CN120272324A - 一株石油污染土壤中苯并[a]芘降解真菌Arthrinium acutiapicum DL-5的分离鉴定及其菌剂制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株石油污染土壤中苯并[a]芘降解真菌Arthrinium acutiapicum DL‑5及其菌剂和应用。本发明从宁波某石油污染土壤中驯化和分离并鉴定到一株以苯并[a]芘为碳源的降解菌株Arthrinium acutiapicum DL‑5，DL‑5能够利用苯并[a]芘作为碳源，在苯并[a]芘的初始浓度为25mg·L^‑1的无机盐培养液中培养7天后，DL‑5纯菌对苯并[a]芘的降解率可达到75％以上。而制作成菌剂以后，对苯并[a]芘的降解率能够提升至80％以上，因此，该菌株及其菌剂在多环芳烃的生物修复方面具有较好的应用潜力。

Description

一株石油污染土壤中苯并[a]芘降解真菌Arthrinium acutiapicum DL-5的分离鉴定及其菌剂制备和应用

技术领域

本发明属于有机污染物降解领域，具体涉及一株石油污染土壤中苯并[a]芘降解真菌Arthrinium acutiapicum DL-5的分离鉴定及其菌剂制备和应用。

背景技术

随着现代工业过程的快速发展，工业化作业中产生的污染物越来越多，特别是持久性有机污染物如多环芳烃(PAHs)。PAHs在环境中普遍存在且不断积累。由于PAHs具有潜在的致癌、致畸、致突变性及生物累积性等特性，能够对生态环境和人类健康构成重大危害，因此，PAHs污染受到人们的广泛关注。工矿业、农业等人为活动以及土壤环境背景值高等因素往往导致环境中的多环芳烃严重超标并造成了污染。此外，化工类园区及周边土壤、采油区、采矿区、污水灌溉区等重要有机污染场所的主要污染物中大多包含高浓度的多环芳烃。苯并[a]芘是一种五环芳烃，它与PAHs的致癌性有着非常密切的关系。

环境中有毒有害有机污染物的自然衰减主要依赖相关微生物代谢作用，生物修复技术具有成本低、效果好、无二次污染等优点，因此该方法是目前PAHs污染修复最具潜力的修复手段。目前，已报道的苯并[a]芘降解真菌菌株较少，主要包扩Trichoderma，Scedosporium，Fusarium，Penicillium和Aspergillus等。由于环境中的大部分微生物都是不可培养的，很多微生物尤其是具有特定功能的微生物都不能通过纯培养的方式分离获得。因此，筛选出能有效降解高浓度苯并[a]芘的菌株具有重要的应用价值和现实意义。本实验以质量浓度为25mg·L^-1的苯并[a]芘作为菌株降解的底物，以期为多环芳烃生物处理提供数据支持。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株具有苯并[a]芘降解能力的菌株Arthriniumacutiapicum DL-5，其于2025年02月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：65989。

本研究报道菌株属于Arthrinium acutiapicum，该菌种可以从各种陆地和水生栖息地中分离出来。目前有关Arthrinium acutiapicum的污染物降解研究报道还比较少，国内外均未有过Arthrinium acutiapicum降解苯并[a]芘的研究报道。本研究从宁波某石油污染场地中驯化和分离得到1株以高浓度苯并[a]芘作为碳源的菌株DL-5，对其进行鉴定，并研究其生长特性，同时制成菌剂探究其对苯并[a]芘的降解特性，为PAHs污染环境的生物修复提供参考。

本发明的第二个目的是提供上述Arthrinium acutiapicum DL-5在降解苯并[a]芘中的应用。

优选，所述的降解苯并[a]芘是降解石油污染土壤中的苯并[a]芘。

优选，是将Arthrinium acutiapicum DL-5应用在苯并[a]芘污染的环境中对苯并[a]芘进行降解。

本发明的第三个目的是提供一种苯并[a]芘降解菌剂，其包含上述的Arthriniumacutiapicum DL-5作为活性成分。

优选，所述的苯并[a]芘降解菌剂的制备方法为：

1)将玉米与水按质量比1:5加热制成糊状后，按质量比150：100:10:1加入木屑、麦麸和木质素磺酸钠，挼搓成团，将团状培养基质混合物放入搓丸机中制得球状培养基质，灭菌烘干备用；

2)将培养好的Arthrinium acutiapicum DL-5制成菌液；

3)将2)中的菌液按1:10的质量比例加入到质量浓度3％的海藻酸钠溶液中，将1)中的球状培养基质与此溶液充分混合，完成后加入质量浓度为4％的无菌氯化钙溶液，硬化处理，得到丸状的包封真菌；

4)将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7天，待表面长满白色菌丝后即为苯并[a]芘降解菌剂。

优选，步骤2)中，所述菌液是菌丝含量为10g/L的菌液。

本发明的第四个目的是提供一种降解苯并[a]芘的方法，是将上述的Arthriniumacutiapicum DL-5洒于含有苯并[a]芘的环境中，对苯并[a]芘进行降解。

优选，是将Arthrinium acutiapicum DL-5洒于苯并[a]芘污染的环境中对苯并[a]芘进行降解。

优选，是将Arthrinium acutiapicum DL-5洒于石油污染土壤中对苯并[a]芘进行降解。

本发明从宁波某石油污染土壤中驯化和分离得到一株以苯并[a]芘为碳源的降解菌株DL-5，根据菌株形态、生理特征、ITS基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为Arthrinium acutiapicum DL-5，生长的最佳环境条件为：温度为33℃，pH值为7，不添加氯化钠；该菌株的ITS基因测序分析结果显示与DL-5最相近的菌株为Arthriniumacutiapicum KUMCC20-0209(99.34％)。DL-5能够利用苯并[a]芘作为碳源，在苯并[a]芘的初始浓度为25mg·L^-1的无机盐培养液中培养7天后，DL-5纯菌对苯并[a]芘降解率可达到75％以上。而DL-5制作成菌剂以后，对苯并[a]芘的降解率能够提升至80％以上。因此，该菌株DL-5及其菌剂在多环芳烃的生物修复方面具有较好的应用潜力。

Arthrinium acutiapicum DL-5，其于2025年02月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：65989。

附图说明

图1是实施例1中菌株DL-5在PDB培养基上生长7d的正面和反面。

图2是实施例1中菌株DL-5和其相关菌的基于ITS基因序列的系统发生关系，构建方法为邻接法，自展值设定重复1000次，图中仅展示了自展值大于50％的结果，比例尺0.01代表每个核苷酸的替换率。

图3是实施例2中菌株DL-5在不同培养温度、盐度、pH下生长。

图4是实施例3中菌株DL-5和DL-5菌剂在含苯并[a]芘的无机盐培养基中的降解效率(初始浓度25mg·L^-1)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1Arthrinium acutiapicum DL-5的分离与鉴定

1.材料与方法

1.1样品来源

从宁波某石油污染场地取得土壤样品，以高浓度苯并[a]芘为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效的苯并[a]芘降解菌株。

1.2培养基

1.2.1无机盐培养基

无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养，纯菌以及菌剂条件下苯并[a]芘降解实验。该培养基配方见表1(含苯并[a]芘溶液)，其配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。

表1无机盐培养基配方

1.2.2营养培养基

营养培养基用于真菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添质量分数1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基pH均调节至7。营养培养基配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。

表2Potato-Dextrose broth培养基(PDB)成分

1.3菌株的驯化、筛选和分离

将采集的污染土壤中加入到上述无机盐培养基中，另加入硫酸链霉素和青霉素(浓度为100ug/ml)以抑制细菌生长，分别以浓度为50mg·L^-1的苯并[a]芘作为降解的底物，放置于28℃培养箱中避光震荡培养。利用以苯并[a]芘为碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周期。取10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜无机盐培养基中并重复上述富集过程，如此重复三次。

将上述获得的第四代富集培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基分离。将涂布好的样品置于原培养温度条件下培养，经过48小时左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、菌丝等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到1株对苯并[a]芘有高效降解性能的菌株DL-5。挑取纯化后的单菌落到相应固体试管营养培养基中培养，用灭菌后的液体石蜡进行封存，放置于-4℃长期保存。

1.4菌株的鉴定

根据菌株DL-5的形态特性和分子生物学特性对其进行鉴定。

1.4.1形态特征

DL-5是一株从宁波石油污染土壤中分离出的真菌，经活化以后，在28℃有氧的条件下，PDB平板上生长7d后，能形成直径为12.5mm白色、圆形、白色绒毛状菌丝向上生长的菌落。该菌为专性好氧菌(图1)。

1.4.2分子生物学特性

分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。在进行测序和构建系统发育树之前，需要提取真菌的DNA(实验使用的真菌基因组DNA快速抽提试剂盒来自生工生物工程(上海)股份有限公司)。为了对真菌的分类学进行研究，通常需要扩增ITS基因以及构建系统发育树，扩增的基因为真核中编码rRNA所组成部分中的一段DNA，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定真菌。

聚合酶链式反应(PCR)主要是用来扩增不同的基因片段，PCR需要不同的引物(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR扩增反应的体系：10×buffer 2.5μl，Mg²⁺(25mmol/l)1.5μl，dNTP(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，Taq酶：0.25μl，DNA组模板0.1μl，去离子水19.35μl。PCR扩增反应条件：95℃预变性3min，95℃45s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环。72℃延伸10min，反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用0.75-1％的琼脂糖并加入核酸染色剂GelRed配制成凝胶块，在凝胶块中加入PCR产物和包含各种长度片段的DNA标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入TBE(Tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定PCR产物扩增反应成功。然后将扩增成功的PCR产物进行测序，测序引物与扩增引物相同。

将测序所得的真菌ITS基因序列上传到EzTaxon-e(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)上，此网站会将提交的序列与已被公认种的典型菌株的ITS基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的ITS基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而来鉴定分离的菌株。构建系统发育树利用MEGA 5.05程序，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常设定为重复1000次计算。

通过PCR和基因测序所得到的一个长为603bp ITS基因序列。通过ITS基因比对发现，该菌株与Arthrinium acutiapicum KUMCC 20-0209(GenBank中登录号为MT946342.1)的基因相似度为99.34％。由以上结果可得出本实验所分离的真菌DL-5为Arthriniumacutiapicum这个种。

利用DL-5的ITS基因序列和与其相似度较高的ITS基因序列制作系统发育树，从而获得DL-5的ITS基因与其相似性较高的ITS基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图2。目前，在环境领域内关于该菌株的应用鲜有报道。因此，得到高效的苯并[a]芘降解菌对苯并[a]芘污染水土及PAHs污染的处理和深度修复有重要的理论和实际意义。

DL-5的ITS基因序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

CCTGCGGAGGGATCATTACAGAGTTATACAACTCCCACACCATTTGCCAACTTTACTCAGTTATGCCTCGGCGTAAGCTCCGTACGGGGCTGCCGGGTTGCGCTGCGGGCGACAGCTACCCTGTAGCTTACCCTGTAGCGCTACCCTGTAGCGTTACCCTGCGGCGGCCCGCCGGTGGAAACGAAACTCTTGTTTTATTGTATCTTCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATCAGTATTCTGGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCGACCGTAGGGTCGTTCCTTAAAGACAGTGGCGGAGCGGCAGTGGTCCTCTGAGCGTAGTAAATTTATTTCTCGCTTTTGTCAGGCCCTGTCCTCCCGCCATAAAACCCCCAATTTTTTAGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGGCCGGAGGA。

由以上结果可得出本实验所分离的菌株DL-5为Arthrinium acutiapicum这个种，将其命名为Arthrinium acutiapicum DL-5，其于2025年02月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：65989。

实施例2Arthrinium acutiapicum DL-5的生长条件

生长温度的测定：

配置菌株生长所需的营养培养基(实施例1)，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌种Arthrinium acutiapicum DL-5接入到营养培养基内(实验组)，用不接种真菌的营养培养基做为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养7天，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察真菌的生长情况，7天后将培养基倒入称重的离心管后4500转离心30min，倒掉上清液后，放入60度烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。测试温度如下：18℃、23℃、28℃、33℃和38℃。

生长pH的测定：

配置菌株生长所需的营养培养基(实施例1)，用如下缓冲体系调节培养液的pH，pH4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；pH 6.0-8.0，0.1mol/l NaOH和0.1mol/lKH₂PO₄；pH 9.0，0.1mol/l NaHCO₃和0.1mol/l Na₂CO₃。将真菌Arthrinium acutiapicum DL-5接入到培养基内，每个pH做三个重复，用不接种真菌的营养培养基作为对照，将培养基放入新菌生长最适温度下培养7d，每天都需观察真菌的生长情况，7天后将培养基倒入称重的离心管后4500转离心30min，倒掉上清液后，放入60℃烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。测试的pH如下：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

盐浓度耐受：

配置菌株生长所需的营养培养基(实施例1)，调节培养基的盐浓度。将活化好的新菌Arthrinium acutiapicum DL-5接入到已灭菌的培养基内，每个盐浓度做三个重复，用不接菌的营养培养基作为对照，将培养基放置在新菌生长最适温度下培养7d，7天后将培养基倒入称重的离心管后4500转离心30min，倒掉上清液后，放入60度烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重最好得到新菌所能耐受的盐浓度范围。测试盐浓度如下：质量分数0％、2％、4％、6％、8％、10％。

结果如图3所示，在营养肉汤培养基中，DL-5能够在18-38℃的温度条件下生长，最适生长温度为该菌的富集温度33℃；该菌能够在4.0-9.0的pH条件下生长，最适生长pH为7.0；该菌的盐耐受能力较弱，在无盐下长势最好，能在盐浓度为0％到6％的条件下生长但随着盐度升高生长显著下降，8％时几乎不生长。

实施例3Arthrinium acutiapicum DL-5及菌剂的苯并[a]芘降解实验

1.菌剂的制备，步骤如下：

1)将玉米与水按质量比1:5加热制成糊状后，按质量比150：100：10：1加入木屑(过200目筛)，麦麸和木质素磺酸钠，挼搓成团，将团状培养基质混合物放入搓丸机中制得直径为8mm的球状培养基质，灭菌烘干备用。

2)将培养好的DL-5真菌制成菌丝含量为10g/L的菌液。

3)将菌液按1:10的质量比例加入到质量浓度3％的海藻酸钠溶液中，将上述球状培养基质与此溶液充分混合，完成后加入质量浓度为4％的无菌氯化钙溶液，硬化处理20min，得到丸状的包封真菌。

4)将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7天，待表面长满白色菌丝后即为DL-5菌剂。

2.苯并[a]芘降解实验

活化培养7天后的菌株DL-5或DL-5菌剂(DL-5-agent)接种于含有初始为25mg·L^-1的苯并[a]芘的无机盐培养基(实施例1)中，振荡培养，每个处理3个重复，培养条件为：温度33℃，pH 7.0，不添加NaCl。纯菌DL-5和DL-5菌剂的接种量均为质量比10％。生长不添加纯菌和菌剂的处理为对照处理。

取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μL浓度为200mg/L的回收率指示剂(氘代-PAHs)，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2mL，加入少量正己烷(约5mL)，旋转蒸发至2mL，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm3％去活化中性氧化铝，3cm 3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15mL正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15mL，氮吹使其浓缩至约0.5mL，最后转移至1.5mL细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前加入5μL内标物六甲基苯，其浓度为200mg/L。(2)仪器分析：采用安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定各处理样品中PAHs含量。使用的色谱柱为安捷伦DB 5-MS毛细管色谱柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，苯并[a]芘定量用6点校正曲线和内标法进行。微生物细胞浓度的测定采用烘干称重法。

结果显示，苯并[a]芘自身7天的降解率为24.2％。根据GC-MS测定并分析得出菌株DL-5和菌剂均能够降解苯并[a]芘，并且在含有25mg/L浓度苯并[a]芘的无机盐培养液中培养7天后，降解率均可达到80％以上(图4)。其中DL-5纯菌对苯并[a]芘的降解率为82.5％，而菌剂对苯并[a]芘降解效率比纯菌高5.7％，说明菌株DL-5是一种能降解苯并[a]芘的强效菌，并且制成菌剂后，效果更佳。

结论：

1)从宁波石油污染土壤中富集分离获得1株能以苯并[a]芘为碳源生长的苯并[a]芘降解菌DL-5并制成固体菌剂。

2)该菌株DL-5为能形成直径为12.5mm左右、白色、圆形、白色绒毛状菌丝向上生长的菌落。该菌为专性好氧菌。根据分子生物学手段分析，可得出本实验所分离的真菌DL-5为Arthrinium acutiapicum菌株，并绘制了其进化树。目前针对该菌株应用的报道很少，尤其是利用其降解苯并[a]芘的研究尚未见报道。

3)菌株DL-5的最佳生长条件为温度33℃，pH 7.0，不添加NaCl。DL-5能够以苯并[a]芘作为碳源并对其进行降解，在苯并[a]芘初始浓度在25mg·L^-1的无机盐培养液中培养7天后，其降解率可达到82.5％。并且DL-5制成的固体菌剂对苯并[a]芘的降解效果更好，达到88.2％。综上，DL-5是一种能够降解苯并[a]芘的菌株，对多环芳烃适应性强，并且制成的菌剂有更好的降解效果，在生物修复方面具有较好的应用潜力。

Claims (10)

1.Arthrinium acutiapicum DL-5，保藏编号为：GDMCC No：65989。

2.权利要求1所述的Arthrinium acutiapicum DL-5在降解苯并[a]芘中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的降解苯并[a]芘是降解石油污染土壤中的苯并[a]芘。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将Arthrinium acutiapicum DL-5应用在苯并[a]芘污染的环境中对苯并[a]芘进行降解。

5.一种苯并[a]芘降解菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的Arthriniumacutiapicum DL-5作为活性成分。

6.根据权利要求5所述的苯并[a]芘降解菌剂，其特征在于，所述的苯并[a]芘降解菌剂的制备方法为：

1)将玉米与水按质量比1:5加热制成糊状后，按质量比150：100:10:1加入木屑、麦麸和木质素磺酸钠，挼搓成团，将团状培养基质混合物放入搓丸机中制得球状培养基质，灭菌烘干备用；

2)将Arthrinium acutiapicum DL-5制成菌液；

3)将2)中的菌液按1:10的质量比例加入到质量浓度3％的海藻酸钠溶液中，将1)中的球状培养基质与此溶液充分混合，完成后加入质量浓度为4％的无菌氯化钙溶液，硬化处理，得到丸状的包封真菌；

4)将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7天，待表面长满白色菌丝后即为苯并[a]芘降解菌剂。

7.根据权利要求6所述的苯并[a]芘降解菌剂，其特征在于，步骤2)中，所述菌液是菌丝含量为10g/L的菌液。

8.一种降解苯并[a]芘的方法，其特征在于，将权利要求1所述的Arthriniumacutiapicum DL-5洒于含有苯并[a]芘的环境中，对苯并[a]芘进行降解。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，是将Arthrinium acutiapicum DL-5洒于苯并[a]芘污染的环境中对苯并[a]芘进行降解。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，是将Arthrinium acutiapicum DL-5洒于石油污染土壤中对苯并[a]芘进行降解。