CN120204273A - 芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用。本发明通过研究发现，芫荽籽油在雄激素型脱发模型中具有促进VEGF基因表达，在压力型脱发模型中具有Gas6、VEGF和TGF基因表达，从而起到良好的预防和治疗脱发的作用，且毒副作用少。

Description

芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用

技术领域

本发明涉及一种芫荽籽油的新应用，特别是一种芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用。

背景技术

毛发脱落是一种常见的生理现象，在脱发人群中，雄激素脱发占90％。Wnt信号通路是目前已知的雄激素脱发发病机制之一，参与了细胞增殖分化等基本生物过程。在皮肤毛囊组织中，该信号通过调控毛母细胞的生长周期，推动毛囊从静止期重启生长期，促进新的毛发生成。其中Dickkopf相关蛋白1(DickkopfWNT Signaling Pathway Inhibitor 1，DKK-1)是一种Wnt信号抑制蛋白，通过直接或间接竞争性结合Wnt蛋白受体LRP5/6进一步阻断Wnt信号通路，导致毛囊提前进入退化期，导致脱发。

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种关键的血管生成因子，能够促进毛囊周围的血管形成，增加毛囊的血液供应，从而支持毛发生长，且由于VEGF的周期性变化，它调控着毛囊的生长周期；同时，VEGF可以通过特定的信号通路(如PI3K/AKT途径)保护毛囊干细胞(HairFollicle Stem Cell，HFSC)免受雄激素诱导的凋亡，对于维持毛囊的正常功能和毛发生长具有重要作用。

压力型脱发是由于长期精神压力或心理负担导致毛囊生长周期紊乱、激素失衡等引发的脱发问题，压力会促使毛囊提前从生长期进入休止期。

Gas6基因是指生长抑制特异性蛋白6(GrowthArrest-Specific 6)基因，毛乳头细胞(Dermal Papilla，DP)所分泌的Gas6和其在毛囊干细胞(HairFollicle Stem Cell，HFSC)的受体Axl结合，能够促进HFSC的增值，从而促进毛发生长。研究表明，小鼠在压力情况下，来自肾上腺的应激激素皮质酮/通过与DP细胞上的GR受体结合，会抑制DP细胞中Gas6基因的表达，导致毛囊干细胞活性下降，头发停止生长并脱落；而恢复Gas6基因表达则能克服应激诱导的HFSC静息和毛发生长抑制。

TGF为转化生长因子、是一类多效性细胞因子，对于毛囊形态形成、发生发育和毛囊周期调节都有着重要作用。

目前治疗脱发的手段例如：米诺地尔、地塞米松等药物治疗，但是药物治疗很难治愈，存在反复发作的风险，而且长期用药会存在一定的毒性反应。

虽然也有研究报道何首乌、大葱提取物、桑根提取物、雪腐竹玉汤、青蒿素、皂苷以及葛根提取物等植物活性成分对脱发有一定治疗作用，但是防脱发效果不够理想。

芫荽籽油，又称芫荽油，具有独特的芫荽籽香型，外观为无色或淡黄色挥发性精油，几乎不溶于水，但易溶于乙醇、乙醚和冰醋酸等有机溶剂。芫荽籽油的提取方法通常包括将成熟的芫荽籽破碎后，采用水蒸气蒸馏法或者超临界二氧化碳萃取法提取。

目前，研究发现芫荽籽油具有舒缓胀气和胃绞痛、促进血液循环、增强免疫力、平衡皮脂分泌、舒缓和抗炎等作用，但是尚无研究报道芫荽籽油关于预防脱发、生发方面的作用。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用。本发明通过研究发现，芫荽籽油在雄激素型脱发模型中具有促进VEGF基因表达，在压力型脱发模型中具有Gas6、VEGF和TGF基因表达，从而起到良好的预防和治疗脱发的作用，且毒副作用少。

本发明的技术方案：芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用，所述防脱发包括预防脱发、治疗脱发和刺激毛发生长中的至少一种。

前述的应用中，所述脱发为雄激素型脱发或/和压力型脱发。

前述的应用中，所述芫荽籽油在制备促进VEGF基因表达的防雄激素型脱发组合物中的应用。

前述的应用中，所述芫荽籽油在制备促进VEGF、Gas6、TGF基因表达的防压力型脱发组合物中的应用。

前述的应用中，所述芫荽籽油是芫荽籽经清洗分离、干燥、挤压、离心、脱色脱味后得到。

前述的应用中，所述芫荽籽油中含有重量百分比为60％-75％的欧芹酸。

前述的应用中，所述芫荽籽油在制备防雄激素型脱发组合物中的细胞用量≤0.03125wt％。

前述的应用中，所述芫荽籽油在制备防压力型脱发组合物中的细胞用量≤2.5μg/mL。

前述的应用中，所述组合物包括药学组合物或者化妆品组合物。

前述的应用中，所述化妆品组合物包括洗发水、润发乳、发蜡、发胶、护发素、喷雾剂、防脱精华液、精化喷雾、预洗凝露中的任意一种。

本发明还提供了一种防脱发化妆品，包含芫荽籽油以及化妆品上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用。本发明通过建立雄激素模型进行防脱发测试，发现芫荽籽油能够促进血管内皮生长因子(VEGF)表达，从而起到预防雄激素型脱发、刺激毛发生长的效果。

另外本发明还通过建立皮质酮模型进行防脱发测试，发现芫荽籽油能够促进Gas6、VEGF和TGF基因表达，从而起到预防压力型脱发，并刺激毛发生长的效果，且毒副作用少。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

芫荽籽油应用效果验证：

本测试所用细胞为毛乳头细胞，批号：210727，来自广东博溪陕西分公司。本测试所用主要试剂为MSCM培养液(Gibco)、PBS(索莱宝)、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、DHT(Sigma)、米诺地尔(Sigma)、VEGF ELISA试剂盒(Abcam)。本测试所用主要设备为CO₂培养箱(Thermo，150I)、超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-1F)、倒置显微镜(Olympus，CKX53)、酶标仪(BioTek，Epoch)。

实验例1：雄激素模型-防脱测试。

细胞毒性测试：

1)细胞接种：对毛乳头细胞进行复苏，复苏细胞后，待铺板率达到60％左右时，细胞接种至96孔板，CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

2)试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组(Control)、阳性对照组(PC)与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度的样品工作液，每个浓度下设置3个重复孔。

3)配液：按测试浓度设定表(表1)用DMSO配制不同浓度的样品工作液。

表1测试浓度设定表

4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到50％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)中培养24h。

5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μLDMSO，在490nm处读取OD值。

细胞毒性测试的MTT检测结果如下表(表2)所示。

表2芫荽籽油的MTT检测结果

根据MTT结果，表明了芫荽籽油基于毛乳头细胞，在0.03125％的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。

防脱效果测试：

1)细胞接种：对毛乳头细胞进行复苏，复苏细胞后，待铺板率达到60％左右时，接种细胞至6孔板，CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

2)配液：按照测试分组(表3)配制样品工作液。

表3测试分组

3)刺激及给药：根据测试分组，待6孔板中细胞铺板率达到80％～90％时，进行分组给药，每组设3个复孔。空白对照(BC)组每孔加入2mL培养液，阴性对照(NC)组每孔加入2mL含800nMDHT的培养液，阳性对照(PC)组每孔加入2mL含800nMDHT和500μM米诺地尔的培养液，样品组每孔加入2mL含800nMDHT和相应浓度受试物的培养液。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO₂)中培养24h。

4)ELISA测试：孵育结束后，收集培养液于离心管中，收集完后将用于ELISA检测的样品置于-80℃冰箱冷冻保存，根据ELISA试剂盒的操作说明书进行VEGF指标检测分析。

5)结果统计分析：应用GraphPadPrism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。

6)检测结果：

血管内皮生长因子(VEGF)测试结果如下表(表4)所示。

表4VEGF含量结果汇总表

备注：用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

根据表4可知，与BC组相比，NC组的VEGF含量显著下降，说明本次测试刺激条有效。与NC组相比，PC组的VEGF含量显著上升，说明本次测试阳性对照有效。与NC组相比，样品组的VEGF含量显著上升，提升率为43.73％，表明基于DHT刺激的毛乳头细胞，芫荽籽油能够促进血管内皮生长因子(VEGF)的分泌，提升VEGF表达，提高VEGF含量，从而促进毛囊周围的血管形成，增加毛囊的血液和营养供应，从而起到防雄激素型脱发、刺激毛发生长，提高毛囊健康性的作用。

实验例2：皮质酮模型-防脱测试。

1)细胞接种：对毛乳头细胞(DP细胞)进行复苏，观察细胞生长情况，2天后进行计数，并将细胞接种至96孔板和12孔板。其中，96孔板用于检测细胞存活率，12孔板用于检测Gas6等基因表达水平。将孔板置于CO₂培养箱中(37℃、5％CO₂)孵育过夜。

2)配液：配制样品工作液。

3)试验分组：当毛乳头细胞铺板率达到60％左右时，进行分组给药。每组设3个复孔。

4)选取浓度为25μM～800μM的皮质酮进行细胞毒性实验，检测细胞存活率，实验条件参见表5。

表5不同皮质酮浓度试验条件分组

皮质酮(Cortisone)的细胞毒性试验结果如下表(表6)所示。

表6实验结果

选取用DMSO稀释的不同浓度的芫荽籽油进行细胞毒性实验，检测细胞存活率，实验条件参见表7。

表7不同芫荽籽油浓度试验条件分组

芫荽籽油的细胞毒性试验结果如下表(表8)所示。

表8细胞存活率

序号	1	2	3	4	5
						处理	Ctrl	0.5μg/mL	2.5μg/mL	5μg/mL	50μg/mL
平均存活率(％)	100	104％	103％	103％	96％

5)根据上述细胞毒性试验结果，选择造模皮质酮的浓度为100μM,芫荽籽油的浓度为2.5μg/mL，进行Gas6、VEGF和TGF的qPCR定量检测，实验条件参见表9。

表9造模的实验条件

给药完成后，将96孔板和12孔板放置在培养箱中(37℃、5％CO₂)孵育72小时。

6)数据处理：

6.1)细胞活力测试：在96孔板中每孔加入10μL的CCK-8试剂，并在培养箱中(37℃、5％CO₂)孵育3小时。然后使用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

6.2)细胞存活率计算：细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％；其中As:实验组孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)；Ac:阴性对照组孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物)；Ab:空白对照组孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)。

6.3)收样：12孔板孵育结束后，收集细胞用于后续测试。

6.4)基因表达检测：提取RNA，反转录至cDNA，进行荧光定量PCR检测，采用2^-△△Ct方法进行结果计算。

6.5)结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean+SD。各组间比较采用one-wayANOVA统计分析。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。

7)检测结果：

芫荽籽油+皮质酮(Cort)的细胞毒性试验结果如下表(表10)所示。

表10细胞存活率

序号	1	2
			处理	Ctrl	2.5μg/mL-Cort
平均存活率(％)	100	96％

芫荽籽油的Gas6、VEGF和TGF的试验结果参见表11。

表11Gas6、VEGF和TGF试验结果汇总表

根据表10可知，基于毛乳头细胞，2.5μg/mL的芫荽籽油+皮质酮未表现出明显的细胞毒性。

根据表11可知，一定浓度下的芫荽籽油能够促进Gas6、VEGF和TGF的基因表达，从而起到对压力型脱发的预防作用，并促进毛发生长，且毒副作用少。

根据以上试验可知，芫荽籽油可以应用在防雄激素型和压力型脱发组合物中，防脱发组合物包括药学组合物或者化妆品组合物。

药学组合物包括霜剂、贴剂、软膏剂、乳膏制剂、凝胶剂、胶囊剂、注射剂、霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、擦剂和喷雾剂中的任意一种。

化妆品组合物包括洗发水、润发乳、发蜡、发胶、护发素、喷雾剂、防脱精华液、精化喷雾、预洗凝露中的任意一种。

本发明还提供一种防脱发化妆品，包含芫荽籽油以及化妆品上可接受的载体，芫荽籽油的含量一般为1wt％。

应当理解的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，对本领域技术人员来说，可以对上述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而所有这些修改和替换，都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.芫荽籽油在制备防脱发组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脱发为雄激素型脱发或/和压力型脱发。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述芫荽籽油在制备促进VEGF基因表达的防雄激素型脱发组合物中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述芫荽籽油在制备促进VEGF、Gas6、TGF基因表达的防压力型脱发组合物中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述芫荽籽油中含有重量百分比为60％-75％的欧芹酸。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述芫荽籽油在制备防雄激素型脱发组合物中的细胞用量≤0.03125wt％。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述芫荽籽油在制备防压力型脱发组合物中的细胞用量≤2.5μg/mL。

8.根据权利要求1所述的的应用，其特征在于：所述组合物包括药学组合物或者化妆品组合物。

9.根据权利要求8所述的的应用，其特征在于：所述化妆品组合物包括洗发水、润发乳、发蜡、发胶、护发素、喷雾剂、防脱精华液、精化喷雾、预洗凝露中的任意一种。

10.一种防脱发化妆品，其特征在于：包含芫荽籽油以及化妆品上可接受的载体。