CN120168697A - 一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂及其制备方法，属于生物材料制备和生物医学应用领域。其是利用丝素蛋白、海藻酸钠及单宁酸等仿生海洋贻贝生物物质为组分构成具有强湿态黏附性能的医用粘合剂，其基于各材料之间的分子链纠缠以及交联，使所得医用粘合剂不仅具有良好的生物相容性和抗感染性能，而且具有原位喷涂的能力，可直接在损伤处进行喷涂，并可由其进一步衍生出粉末和创可贴形式，更方便了该粘合剂的使用。本发明制备的粘合剂所使用的原料安全无毒且来源广泛，且制备方法简单，有望替代传统的医用粘合剂，在战场等紧急止血条件下实现较高的应用价值。

Description

一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂及其制备 方法

技术领域

本发明属于生物材料和生物医学应用领域，具体涉及一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂及其制备方法。

背景技术

出血是创伤性损伤的主要死亡原因，因为大量失血常导致严重的并发症，包括低血压和多器官功能障碍，这些并发症可导致严重的愈合级联反应破坏，如无法控制的止血和长期的炎症，最终导致愈合进展受损和不可避免的疤痕形成。出血控制对时间非常敏感，大多数死亡发生在创伤损伤后的最初一小时，因此，快速和有效的出血控制对于致命性和/或不可压缩性出血，如内脏或高压动脉出血至关重要。

目前，止血材料的主要类别包括粉末、纱布、水凝胶和海绵。然而，海绵和纱布不适合用于形状不规则、有大量或不可压缩出血的伤口，因为它们无法进入深出血部位。另一方面，常规的止血粉不能形成稳定的结痂，甚至不能在血液中固定。近年来，与预制水凝胶相比，原位喷涂凝胶已成为最有前途的解决方案之一，它具有独特的优势，包括优异的便携性、增强的灵活性和对不同尺寸、不规则伤口的优越符合性。不幸的是，由于缺乏出血管理、水分和透气性调节，以及伤口营养来支持无疤痕伤口愈合，目前的可喷水凝胶无法处理具有复杂病理条件的广泛伤口。同时，它们没有足够的组织粘附性和力学性能，因此既不能稳定初始的伤口，也不能牢固地粘附和匹配身体运动来保护伤口部位。此外，它们不能在防止微生物感染的同时，为伤口提供必要的氧扩散渗透。所有这些限制都可能导致延长的炎症反应，延迟皮肤上皮化与瘢痕。

现有专利CN 118806979A公开了一种抑菌止血、促进伤口愈合水凝胶及其制备方法，所述抑菌止血、促进伤口愈合水凝胶是将明胶、负载多肽螯合钙的改性木质素微球、水和甘油混合均匀，再加入ε-聚赖氨酸，最后加入丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵，倒入模具中反应制得，该多功能水凝胶敷料具有优异力学性能的生物活性聚合物为基础，旨在提供抗菌性能并加速伤口愈合的效率。但该敷料制备过程复杂，原料繁杂，且未提及湿态黏附强度的相关数据。又如专利CN 106822989A公开了一种促进伤口愈合的可喷涂凝胶剂及其制备方法，该可喷涂凝胶安全无刺激，具有良好的生物相容性，用于伤口处理，良好的吸水性使得其能够充分地吸收伤口的渗出液，吸水后溶胀能够维持创面生理性湿润，并且总质量分数为5～10%时，凝胶剂的粘度表现出随剪切速率增加而降低的塑性特点，特别适合喷涂使用，该浓度下的还具有良好的抑菌性，从而免受细菌感染，从而有效促进伤口的愈合，但该材料使用的高碘酸钠对皮肤有刺激作用，或不利于伤口愈合。再如，专利CN118892572A公开了一种具有抗菌止血修复功能的白芨-丝素蛋白水凝胶敷料的制备方法，该敷料以白芨多糖、丝素蛋白和PVA为原料通过冻融法制备得到，制备方法简单，所得敷料具有良好的止血抗菌效果和力学性能，并且在伤口修复过程中保持自身形态的良好，不会对伤口造成二次伤害，但该敷料的机械强度过高，无法匹配组织承受的强度。

发明内容

本发明的目的在于提高一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂，用于止血并促进感染伤口愈合。本发明通过引入丝素蛋白（SF）和海藻酸钠（SA）对贻贝进行深层次仿生，构建了一种具有普适性的止血材料，其展示出强粘附性、多使用形式、良好的生物相容性、优异的力学性能、广泛的适用范围、安全无毒以及便于操作的优点，有望作为医用粘合剂，在战场等紧急止血条件下实现潜在的临床应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂，其制备方法包括以下步骤：

（1）将无水碳酸钠于煮沸的去离子水中搅拌混匀，加入蚕丝进行脱胶处理；处理后清洗干燥，用溴化锂溶液或氯化钙/无水乙醇/水三元溶液溶解，然后在去离子水中透析，再经离心过滤，得到丝素蛋白溶液；

（2）将海藻酸钠于去离子水中搅拌溶解，得到海藻酸钠溶液；

（3）将仿生海洋贻贝生物物质溶解于去离子水中，搅拌混合均匀，得到仿生海洋贻贝生物物质溶液；

（4）在室温下，将所得丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液充分混合，之后将所得混合液与仿生海洋贻贝生物物质溶液充分混合，制得具有紧急止血及抗感染功能的丝素蛋白水凝胶。

进一步地，步骤（1）所述脱胶处理的时间为5-120 min，优选为10-100 min。

进一步地，步骤（1）所述干燥的温度为5-100 ℃，优选为15-100 ℃；干燥的时间为1-50h，优选为2-50 h。

进一步地，步骤（1）所述溴化锂溶液的浓度为9.3 mol/L。

进一步地，步骤（1）所述氯化钙/无水乙醇/水三元溶液中氯化钙、无水乙醇与水的摩尔比为1:2:8。

进一步地，步骤（1）所得丝素蛋白溶液的质量浓度为0.1-50.0%，优选为1-15%。

进一步地，步骤（2）所述搅拌的温度为10-80 ℃，优选为20-70 ℃。

进一步地，步骤（2）所得海藻酸钠溶液的质量浓度为0.01-30.0%，优选为0.1-15%。

进一步地，步骤（3）中所述仿生海洋贻贝生物物质为多巴胺、酚羟基壳聚糖、单宁酸、没食子酸中的一种或多种。

进一步地，步骤（3）中所述搅拌的温度为10-60 ℃。

进一步地，步骤（3）中所得仿生海洋贻贝生物物质溶液的质量浓度为0.1-80.0%，优选为5-50%。

进一步地，步骤（4）中所用丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:500-500:1，优选为1:30-30:1；所用混合液与仿生海洋贻贝生物物质溶液的体积比为1:500-500:1，优选为1:30-30:1。

进一步地，步骤（4）中混合液与仿生海洋贻贝生物物质溶液的混合方式可采用喷涂、注射和手动搅拌中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明的显著优势在于：

在海洋环境中，贻贝表现出卓越的附着力，能够牢牢附着在船舶、岩石和水下设施等固体表面，即使在风浪的冲击下也能保持稳定。这种附着力主要得益于贻贝足丝分泌的贻贝足蛋白（Mfps），其中3,4-二羟基苯丙氨酸（Dopa）或其儿茶酚基团在Mfps与表面结合中起着关键作用。本发明利用仿生思想构建的医用水凝胶基于胶粘剂基团、动态氧化还原平衡和较强的机械性能三个方面，能更全面、更深入地模拟了伤口的粘附。以单宁酸（TA）为例，最初，TA模拟贻贝的Mfp-3和Mfp-5成分作为粘附特征官能团的基础，由于其含有大量的酚羟基，能有效地保证水凝胶的强界面粘附；其次，丝素蛋白（SF）对水凝胶的持久粘附性能至关重要，其中的疏水性氨基酸减轻了单宁酸中酚羟基对氧化的敏感性，从而确保了水凝胶长期优异的粘合性能；最后，添加的海藻酸钠（SA）可改善水凝胶的机械性能，以模拟胶原蛋白在贻贝中的作用。更重要的是，所得水凝胶可作为医用粘合剂，并进一步制成粉末、防粘连创可贴及喷雾剂这三种样品形式，从而可用于不同类型的伤口出血，且其展示出强粘附性、良好的生物相容性、优异的力学性能、广泛的适用范围、安全无毒以及便于操作的优点，在战场等紧急止血条件下实现潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为实施例2制备的丝素蛋白水凝胶（FTS-G）的傅里叶红外光谱图。

图2为实施例2制备的丝素蛋白水凝胶的湿态粘附性能和爆破压性能的测试结果图。

图3为实施例3制备的粉末形式医用粘合剂（FTS-G）的合成流程图（a）、喷水成胶的微观图（b）、粉末水化凝胶后的稳定性情况图（c）、37℃下粉末凝胶化的照片（d）、25、37℃下粉末凝胶化后的粘附强度情况图（e）、37℃下粉末遇血液和PBS凝胶化后的粘附强度情况图（f）、粉末温度依赖性机理图（g）、粉末凝胶化后的粘附强度随时间变化情况图（h）。

图4为实施例4制备的喷雾形式医用粘合剂进行喷涂的效果图。

图5为实施例5制备的创可贴形式医用粘合剂的组成以及粘附效果图。

图6为实施例2、3制备的医用粘合剂与对比例1、2商用产品的抗菌性能对比图，其中（a）为不同样品对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抑菌活性，（b）为细菌在不同样品表面生长的扫描电镜图像，（c）为不同样品的刃天青指示剂显色实验，（d）为不同样品与MRSA共培养24 h的抑菌环直径，（e）为刃天青指示剂显色实验中不同样品的吸光度。

图7为实施例2、3制备的医用粘合剂的细胞相容性情况图，其中（a）为NIH/3T3细胞在细胞培养板（对照）、FTS-G（凝胶样品）和FTS-P（粉末样品）中培养1、3和5天的活/死染色图像，（b）为溶血率实验。（c）为细胞毒性测试。

图8为实施例4制备的医用粘合剂与对比例1、2商用产品的止血效果对比图，其中（a）为大鼠肝脏和股动脉进行止血的示意图，（b、c）为大鼠肝脏和股动脉止血的流程图，（d、f）为大鼠肝脏和股动脉止血量对比情况图，（e、g）为大鼠肝脏和股动脉的止血时间对比情况图。

图9为实施例2、实施例3制备的医用粘合剂和对比例3商用产品促进大鼠感染伤口愈合的对比情况图，其中，（a）为进行大鼠伤口感染的操作示意图，（b）为不同组背部注射细菌溶液及进行伤口止血的照片，（c）为不同组在治疗第3天、第7天、第10天和第14天的全层感染伤口的照片，（d）为不同组在治疗第0天、第3天、第7天、第10天和第14天的伤口愈合变化模拟图，（e）为不同组的皮肤出血情况（中间照片为滤纸擦拭的血液痕迹），（f）为不同组在治疗第0天和第14天的菌落数量，（g）为不同组的伤口愈合率统计情况。

具体实施方式

一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备包括以下步骤：

（1）将无水碳酸钠于煮沸的去离子水中搅拌混匀，加入蚕丝，脱胶处理5-120 min；处理后清洗，5-100 ℃干燥1-50 h，然后用浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液或摩尔比为1:2:8的氯化钙/无水乙醇/水三元溶液溶解，再在去离子水中透析后，经离心过滤，得到质量浓度为0.1-50.0%的丝素蛋白溶液；

（2）将海藻酸钠于去离子水中，10-80 ℃搅拌溶解，得到质量浓度为0.01-30.0%的海藻酸钠溶液；

（3）将仿生海洋贻贝生物物质溶解于去离子水中，10-60 ℃搅拌混合，得到质量浓度为0.1-80.0%的仿生海洋贻贝生物物质溶液；

（4）在室温下，将所得丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液按体积比1:500-500:1充分混合，之后采用喷涂、注射和/或手动搅拌的方式将所得混合液与仿生海洋贻贝生物物质溶液按体积比1:500-500:1充分混合，制得具有紧急止血及抗感染功能的丝素蛋白水凝胶。

其中，步骤（3）中所述仿生海洋贻贝生物物质为多巴胺、酚羟基壳聚糖、单宁酸、没食子酸中的一种或多种。

经过体内和体外实验证实，该材料不仅具有良好的细胞和血液生物相容性，而且集强湿态粘附、抗感染、促修复优点于一体，有望作为医用粘合剂，在战场等紧急止血条件下实现潜在的临床应用价值。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）将5 L去离子水煮沸，加入8 g碳酸钠搅拌混匀，随后加入15 g蚕丝，脱胶处理25 min后，用去离子水充分洗涤处理后的脱胶丝素蛋白纤维8次，并于60 ℃烘箱干燥6 h，再将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入9.3 M的溴化锂溶液中，60 ℃溶解6 h，然后将其放入去离子水中透析3天；透析后的溶液经两次离心过滤，得到质量浓度为8.9%的丝素蛋白（SF）溶液；

（2）将1.0 g海藻酸钠溶解于50 mL去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量浓度为2%的海藻酸钠（SA）溶液；

（3）将15 g单宁酸（TA）溶解于50 mL去离子水中，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的单宁酸溶液；

（4）在室温下，将所得SF溶液与SA溶液混合后，加入TA溶液（混合体积比按SF溶液:SA溶液:TA溶液=5:1:5），充分搅拌混合，即可得到丝素蛋白水凝胶。

实施例2

（1）将5 L去离子水煮沸，加入8 g碳酸钠搅拌混匀，随后加入15 g蚕丝，脱胶处理25 min 后，用去离子水充分洗涤处理后的脱胶丝素蛋白纤维8次，并于60 ℃烘箱干燥6 h，再将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入9.3 M的溴化锂溶液中，60 ℃溶解6 h，然后将其放入去离子水中透析3天；透析后的溶液经两次离心过滤，得到质量浓度为8.9%的丝素蛋白（SF）溶液；

（2）将0.5 g海藻酸钠溶解于50 mL去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量浓度为1%的海藻酸钠（SA）溶液；

（3）将15 g单宁酸（TA）溶解于50 mL去离子水中，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的单宁酸溶液；

（4）在室温下，将所得SF溶液与SA溶液混合后，加入TA溶液（混合体积比按SF溶液:SA溶液:TA溶液=5:1:5），充分搅拌混合，即可得到丝素蛋白水凝胶。

实施例3

（1）将5 L去离子水煮沸，加入8 g碳酸钠搅拌混匀，随后加入15 g蚕丝，脱胶处理25 min 后，用去离子水充分洗涤处理后的脱胶丝素蛋白纤维8次，并于60 ℃烘箱干燥6 h，再将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入9.3 M的溴化锂溶液中，60 ℃溶解6 h，然后将其放入去离子水中透析3天；透析后的溶液经两次离心过滤，得到质量浓度为8.9%的丝素蛋白（SF）溶液；

（2）将0.5 g海藻酸钠溶解于50 mL去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量浓度为1%的海藻酸钠（SA）溶液；

（3）将15 g单宁酸（TA）溶解于50 mL去离子水中，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的单宁酸溶液；

（4）在室温下，将所得SF溶液与SA溶液混合后，加入TA溶液（混合体积比按SF溶液:SA溶液:TA溶液=5:1:5），充分搅拌混合，随后进行冷冻干燥，再将干燥后的水凝胶用研钵研磨成粉，即可得到粉末形式的医用粘合剂。

实施例4

（1）将5 L去离子水煮沸，加入8 g碳酸钠搅拌混匀，随后加入15 g蚕丝，脱胶处理25 min 后，用去离子水充分洗涤处理后的脱胶丝素蛋白纤维8次，并于60 ℃烘箱干燥6 h，再将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入9.3 M的溴化锂溶液中，60 ℃溶解6 h，然后将其放入去离子水中透析3天；透析后的溶液经两次离心过滤，得到质量浓度为8.9%的丝素蛋白（SF）溶液；

（2）将0.5 g海藻酸钠溶解于50 mL去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量浓度为1%的海藻酸钠（SA）溶液；

（3）将15 g单宁酸（TA）溶解于50 mL去离子水中，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的单宁酸溶液；

（4）在室温下，按体积比5:1:5分别取SF溶液、SA溶液、TA溶液，然后将SF溶液与SA溶液混合后装入喷壶，并将TA溶液单独装入喷壶中，即可得到喷雾形式的医用粘合剂。

实施例5

（1）将5 L去离子水煮沸，加入8 g碳酸钠搅拌混匀，随后加入15 g蚕丝，脱胶处理25 min 后，用去离子水充分洗涤处理后的脱胶丝素蛋白纤维8次，并于60 ℃烘箱干燥6 h，再将烘干的脱胶丝素蛋白纤维放入9.3 M的溴化锂溶液中，60 ℃溶解6 h，然后将其放入去离子水中透析3天；透析后的溶液经两次离心过滤，得到质量浓度为8.9%的丝素蛋白（SF）溶液；

（2）将0.5 g海藻酸钠溶解于50 mL去离子水中，50 ℃下搅拌过夜，得到质量浓度为1%的海藻酸钠（SA）溶液；

（3）将15 g单宁酸（TA）溶解于50 mL去离子水中，室温搅拌混合均匀，得到质量浓度为30%的单宁酸溶液；

（4）在室温下，将所得SF溶液与SA溶液混合后，加入TA溶液（混合体积比按SF溶液:SA溶液:TA溶液=5:1:5），充分搅拌混合，即得到丝素蛋白水凝胶。

（5）将2.96 g聚乳酸（PLA）颗粒溶于15 mL二氯甲烷（DCM）与10 mLN, N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶液中，配成纺丝液；之后将所得纺丝在正负极为8 kV与-8 kV的高压电场存在下被拉伸成丝，从而在滚筒离型纸表面收集到厚度为0.2 mm的PLA薄膜。

（6）将步骤（4）得到的丝素蛋白水凝胶与步骤（5）得到的PLA薄膜进行物理粘合，并在水凝胶未粘合的另一面覆盖PTFE膜，再剪裁出需要的形状，即可得到创可贴形式的医用粘合剂。

图1为实施例2制备的丝素蛋白水凝胶（FTS-G）的傅里叶红外光谱图。由图可见，1706、1610、1534和1446 cm^-1处的峰归属于TA中芳香化合物的特征吸收峰。同时，1609 cm^-1处的峰属于SA中羧基上C=O的伸缩振动。SF中1660 cm^-1处的峰归因于酰胺I（C=O）和酰胺II（N-H）的拉伸和弯曲模式，而在FTS中红移至1531 cm^-1，这是因为SF从α-螺旋结构转变为β-折叠结构所致（a）。此外，在3000-3600 cm^-1出现的宽峰是由于化学反应后保留完好的苯酚羟基（Ar-OH），这是水凝胶强湿附着力的关键（b）。FTIR结果证实，SA、SF和TA成功结合形成了复合材料。

图2为实施例2制备的FTS-G的湿态粘附性能和爆破压性能的测试结果图。采用质构仪测试所得水凝胶对湿塑料、猪皮和木材的粘接强度，由图中可见，其粘接强度分别为197.1±19.2 kPa、363.4±18.0 kPa和708.3±73.6 kPa（a）。这些强附着力主要是由于FTS与各种底物之间的共价键和非共价键，如氢键、配位键、π-π相互作用和金属螯合作用。同时，对所得水凝胶的爆破压性能进行测试，其具体是先在直径15.0 mm的软管上形成一个边长10.0 mm的方孔，然后用强力胶将边长20.0mm的猪皮或肠衣（中间有直径4.0 mm的穿透孔）固定在软管上，再将直径为10.0 mm的圆形水凝胶附着在猪皮或肠衣上预制的穿透孔上，然后将其固定在压力表上。实验时，将PBS以10.0 mL min⁻¹的速率推入软管内，导致水凝胶在缺陷处破裂的最大压力被确定为破裂压力。由图可知，附着在猪皮或肠衣上的FTS-G承受的破裂压力分别为180.0±7.5 mmHg和165.0±7.5 mmHg，这些数值超过了正常的人动脉血压（~120 mmHg），表明FTS-G在预防压力性动脉出血方面具有良好效果。

图3为实施例3制备的粉末形式医用粘合剂（FTS-P）的性能表征图。如图所示，将预制备的FTS进行冻干和研磨，可得到SF/TA/SA止血粉；FTS-P在水化后出现自融合过程，并在5 s内迅速转化为凝胶（a）。在倒置显微镜下进一步观察这种自融合组装过程，可见FTS-P水化后由细粉转变为块凝胶（b）。为了评估FTS-P转化为凝胶形式后的粘接稳定性，将粉末均匀放置在硅胶模具上。水化后，用镊子对模具施加机械振动，结果显示，FTS-P水化后即使在振动条件下也没有出现脱离现象，说明形成的水凝胶具有优异的粘附性能（c）。此外，研究中还发现，粉末凝胶化后的粘附强度会随温度变化。生理温度下，其粘附强度可达到185.3±13.7 kPa，且不论是使用血液或是PBS进行凝胶化都能达到类似的粘附强度（d-f）。进一步探讨水凝胶粘附强度随温度变化的机理。其一方面主要是由于随温度升高，软化后的水凝胶更贴合组织界面；另一方面，温度升高使水凝胶暴露更多官能团，增加了与组织界面结合的面积（g）。最后还探究了生理温度下粉末凝胶化后的粘附强度随时间的变化，粉末凝胶化后5分钟就可达到100 kPa，随着时间延长，其最终可达到近200 kPa（h）。

图4为实施例4制备的喷雾形式的医用粘合剂进行喷涂的效果图。由图可知，其喷雾的成胶性良好，成胶均匀。

图5为实施例5制备的创可贴形式的医用粘合剂的组成以及粘附效果图。由图可知，其在生理温度且在湿态情况下，可在培养皿上牢固粘附。

以商用止血海绵（Kuai Kang）、止血胶带（XUELIAN）和医用抗菌敷料（3M）分别作为对比例1-3，进一步进行实验。

抗菌性能是止血材料的另一个主要问题，因为细菌感染会导致持续炎症、出血加剧和伤口愈合延迟。为评价实施例2、3制备的医用粘合剂的抗菌能力，进行一系列抗菌试验，结果见图6。由图6可见，将不同样品放置在涂满耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的琼脂盘上，在37 ℃下进行共培养，采用对比例1、2商用产品的培养皿中均未检测到抑菌圈，而使用实施例2、3医用粘合剂的培养皿中表现出明显的抑菌圈，且对比例1、2中的MRSA形态良好，而实施例2、3中的MRSA形态萎缩，细胞膜破碎，内容物流出，证实实施例2、3制备的复合产品具有较好的抑菌活性（a、b、d）。进一步进行刃天青指示剂显色实验，验证其抑菌能力（在细菌增殖显色实验中，指示剂与MRSA产生的还原性物质发生反应，使其颜色由紫色变为粉红色，甚至变为无色）。由图可见，细菌共培养24小时后，加入实施例2、3医用粘合剂的孔中颜色仍为紫色，而加入对比例1、2商用产品的孔中变为粉红色，证实实施例2、3所得医用粘合剂有效抑制了MRSA的增殖（c）。且实施例2、3医用粘合剂在600 nm较低的吸光度值也定量地证实了这一结果（d）。

细胞毒性是止血敷料临床应用的另一个重要前提。因此采用小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3）的LIVE/DEAD染色和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验研究实施例2、3制备的医用粘合剂的细胞相容性，结果见图7。如图7所示，使用实施例2、3医用粘合剂处理的细胞和对照组一样，NIH3T3细胞均呈现健康的纺锤样形态（a），表明其具有良好的细胞相容性。且经细胞增殖行为的定量分析可知，各组培养的NIH 3T3细胞均表现出良好的细胞增殖趋势（c）。另外，采用体外溶血试验评价实施例2、3制备医用粘合剂的血液相容性，结果显示，TritonX-100上清液呈鲜红色，表明完全溶血。与此形成鲜明对比的是，经实施例2、实施例3医用粘合剂和PBS缓冲处理的样品呈淡粉色，溶血率均在5%以下（b），充分说明合成的FTS-G和FTS-P符合临床使用的安全标准。

为了评价实施例4制备医用粘合剂的止血能力，建立了大鼠肝横断模型和股动脉出血模型进行体内评估，并以喷雾方式止血，结果见图8。由图可见，在大鼠肝横断模型中，与空白组、纱布组和对比例1比较，使用实施例4医用粘合剂进行止血的效果最好，其出血量为54.8±15.0 mg，止血时间为6.7±1.5 s（d、e）。这种良好的止血作用在大鼠股动脉出血模型中得到进一步验证（c、f、g）。

细菌感染是伤口止血修复中必须考虑的重要因素。在大鼠皮下注射MRSA 24 h后，在细菌注射部位形成直径1 cm的圆形创面缺损，引起严重感染和出血，然后将各种样品涂在这些感染的伤口上，考察不同样品对感染伤口愈合的效果，结果见图9。如图所示，与空白组相比，实施例2、3制备的医用粘合剂的止血效果明显改善，并略优于对比例3（b、e）。伤口愈合是组织创伤治疗的另一个重要步骤。值得注意的是，使用实施例2、3医用粘合剂的处理组在治疗期间表现出最佳的伤口愈合性能（c、d、g）。随后，在第0天和第14天对不同组伤口分泌物进行细菌培养，结果显示使用实施例2和实施例3医用粘合剂的处理组均表现出优异的抗菌性能（f）。

以上实施例说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，是本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将无水碳酸钠于煮沸的去离子水中搅拌混匀，加入蚕丝进行脱胶处理；处理后清洗干燥，用溴化锂溶液或氯化钙/无水乙醇/水三元溶液溶解，然后在去离子水中透析，再经离心过滤，得到丝素蛋白溶液；

（2）将海藻酸钠于去离子水中搅拌溶解，得到海藻酸钠溶液；

（3）将仿生海洋贻贝生物物质溶解于去离子水中，搅拌混合均匀，得到仿生海洋贻贝生物物质溶液；

（4）在室温下，将所得丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液充分搅拌混合，之后将所得混合液与仿生海洋贻贝生物物质溶液充分混合，制得具有紧急止血及抗感染功能的丝素蛋白水凝胶。

2. 根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述脱胶处理的时间为5-120 min。

3. 根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述溴化锂溶液的浓度为9.3 mol/L；所述氯化钙/无水乙醇/水三元溶液中氯化钙、无水乙醇与水的摩尔比为1:2:8。

4.根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）所得丝素蛋白溶液的质量浓度为0.1-50.0%。

5. 根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述搅拌的温度为10-80 ℃，时间为5-72 h。

6.根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）所得海藻酸钠溶液的质量浓度为0.01-30.0%。

7.根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述仿生海洋贻贝生物物质为多巴胺、酚羟基壳聚糖、单宁酸、没食子酸中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所得仿生海洋贻贝生物物质溶液的质量浓度为0.1-80.0%。

9.根据权利要求1所述的一种用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所用丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:500-500:1；所用混合液与仿生海洋贻贝生物物质溶液的体积比为1:500-500:1。

10.一种如权利要求1所述方法制备的用于紧急止血且抗感染的丝素蛋白医用粘合剂。