPLLEKWLNDAETMSVDSSLPSPNQLSSPSLGFDGLPGRPCSAAPMLPSPGKPTSYSPHLVTPQGGAGTLPLSQASSSLSTTVTTLSSAVGTLHPSRTAGGGGGGGGAAPPLNSIPSVTPPPPATTNSTNPSPQGSHSAIGLSGLNPSAGPGLWWNPAPYQP

编码POU2F2△281-340aa的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)：

ATGGTTCATTCCAGCATGGGGGCTCCAGAAATAAGAATGTCTAAGCCCCTGGAGGCCGAGAAGCAAAGTCTGGACTCCCCGTCAGAGCACACAGACACCGAAAGAAATGGACCCGACATTAACCATCAGAACCCCCAGAATAAAGCGTCCCCATTCTCTGTGTCCCCAACTGGCCCCAGCACCAAGATCAAGGCTGAAGACCCCAGTGGCGATTCAGCCCCAGCAGCACCCCCGCCCCCCCAGCCGGCTCAGCCTCATCTGCCCCAGGCCCAACTCATGCTGACGGGCAGCCAGCTAGCTGGGGACATACAGCAACTCCTCCAGCTCCAGCAGCTGGTGCTTGTCCCCGGCCACCACCTCCAGCCACCTGCTCAGTTCCTGCTGCCACAGGCACAGCAGAGTCAGCCAGGCCTGCTACCAACGCCAAATCTATTCCAGCTACCTCAACAAACCCAGGGAGCTCTCCTGACCTCCCAGCCCCGGGCTGGGCTTCCTACACAGCCCCCGAAATGCTTGGAGCCGCCCTCCCACCCGGAGGAGCCCAGCGATCTGGAGGAGCTGGAACAGTTTGCTCGCACCTTCAAGCAACGCCGCATCAAGCTGGGCTTCACACAGGGTGATGTGGGCCTGGCCATGGGCAAGCTCTATGGCAACGACTTCAGCCAAACGACCATTTCCCGCTTCGAGGCCCTCAACCTGAGCTTCAAGAACATGTGTAAACTCAAGCCCCTCCTGGAGAAGTGGCTCAACGACGCAGAGACTATGTCTGTGGATTCAAGCCTACCCAGCCCAAACCAGCTGAGCAGCCCCAGCCTGGGTTTCGACGGGCTGCCGGGGCGGCCTTGCAGTGCGGCCCCCATGCTGCCCAGCCCGGGAAAGCCGACCAGCTACAGCCCTCACCTGGTCACACCCCAAGGGGGCGCAGGGACCTTACCATTGTCCCAAGCTTCTAGCAGTCTGAGCACAACAGTTACTACCTTATCCTCAGCTGTGGGGACGCTCCATCCCAGCCGGACAGCAGGAGGGGGTGGGGGTGGGGGCGGAGCTGCGCCCCCCCTCAATTCCATCCCCTCTGTCACTCCCCCACCCCCGGCCACCACCAACAGCACAAACCCGAGCCCTCAAGGCAGCCACTCGGCTATTGGCTTGTCGGGCCTGAACCCCAGCGCGGGCCCTGGCCTCTGGTGGAACCCTGCCCCTTACCAGCCTTGA

载体pMIGW-POU2F2-335A 339A-GFP，SEQ ID NO:1的第6622-8013位替换为POU2F2的第335位和339位氨基酸双突变为丙氨酸(即POU2F2-335A 339A)的编码序列(SEQ ID NO:8)。

POU2F2-335A 339A的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：

MVHSSMGAPEIRMSKPLEAEKQSLDSPSEHTDTERNGPDINHQNPQNKASPFSVSPTGPSTKIKAEDPSGDSAPAAPPPPQPAQPHLPQAQLMLTGSQLAGDIQQLLQLQQLVLVPGHHLQPPAQFLLPQAQQSQPGLLPTPNLFQLPQQTQGALLTSQPRAGLPTQPPKCLEPPSHPEEPSDLEELEQFARTFKQRRIKLGFTQGDVGLAMGKLYGNDFSQTTISRFEALNLSFKNMCKLKPLLEKWLNDAETMSVDSSLPSPNQLSSPSLGFDGLPGRRRKKRTSIETNVRFALEKSFLANQKPTSEEILLIAEQLHMEKEVIRVWFCNRRQAEKRANPCSAAPMLPSPGKPTSYSPHLVTPQGGAGTLPLSQASSSLSTTVTTLSSAVGTLHPSRTAGGGGGGGGAAPPLNSIPSVTPPPPATTNSTNPSPQGSHSAIGLSGLNPSAGPGLWWNPAPYQP

其中下划线处为突变位点。

编码POU2F2-335A 339A的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)：

ATGGTTCATTCCAGCATGGGGGCTCCAGAAATAAGAATGTCTAAGCCCCTGGAGGCCGAGAAGCAAAGTCTGGACTCCCCGTCAGAGCACACAGACACCGAAAGAAATGGACCCGACATTAACCATCAGAACCCCCAGAATAAAGCGTCCCCATTCTCTGTGTCCCCAACTGGCCCCAGCACCAAGATCAAGGCTGAAGACCCCAGTGGCGATTCAGCCCCAGCAGCACCCCCGCCCCCCCAGCCGGCTCAGCCTCATCTGCCCCAGGCCCAACTCATGCTGACGGGCAGCCAGCTAGCTGGGGACATACAGCAACTCCTCCAGCTCCAGCAGCTGGTGCTTGTCCCCGGCCACCACCTCCAGCCACCTGCTCAGTTCCTGCTGCCACAGGCACAGCAGAGTCAGCCAGGCCTGCTACCAACGCCAAATCTATTCCAGCTACCTCAACAAACCCAGGGAGCTCTCCTGACCTCCCAGCCCCGGGCTGGGCTTCCTACACAGCCCCCGAAATGCTTGGAGCCGCCCTCCCACCCGGAGGAGCCCAGCGATCTGGAGGAGCTGGAACAGTTTGCTCGCACCTTCAAGCAACGCCGCATCAAGCTGGGCTTCACACAGGGTGATGTGGGCCTGGCCATGGGCAAGCTCTATGGCAACGACTTCAGCCAAACGACCATTTCCCGCTTCGAGGCCCTCAACCTGAGCTTCAAGAACATGTGTAAACTCAAGCCCCTCCTGGAGAAGTGGCTCAACGACGCAGAGACTATGTCTGTGGATTCAAGCCTACCCAGCCCAAACCAGCTGAGCAGCCCCAGCCTGGGTTTCGACGGGCTGCCGGGGCGGAGACGCAAGAAGAGGACCAGCATCGAGACGAATGTCCGCTTCGCCTTAGAGAAGAGTTTCCTAGCGAACCAGAAGCCTACCTCAGAGGAGATCCTGCTGATCGCAGAGCAGCTGCACATGGAGAAGGAAGTGATCCGCGTCTGGTTCTGCAACCGGCGCCAGGCAGAGAAACGCGCAAACCCTTGCAGTGCGGCCCCCATGCTGCCCAGCCCGGGAAAGCCGACCAGCTACAGCCCTCACCTGGTCACACCCCAAGGGGGCGCAGGGACCTTACCATTGTCCCAAGCTTCTAGCAGTCTGAGCACAACAGTTACTACCTTATCCTCAGCTGTGGGGACGCTCCATCCCAGCCGGACAGCAGGAGGGGGTGGGGGTGGGGGCGGAGCTGCGCCCCCCCTCAATTCCATCCCCTCTGTCACTCCCCCACCCCCGGCCACCACCAACAGCACAAACCCGAGCCCTCAAGGCAGCCACTCGGCTATTGGCTTGTCGGGCCTGAACCCCAGCGCGGGCCCTGGCCTCTGGTGGAACCCTGCCCCTTACCAGCCTTGA

其中下划线处为突变位点。

2、初始P14细胞的分离和激活

通过磁珠分选方法从Cas9⁺P14转基因小鼠(来自Jaxson Laboratory，JAX:#037394和#026430杂交繁育获得)的脾脏分离得到初始CD8⁺T细胞，将细胞重悬于2mlRPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和白介素-2)中，同时加入多肽gp33-41(强耀生物,Cat#04010023714；由9个氨基酸残基组成的多肽，它是淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒GP1抗原决定基中的最佳序列，序列为KAVYNFATC；SEQ ID NO:13)进行体外激活，即细胞置于5％二氧化碳37℃孵箱中培养，培养24小时后进行病毒感染。

3、初始OT1细胞的分离和激活

通过磁珠分选方法从Cas9⁺OT1转基因小鼠(来自Jaxson Laboratory，JAX:#037394和#003831杂交繁育获得)的脾脏分离得到初始CD8⁺T细胞，将细胞重悬于2mlRPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和白介素-2)中，同时加入多肽OVA257-264(强耀生物合成；由8个氨基酸残基组成的多肽，它是卵清白蛋白(OVA)的1类(Kb)限制性肽表位，序列为SIINFEKL；SEQ ID NO:10)进行体外激活，即细胞置于5％二氧化碳37℃孵箱中培养，培养24小时后进行病毒感染。

4、过表达POU2F2的P14细胞的构建

1)逆转录病毒制备

1×10⁶Phoenix-Eco细胞(ATCC#CRL-3214)贴壁培养24小时后，磷酸钙沉淀法共转染20μg量上述1中制备的表达载体pMIGW-POU2F2-GFP和60μg量包装质粒pCL-Eco(购自Addgene#12371)，转染48小时后收获含有包装病毒的上清，病毒上清0.45μm滤膜过滤以去除死细胞杂质，得到逆转录病毒上清，即过表达POU2F2的逆转录病毒。

2)逆转录病毒体感染

将步骤2体外培养激活培养36小时后的1×10⁶量CD8⁺T细胞，加入1ml步骤1)得到的逆转录病毒上清混匀后，于室温2000×g水平离心2小时。然后放置于二氧化碳孵箱培养4小时，更换至2ml新鲜RPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和2ng/ml量白介素-2)继续培养(此时间记作感染后时间)，使用流式细胞术分选出GFP阳性和CD8⁺T细胞，即得到过表达POU2F2的P14细胞(表示为Pou2f2-P14)。

5、过表达POU2F2-184A 185A的P14细胞的构建

与“4、过表达POU2F2的P14细胞的构建”的区别仅在于：将“表达载体pMIGW-POU2F2-GFP”替换为“表达载体pMIGW-POU2F2-184A 185A-GFP”，其它步骤不变，得到过表达POU2F2-184A 185A的P14细胞(表示为Pou2f2-184A 185A-P14)。

6、过表达POU2F2△281-340aa的P14细胞的构建

与“4、过表达POU2F2的P14细胞的构建”的区别仅在于：将“表达载体pMIGW-POU2F2-GFP”替换为“表达载体pMIGW-POU2F2△281-340aa-GFP”，其它步骤不变，得到过表达POU2F2△281-340aa的P14细胞(表示为Pou2f2△281-340aa-P14)。

7、过表达POU2F2-335A 339A的P14细胞的构建

与“4、过表达POU2F2的P14细胞的构建”的区别仅在于：将“表达载体pMIGW-POU2F2-GFP”替换为“表达载体pMIGW-POU2F2-335A 339A-GFP”，其它步骤不变，得到过表达POU2F2-335A 339A的P14细胞(表示为Pou2f2-335A 339A-P14)。

8、对照Control-P14细胞的构建

与“3、过表达POU2F2的P14细胞的构建”的区别仅在于：将“表达载体pMIGW-POU2F2-GFP”替换为“为不编码过表达基因的空载体pMIGW-GFP”，其它步骤不变，得到对照P14细胞(表示为Control-P14)。

9、过表达POU2F2的OT1细胞的构建

与“4、过表达POU2F2的P14细胞的构建”的区别在于：将“P14细胞”替换为“OT1细胞”，其它步骤不变，得到过表达POU2F2的P14细胞(表示为Pou2f2-OT1)。

10、对照Control-OT1细胞的构建

与“9、对照Control-P14细胞的构建”的区别仅在于：将“P14细胞”替换为“OT1细胞”，其它步骤不变，得到对照OT1细胞(表示为Control-OT1)。

实施例2、病毒感染和滴定

淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)株Armstrong和LCMV克隆13各自诱导急性和慢性感染。LCMV在BHK21[C13]细胞中(CCL10)中繁殖。并通过在VERO细胞上的噬斑测定法进行滴定。用LCMV克隆13(2×10⁶个PFU)静脉内感染小鼠或LCMV Armstrong(2×10⁶个PFU)腹腔注射感染小鼠。感染LCMV的小鼠按照清华大学机构生物安全条例进行饲养。血清/器官/组织样本中的LCMV病毒载量通过qPCR测定进行定量。

实施例3、表达卵清蛋白257-264肽段的李斯特菌感染

表达卵清蛋白257-264肽段的李斯特菌，以下简称为LM-OVA。LM-OVA在添加红霉素的脑心浸出液培养基中繁殖。用LM-OVA(1×10⁵个PFU)静脉内感染小鼠。感染LM-OVA的小鼠按照清华大学机构生物安全条例进行饲养。血清/器官/组织样本中的LM-OVA细菌载量通过qPCR测定进行定量。

实施例4、过表达POU2F2显著增强了在LCMV克隆13病毒慢性感染过程中CD8⁺T细胞的扩增和持久性

细胞回输流程如图1中的A所示：从Cas9⁺P14转基因小鼠脾和淋巴结分离CD8⁺T细胞，经多肽gp33-41活化24小时，得到活化后CD8⁺T细胞(方法同实施例1的2)；再将转染pMIGW-GFP获得的逆转录病毒、转染pMIGW-POU2F2-GFP获得的逆转录病毒分别感染已活化的CD8⁺T细胞，得到重组细胞命名为Control-P14和Pou2f2-P14细胞(方法同实施例1的4和8)。将感染24小时获得的上述细胞分别鼠尾静脉输入到B6小鼠，输入方式具体如下：

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成2组，即对照(Control)组(5只)、Pou2f2组(5只)。LCMV克隆13感染小鼠(方法同实施例2)。

对照(Control)组：将实施例1方法制备的Control-P14细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至Control组的每只小鼠；

Pou2f2组：将实施例1方法制备的Pou2f2-P14细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至Pou2f2组的每只小鼠；

分别在回输后第7天、第14天、第21天和第28天时，用抗CD8抗体和GFP荧光流式分析每只小鼠的外周血内回输的Control-P14细胞和Pou2f2-P14细胞占总CD8⁺T细胞的比例，即在血液中监测输入的P14细胞的增殖、收缩和持久性。

结果如图1中的C和图1中的D所示，在LCMV克隆13慢性感染过程中，在感染后第7天，对照组和过表达POU2F2的P14细胞组(Pou2f2组)的P14都在血液中进行了扩增；随后，在感染后第14天及21天，对照(Control)组P14细胞逐渐减少，进入收缩期，而过表达POU2F2抑制了收缩期P14细胞的减少；直至感染后28天，Pou2f2组的P14细胞仍保持在扩张期的水平。说明过表达POU2F2抑制了T细胞进入收缩期并增强了P14细胞的持久性和记忆P14细胞的形成。

在感染后30天，我们分析每组小鼠血清的病毒滴度。如图1中的E所示：

与对照组相比，P14细胞过表达POU2F2更好的控制了LCMV克隆13病毒的复制，表明过表达POU2F2的P14细胞在被LCMV克隆13慢性感染的小鼠中具有抗病毒功效。

实施例5、过表达POU2F2的突变体同样显著增强了在LCMV克隆13病毒慢性感染过程中CD8⁺T细胞的扩增和持久性

细胞回输流程：从Cas9⁺P14转基因小鼠脾和淋巴结分离CD8⁺T细胞，经多肽gp33-41活化24小时，得到活化后CD8⁺T细胞(方法同实施例1的2)；再将转染pMIGW-GFP获得的逆转录病毒、转染pMIGW-POU2F2-GFP获得的逆转录病毒、转染pMIGW-POU2F2-184A 185A-GFP获得的逆转录病毒、转染pMIGW-POU2F2△281-340aa-GFP获得的逆转录病毒以及转染pMIGW-POU2F2-335A339A-GFP获得的逆转录病毒、分别感染已活化的CD8⁺T细胞，得到重组细胞命名为Control-P14、Pou2f2-P14、Pou2f2-184A 185A-P14、Pou2f2-△281-340aa-P14和Pou2f2-335A339A-P14细胞(方法同实施例1的4-8)。将感染24小时获得的上述细胞进行流式细胞分析，如图1中的B与对照pMIGW-GFP相比，转染pMIGW-POU2F2-GFP病毒的T细胞高表达POU2F2。分别鼠尾静脉输入到B6小鼠，输入方式具体如下：

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成2组，即对照(Control)组、Pou2f2组、Pou2f2-184A 185A组、Pou2f2-△281-340aa组和Pou2f2-335A 339A组，每组5只小鼠。LCMV克隆13感染小鼠(方法同实施例2)。

Pou2f2-184A 185A组：将实施例1方法制备的Pou2f2-184A 185A-P14细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至Pou2f2-184A 185A组的每只小鼠；

Pou2f2-△281-340aa组：将实施例1方法制备的Pou2f2-△281-340aa-P14细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至Pou2f2-△281-340aa组的每只小鼠；

Pou2f2-335A 339A组：将实施例1方法制备的Pou2f2-335A 339A-P14细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至Pou2f2-335A 339A组的每只小鼠；

分别在回输后第7天、第14天、第21天、第28天和第56天时，用抗CD8抗体和GFP荧光流式分析每只小鼠的外周血内回输的转染表达空载体病毒的Control-P14细胞、Pou2f2-P14细胞、Pou2f2-184A 185A-P14细胞、Pou2f2-△281-340aa-P14细胞以及Pou2f2-335A339A-P14细胞占总CD8⁺T细胞的比例，即在血液中监测输入的P14细胞的增殖、收缩和持久性。

结果如图2中的A和图2中的B所示，在LCMV克隆13慢性感染过程中，在感染后第7天，对照，过表达POU2F2以及POU2F2-184A 185A P14细胞在血液中的扩增水平相近，而过表达POU2F2-△281-340aa P14细胞和POU2F2-335A 339A P14细胞扩增增强；随后，在感染后第14天及28天，对照(Control)组P14细胞逐渐减少，进入收缩期，而过表达POU2F2或其几种突变体都抑制了收缩期P14细胞的减少；直至感染后56天，对照组P14细胞回缩至1％左右，而过表达POU2F2或其几种突变体的P14细胞仍保持在较高的比例，其中过表达POU2F2-335A339A P14细胞的比例最高。以上结果说明过表达POU2F2或几种突变体抑制了T细胞进入收缩期并增强了P14细胞的持久性和记忆P14细胞的形成。

实施例6、过表达POU2F2显著增强了在LCMV Amstrong病毒急性感染过程中CD8⁺T细胞的扩增和持久性

细胞回输流程如图3中的A所示：从Cas9⁺P14转基因小鼠脾和淋巴结分离CD8⁺T细胞，经多肽gp33-41活化24小时，得到活化后CD8⁺T细胞(方法同实施例1的2)；再将转染pMIGW-GFP获得的逆转录病毒、转染pMIGW-POU2F2-GFP获得的逆转录病毒分别感染已活化的CD8⁺T细胞，得到重组细胞命名为Control-P14和Pou2f2-P14细胞(方法同实施例1的4和8)。将感染24小时获得的上述细胞分别鼠尾静脉输入到B6小鼠，输入方式具体如下：

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成2组，即对照(Control)组(5只)和Pou2f2组(5只)。LCMV Amstrong感染小鼠(方法同实施例2)。

结果如图3中的B和图3中的C所示，在LCMVA mstrong急性感染过程中，在感染后第7天，对照组和过表达POU2F2 P14细胞组(Pou2f2组)的P14都在血液中进行了扩增，过表达POU2F2增强了P14的扩增；随后，在感染后第14天、21天以及28天，对照(Control)组P14细胞逐渐减少，进入收缩期，而过表达POU2F2显著抑制了收缩期P14细胞的减少。说明过表达POU2F2抑制了T细胞进入收缩期并增强了P14细胞的持久性。

实施例7、过表达POU2F2显著增强了在LM-OVA诱导的急性感染过程中CD8⁺T细胞的扩增和持久性

细胞回输流程如图4中的A所示：从Cas9⁺OT1转基因小鼠脾和淋巴结分离CD8⁺T细胞，经多肽OVA257-264活化24小时，得到活化后OT1细胞(方法同实施例1的3)；再将转染pMIGW-GFP获得的逆转录病毒、转染pMIGW-POU2F2-GFP获得的逆转录病毒分别感染已活化的OT1细胞，得到重组细胞命名为Control-OT1和Pou2f2-OT1细胞(方法同实施例1的9-10)。将感染24小时获得的上述细胞分别鼠尾静脉输入到B6小鼠，输入方式具体如下：

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成2组，即对照(Control)组(5只)和Pou2f2组(5只)。LM-OVA感染小鼠(方法同实施例2)。

对照(Control)组：将实施例1方法制备的Control-OT1细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至Control组的每只小鼠；

Pou2f2组：将实施例1方法制备的Pou2f2-OT1细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至Pou2f2组的每只小鼠；

分别在回输后第7天、第14天和第28天时，用抗CD8抗体和GFP荧光流式分析每只小鼠的外周血内回输的Control-OT1细胞和Pou2f2-OT1细胞占总CD8⁺T细胞的比例，即在血液中监测输入的OT1细胞的增殖、收缩和持久性。

结果如图4中的B和图4中的C所示，在LM-OVA感染过程中，在感染后第7天，对照组和过表达POU2F2 P14细胞组(Pou2f2组)的OT1都在血液中进行了扩增，过表达POU2F2显著增强了OT1的扩增；随后，在感染后第14天、以及28天，对照(Control)组OT1细胞逐渐减少，进入收缩期，而过表达POU2F2显著抑制了收缩期OT1细胞的减少。说明过表达POU2F2抑制了T细胞进入收缩期并增强了OT1细胞的持久性。

载体pMIGW-POU2F2-GFP的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

tctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatggtgagcaagggcgaggagc tgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtctggcga gggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctgg cccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgact tcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagac ccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggac ggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaaga acggcatcaaggcgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagca gaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaa gaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacg 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其中，单下划线部分为EGFP；双下划线部分为POU2F2的编码序列，也即SEQ ID NO:9。

POU2F2(人)的核苷酸序列SEQ ID NO:11：

ATGGTTCACTCCAGCATGGGGGCTCCAGAAATAAGAATGTCTAAGCCCCTGGAGGCCGAGAAGCAAGGTCTGGACTCCCCATCAGAGCACACAGACACCGAAAGAAATGGACCAGACACTAATCATCAGAACCCCCAAAATAAGACCTCCCCATTCTCCGTGTCCCCAACTGGCCCCAGTACAAAGATCAAGGCTGAAGACCCCAGTGGCGATTCAGCCCCAGCAGCACCCCTGCCCCCTCAGCCGGCCCAGCCTCATCTGCCCCAGGCCCAACTCATGTTGACGGGCAGCCAGCTAGCTGGGGACATACAGCAGCTCCTCCAGCTCCAGCAGCTGGTGCTTGTGCCAGGCCACCACCTCCAGCCACCTGCTCAGTTCCTGCTACCGCAGGCCCAGCAGAGCCAGCCAGGCCTGCTACCGACACCAAATCTATTCCAGCTACCTCAGCAAACCCAGGGAGCTCTTCTGACCTCCCAGCCCCGGGCCGGGCTTCCCACACAGGCCGTGACCCGCCCTACGCTGCCCGACCCGCACCTCTCGCACCCGCAGCCCCCCAAATGCTTGGAGCCACCATCCCACCCCGAGGAGCCCAGTGATCTGGAGGAGCTGGAGCAATTCGCCCGCACCTTCAAGCAACGCCGCATCAAGCTGGGCTTCACGCAGGGTGATGTGGGCCTGGCCATGGGCAAGCTCTACGGCAACGACTTCAGCCAGACGACCATTTCCCGCTTCGAGGCCCTCAACCTGAGCTTCAAGAACATGTGCAAACTCAAGCCCCTCCTGGAGAAGTGGCTCAACGATGCAGAGACTATGTCTGTGGACTCAAGCCTGCCCAGCCCCAACCAGCTGAGCAGCCCCAGCCTGGGTTTCGACGGCCTGCCCGGCCGGAGACGCAAGAAGAGGACCAGCATCGAGACAAACGTCCGCTTCGCCTTAGAGAAGAGTTTTCTAGCGAACCAGAAGCCTACCTCAGAGGAGATCCTGCTGATCGCCGAGCAGCTGCACATGGAGAAGGAAGTGATCCGCGTCTGGTTCTGCAACCGGCGCCAGAAGGAGAAACGCATCAACCCCTGCAGTGCGGCCCCCATGCTGCCCAGCCCAGGGAAGCCGGCCAGCTACAGCCCCCATATGGTCACACCCCAAGGGGGCGCGGGGACCTTACCGTTGTCCCAAGCTTCCAGCAGTCTGAGCACAACAGTTACTACCTTATCCTCAGCTGTGGGGACGCTCCACCCCAGCCGGACAGCTGGAGGGGGTGGGGGCGGGGGCGGGGCTGCGCCCCCCCTCAATTCCATCCCCTCTGTCACTCCCCCACCCCCGGCCACCACCAACAGCACAAACCCCAGCCCTCAAGGCAGCCACTCGGCTATCGGCTTGTCAGGCCTGAACCCCAGCACGGGCCCTGGCCTCTGGTGGAACCCTGCCCCTTACCAGCCTTGA

POU2F2(人)的氨基酸序列SEQ ID NO:12：

MVHSSMGAPEIRMSKPLEAEKQGLDSPSEHTDTERNGPDTNHQNPQNKTSPFSVSPTGPSTKIKAEDPSGDSAPAAPLPPQPAQPHLPQAQLMLTGSQLAGDIQQLLQLQQLVLVPGHHLQPPAQFLLPQAQQSQPGLLPTPNLFQLPQQTQGALLTSQPRAGLPTQAVTRPTLPDPHLSHPQPPKCLEPPSHPEEPSDLEELEQFARTFKQRRIKLGFTQGDVGLAMGKLYGNDFSQTTISRFEALNLSFKNMCKLKPLLEKWLNDAETMSVDSSLPSPNQLSSPSLGFDGLPGRRRKKRTSIETNVRFALEKSFLANQKPTSEEILLIAEQLHMEKEVIRVWFCNRRQKEKRINPCSAAPMLPSPGKPASYSPHMVTPQGGAGTLPLSQASSSLSTTVTTLSSAVGTLHPSRTAGGGGGGGGAAPPLNSIPSVTPPPPATTNSTNPSPQGSHSAIGLSGLNPSTGPGLWWNPAPYQP

需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims

1.POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子或其促进剂的以下任一项用途：

(B)在制备用于增强免疫细胞抗感染能力的产品中的用途；

(C)在制备用于预防和/或逆转免疫细胞耗竭的产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述POU2F2蛋白选自：

(a)具有SEQ ID NO:2或12所示氨基酸序列的多肽；或

(b)与SEQ ID NO:2或12所示的氨基酸序列80％以上同源或具有80％以上序列相同性，且具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的蛋白质或多肽；或

(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽；和/或

所述核酸分子选自：

(i)具有SEQ ID NO:9或11所示核苷酸序列的核酸分子；或

(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交的分子；

(iii)与SEQ ID NO:9或11所示的核苷酸序列80％以上同源或具有80％以上序列相同性、且编码具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的蛋白质或多肽的核酸分子；

(iv)由(i)或(ii)或(iii)的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有抗感染、增强免疫细胞抗感染能力和预防和/或逆转免疫细胞耗竭中至少一项活性的蛋白质或多肽的核酸分子；和/或

所述促进剂选自：提高POU2F2蛋白水平或促进POU2F2蛋白功能的物质；外源性POU2F2蛋白；POU2F2蛋白编码序列的裸DNA；POU2F2蛋白编码序列的脂质体包裹DNA；能够在体内转化为POU2F2蛋白的POU2F2蛋白前体蛋白或偶联物或复合物。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，POU2F2蛋白突变体选自：

(3)如SEQ ID NO:2所示的POU2F2的第335位和339位氨基酸双突变为丙氨酸所获得的突变体；

任选地，POU2F2蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、5或7所示。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染包括病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染、寄生虫感染或其组合。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的用途，其特征在于，所述与感染相关的疾病和/或征状为选自下组中的一种或多种：

6.根据权利要求1～5中任一项所述的用途，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞、NKT细胞、NK细胞、天然淋巴细胞(ILC)和嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)中的至少一种；

任选地，所述T细胞包含原初T细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、耗竭的T细胞、耐受T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、T细胞受体T细胞(TCR-T细胞)和抗原特异性T细胞中的至少一种；

任选地，所述的T细胞包含活化的T细胞；

任选地，所述的T细胞包含抗原特异性T细胞，优选地，所述抗原特异性T细胞是针对引起感染的病原体的抗原特异性T细胞；

任选地，所述的T细胞包含CD8⁺T细胞。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的用途，其特征在于，所述产品为药物组合物、药盒、试剂或试剂盒。

8.一种重组免疫细胞，相较于未重组的免疫细胞，所述重组免疫细胞具有提高的POU2F2蛋白水平或功能；

任选地，所述免疫细胞包括T细胞、NKT细胞、NK细胞、天然淋巴细胞(ILC)和嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)中的至少一种；

任选地，所述的T细胞包含原初T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、记忆T细胞、活化的T细胞、耗竭的T细胞、耐受T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、T细胞受体T细胞(TCR-T细胞)和抗原特异性T细胞中的至少一种；

任选地，所述的T细胞包含活化的T细胞；

任选地，所述的T细胞包含CD8⁺T细胞。

9.如权利要求8所述的重组免疫细胞在制备用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途。

10.一种药物组合物或药盒，其包含：

(A)治疗或预防有效量的POU2F2蛋白或其突变体、编码POU2F2蛋白或其突变体的核酸分子和/或其促进剂，和/或如权利要求8所述的重组免疫细胞；

(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。