CN120167008A

CN120167008A - 从固定床生物反应器中回收目标生物分子的系统和方法

Info

Publication number: CN120167008A
Application number: CN202380075918.XA
Authority: CN
Inventors: 让-克里斯托夫·德格曼德; 安托万·休伯特; 塔妮娅·佩雷拉·奇利马; 罗马内·梅尔斯
Original assignee: Univolcels Technologies Inc
Current assignee: Univolcels Technologies Inc
Priority date: 2022-11-18
Filing date: 2023-11-17
Publication date: 2025-06-17
Also published as: EP4619499A2; US20240182833A1; WO2024105226A2; WO2024105226A3

Abstract

本发明涉及一种从在固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的方法，所述方法包括：向所述生物反应器中添加裂解溶液，从而裂解所述生物反应器中的所述细胞，并且在裂解所述细胞之前、同时和/或之后，对所述生物反应器施加一种或多种机械作用，在其之后从所述生物反应器中回收所述一种或多种目标生物分子。本发明进一步涉及用于从固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的系统。

Description

从固定床生物反应器中回收目标生物分子的系统和方法

技术领域

以下申请以其全文通过援引并入本文：

细胞生长基质(Cell Growth Matrix)，PCT/EP2017/078775，2017年11月09日，并且2018年5月17日公开为WO2018/087235A1。

生物反应器及相关方法(Bioreactor and Related Methods)，PCT/EP2018/086394，2018年12月20日，并且2019年6月27日公开为WO2019/122239。

具有增强细胞收获能力的生物反应器系统及相关方法(Bioreactor System withEnhanced Cell Harvesting Capabilities and Related Methods)，PCT/EP2022/065264，2022年6月03日，并且2022年12月28日公开为WO2022/254039。

编织细胞培养基底(Woven cell culture substrates)，PCT/US2020/016576，2020-02-04，并且公开为WO 2020163329A1，2020-08-13。

本文所述的系统、组合物和方法涉及在固定床生物反应器，优选在结构化固定床生物反应器诸如上文通过引用以其整体并入本文的专利申请中描述的生物反应器中进行贴壁或悬浮细胞的细胞培养；以及从固定床生物反应器的细胞培养收获物中回收一种或多种目标生物分子。

PCT公开WO2022/254039通过引用以其整体并入本文，并且其公开了生物反应器及固定床配置，以及用于向该文献所述生物反应器和固定床系统施加机械能与化学剂/酶促剂结合的系统和工艺。本文中提及的生物反应器和固定床系统以及向生物反应器和固定床系统施加机械能的系统，包括但不限于该文献中所描述的那些。

本发明涉及用于从固定床生物反应器中获得病毒载体及其他目标生物分子的方法。在第二方面，本发明涉及用于从固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的系统。因此，本发明关于从固定床生物反应器中培养的细胞中收获目标生物分子的技术领域。

背景技术

固定床生物反应器是生产生物分子诸如重组蛋白、单克隆抗体、病毒载体、病毒及细胞囊泡(诸如外泌体)的有效工具。动物细胞能够用于生产这类生物分子，例如使用组成型表达系统、感染或转染。然后目标生物分子能够被细胞释放(诸如分泌型重组蛋白、“分泌型”病毒或裂解性病毒)，或者能够保留在细胞内(例如细胞内蛋白、病毒或某些病毒载体)。细胞外的目标生物分子可以在生物反应器的上清液以及一个或多个再循环/灌注回路中被回收，通过使用一个或多个清空和冲洗步骤来回收感兴趣的目标生物分子(在本文中称为目标生物分子)。然而，细胞内及部分细胞内的产物仍保留于细胞中，需在工艺末期使用化学/酶促溶液裂解细胞。然而，常规裂解条件较为严苛，其使用可能对目标生物分子造成损伤，因它们常对pH、剪切应力、酶活性及洗涤剂敏感。此外，目标生物分子可能被细胞碎片或其他生物分子(例如细胞膜、DNA等)捕获，其仍会堵塞于固定床结构内部。

本发明旨在解决上述至少一些问题及缺点。本发明的目的是提供一种消除这些缺点并提高从固定床生物反应器中细胞内(或部分细胞内)目标生物分子回收率的方法及系统。

发明内容

本发明及其实施方式为上述一个或多个缺点提供解决方案。为此，本发明涉及根据权利要求1所述的从固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的方法。更特别地，本文所述方法涉及一种从固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的方法，所述方法包括：

-向所述生物反应器中添加裂解溶液，从而裂解所述生物反应器中的所述细胞，并且在裂解所述细胞之前、同时和/或之后，对所述生物反应器施加一种或多种机械作用，在其之后从所述生物反应器中回收所述一种或多种目标生物分子。

通过将裂解溶液与一种或多种机械作用相结合，能够从生物反应器中获得更高的目标生物分子产率。

所述方法的优选实施方式在权利要求2至11中的任一项中示出。

在第二方面，本发明涉及根据权利要求12所述的系统。更特别地，本文所述系统涉及一种包括以下的系统：搅拌装置和固定系统，

-所述搅拌装置包括适于接收生物反应器的平台；已经

-所述固定系统包括用于将所述生物反应器固持至所述平台的至少一个紧固件，以及适于安装至所述生物反应器并接收所述至少一个紧固件的桥结构。

所述系统的优选实施方式在权利要求13至15中的任一项中示出。

在实施方式中，本发明涉及根据权利要求12所述的系统，其中所述紧固件包括可调节绑带，以及其中所述固定系统进一步包括用于定位和引导绑带放置的一个或多个绑带引导件。

在实施方式中，本发明涉及根据权利要求12-13中任一项所述的系统，其中所述固定系统包括用于接合生物反应器的盖或罩的环形部分部件。

在实施方式中，本发明涉及根据前述权利要求12-14中任一项所述的系统，其中所述搅拌装置包括振动台，所述振动台包括生物反应器放置在其上的占位件(placeholder)。

在实施方式中，所述桥结构包括顶部部分及悬垂部分(depending portion)。

在实施方式中，所述固定系统包括可释放联接件。

在实施方式中，搅拌装置包括振动台形式的搅拌器、涡旋装置、振荡器，或用于向生物反应器和/或固定床材料施加机械能的另一种装置。

在实施方式中，所述系统形成了生物反应器的对接站的一部分。

在实施方式中，该系统进一步包括用于控制搅拌装置的控制器。

在实施方式中，所述系统进一步包括用于控制搅拌装置及生物反应器或细胞收获过程的控制器。

在实施方式中，生物反应器包括结构化的固定床生物反应器。

在实施方式中，固定床包括多个细胞固定化层。

在实施方式中，多个细胞固定化层布置为堆叠或螺旋构型。

在实施方式中，细胞固定化层或者布置为直接接触，或者在相邻层之间具有间隔。

在实施方式中，细胞固定化层布置为或者直接接触或者在所述一个或多个细胞固定化层之间具有一个或多个间隔层。

在实施方式中，固定床是3D打印固定床。

在实施方式中，本发明涉及一种从生物反应器中回收生物分子的系统，所述系统包括：

-留置在搅拌装置的平台上的生物反应器；以及

-用于将生物反应器的至少部分联接至搅拌装置的固定系统。

本发明可概括如下：

1.一种从固定床生物反应器中的细胞中回收目标生物分子的工艺，该工艺包括以下步骤：

排空来自所述生物反应器的细胞培养基；

向所述生物反应器添加冲洗溶液；

排空来自所述生物反应器的所述冲洗溶液；

通过向所述生物反应器添加裂解溶液来裂解所述生物反应器中的所述细胞；

排空来自所述生物反应器的所述裂解溶液；

通过向所述生物反应器添加洗涤溶液来洗涤所述生物反应器中的所述细胞；

排空来自所述生物反应器的所述洗涤溶液；以及

从所述固定床生物反应器中回收所述目标生物分子，

其中，所述工艺进一步包括在所述裂解步骤和/或所述洗涤步骤期间向所述生物反应器添加高电导率溶液。

2.一种从固定床生物反应器中的细胞中回收目标生物分子的工艺，该工艺包括以下步骤：

排空来自所述生物反应器的细胞培养基；

向所述生物反应器添加冲洗溶液；

排空来自所述生物反应器的所述冲洗溶液；

排空来自所述生物反应器的所述裂解溶液；

排空来自所述生物反应器的所述洗涤溶液；以及

3.根据实施方式2所述的工艺，进一步包括从所述冲洗溶液、所述裂解溶液和所述洗涤溶液中的一个或多个中回收所述目标生物分子。

4.根据实施方式1或2所述的工艺，其中，所述裂解溶液包括添加DNase，优选内切核酸酶，更优选benzonase。

5.根据实施方式1或2所述的工艺，其中，所述裂解溶液是低电导率的。

6.根据实施方式1或2所述的工艺，其中，在所述裂解步骤期间提高所述裂解溶液的电导率。

7.根据实施方式1或2所述的工艺，其中，通过添加NaCl将所述裂解溶液的电导率提高至最高达1M。

8.一种从固定床生物反应器中的细胞中回收目标生物分子的工艺，该工艺包括以下步骤中的一个或多个步骤：

-进行具有若干次冲洗的若干个循环。

-具有足够的接触时间。

-使用DNase降解游离DNA

-使用表面活性剂限制AAV对塑料容器壁的吸附

-采用低于等电点(pH3至5)或高于等电点(pH8至9)的pH。

-对所述生物反应器施加振动。

-在一个或多个裂解步骤期间和/或后续的冲洗步骤期间，对所述生物反应器施加振动。

-在本文上述列出的一个或多个工艺期间，对所述生物反应器施加振动。

-使用电泳从固定床生物反应器提取一种或多种带电荷的生物分子。

-以再循环模式，优选使用再循环回路，运行上述一个或多个步骤。

9.从细胞培养收获物中的细胞中回收细胞或目标生物分子的工艺，所述工艺包括，移动所述细胞培养收获物中的固定床；并从所述细胞培养收获物中回收所述目标生物分子。

10.一种从包括细胞的固定床生物反应器中回收目标生物分子的工艺，所述工艺包括，移动所述固定床；并回收所述目标生物分子。

11.一种从包括溶液中的细胞的固定床生物反应器中回收目标生物分子的工艺，所述工艺包括，相对于所述固定床移动所述溶液；并回收所述目标生物分子。

12.根据前述实施方式2-11中任一项所述的工艺，其中，所述目标生物分子选自由以下组成的组：治疗性蛋白、抗体、病毒、病毒疫苗、病毒载体、病毒基因组、蛋白质、病毒样颗粒(VLP)、微囊泡、外泌体及多糖。

13.根据实施方式12所述的工艺，其中，所述细胞选自由以下组成的组：贴壁细胞、悬浮细胞以及贴壁细胞和悬浮细胞的组合。

14.根据实施方式13所述的工艺，其中，所述细胞被附着或捕获在固定床中。

15.根据实施方式14所述的工艺，其中，所述目标生物分子是细胞内的。

16.根据实施方式15所述的工艺，其中，所述目标生物分子是细胞外的。

17.根据实施方式16所述的工艺，其中，所述细胞在细胞培养基中。

18.根据实施方式17所述的工艺，其中,所述细胞在使细胞从所述固定床脱离的溶液中，且所述工艺进一步包括使所述细胞从所述固定床脱离的步骤。

19.根据实施方式18所述的工艺，其中，所述脱离溶液包括洗涤剂、DNase、适当pH(与等电点不同)及适当电导率的组合。

20.根据实施方式19所述的工艺，其中，所述细胞在裂解溶液中，并且所述工艺进一步包括裂解所述细胞的步骤。

21.根据实施方式20所述的工艺，其中，所述裂解溶液包括洗涤剂、适当pH(与等电点不同)下的DNase及适当电导率的组合。

22.根据实施方式21所述的工艺，其中，移动所述固定床包括选自由以下组成的组的动作：振动、搅拌、压实、膨胀及前述的组合。

23.根据实施方式22所述的工艺，其中，移动所述溶液包括选自由以下组成的组的动作：振动、搅拌、压实、膨胀及前述的组合。

24.根据实施方式23所述的工艺，其中，所述脱离步骤是在所述裂解步骤之前。

25.根据实施方式24所述的工艺，进一步包括添加裂解溶液并裂解所述细胞。

26.根据实施方式25所述的工艺，其中，所述生物反应器包括裂解的细胞和溶液中的所述目标生物分子。

27.根据实施方式26所述的工艺，进一步包括添加高电导率溶液的步骤，其中所述高电导率溶液包括在150mmol/L NaCl至2mol/L NaCl之间并且包括端点值的电导率。

28.根据实施方式27所述的工艺，其中，所述高电导率溶液与溶液中裂解的细胞及所述目标生物分子接触时间为5至360分钟并且包括端点值。

29.根据实施方式28所述的工艺，进一步包括电泳步骤。

30.根据实施方式29所述的工艺，其中，所述裂解步骤的至少一部分以再循环模式进行。

31.根据实施方式30所述的工艺，其中，所述高电导率溶液步骤的至少一部分以再循环模式进行。

32.根据实施方式31所述的工艺，其中，所述细胞在所述裂解步骤前从所述固定床脱离。

33.根据实施方式32所述的工艺，其中，所述细胞在所述裂解步骤前从所述固定床回收。

34.根据实施方式33所述的工艺，其中，所述细胞在所述裂解步骤前从所述固定床去除。

35.一种从固定床生物反应器中的细胞中回收目标生物分子的工艺，所述工艺包括以下步骤：通过向所述生物反应器中添加裂解溶液来裂解所述生物反应器中的所述细胞；

通过向所述裂解溶液中添加盐提高所述裂解溶液的所述电导率；以及从所述生物反应器中回收目标生物分子。

36.根据实施方式35所述的工艺，其中，通过向所述裂解溶液中添加NaCl提高所述裂解溶液的电导率。

37.根据实施方式36所述的工艺，其中，所述裂解溶液中NaCl的浓度是1M至2M之间。

38.一种从固定床生物反应器中的细胞中回收目标生物分子的工艺，该工艺包括以下步骤：

排空来自所述生物反应器的所述裂解溶液；

向所述生物反应器添加高电导率溶液；以及

从所述生物反应器中回收目标生物分子。

39.根据前述实施方式2-38中任一项所述的工艺，其中，所述目标生物分子选自由以下组成的组：治疗性蛋白、抗体、病毒、病毒疫苗、病毒载体、病毒基因组、蛋白质、病毒样颗粒(VLP)、微囊泡、外泌体及多糖。

附图说明

图1示出了根据实施例1中所述本发明的实施方式获得AAV2的方法中进行的步骤的流程图。

图2示出了根据实施例2中所述本发明的实施方式获得AAV2的方法中进行的步骤的流程图。

图3示出了根据本发明实施方式，在1cm/s的搅拌下从固定床生物反应器中收获和回收目标生物分子进行的步骤的流程图。

图4示出了根据本发明实施方式，从固定床生物反应器中收获和回收AAV进行的步骤的流程图。

图5示出了根据本发明实施方式，在生物反应器以再循环模式运行时从固定床生物反应器中收获和回收AAV进行的步骤的流程图。

图6A示出了电泳衍生系统的一般示意图。

图6B示出了根据本发明实施方式的电极详细结构。

图7A示出了根据本发明实施方式，在电泳衍生系统中带负电荷的生物分子的迁移。负电颗粒从阳极向阴极迁移。

图7B示出了根据本发明实施方式，在电泳迁移过程中电流反转，以实现生物分子的便捷收集，并避免其在阴极(+)上的聚集。

图8-12示出了根据本发明实施方式，对生物反应器施加机械作用的系统。

图13示出了根据本发明实施方式的桥结构，包括用于在固定系统中将绑带安装的过程中定位和引导绑带放置的绑带引导件，以及适于限制容器或生物反应器的盖的位移和/或破损的推顶销(pushing pin)。

图14示出了根据本发明实施方式，预先安装绑带的棘轮，用于调节固定系统中绑带长度。

图15和图16示出了根据本发明实施方式的振动台。

具体实施方式

本发明涉及从固定床生物反应器中获得病毒载体及其他目标生物分子的方法。在第二方面，本发明涉及包括搅拌装置和固定系统的系统，用于从固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子。

除非另有定义，否则在公开本发明中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括了术语定义以更好地理解本发明的教导。

如本文使用的，以下术语具有以下含义：

除非上下文明确地另有说明，否则“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“该”包括单数和复数指示物。举例而言，“隔室”是指一个隔室或多于一个隔室。

引用可测量值诸如参数、量、持续时间等，如本文所使用的“约(about)”意在涵盖指定值的或来自该指定值的+/-20％或更少、优选地+/-10％或更少，更优选地+/-5％或更少，甚至更优选地+/-1％或更少，并且仍更优选地+/-0.1％或更少的变化，只要此类变化适合于在本公开的发明中进行。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也是具体地公开的。

如本文所使用的“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“由……组成(comprised of)”与“包括(include)”、“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(contain)”、“含有(containing)”、“含有(contain)”同义，并且是包含性的或开放式的术语，其指定了以下内容的存在，例如，“部件包括”不排除或排除本领域已知的或其中公开的另外的、未列举的部件、特征、元件、构件、步骤的存在。

此外，说明书和权利要求书中的“第一”、“第二”、“第三”等术语仅用于区分相似元素，除非特别说明，并不必然表示顺序或时间先后关系。应当理解，在适当情况下这些术语可互换使用，且本文描述的本发明实施方式的操作顺序能够不限于说明书描述或例示的顺序。

通过端点列举的数值范围包括归入在范围内的所有数字和分数，以及列举的端点。

除非另有定义，本文以及整个说明书中的“按重量计％”“重量百分数”“％wt”或“wt％”这些表述，是指各组分基于制剂总重量的相对重量。

鉴于术语“一个或多个”或“至少一个”，诸如一组成员中的一个或多个成员或者至少一个成员，本身是清楚的，通过进一步举例，该术语尤其涵盖提及所述成员中的任何一个，或所述成员中的任何两个或更多个，例如，所述成员的任何≥3个、≥4个、≥5个、≥6个或≥7个等，并且直至最多全部所述成员。

除非另有定义，否则在公开本发明中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，本说明书中使用的术语的定义被纳入其中，以便更好地理解本发明的教导。本文所使用的术语或定义仅为了有助于理解本发明。

在整个说明书中对“一种实施方式”或“实施方式”的引用意味着结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一种实施方式中。因此，在整个说明书的各个段落中出现的短语“在一种实施方式中”或“在实施方式中”不必然全指代同一实施方式，但是可以。此外，如本领域技术人员从本公开内容中显而易见的那样，存在于一种或多种实施方式中特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式进行组合。此外，虽然本文所描述的一些实施方式包括了其他实施方式中所包括的一些而不包括其他特征，但不同实施方式的特征组合旨在处于本发明的保护范围内，并构成了不同的实施方式，如本领域技术人员所理解的。例如，在以下权利要求中，任何一项所要求保护的实施方式都可以以任何组合方式使用。

固定床生物反应器是生产生物分子诸如重组蛋白、单克隆抗体、病毒载体、病毒和细胞囊泡(诸如外泌体)(也称为“目标生物分子”)的有效工具。动物细胞被用于生产这类产品(使用组成型表达系统、感染或转染)。一种或多种目标产物可以由细胞释放(诸如分泌的重组蛋白、“分泌型”病毒或裂解性病毒)，或者可以部分保留在细胞内(例如细胞内蛋白、病毒或一些病毒载体)。

细胞外的目标生物分子可以在生物反应器的上清液以及一个或多个再循环/灌注回路中被回收，通过使用一个或多个清空、冲洗和浓缩步骤来回收感兴趣的目标生物分子(在本文中称为目标生物分子)。

细胞内的产物保留在细胞中，并且需要在过程结束时使用化学/酶促溶液来裂解细胞。在裂解细胞后，含有细胞碎片(宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、细胞膜和细胞器)和目标生物分子的溶液通过清空和冲洗生物反应器来收获(就像处理细胞外产物那样)。细胞膜很脆弱，并且裂解细胞的溶液是已知的(低渗-高渗冲击、酸性-碱性pH变化、洗涤剂或这些的组合)。然而，大多数目标生物分子很容易被破坏。因此，需要一种既能裂解细胞又不会破坏目标生物分子的解决方案。

一些现有技术的工艺是(用胰蛋白酶或细胞脱离酶)使细胞脱离，然后在生物反应器外裂解细胞，因为在生物反应器内部进行裂解效率不高。此外，众所周知，使用传统方法从固定床生物反应器中的细胞中回收细胞内目标生物分子是困难的。因此需要有效的工艺来从固定床生物反应器中回收细胞内生物分子。

在这些细胞内产物中，一些目标生物分子难以收获，因为它们对pH、剪切力和洗涤剂敏感。此外，许多目标生物分子已知粘附或者附着在塑料材料上，诸如T型培养瓶、细胞工厂和储存容器。而且，一些目标生物分子，包括腺相关病毒且为血清型2(本文统称为AAV)，可以附着在塑料生物反应器材料和塑料固定床材料上，特别是亲水化塑料固定床和亲水化塑料结构化固定床材料。因此，需要一种解决方案，其通过减少目标生物分子与一个或多个塑料部件(包括但不限于生物反应器和固定床)的相互作用，来有助于从固定床生物反应器中回收目标生物分子。此外，据信一些目标生物分子，特别是细胞内目标生物分子(包括但不限于AAV)，在裂解步骤之后，仍可以机械性地被捕获在固定床和细胞碎片(包括细胞器诸如细胞核)中或附着在固定床和细胞碎片(包括细胞器诸如细胞核)上，使得目标生物分子的回收变得困难。因此，需要一种解决方案，其通过减少目标生物分子与固定床和细胞碎片的相互作用，来有助于从固定床生物反应器中回收目标生物分子。在本领域中已知，向AAV悬浮细胞培养收获物中添加表面活性剂(诸如Pluronic F68，通常为0.1-0.01％)，以防止“丢失”余留在生物反应器、管道或储存容器壁上的病毒。

发明人发现，当他们尝试使用本领域已知的用于悬浮细胞技术的溶液和工艺，在生物反应器中进行裂解步骤后，从具有结构化固定床的生物反应器中的细胞中回收AAV时，很大比例的AAV无法回收，因为其被捕获在固定床中或附着在固定床上，或者附着在被捕获在固定床中或附着在固定床上的细胞碎片(诸如细胞宿主细胞蛋白/DNA)上。

本发明人还发现，当结构化固定床材料包括亲水化PET时，大部分未回收的目标生物分子(例如AAV)与细胞碎片、吸附的蛋白质、吸附的DNA以及细胞外细胞基质相互作用/聚集，和/或被捕获在这些物质中，而这些物质在细胞经化学(洗涤剂)裂解后仍余留在固定床材料上。

一次性固定床生物反应器(实例包括Pall的iCELLis、Univercells Technologies的scale-X和Corning的Ascent)由塑料材料制成，生物分子(例如AAV)可能会粘附在这种材料上。由于它们具有供细胞的大量亲水化表面，AAV或其他目标生物分子的“粘附性”是个重要问题，这使得回收目标生物分子比从悬浮细胞生物反应器中回收更加复杂。

本发明人用含有0.1％和1％的曲拉通(Triton)以及DNase(benzonase)的经典溶液对scale-X生物反应器进行了测试，并且观察到在收获(通过荧光显微术并在原位收获后经冻/融循环再进行异位收获)后仍有一些病毒余留。

从对scale-X生物反应器中收获的AAV2所做测试中得到的信息示出：

·基于洗涤剂的“经典溶液”(0.1％和1％的曲拉通X-100)有时不足以实现良好的回收率(在原位裂解和冲洗后仍有病毒余留，通过荧光显微术以及异位裂解后进行的异位收获得以证实)。

·“经典溶液”足以裂解细胞(证据：溶液的浊度)，但不足以回收病毒。

·添加benzonase(DNase)来降解DNA以限制病毒的粘附性，有时也是不够的。

关于裂解溶液，已知曲拉通X-100和吐温(吐温20和吐温80)洗涤剂在裂解细胞以及从悬浮细胞中回收AAV方面是有效的(浓度为0.1％至0.5％)。可以添加DNase(诸如benzonase)来切割游离的DNA，并防止AAV粘附在DNA上。然而，正如上文所述，目标生物分子的回收仍然存在问题。

本发明人意外地发现，将化学裂解步骤(使用裂解溶液)与机械作用相结合有助于从生物反应器中回收目标生物分子。在一种实施方式中，本发明包括新型的溶液组合，以提高目标生物分子的产率，优选提高从细胞培养物或细胞收获溶液中的细胞中细胞内生物分子的产率。

因此，在第一方面，本发明涉及一种从固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的方法，所述方法包括：

尽管本公开内容主要是在从细胞中回收AAV的背景下呈现的，但本文所描述的本发明不应仅限于AAV的回收，而是该发明可用于从贴壁细胞或悬浮细胞中回收其他目标生物分子，其中此类目标生物分子可包括以下中的一种或多种：病毒、非裂解性病毒、具有有限致细胞病变效应的病毒、非分泌型或部分分泌型重组蛋白、非分泌型或部分分泌型抗体、细胞内或部分细胞内的病毒载体。细胞可以选自由以下组成的组：贴壁细胞、悬浮细胞以及贴壁细胞和悬浮细胞的组合。可以使用所有类型的细胞，实例包括哺乳动物细胞，诸如干细胞(例如造血干细胞、骨骼肌干细胞、间充质干细胞)、免疫细胞(例如淋巴细胞、树突状细胞)和胰岛细胞。原核细胞(诸如细菌细胞)或病毒细胞也可以使用。

在实施方式中，所述目标生物分子是AAV。因此，在实施方式中，本发明涉及一种从在固定床生物反应器中培养的细胞中获得AAV的方法，所述方法包括：

-向所述生物反应器中添加裂解溶液，从而裂解所述生物反应器中的细胞，并且在裂解所述细胞之前、同时和/或之后，对所述生物反应器施加一种或多种机械作用，在其之后从所述生物反应器中回收AAV分子。

在一种实施方式中，本发明包括以下步骤中的一个或多个步骤，以从生物反应器中，优选从固定床生物反应器中，回收目标生物分子，优选AAV病毒。

如上文所述，生物分子会吸附到塑料容器壁上。在实施方式中，因此本发明的方法包括使用表面活性剂来限制生物分子诸如AAV吸附到塑料容器壁上。在实施方式中，使用0.1％的表面活性剂(比通常的工艺更多)。在实施方式中，使用0.1％至0.01％的PluronicF68。在实施方式中，本发明的方法进一步包括使用表面活性剂来限制生物分子诸如AAV吸附到塑料容器壁上(如同悬浮工艺那样，例如0.1％至0.01％的Pluronic F68)。Pluronic^TMF-68是一种非离子型表面活性剂，通常用于控制剪切力、防止搅动培养物中产生泡沫以及减少细胞附接在亲水性表面上。还知道添加它可以防止生物分子诸如AAV在储存期间粘附到移液管和塑料容器的塑料上。对于AAV，通常建议的使用浓度在0.01％至0.2％之间。

在实施方式中，本发明的方法进一步包括进行若干个循环并若干次冲洗，以从生物反应器中，优选从固定床生物反应器中，回收目标生物分子，优选AAV病毒。

在实施方式中，在向生物反应器中添加裂解溶液之前，先将生物反应器排空。在其他实施方式中，在排空生物反应器前30分钟至1小时之间，向培养上清液中添加0.1％的Pluronic^TMF-68(v/v)。在一些培养基中已经存在0.1％(v/v)的Pluronic^TMF-68。即使培养基中已有Pluronic^TMF-68，添加Pluronic^TMF-68直至达到0.2％(v/v)可以是有用的。因此，在实施方式中，添加Pluronic^TMF-68直至在培养上清液中达到0.2％(v/v)的浓度。

在实施方式中，在向生物反应器中添加裂解溶液之前，先将生物反应器排空并冲洗。使用这种中性冲洗溶液来消除残留的培养基(可能会干扰裂解步骤的成分)，并继续收集生物分子(诸如rAAV2)细胞外部分。在实施方式中，一旦生物反应器清空，就用冲洗溶液将其完全填充，然后再清空，从而进行第一冲洗步骤。本发明人观察到，对生物反应器进行填充/清空对生物分子诸如rAAV的收获有积极影响。因此，在实施方式中，进行多于一个冲洗步骤。

在实施方式中，在所述冲洗步骤过程中使用冲洗缓冲液或冲洗溶液制剂。

在其他实施方式中，所述冲洗缓冲液包括表面活性剂，诸如Pluronic。在其他实施方式中，所述冲洗缓冲液包括0.1％(v/v)的Pluronic。在实施方式中，所述冲洗缓冲液包括PBS-MK缓冲液(PBS-镁钾缓冲液)和Pluronic^TMF-68。在实施方式中，所述冲洗缓冲液包括PBS、2.5mM KCl、1mM MgCl₂、0.1％(v/v)Pluronic，pH为7。

细胞裂解形成本发明方法的核心步骤，因为这对于释放细胞内目标生物分子是必要的(例如，大多数rAAV2是细胞内的)。细胞与裂解溶液之间的接触时间，以及进行裂解的温度，都会影响裂解的效率。

在实施方式中，裂解步骤包括向生物反应器中添加裂解溶液，并使细胞与裂解溶液接触一段足够长的时间，以裂解细胞的至少一部分。在实施方式中，裂解溶液与细胞接触30分钟至6小时。在实施方式中，裂解溶液与细胞接触1至2小时。在实施方式中，本发明的方法包括使细胞与裂解溶液有足够的接触时间，以从生物反应器中，优选从固定床生物反应器中，回收目标生物分子，优选AAV病毒。在这段接触时间期间，应该对生物反应器施加一种或多种机械作用。例如，可以对生物反应器进行搅拌。

在优选的实施方式中，裂解步骤在37℃下进行2小时(可能取决于工艺)，同时保持0.5-1cm/s的搅拌(使液位(liquid level)相对于固定床结构以0.5至1cm/s的速度移动)。可以定期开启/关闭搅动以扰乱流动。也可以进行来回循环(清空/填充步骤)，因为对固定床的洗出效果有助于回收目标生物分子，诸如病毒。替代地，裂解步骤可以进行两次，每次持续一(或两)小时。根据科学文献，裂解步骤可能需要30min至若干个小时(最长达6小时)(例如4小时)，并对原始裂解物进行定期取样(例如在1、2、3、4小时后)。然后可以对这些样品进行分析以量化病毒滴度。在这些裂解溶液中，病毒应该能在若干个小时内保持稳定。

在实施方式中，裂解溶液包括洗涤剂试剂。用于裂解细胞的洗涤剂试剂在本领域是已知的，并且可以基于所使用的细胞系、目标生物分子和生物反应器的类型来选择特定的洗涤剂。在实施方式中，所述裂解溶液包括至少一种洗涤剂，诸如曲拉通X-100、吐温20或吐温80。

使用吐温20或曲拉通X-100是因为洗涤剂破坏细胞膜。洗涤剂的使用与浓度和时间有关，据报道曲拉通X-100的浓度在0.1％至0.5％之间，吐温20的浓度在0.1％至1％(v/v)之间。两性离子洗涤剂(Zwittergent)3-14(Calbiochem)似乎也很有前景。由于欧洲REACH规定倾向于禁止使用曲拉通及其衍生物，因此使用吐温20或两性离子洗涤剂是有利的。已知曲拉通比吐温更有效。建议使用较高浓度的吐温(为使病毒充分释放所需的曲拉通或两性离子洗涤剂的浓度比吐温20更低。这与洗涤剂的固有属性——临界胶束浓度有关)。

在实施方式中，裂解溶液可以包括选自由以下组成的组中的洗涤剂试剂或表面活性剂：曲拉通X-100、吐温-20、吐温-80、两性离子洗涤剂及其组合的。在实施方式中，裂解溶液中洗涤剂试剂的浓度为0.05％至1.5％v/v。在优选的实施方式中，裂解溶液中洗涤剂的浓度在0.1％至1.0％v/v之间。

在一种实施方式中，细胞系包括HEK293T细胞。在实施方式中，生物反应器是结构化固定床生物反应器，并且在其他实施方式中，目标生物分子是细胞内的。在实施方式中，目标生物分子可以包括细胞内蛋白、病毒或病毒载体。在优选的实施方式中，目标生物分子是AAV。

在实施方式中，所述裂解溶液进一步包括DNase和/或表面活性剂。在实施方式中，本发明的方法包括使用DNase来降解游离的DNA，并防止生物分子诸如AAV粘附到吸附在固定床纤维上的DNA上。在其他实施方式中，DNase可用于悬浮培养工艺，其中例如可以在经典的磷酸盐缓冲液中，在37℃下，在1-2mM MgCl₂中，使用10-50单位的Benzonase/ml处理1小时。

在实施方式中，在裂解步骤期间进行核酸酶处理。添加DNase是为了：

1.在提取生物分子诸如rAAV的过程中，消化宿主细胞的细胞核物质。

2.避免形成细胞核物质与生物分子诸如AAV的复合物。

3.降低裂解物的粘度，以促进后续的过滤和色谱步骤。

为了限制由基因组DNA诱导的复合物和粘度，优选在细胞破裂的同时添加酶。然而，这一步骤可能与酶活性的最佳条件(pH和盐度，诸如NaCl)不兼容。在实施方式中，使用Benzonase(Millipore Sigma)作为DNase。pH8不改变benzonase的酶活性，因为它在pH7-9之间具有活性。然而，盐浓度过高(1M NaCl；需要将其降低至100-150mM以保持有效活性)。在实施方式中，可以使用盐激活核酸酶(SAN-HQ；ArcticZymes)。报道了它在500mM NaCl下的活性。

在实施方式中，在裂解步骤过程中添加20-50U/mL的Benzonase，且最少温育时间为30-60min。此外，可能有必要添加1-2mM MgCl₂以维持酶的活性。请注意，也可以使用更高浓度的Benzonase。

如上文所述，在实施方式中，裂解步骤可进一步包括向裂解溶液中添加酶试剂。在实施方式中，酶试剂选自由盐激活核酸酶内切核酸酶和DNase组成的组。在另一种实施方式中，该酶是一种DNase酶，更可能是DNase，也许更具体地说是Benzonase。因此，裂解溶液进一步包括酶试剂。据信添加酶试剂可水解和切割游离的DNA，并减少细胞裂解过程中由DNA含量引起的团聚或粘度。DNase还可有助于防止目标生物分子粘附到DNA上。该酶或DNase可与洗涤剂试剂同时添加到裂解溶液中，或者在添加洗涤剂试剂之后添加。在实施方式中，DNase与洗涤剂试剂同时添加到裂解溶液中。在实施方式中，在添加洗涤剂试剂(裂解剂)之后添加。在实施方式中，调节pH和电导率以优化酶的活性。在实施方式中，裂解溶液的pH在7至9之间，溶液的电导率在50至150mM之间。在实施方式中，包括DNase(也许是Benzonase)的裂解溶液温育20至90分钟。包括DNase的裂解溶液可温育30-60分钟。

在实施方式中，本发明的方法进一步包括使用DNase降解游离的DNA，并防止AAV粘附到吸附在固定床纤维上的DNA上(如同悬浮培养工艺那样，例如，在经典的磷酸盐缓冲液中，10-50U Benzo/ml，37℃，1小时，1-2mM MgCl₂)，以从生物反应器中，优选从固定床生物反应器中，回收目标生物分子，优选回收AAV病毒。

在实施方式中，裂解步骤可包括向生物反应器中添加DNase试剂，并使细胞与DNase试剂接触一段足够长的时间，以水解细胞的至少一部分。

在实施方式中，包括DNase诸如Benzonase的裂解溶液进一步包括盐，以调节裂解溶液的电导率。优选地，裂解溶液的电导率对该酶来说是最佳的。在实施方式中，该盐选自由NaCl、MgCl₂及其组合组成的组。在实施方式中，包括benzonase的裂解溶液进一步包括浓度小于150mM、优选在100至150mM之间的Mg阳离子。在实施方式中，包括洗涤剂、酶以及100至150mM之间的盐，优选Mg阳离子或NaCl且具有的pH在7至9之间的裂解溶液，温育30分钟至2小时。

在优选的实施方式中，裂解溶液包括DNase、洗涤剂或表面活性剂，或上述任一的任意组合，且处于适当pH和电导率下。

在实施方式中，目标生物分子细胞培养收获物可包括最多达三个裂解步骤，如图3所示。在实施方式中，目标生物分子的细胞培养收获物可包括单独的添加酶(Benzo)的步骤，如图3进一步所示。

在实施方式中，本发明的方法进一步包括使用高电导率溶液(0.5至1M的NaCl)来限制生物分子诸如AAV与保留在纤维上的吸附生物材料之间的相互作用。当目标生物分子是AAV时，使用高电导率溶液特别有用。

在实施方式中，该方法进一步包括在裂解步骤和/或洗涤步骤过程中使用包括0.5至1M NaCl的溶液。在其他实施方式中，所述溶液是通过在裂解步骤期间增加裂解溶液的离子强度而获得的。

添加NaCl是因为必须保持足够的离子强度，以避免rAAV2聚集以及与裂解过程中释放的其他细胞成分结合。在实施方式中，在裂解步骤期间使用高盐浓度。我们认为这还可以减少生物分子诸如rAAV2与可能仍吸附在生物反应器表面上的细胞或细胞碎片之间的表面相互作用。

在实施方式中，本发明的方法进一步包括使用高电导率溶液(0.5至1.0M的NaCl)来限制目标生物分子诸如AAV与保留在纤维上的吸附生物材料之间的相互作用。

在实施方式中，本发明涉及包括2.0M NaCl的裂解溶液。在实施方式中，本发明涉及包括0.5至1.0M NaCl的裂解溶液。在实施方式中，本发明涉及包括0.5M NaCl的裂解溶液。在实施方式中，本发明涉及包括0.6MNaCl的裂解溶液。在实施方式中，本发明涉及包括0.7M NaCl的裂解溶液。在实施方式中，本发明涉及包括0.8M NaCl的裂解溶液。在实施方式中，本发明涉及包括0.9M NaCl的裂解溶液。在实施方式中，本发明涉及包括1.0M NaCl的裂解溶液。

在实施方式中，本发明涉及生物反应器，其包括固定床和包括0.5至1.0M NaCl之间的裂解溶液。

本公开提供了用于提高从细胞培养收获物中回收的目标生物分子产率的工艺和化学。更具体地说，本公开提供了从包括固定床和细胞培养液的生物反应器中的细胞培养收获物中回收目标生物分子的工艺，所述工艺包括在第一步骤中裂解生物反应器中的细胞(图1中的步骤2和图3中的步骤3)，并在第二步骤中增加细胞培养液的电导率。增加细胞培养液的电导率可能有助于中和目标生物分子的电荷。

在实施方式中，在用裂解溶液温育后，在第二步骤中通过向裂解溶液中添加额外的盐来增加裂解溶液的电导率。提高裂解溶液的电导率有助于增加在裂解步骤过程中与细胞碎片聚集的目标生物分子的溶解度，并且可以进一步降低裂解溶液的粘度。增加目标生物分子的溶解度会提高裂解溶液中可用于回收的游离目标生物分子的浓度。在实施方式中，在裂解步骤的第二步骤中，裂解溶液的电导率增加到大于150mM。在实施方式中，在用裂解溶液温育后，向裂解溶液中添加NaCl。在实施方式中，在用裂解溶液温育后，将NaCl浓度调节至最高达1.0M。在实施方式中，在用裂解溶液温育后，将NaCl浓度调节至最高达2.0M。在存在多个裂解步骤的实施方式中，在用最终的裂解溶液温育后增加裂解溶液的电导率。在实施方式中，从高电导率的裂解溶液中回收目标生物分子。在实施方式中，在排空步骤中从高电导率的裂解溶液中回收目标生物分子(见图2中的步骤#3)。在实施方式中，在再循环回路中从高电导率的裂解溶液中回收目标生物分子。在实施方式中，其中存在多于一个裂解步骤，在一个或多个排空步骤中从裂解溶液中回收目标生物分子。另一种可能性是在裂解后紧接着进行使用酶/内切核酸酶/DNase/Benzonase的单独额外步骤，以限制细胞裂解和内切核酸酶活性之间的干扰。由于裂解步骤将在高离子强度下进行，因此使用内切核酸酶的这个额外步骤应该使用盐激活核酸酶(SAN)来完成。盐激活核酸酶是一种通用的、非特异性的内切核酸酶，其可切割双链和单链的DNA以及RNA。SAN在高于中性的pH下具有活性。然而，与其他核酸酶不同的是，它在高pH和高盐浓度下具有最佳活性。这些特性使得SAN非常适合从细胞提取物和蛋白质样品中去除DNA。

在实施方式中，裂解步骤可以在不同的步骤中实施。在实施方式中，洗涤剂和酶的添加可以在单独的步骤中进行。在实施方式中，在每个步骤之间排空生物反应器，并在每个排空步骤过程中回收目标生物分子。在实施方式中，洗涤剂、酶和高电导率溶液在单独的步骤中实施。在实施方式中，在每个步骤之间排空生物反应器，并在每个排空步骤过程中回收目标生物分子。在实施方式中，在一个步骤中添加洗涤剂和酶，在单独的步骤中添加高电导率溶液。在实施方式中，在每个步骤之间排空生物反应器，并在每个排空步骤过程中回收目标生物分子。

在实施方式中，在裂解步骤期间对生物反应器进行搅拌。下文描述了用于搅拌生物反应器的系统和工艺。在实施方式中，任何一个或多个裂解步骤都可以以再循环模式实施。在实施方式中，目标生物分子的回收可以在任何步骤过程中进行，和/或从本文上述或下述的任何一种或多种溶液中进行，包括在某个步骤以再循环模式运行的情况。在一种或多种实施方式中，目标生物分子的回收包括对目标生物分子的收集。在实施方式中，在裂解步骤之前从细胞培养收获物上清液中回收并收集目标生物分子(图2中的步骤#1)。在实施方式中，排空生物反应器，并在裂解步骤之前从细胞培养收获物上清液中回收并收集目标生物分子(图2中的步骤#1)。在实施方式中，在排空细胞培养收获物上清液之前或之后且在裂解步骤之前，向细胞培养收获物中添加表面活性剂，优选泊洛沙姆188(也称为Pluronic)(图3中的步骤1)。表面活性剂，优选泊洛沙姆188(也称为Pluronic F68)用于减少或控制泡沫和/或团聚，和/或控制剪切力，和/或减少细胞在细胞培养收获物中，特别是在上清液中对亲水性表面的附接。在实施方式中，在裂解步骤之前，向细胞培养收获物上清液中添加表面活性剂，优选泊洛沙姆188，进行15至45分钟之间，并且在裂解前在细胞培养收获物上清液中泊洛沙姆188的浓度在0.05％w/v至5.0％w/v之间。在实施方式中，将包括泊洛沙姆的细胞培养收获物上清液从生物反应器中排空，并在添加泊洛沙姆之后且在裂解步骤之前从细胞培养收获物上清液中回收并收集目标生物分子(图2中的步骤#1和图3中的步骤1)。在实施方式中，在从生物反应器中排空细胞培养收获物上清液之后，进行冲洗步骤，所述冲洗步骤包括向生物反应器中添加冲洗溶液(见图2中的步骤2和图3中的步骤2)。冲洗溶液可以消除可能干扰裂解步骤的残留培养基。在实施方式中，冲洗溶液包括缓冲液。在实施方式中，缓冲液包括PBS。在实施方式中，洗涤溶液的pH在6至8之间。优选地，冲洗溶液的pH为7。在实施方式中，洗涤溶液进一步包括表面活性剂。在实施方式中，表面活性剂是泊洛沙姆。在实施方式中，将冲洗溶液从生物反应器中排空。在实施方式中，冲洗步骤重复2至4次。优选地，冲洗步骤重复两次。

在实施方式中，冲洗溶液包括：

·PBS

·2.5mM KCl

·1mM MgCl₂

·0.1％(v/v)Pluronic

·pH7

在实施方式中，在每个裂解步骤之后进行洗涤步骤(见图2中的步骤#4和图3中的间歇性冲洗步骤)。洗涤步骤回收在裂解步骤后保留在生物反应器以及生物反应器固定床中的目标生物分子。在实施方式中，洗涤步骤回收保留在固定床(纤维、细胞碎片、细胞外基质)中的一个或多个中并与生物反应器壁或内部组件相互作用的目标生物分子。在实施方式中，向生物反应器中添加洗涤溶液。在实施方式中，洗涤溶液与生物反应器内部和固定床接触一段足够长的时间，以从生物反应器和固定床中将目标生物分子回收到洗涤溶液中。在实施方式中，将冲洗溶液从生物反应器中排空，并从洗涤溶液中回收目标生物分子。在实施方式中，重复洗涤和排空步骤。在实施方式中，洗涤和排空步骤重复2至4次。在实施方式中，洗涤和排空步骤重复两次。

在实施方式中，洗涤溶液包括：

·PBS

·1.0至3.0mM KCl

·0.5至2.5mM MgCl₂

·0.01至0.2％(v/v)Pluronic

·5至15mM Tris-pH8

在另一种实施方式中，洗涤溶液包括：

·PBS

·2.5mM KCl

·1mM MgCl₂

·0.1％(v/v)Pluronic

·10mM Tris-pH8

在实施方式中，在本文上述或下述细胞培养收获步骤中的任何一个或多个步骤过程中，可以使用本文下述的任何技术或工艺对生物反应器进行搅拌。在实施方式中，搅拌增加从生物反应器中回收的目标生物分子的量。

在一种实施方式中，本发明人观察到，pH低于或高于AAV的等电点(根据血清型不同，在5至6之间)时，回收率比中性pH时更好(在pH为3.0和8.0时进行异位收获)。本发明人还表明，高电导率允许具有更好的回收率。

如上文所述，据信AAV会粘附在固定床纤维上吸附的生物材料上。本发明人已经表明，非中性pH(低：3.0-4.0以及高：8.0-9.0)和高电导率溶液(1M NaCl)有助于回收病毒，这表示静电相互作用是AAV附着到固定床纤维上吸附的生物材料上的关键因素。本发明人进行了一些测试来证明这一点，并观察到pH低于或高于AAV的等电点(根据血清型不同，在5至6之间)时，回收率比中性pH时更好(通过在pH为3.0和8.0时进行异位收获测试)。本发明人还表明，高电导率允许具有更好的回收率(通过在0.5和1MNaCl下进行异位收获测试)。这些溶液与从IEX(离子交换色谱法)和CEX(阳离子交换色谱法)中洗脱病毒的溶液非常相似，并且适合保持AAV的稳定性。因此，在一种实施方式中，本发明是将细胞裂解化学溶液(洗涤剂)与通常用于从IEX和CEX色谱系统中洗脱病毒的溶液相结合，以从固定床中回收病毒。

在实施方式中，本发明的方法包括使用低于等电点(pH为3至5)或高于等电点(pH为8至9)的pH。

在实施方式中，本发明的方法包括使用低于或高于目标生物分子等电点的pH。通过使用低于或高于目标生物分子等电点的pH，防止目标生物分子与亲水化固定床材料之间的相互作用。

注意的是，由于病毒在pH为3时不太稳定，因此在裂解后应对溶液进行淬灭和缓冲。

因此，在其他实施方式中，在裂解步骤之后，对溶液进行淬灭和缓冲。在实施方式中，在裂解步骤之后添加灭活溶液，以淬灭或抑制裂解溶液，从而提高收获后生物分子的稳定性。

高离子强度(NaCl>150mM)对于避免病毒载体聚集很重要，但这些一价盐的浓度大大降低Benzonase的活性(例如，在150mM NaCl下，相对活性损失+/-70％)。为了确保有效收获，可以使用以下折衷方案：

在实施方式中，首先，在不添加NaCl的情况下开始裂解步骤(N.B.:PBS缓冲液提供137mM)，以保持Benzonase的有效活性(生产商手册)。由于Mg²⁺是Benzonase的辅因子，其浓度必须准确。因此，在实施方式中，添加2mM MgCl₂，该浓度对酶活性而言是最佳的。在这些盐度条件下，Benzonase保留有效活性，并且载体的聚集应该会受到限制。在接下来的步骤中，温育1(或2)小时后，可以通过将NaCl浓度调节至最高达1M来增加裂解缓冲液的离子强度。在这些条件下，Benzonase被抑制，但病毒载体聚集的风险降低，和/或病毒颗粒的聚集体溶解(如果这个过程是可逆的)。在这样的盐度下，病毒与塑料材料的相互作用应该会减少。

在另一种实施方式中，在裂解后紧接着进行使用内切核酸酶/Benzonase的单独额外步骤，以限制细胞裂解和内切核酸酶活性之间的干扰。由于裂解步骤将在高离子强度下进行，因此使用内切核酸酶的这个额外步骤应该使用盐激活核酸酶来完成。

在实施方式中，裂解缓冲液的配方如下：

-1％(v/v)吐温20或曲拉通X-100

-1M NaCl

-10mM Tris-pH8

-0.1％ Pluronic(v/v)

-20-50U/mL内切核酸酶(Dnase)和1-2mM MgCl₂

使用10mM Tris-pH8的缓冲液，是因为观察到碱性溶液加上适量的洗涤剂诸如曲拉通X-100或吐温20，足以裂解包裹有生物分子的细胞(例如包裹有rAAV的细胞)，并从所述细胞中释放所述生物分子(例如病毒颗粒)。根据不同的工艺，化学细胞裂解方案所报道的pH通常在8-9之间。酸性pH(3-4)对于收获生物分子(例如病毒颗粒)似乎也很有前景，但它可能会对(病毒)蛋白质的完整性产生影响。

0.1％ Pluronic(v/v)的作用与其在冲洗溶液中的作用类似。Pluronic^TMF-68是一种非离子型表面活性剂，通常用于控制剪切力、防止搅动培养物中产生泡沫以及减少细胞附接在亲水性表面上。还知道添加它可以防止AAV在储存期间粘附到移液管和塑料容器的塑料上。

在一种实施方式中，本发明包括一种通过洗涤剂、Pluronic(防止AAV吸附)、高电导率、pH和benzonase(切割宿主细胞DNA)的组合来回收目标生物分子(优选AAV，更优选细胞内的AAV)的方法。

如上文所述，在优选的实施方式中，在所述细胞的所述裂解之后，通过用洗涤溶液填充和/或排空生物反应器来进行一个或多个洗涤步骤。

进行洗涤步骤是为了去除堵塞于固定床(纤维、细胞碎片、细胞外基质)中和/或与生物反应器壁相互作用的生物分子，诸如rAAV2。一旦生物反应器是空的，就用洗涤溶液将其充满，然后再清空，从而进行一次洗涤步骤。如前所述，对生物反应器进行填充/清空对生物分子诸如rAAV的收获有积极影响。因此，在优选的实施方式中，洗涤步骤进行多于一次，例如两次。在实施方式中，在细胞裂解2小时后进行洗涤步骤。

在实施方式中，洗涤溶液的配方如下：

-PBS

-2.5mM KCl

-1mM MgCl₂

-0.1％(v/v)Pluronic

-10mM Tris-pH8

在优选的实施方式中，与冲洗溶液相比，洗涤溶液的pH更偏碱性。

当生长在表面上的细胞被裂解时，应施加机械作用或动作，以回收可能仍粘附在表面上的细胞碎片和目标产物。在某些情况下，只轻微搅拌即是足够的。有时，仅液体的移动就足以回收目标产物。但有时则需要更强的机械作用。从固定床生物反应器中回收生物分子诸如AAV比从悬浮细胞中回收更为复杂，因为所述生物分子诸如AAV可能会粘附到生物反应器的表面(可供细胞生长的表面)。

因此，本文上述的发明包括用于从固定床和/或生物反应器中回收和/或提高细胞(贴壁或悬浮细胞)的回收率的机械作用。本发明人对从固定床生物反应器中收获AAV2进行了测试，表明AAV不会粘附在“新鲜的”亲水化PET/PP材料(未被定植的固定床纤维)上，这表示AAV不粘附在固定床材料(PET/PP)本身，而是被细胞碎片或其他生物分子(例如细胞膜、DNA、蛋白质等)捕获而余留，这些物质在化学(洗涤剂)裂解后仍会堵塞于固定床结构内部。

在静止、轻微搅拌和强烈机械作用(涡旋)下进行的(异位)AAV收获测试表示，机械作用对AAV的收获产率起作用。

本发明涉及一种从在固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的方法，所述方法包括：

本发明包括一种从包括固定床的生物反应器中的细胞培养收获物中回收目标生物分子的收获工艺，其中所述工艺包括对生物反应器、固定床或其组合施加机械作用，持续一段足够长的时间，以提高目标生物分子的回收率。

在实施方式中，所述机械作用可以选自移动固定床生物反应器或移动所述固定床生物反应器中的溶液，从而使液位相对于固定床结构移动。所述液位可以以一定的速度移动，从而表示在一定时间范围内液位相对于固定床结构移动的距离(例如以cm/s表示)。

在其他实施方式中，移动生物反应器包括选自由以下组成的组的动作：振动、搅拌、压实、膨胀、摇晃、施加超声波以及前述的组合。

在实施方式中，移动固定床生物反应器包括移动所述生物反应器内的固定床。在其他实施方式中，移动固定床包括选自由以下组成的组的动作：振动、搅拌、压实、膨胀以及前述的组合。

在其他实施方式中，移动溶液包括选自由以下组成的组的动作：振动、搅拌、压实、膨胀、摇晃、施加超声波、至少部分排空生物反应器中的液体、向生物反应器中添加液体以及前述的组合。所述溶液可以是任何类型的合适溶液，诸如裂解溶液、洗涤溶液或灭活溶液。溶液(例如裂解溶液)可以通过使用生物反应器内的内部循环(诸如通过搅拌器)或通过使用外部再循环(循环或灌注)在内部移动。在其他实施方式中，所述溶液可以通过叶轮在生物反应器内利用内部循环在内部移动。

在优选的实施方式中，所述方法包括搅拌生物反应器并移动所述固定床生物反应器中的溶液，从而使液位相对于固定床结构移动。在其他优选实施方式中，搅拌和移动步骤同时进行。通过在搅拌生物反应器(例如通过振动)的同时使液位相对于固定床结构移动，搅拌的能量可以传递到固定床结构的气液界面(ALI)。移动步骤可以包括至少部分排空生物反应器中的液体，诸如通过将液位从固定床结构的顶部附近移动到固定床的底部附近。移动步骤可以包括向生物反应器中添加液体，诸如例如通过向生物反应器中添加细胞裂解溶液。移动步骤可以包括相对于生物反应器移动固定床，以移动液位的位置。在移动步骤之前，液位可以定位于固定床结构的上方，这可能涉及多次(但也可能仅一次)升高和降低液位(诸如，例如从固定床结构的顶部到固定床结构的底部)。搅拌步骤可以包括使生物反应器振动。

该方法可以包括在使生物反应器振动的同时调节固定床生物反应器中液位的位置。调节步骤可以包括用液体填充和冲刷生物反应器，包括重复用液体填充和冲刷生物反应器。

更进一步地，该方法可以包括倾斜生物反应器和/或压实生物反应器中的固定床。调节步骤可以包括相对于生物反应器移动固定床。

该方法可以包括使生物反应器振动、倾斜并排空生物反应器。振动、倾斜和排空步骤可以同时进行。

在优选的实施方式中，生物分子是细胞内生物分子。在更优选的实施方式中，目标生物分子是细胞内蛋白质、病毒或病毒载体。这种机械作用可以持续地或间歇地施加，并且可以在一个或多个目标生物分子收获步骤期间施加；持续一段足够长的时间，以提高目标生物分子的回收率。在实施方式中，机械作用是振动。在另一种实施方式中，机械作用是旋转。在又一其他实施方式中，机械作用是不同作用的组合。

在一种实施方式中，在细胞培养之后施加机械作用。在另一种实施方式中，在细胞收获过程期间施加机械作用。在一种实施方式中，细胞培养收获物包括动物细胞。在其他实施方式中，细胞培养收获物包括HEK293T细胞。在另一种实施方式中，在目标生物分子收获过程的一个或多个目标生物分子收获步骤期间施加机械作用。在另一种实施方式中，在一个或多个目标生物分子收获步骤期间施加机械作用，所述收获步骤包括以下中的一个或多个：在从生物反应器中排空培养基之前、在从生物反应器中排空培养基时、在从生物反应器中排空培养基之后、在添加冲洗溶液期间、在冲洗步骤期间、在排空冲洗溶液期间、在添加裂解溶液之前、在添加裂解溶液期间、在裂解步骤期间、在排空裂解溶液期间、在排空裂解溶液之后、在添加洗涤溶液之前、在添加洗涤溶液期间、在洗涤步骤期间、在排空洗涤溶液期间以及在排空洗涤溶液之后。

在一种实施方式中，在目标生物分子(包括细胞囊泡)收获过程中的任何一个或多个步骤期间施加的机械作用，其包括了本文上述和下述列出的步骤，可以包括本领域技术人员已知的用于对生物反应器、固定床或其组合施加机械作用的任何一个或多个工艺或装置。在一种实施方式中，在目标生物分子收获过程中的任何一个或多个步骤期间施加的机械作用，其包括了本文上述和下述列出的步骤，可以包括PCT出版WO2022/254039中公开的任何一个或多个工艺或装置，其标题为“具有增强细胞收获能力的生物反应器系统及相关方法(Bioreactor System with Enhanced CellHarvesting Capabilities and RelatedMethods)”,其内容以引用的方式以其整体并入本文。在可能的情况下，本文的描述使用与上述PCT申请及其附图中的等效元件相对应的附图标记。

在优选的实施方式中，机械作用及其应用包括使生物反应器振动，其中该生物反应器包括固定床材料，细胞附着于该固定床材料上或被捕获于其中，并且其中这些细胞包括目标生物分子。在一种实施方式中，使用PCT出版WO2022/254039(其标题为“具有增强细胞收获能力的生物反应器系统及相关方法(Bioreactor System with Enhanced CellHarvesting Capabilities and Related Methods)”，该出版的内容以引用的方式以其整体并入本文)的图2和图2A中所示并描述的系统的修改版本，对包括目标生物分子的生物反应器施加机械作用。此外，如本文上述和下述所描述的用于提供机械作用的系统并不限于目标生物分子的回收，还可以很容易地适用于细胞收集，以及用于实现从小规模到大规模贴壁细胞生产的种子培养物的生成，和/或任何需要对容器进行搅拌或因搅拌容器而受益的应用。

在本发明的实施方式中，所述机械作用或动作可以选自搅拌、振动、涡旋或移动生物反应器内部的溶液。在实施方式中，移动溶液包括用溶液填充和/或排空生物反应器。在实施方式中，所述机械作用或动作选自由以下组成的组：振动、搅拌、压实、涡旋、摇晃、施加超声波、用溶液填充和/或排空生物反应器、膨胀以及前述的组合。在优选的实施方式中，可以在搅拌条件下进行收获。在其他实施方式中，所述搅拌以0.5至2cm/s的速度进行。因此，在实施方式中，液位相对于固定床结构的移动以0.5至2cm/s的速度发生。这是指生物反应器内部液体的(竖直)移动速度(例如在生物反应器排空和/或填充期间)。

在实施方式中，本发明的方法包括对生物反应器施加振动。在实施方式中，在裂解步骤和/或随后的冲洗步骤中的一个或多个步骤期间施加所述振动。这样，能够回收仍然被捕获在固定床基质中的生物分子，诸如AAV。

在实施方式中，在本文上述列出的一个或多个过程期间施加所述振动。在实施方式中，在冲洗步骤期间，或在裂解溶液与细胞之间接触时间的期间，或在施加DNase期间，或在施加表面活性剂期间，或在收获细胞期间，或在使用低于或高于等电点的pH时，或在使用高电导率溶液时，施加所述振动。

在优选的实施方式中，使用PCT/EP2022/065264(“具有增强细胞收获能力的生物反应器系统及相关方法(Bioreactor System with Enhanced Cell HarvestingCapabilities and Related Method)”，2022年6月03日，其内容以引用的方式以其整体并入本文)中描述的细胞收获振动台，以从固定床生物反应器中收获生物分子诸如AAV。可以将20至100Hz的振动与填充和/或清空循环相结合使用，以将振动传递到固定床结构的ALI(气液界面)。由于这种振动适用于使用振动和脱离酶(诸如胰蛋白酶)从固定床生物反应器中回收脆弱的活细胞，所以它们也应该适用于敏感产物(诸如AAV)。因为使用洗涤剂来裂解细胞，一个缺点可能是会产生泡沫。因此，在化学裂解之后，在使用不含有高浓度洗涤剂的缓冲液进行冲洗步骤时，振动可能更为合适。

因此，在实施方式中，所述机械作用或动作是施加到所述生物反应器上的振动，其中所述振动的频率为20至100Hz。在优选的实施方式中，在进行所述振动的同时在生物反应器内部移动液体(诸如填充和/或清空循环，以将振动传递到固定床结构)。在实施方式中，通过振动台施加所述振动。

在实施方式中，该方法进一步包括搅拌生物反应器、使液位相对于固定床结构移动，并将细胞裂解溶液引入至生物反应器中。在一种实施方式中，搅拌和移动步骤同时进行。移动步骤可以包括将液位移动到比先前的液位更高或更低的位置。在实施方式中，移动步骤包括至少部分地排空生物反应器中的液体，诸如通过将液位从固定床结构的顶部附近移动到固定床的底部附近。移动步骤可以包括向生物反应器中添加液体，诸如例如通过向生物反应器中添加细胞裂解溶液。移动步骤可以包括使用于细胞截留/附着和生长的结构(固定床)相对于生物反应器移动，以移动液位的位置。在移动步骤之前，液位可以定位于固定床结构的上方，这可能涉及多次(但也可能仅一次)升高和降低液位(诸如，例如从固定床结构的顶部到固定床结构的底部)。使液位相对于固定床结构移动也可以包括使用搅拌器。在一些实施方式中，搅拌器可以是旋转的、非接触式磁性叶轮、叶片或螺旋搅拌系统，或外部循环系统。在一些实施方式中，搅拌器可以包括圆盘叶片涡轮机、弯曲叶片涡轮机、开式叶片流体翼型轴向叶轮、斜叶涡轮式叶轮或三叶螺旋桨。

搅拌步骤可以包括使生物反应器振动。引入步骤可以包括选自由盐激活核酸酶内切核酸酶和DNase组成的组中的酶试剂。

该方法可以包括在对所述生物反应器施加一种或多种额外的机械作用的同时，调节固定床生物反应器中液位的位置。在优选的实施方式中，所述一种或多种额外的机械作用包括使生物反应器振动。调节步骤可以包括用液体填充和冲刷生物反应器，包括重复用液体填充和冲刷生物反应器。调节固定床生物反应器中液位的位置可以包括在生物反应器内部使用搅拌器，诸如叶轮。

有关从固定床生物反应器中收获和回收生物分子诸如AAV细胞的工艺步骤和条件实例的数据，参见实施例2和相关的图2。

在实施方式中，本发明涉及在再循环模式下从固定床生物反应器中收获生物分子(诸如病毒载体，特别是AAV)。

本文公开的发明包括用于提高从细胞培养物中获得目标生物分子的产率和回收率的工艺、组合物和装置。用于实施此类系统和工艺的该工艺和系统中的任何步骤可以以分批模式、灌注模式、再循环模式或其组合进行运行。在一种实施方式中，本文公开的系统可以包括例如一个或多个液体转移装置，诸如双向泵或可逆泵，或其他装置，以将流体传输至生物反应器和从该生物反应器传输流体。液体转移装置可以使在排空模式期间排空的流体在填充模式期间再循环至生物反应器中，或可以在此类填充模式期间将新鲜流体引入至生物反应器中。液体转移装置还可以仅进行排空、清空或填充循环，并且可以仅使用一个此类循环(例如，一个排空或填充)或多个循环来完成。

在实施方式中，在再循环模式下从固定床生物反应器中获得目标生物分子。在一种实施方式中，本发明包括从具有约0.3至约0.1的V/S比率和约10％至约55％的空隙体积的固定床生物反应器中回收目标生物分子，包括以下步骤(另见图4的示意图概述)，并将步骤中的一个或多个步骤重复1至10次，优选1至5次。

-添加0.1％的Pluronic(30min)

-2次冲洗,PBS-MK(5min-37℃)

-细胞裂解#1，曲拉通/benzonase(2h-37℃)

-增加电导率(最终浓度1M NaCl-30min)

-细胞裂解#2和#3，曲拉通/盐(30min-37℃)

-洗涤，PBS-MK(5min)

在一种实施方式中，本发明包括一种从固定床生物反应器中收获细胞内目标生物分子优选AAV的方法，当生物反应器在再循环模式下运行时，所述方法包括本文上述的一个或多个步骤。在一种实施方式中，再循环模式包括再循环回路。这种“人工”增加了生物反应器的体积，允许在不增加杂质浓度的情况下，每个表面(进而每个细胞和病毒)接触到相似量的酶和裂解缓冲液。再循环模式可以在整个收获过程中使用，也可以间歇使用，或者仅在一个或多个步骤期间使用。

在收获期间以再循环模式运行生物反应器还允许执行来回循环(在收获期间进行，见图5)，以产生机械作用，从而可以提高和或增加从生物反应器中回收的目标生物分子，优选AAV病毒的产率。再循环回路可以包括取样部分，用于在再循环回路运行期间取样。再循环回路也可以或替代地用于清空或排空生物反应器，包括在来回循环期间(开启/关闭搅拌循环与固定床排空/填充相结合)。在另一种实施方式中，再循环回路包括用于培养基交换操作的装置。

·进行具有若干次冲洗的若干个循环。

·具有足够的接触时间。

·使用DNase降解游离的DNA，并防止AAV粘附到吸附在固定床纤维上的DNA上。

·使用表面活性剂来限制AAV在塑料容器壁上的吸附过程。

·在搅拌下进行收获。

·对生物反应器施加振动。

·在一个或多个裂解步骤期间和/或后续的冲洗步骤期间，对生物反应器施加振动。

·在本文上述列出的一个或多个工艺期间，对生物反应器施加振动。

·以再循环模式，优选使用再循环回路，运行上述一个或多个步骤。

在实施方式中，以下步骤中的一个或多个步骤以再循环模式运行，优选使用再循环回路：冲洗步骤、裂解溶液与细胞之间的接触时间、施加DNase或施加表面活性剂、细胞收获或者在使用低于或高于等电点的pH时、使用高电导率溶液时，或者在使用电泳从固定床生物反应器中提取一种或多种带电生物分子时。

对于本发明的优选实施方式的示意图，请参见图2。在该方法的实施方式中，使用电泳从固定床生物反应器中提取一种或多种带电生物分子。在实施方式中，使用基于电泳的替代溶液来提取生物颗粒。

在一种实施方式中，本发明包括使用电泳从固定床生物反应器中，优选从固定床中提取一种或多种带电生物分子。当对固定床应用电泳时，通过施加恒定均匀的电场，使固定床内的生物分子产生流通。

在一种实施方式中，本发明包括定位在生物反应器中2个电极：(A)阳极，位于固定床顶部上并与其直接接触；(B)阴极，位于生物反应器底部上，在叶轮下方(图6A)。根据生物分子的类型及其所带电荷，电极电荷可以很容易地反转。

在一种实施方式中，电极结构可以类似于网状，确保产生均匀的电场(图6B)。

本发明展示了一种在固定床生物反应器中实施的衍生电泳结构，其中固定床由组装元件构成，诸如PET FB层或3D结构。培养之后，如有需要则进行细胞裂解，并且在两个电极之间施加恒定的电位差，其导致任何带电荷的生物分子(包括带电荷的病毒、蛋白质和DNA)发生迁移(图7A)。

在一种实施方式中，反向启动叶轮以反转液体循环的方向(图7B)，同时添加PBS缓冲液来补充固定床内液体的不足。由于液体和生物材料会流向叶轮和生物反应器的中心，因此需要将多余的液体泵出，并将生物产物收集到收获瓶中。

优点：

本发明对现有的生物反应器硬件和软件系统只需进行最小程度的修改，包括：(1)电极的实施；以及(2)对软件进行调整，以允许磁性叶轮旋转方向的反转。

·进行具有若干次冲洗的若干个循环。

·具有足够的接触时间。

·使用电泳从固定床生物反应器中提取一种或多种带电荷的生物分子。

在第二方面，本发明涉及一种系统，包括：搅拌装置和固定系统，所述搅拌装置包括适于接收生物反应器的平台；以及，所述固定系统包括用于将所述生物反应器固持至所述平台的至少一个紧固件，以及适于安装至所述生物反应器并接收所述至少一个紧固件的桥结构。在优选实施方式中，该系统进一步包括生物反应器。

在一种实例中，所述系统可以包括用于搅拌生物反应器的搅拌装置和用于移动或改变生物反应器内液位的第二装置，诸如在一种实例中，通过用液体填充生物反应器，使得液位处于或高于固定床的顶部部分，以及排空生物反应器，从而将液位从填充水平移动至固定床的底部或底部下方。替代地或额外地，第二装置可以在固定床生物反应器的内部与外部之间产生一部分液体的往复或“来回”移动。液体的这种来回移动可以由致动器诸如一个或多个泵产生以用于产生脉冲作用，其中液体部分地被排空，并且然后部分地被引入至生物反应器中，或者其可以涉及生物反应器的完全排空和再填充。为此目的，生物反应器可以与入口、出口或排放口相关联，它们中的每一个都可以与合适的泵和通气孔相关联。生物反应器可以包括刚性容器，或可以包括一次性或单次使用的容器或袋。搅拌装置可以是例如将搅拌能量施加至生物反应器或施加至固定床的任何装置。施加能量的生物反应器的部分可以包括生物反应器的任何部分，只要其能使固定床产生振动即可。搅拌装置可以包括例如振动台形式的搅拌器、涡旋装置、振荡器，或用于将机械能施加至生物反应器和/或用于贴壁细胞生长/截留的结构诸如固定床的另一种装置。搅拌装置可以处于生物反应器的内部或外部。振动动作可以是振荡的、往复的或周期性的，谐波的或随机的。频率可以在0.5至200赫兹之间。频率可以是20-100赫兹，或者更具体地说，是50-80赫兹。振幅可以较低，诸如0.5-5.0毫米，或者更具体地说，是2-3毫米。第二装置可以包括，例如，一个或多个液体转移装置，诸如双向或可逆泵，或其他装置，以将流体传输至生物反应器和从生物反应器传输流体。第二装置可以使在排空模式期间排空的流体在填充模式期间再循环至生物反应器中，或可以在此类填充模式期间将新鲜流体引入至生物反应器中。第二装置还可以仅进行排空、清空或填充循环，并且可以仅使用一个此类循环(例如，一个排空或填充)或多个循环来完成。第二装置可以与搅拌装置集成在一起，以便这些装置协同或并行工作。替代地，装置可以是单个装置的部分。

在一些实施方式中，本文公开的生物反应器可以包括过程控制器。在一些实施方式中，本文公开的系统可包括一个或多个过程控制器。在实施方式中，一个或多个过程控制器配置为控制生物反应器和系统两者。在一些实施方式中，过程控制器被配置为控制生物反应器和/或系统的运行，并且可以包括多个传感器、本地计算机、本地服务器、远程计算机、远程服务器或网络。在一些实施方式中，生物反应器和/或系统可以包括一个或多个传感器，例如温度传感器(例如热电偶)、流速传感器、气体传感器、液位传感器或任何其他传感器。在一些实施方式中，过程控制器可以操作控制生物分子生产和收获过程的各个方面，并且可以与设置在生物反应器和/或系统中的传感器联接，例如，以实时控制进入生物反应器和/或系统的温度、体积流速或气体流速。在实施方式中，过程控制器分为两部分，即可编程逻辑控制器(PLC)和监视控制与数据采集(SCADA)。PLC是系统的智能，连接着传感器和致动器。PLC只含有数据，不含有电力。SCADA对于可视化、数据历史记录和审计追踪很重要。这个SCADA系统在服务器上运行，服务器存储数据历史记录并支持可视化。在实施方式中，信息也可以从客户端平板电脑上被可视化。在实施方式中，客户端网络可以直接连接到服务器以进行远程访问。在一些实施方式中，过程控制器可以包括人机界面(HMI)，诸如显示器，例如计算机监视器、智能手机应用程序、平板电脑应用程序或模拟显示器，用户可以访问它来确定系统的状态(基于系统中包括的传感器)，并通过各种致动器诸如泵、阀、加热器和搅拌器来控制系统。在一些实施方式中，过程控制器可以包括输入，例如，键盘、单独的智能平版电脑、键组、鼠标或触摸屏，以允许用户输入控制参数来控制生物反应器的运行。在一些实施方式中，过程控制器可以控制生物反应器的访问。

在任何一种情况下，都可以提供控制器来管理本发明的方法，其中向生物反应器中添加裂解溶液，从而裂解生物反应器中的细胞，并且在裂解所述细胞之前、同时和/或之后，对所述生物反应器施加一种或多种机械作用，在其之后从所述生物反应器中回收一种或多种目标生物分子。在实施方式中，控制器管理算法或过程，以自动化方式或根据操作员指令，进行搅拌和液体来回移动到生物反应器并从生物反应器来回移动的组合操作。

使用上述系统，可以进行本发明的方法，其中向生物反应器中添加裂解溶液，从而裂解生物反应器中的细胞，并且在裂解所述细胞之前、同时和/或之后，对所述生物反应器施加一种或多种机械作用，在其之后从所述生物反应器中回收一种或多种目标生物分子。如前所述，所述机械作用可以包括两种或更多种机械作用的组合。在优选实施方式中，本发明的系统允许将对生物反应器的搅拌与生物反应器内部液体的移动进行组合，以提高生物分子的收获率。例如，系统可以振动、脉冲或振荡生物反应器容器，同时经由外部泵送用脉冲或来回的液体移动来循环裂解溶液。替代地，裂解溶液可以通过使用生物反应器内的内部循环(诸如经由搅拌器)或通过使用外部再循环-循环或灌注来内部地移动。例如，振动可以处于选定的频率(例如，20-300Hz，包括例如60-80Hz)，并且液体的脉冲施加多次循环(例如，在1至10之间，并且以0.1-5L/min之间的流速进行)。此类搅拌在相邻于生物反应器的气相的液位处产生最大的能量转移。通过在振动/振荡/搅拌过程中动态调整生物反应器内以及固定床沿线的液位，诸如通过使用第二装置(例如泵)，更有效地使生物分子从固定床材料上脱离。因此，来自生物反应器的生物分子的产率或收获以容易且相对便宜的方式增加，并且没有显著增加成本或复杂性。

该系统可以进一步包括收获容器、废物容器和含有细胞裂解溶液的供应容器，它们中的每一个都可以与生物反应器或彼此之间进行流体连通。用于供应冲洗溶液和灭活溶液的任选的容器也可以被设置与生物反应器流体连通，或与前述容器的任一个流体连通。过滤器或其他装置可以定位在这些容器中的任何一个和/或生物反应器之间。这些容器中的任何一个或全部(以及其中的溶液)可以任选地进行搅拌，并且可以是再循环回路的一部分，以允许与生物反应器，可能还与有储器进行再循环。该系统还可以适于对裂解溶液进行预热和/或保持细胞裂解溶液的温度(通常为37℃)。该系统设计用于贴壁细胞以及非贴壁细胞的生长。在实施方式中，生物反应器是分批式生物反应器。在另一种实施方式中，生物反应器是灌注式生物反应器。在灌注式生物反应器中，等体积的培养基同时添加到生物反应器中并从生物反应器中去除，而细胞则保留在生物反应器中。这提供了稳定的新鲜营养源，并能持续去除细胞(废物)产物。与传统生物反应器相比，灌注允许实现更高的细胞密度，从而实现更高的体积生产率。此外，灌注式生物反应器允许在去除培养基的过程期间持续收获分泌产物。

在实施方式中，该系统包括一个或多个通过过滤(诸如切向流过滤(TFF)、包被磁珠(亲和)、填充床或膨胀床色谱法，或特定的纯化亲和柱或超速离心步骤)来浓缩/纯化目标生物分子的装置。

在实施方式中，该系统包括浓缩器。该系统的浓缩器可以从技术人员已知的多种适合减少目标生物分子留置在其中的液体的体积的装置中选择。在一些实施方式中，浓缩器包括一种类型的浓缩装置(例如，切向流过滤器)。在一些实施方式中，浓缩器包括多于一种类型的浓缩装置(例如，切向流过滤器和死端过滤器)。这些装置中的大多数基于过滤和/或尺寸排阻色谱法。在一种实施方式中，浓缩器是过滤装置，更优选是微滤装置，或超滤装置，或者是微滤和超滤装置两者的组合。当该系统配备有用于减少目标生物分子留置在其中的液体的体积的超滤装置时，该装置的膜经过适配，以便允许水和低分子量溶质(通常将其称为渗透物)通过，而大分子诸如生物分子则保留在渗余物的膜上。在其他实施方式中，该系统设置有切向流过滤装置(TFF)。在实施方式中，所述TFF配备有至少一根中空纤维，其具有的孔隙的孔隙率足以几乎保留所有的目标生物分子，同时准许较小的污染物诸如生长培养基和溶质穿过膜的孔隙。与死端过滤不同，其中液体穿过膜或床，并且固体被捕获在过滤器上，TFF装置中允许切向流穿过过滤器表面，而不是直接穿过过滤器。因此，在TFF中可避免形成滤饼。在另一种实施方式中，所述TFF可以配备有允许进行切向流过滤的盒/筒。在又另一种实施方式中，所述TFF是单程切向流过滤(SP-TFF)。当纯化蛋白质诸如抗体时，这种装置特别有优势。在一些实施方式中，TFF装置包括膜，其面积在约1000cm²至2000cm²之间，优选约1500cm²。TFF可以重复使用、一次性使用和/或是一次性的。在一些实施方式中，TFF是即插即用的。

在实施方式中，该系统设置有一个或多个基于膜的色谱装置。所述膜可以有各种形状因子，如柱体、孔板和盒，膜的体积小至5.5微升，最大到若干升。所述基于膜的色谱装置包括例如：基于蛋白A的亲和膜色谱装置，用于捕获步骤中的抗体纯化；利用亲和膜吸附技术的装置；利用多模式强阴离子交换膜的装置；利用弱阴离子交换膜的装置；利用亲和膜色谱法选择性纯化与唾液酸有结合亲和力的生物制品诸如唾液酸结合凝集素、生物标志物和许多病毒表面蛋白(例如AAV4和AAV5)以及重组蛋白的装置。

如上文所述，本发明进一步涉及一种从固定床生物反应器中回收目标生物分子的系统。

为了在搅拌过程中保持生物反应器的完整性，可以使用固定系统将生物反应器附接到该系统上，特别是附接到搅拌装置上。

固定系统可以包括将搅拌装置联接到生物反应器的结构，其应具有足够的刚性，以便将机械能传递到生物反应器。

固定系统包括用于将生物反应器固持至搅拌装置平台的至少一个紧固件，以及适于安装至生物反应器并接收至少一个紧固件的桥结构。在实施方式中，所述紧固件包括绑带。在其他实施方式中，所述紧固件包括可调节的绑带。在实施方式中，所述固定系统进一步包括用于定位和引导绑带放置的一个或多个绑带适配器或引导件。

为了防止机械损坏，固定系统应该被适合地装配至生物反应器，并且应该维持和保护本生物反应器的任何易碎部件(例如，pH和DO探头)以防止损坏。

在实施方式中，搅拌装置包括振动台，所述振动台包括生物反应器放置在其上的占位件。在实施方式中，该振动台适于接收容器，优选生物反应器。

在实施方式中，桥包括顶部部分及悬垂部分。如本文使用的顶部部分称为蛛形部分。在实施方式中，蛛形部分包括两条或更多条在桥中心和顶部的公共连接点处相交的绑带。在实施方式中，每条绑带包括从蛛形部分向下悬垂的两条支腿。在优选实施方式中，这些绑带相互垂直并相交，绑带和支腿的长度相同，并且桥是对称的。在实施方式中，绑带和悬垂部分可以具有任意的宽度、长度和深度，并且这种桥结构能够适配任何尺寸的生物反应器或容器。在实施方式中，悬垂部分可以延伸至并接触生物反应器的一部分或搅拌装置的平台，以便与之联接。在实施方式中，悬垂部分接触并由生物反应器的一部分或搅拌装置的平台支撑。

在实施方式中，桥进一步包括环形部分，其中桥的一条或多条支腿连接到该环形部分。环形部分包括平坦表面，适于将桥安装到生物反应器的一部分或搅拌装置的平台上。在实施方式中，环形部分的尺寸适合生物反应器的一部分，以便将桥安装(或联接)到生物反应器上。在优选实施方式中，环形部分的尺寸适合环绕并安装到生物反应器的盖或盖的一部分上。在实施方式中，桥的环形部分搁置在生物反应器盖的环形部分上。环形部分可以完全或部分环绕生物反应器或容器的盖延伸。这允许在不去除附接到生物反应器或容器上的管道、探头、歧管或其他设施的情况下，将桥放置到生物反应器的盖上。在实施方式中，环形部分联接到生物反应器的盖上。在实施方式中，环形部分搁置在生物反应器的盖的一部分上。在实施方式中，环形部分定位于生物反应器的基部周围。环形部分可以使用夹持或其他安装装置联接到生物反应器的一部分上。

环形接收部分和桥可以使用本领域已知的任何技术(包括但不限于夹子、闩锁、锁定闩锁和螺钉)联接到生物反应器、彼此之间、其一部分、平台或其组合。在实施方式中，这种联接是可释放的。因此，在实施方式中，固定系统包括可释放的联接件。

因此，在实施方式中，固定系统包括用于与生物反应器的盖或罩接合的环形部分部件。

在实施方式中，该系统进一步包括用于控制搅拌装置的控制器。在实施方式中，所述控制器控制生物反应器或细胞收获工艺。

搅拌装置可以手动控制，或以自动化方式控制。在实施方式中，所述搅拌装置是远程控制的。

搅拌装置可以独立控制，或由控制器控制。在实施方式中，所述控制器被包含在PDG箱中。在实施方式中，所述控制器可以与搅拌装置一体成型(诸如例如包括在振动台内)。在实施方式中，控制器形成生物反应器的对接站的一部分。该对接站可以包括控制器，该控制器具有显示器以用于显示与正在进行的生物处理操作相关联的各种参数，并且还允许输入以控制该生物处理操作的各个方面。例如，对接站可以包括与通过导管连接的泵相关联的各种辅助容器。控制器可以用于控制这些泵，以便控制流入或流出生物反应器的流体流量，以及控制生物反应器中流体的混合，诸如通过控制搅拌装置。

固定床可以包括，例如，微载体(例如由不同材料如明胶、葡聚糖、纤维素、塑料或玻璃制成的珠粒)、结构化固定床、3D打印基质、包括一种或多种织造或非织造材料的床，诸如例如直接接触已插入的间隔物、珠粒、中空纤维或具有该已插入的间隔物、珠粒、中空纤维的此类材料的一个或多个片材，或用于促进贴壁细胞生长或经由截留的细胞生长的任何其他合适的细胞培养结构。该床可以设计成任何期望的形状、定向或形式，例如包括3D多孔整体结构、堆叠层(参见，例如，美国专利第11,111,470号)、竖直布置的平行层、呈螺旋或缠绕构型布置的层，或填充床(参见，例如，美国专利第8,137,959号)。在实施方式中，结构化固定床包括三维(3D)整体结构，诸如由多个相互连接的单元或物体形成的支架或晶格形式。这样的物体具有供细胞附着的表面。固定床本质上可以是单次使用的，以避免根据生物处理标准进行清洗所涉及的成本和复杂性。这种整体式结构化固定床可以防止颗粒的产生(含有PET纤维的固定床可能释放一些游离纤维)，这使得其可用于最终产品能够进行过滤的工艺(例如，对于不能进行无菌过滤的大型病毒生产的干细胞应用)。

也可以对固定床材料施加各种处理，以赋予其某些特性，诸如，例如使床的某些部分具有亲水性，而某些部分具有疏水性。同样，某些部分可以诸如例如通过提供结合配体来使其具有细胞附着性。在优选实施方式中，固定床包括亲水性材料。

在实施方式中，固定床包括多个细胞固定化层。在实施方式中，多个细胞固定化层布置为堆叠或螺旋构型。在实施方式中，细胞固定化层或者布置为直接接触，或者在相邻层之间具有间隔。在实施方式中，所述细胞固定化层在所述一个或多个细胞固定化层之间布置有一个或多个间隔层。在实施方式中，固定床是3D打印固定床。

-留置在搅拌装置的平台上的生物反应器；以及

-用于将生物反应器的至少部分联接至搅拌器的固定系统。

在实施方式中，所述系统包括：生物反应器，所述生物反应器包括用于细胞截留/附着和生长的结构；生物分子收获机构，所述生物分子收获结构适于搅拌所述生物反应器并适于使液位相对于所述结构移动；以及容器，所述容器包括与所述生物反应器流体连通的细胞裂解溶液。生物分子收获机构包括用于振动或振荡生物反应器的装置和/或泵。可以提供泵以用于泵送液体，以便使液位相对于结构移动，并且可以提供控制器以用于控制泵以及可能的振动器。

在这些或其他实施方式中，生物反应器可以相对于水平平面倾斜，以促进液体从生物反应器排空。生物分子收获装置可以包括致动器，致动器用于使用于细胞截留/附着和生长的结构相对于生物反应器移动，以移动液位的位置。可以提供控制器，用于控制搅拌生物反应器并使液位相对于用于细胞截留/附着和生长的结构移动。该控制器可以适于控制向生物反应器递送一种或多种溶液。

本公开的其他方面关于一种用于收获细胞的系统，包括：生物反应器，该生物反应器包括用于细胞截留/附着和生长的结构；搅拌器，适于搅拌生物反应器；致动器，用于使液位相对于用于细胞截留/附着和生长的结构移动；以及容器，该容器包括与生物反应器流体连通的溶液。在一种实施方式中，搅拌器包括振动器。致动器可以包括线性致动器和/或泵。还可以提供控制器以控制致动器和/或搅拌器。

在一种实施方式中，用于细胞截留/附着和生长的结构包括固定床，诸如3D打印固定床。用于细胞截留/附着和生长的结构包括具有多个细胞固定化层的固定床，所述多个细胞固定化层诸如以堆叠式或螺旋构型来布置，并且直接接触相邻层或在这些相邻层之间具有间隔。

现在将结合实例和附图更详细地描述本发明，但这些实例和附图并非限制性的。

附图描述

对生物反应器施加机械作用的系统的一种实施方式示意性地示出于图8至图12中。该系统可包括用于搅拌生物反应器12的装置18。装置18可以是，例如，向生物反应器12或固定床(未示出)施加搅拌能量的任何装置。被施加能量的生物反应器12的部分可以包括其任何部件或部分，只要所述部件或部分产生足以使生物反应器和或其内容物(包括但不限于液体培养基、固定床材料、细胞、细胞碎片及其组合)发生移动的振动即可。装置18可以包括，例如，振动台形式的搅拌器、涡旋装置、振荡器，或用于向生物反应器和/或固定床材料施加机械能的另一种装置。装置18可以处于生物反应器12的内部或外部。优选地，装置18处于生物反应器的外部。该机械作用，优选振动动作，可以是振荡的、往复的或周期性的，谐波的或随机的。

振动台可包括马达，优选振动马达、变压器和变频机。频率可以是5-100赫兹，或者更具特别地，20-100赫兹，以及更特别地在50至70赫兹之间。振幅可以较低，诸如0.1-5.0毫米，或者更特别地，2-3毫米。

在其他实施方式中，可以提供控制器(例如，计算机或处理器)来管理该系统，并对生物反应器施加机械作用(搅拌)。在其他实施方式中，可以提供具有软件的控制器(例如，计算机或处理器)，所述控制器以自动化方式或根据操作员指令来管理所述系统以及施加机械作用、移动与各个步骤相关联的液体、进行搅拌和液体移动到生物反应器12并从生物反应器移动的组合的过程。参见图11。在实施方式中，单个控制器使用本文所述的振动台来控制生物反应器中细胞的生长以及从生物反应器中回收细胞或目标生物分子。

在一种实施方式中，用于对生物反应器诸如固定床生物反应器施加机械作用(搅拌)的装置可以包括用于支撑或对接生物反应器的平台202。在一种实施方式中，平台提供了将机械能传递到生物反应器的接口。在其他实施方式中，平台可包括用于放置生物反应器基部或其部分的占位件204。占位件可包括用于放置生物反应器基部或其部分的开口、凹部、嵌入件或凹痕204。在另一种实施方式中，平台可以用另一个具有不同尺寸开口、嵌入件或凹痕的平台来更换/互换，以适应不同尺寸的生物反应器或容器。在另一种实施方式中，盘或环形结构可在平台和生物反应器之间提供接口。嵌入件、盘或环形结构可防止生物反应器与搅拌装置之间直接接触。在实施方式中，盘或环形结构由包括塑料的材料制成。在优选实施方式中，该嵌入件、盘或环形结构由包括聚甲醛(POM)的材料制成。

在实施方式中，占位件204(图12)包括一个或多个同心凹部，以能够放置和使用不同尺寸的容器或生物反应器。在实施方式中，占位件使用螺钉附接在振动台的平台上。在实施方式中，占位件由聚甲醛(POM)制成，并且是从一块塑料块中加工出来的。

在另一实施方式中，用于对生物反应器施加机械作用(搅拌)的装置可包括固定系统210。固定系统通过将生物反应器适当地固定到搅拌系统(即振动台)上，确保对生物反应器均匀施加力，并避免对生物反应器，特别是生物反应器的盖和接缝，造成机械限制。

在实施方式中，固定系统将生物反应器固持到搅拌装置上。固定系统可以最大限度地减少生物反应器的移动，包括但不限于生物反应器的侧向和竖直移动。固定系统还可以有助于保持生物反应器的完整性，并最大限度地减少、降低或防止搅拌可能对生物反应器造成的机械损坏。在一种实施方式中，固定系统可包括紧固件，用于将生物反应器的至少一部分直接或间接地固持和/或联接到搅拌装置上。在一种实施方式中，紧固件是条带或绑带212。如本文所用，术语“绑带”定义为用于将一个物体紧固或固持到另一个物体上的柔性材料。在一种实施方式中，使用绑带将生物反应器紧固到搅拌装置上。在其他实施方式中，固定系统可包括一条或多条绑带。一条或多条绑带可以是单次使用的或能够重复使用的。一条或多条绑带可以是可调节的、可弯曲的、柔性的、可拉伸的或其组合。一条或多条绑带可以是可拆卸的。一条或多条绑带可以由包括塑料、聚合物以及材料共混物的材料制成。一条或多条绑带可以由包括聚合物、共聚物、聚合物的混合物以及一种或多种聚合物与非聚合物物质的混合物中的一种或多种的材料制成。在实施方式中，绑带可以由包括橡胶、尼龙、氯丁橡胶、聚丙烯、聚酯、聚乙烯和对苯二甲酸酯(PET)中的一种或多种的材料制成。

在实施方式中，绑带可以是织带材料(webbed materail)。在实施方式中，绑带可以是被涂覆的。在实施方式中，绑带可以被涂覆有热塑性聚氨酯(TPU)或聚氯乙烯(PVC)或其组合。在优选实施方式中，固定系统中使用的一条或多条绑带包括BioThane也被称为BioThane Beta 520。一条或多条绑带的长度、厚度和宽度可由本领域技术人员容易地确定。

除了将生物反应器固持到搅拌系统上之外，绑带还提供了一种方式，用于控制将生物反应器固持到搅拌系统18上时的松紧程度或所使用的张力大小，并将绑带的压力均匀地分布到生物反应器上。在优选实施方式中，固定系统包括两条绑带。在实施方式中，每条绑带均具有第一端部和第二端部。

在一种实施方式中，固定系统包括桥结构214。桥结构用于将绑带的力均匀地施加在生物反应器上，以便适当地固定到振动台上。桥结构进一步用于避免对生物反应器的某些元件，特别是盖，造成机械限制。桥结构用于保护生物反应器的突出部分或敏感区域免受损坏，同时不阻碍对其的可及。在实施方式中，桥还可以提供对可能联接到生物反应器上的端口、帽、传感器、取样器和其他硬件、管道、装置和/或歧管的可及。在实施方式中，桥结构在生物反应器盖上方延伸和/或横跨生物反应器盖延伸。桥可以是刚性的或者柔性的。在实施方式中，桥是刚性的。桥可以是可拆卸的、一次性的、一次性使用的和/或能够重复使用的。在实施方式中，桥是塑料的。在实施方式中，桥是金属的。在实施方式中，桥由包括铝的材料制成。

在实施方式中，桥包括顶部部分214A和悬垂部分214B。如本文使用的顶部部分称为蛛形部分。在实施方式中，蛛形部分包括两条或更多条在桥中心和顶部的公共连接点处相交的绑带214A。在实施方式中，每条绑带包括两条从蛛形部向下悬垂的支腿214B。在优选实施方式中，这些绑带相互垂直并相交，绑带和支腿的长度相同，并且桥是对称的。在实施方式中，绑带和悬垂部分可以具有任意的宽度、长度和深度，并且这种桥结构能够适配任何尺寸的生物反应器或容器。在实施方式中，悬垂部分可以延伸至并接触生物反应器的一部分或平台，以便与之联接。在实施方式中，悬垂部分接触并由生物反应器的一部分或平台支撑。在实施方式中，桥进一步包括环形部分214C，其中桥的一条或多条支腿连接到该环形部分。环形部分包括平坦表面，适于将桥安装到生物反应器的一部分或平台上。环形部分的尺寸适合生物反应器的一部分上，以便将桥安装到生物反应器上。在优选实施方式中，环形部分的尺寸适合环绕并安装到生物反应器的盖或盖的一部分上。在实施方式中，桥的环形部分搁置在生物反应器盖的环形部分上。环形部分可以完全或部分环绕生物反应器或容器的盖延伸(参见图13)。这允许在不去除附接到生物反应器或容器上的管道、探头、歧管或其他设施的情况下，将桥放置到生物反应器的盖上。在实施方式中，环形部分联接到生物反应器的盖上。在实施方式中，环形部分搁置在生物反应器的盖的一部分上。在实施方式中，环形部分定位于生物反应器的基部周围。环形部分可以使用夹持或其他安装装置联接到生物反应器的一部分上。替代地，环形部分可以与安装在生物反应器上的接收部分220或垫片相接，所述接收部分或垫片配置为接收桥或将桥结构联接到生物反应器或搅拌装置的平台上。在实施方式中，环形接收部分或垫片安装在生物反应器盖或其一部分上，并且桥的环形部分联接到其上或搁置在其上。在实施方式中，桥的环形部分进一步包括下部部分(220)或边缘，其适于围住盖的一部分。这确保了桥与容器或生物反应器盖的适配性。在实施方式中，环形接收部分在生物反应器和金属桥之间提供了接口。在实施方式中，环形接收部分防止生物反应器和桥之间的直接接触。在实施方式中，环形接收部分由包括塑料的材料制成。在优选实施方式中，环形接收部分由包括聚甲醛(POM)的材料制成。环形接收部分和桥可以使用本领域已知的任何技术(包括但不限于夹子、闩锁、锁定闩锁和螺钉)联接到生物反应器、彼此之间、其一部分、平台或其组合。在实施方式中，这种联接是可释放的。

在实施方式中，固定系统和搅拌系统及组件可以由低颗粒脱落材料构成。在实施方式中，固定系统中可以存在塑料接口，以减少在使用搅拌系统的过程中颗粒的脱落。

在其他实施方式中，固定系统包括绑带引导件226，用于在将绑带安装到固定系统中的期间定位和引导绑带的放置。在另一实施方式中，绑带引导件用于将绑带提供的张力均匀地分布到生物反应器上。

在另一实施方式中，绑带引导件用作绑带和蛛形部之间的接口。在实施方式中，绑带引导件由包括塑料的材料制成。在优选实施方式中，绑带引导件由包括聚甲醛(POM)的材料制成。在实施方式中，绑带引导件包括用于接收和稳定绑带位置的凹部。在实施方式中，绑带引导件附接到蛛形部。在实施方式中，使用螺钉、粘结焊接或本领域已知的用于连接具有相似或不同成分且能形成低颗粒脱落结构的任何两个部件的任何方法，将绑带引导件附接到蛛形部。

在实施方式中，桥进一步包括推顶销，用于限制容器或生物反应器的盖的位移和/或破损。如图9和图13所示，推顶销230可以从蛛形部延伸出来，并使用本领域已知的固定方法固定在蛛形部。推顶销和桥可以由相同或不同的材料组成。在实施方式中，推顶销和桥可以连接或模制在一起(如果由塑料组成)。在实施方式中，推顶销可以用螺钉固定或夹持在桥上。在实施方式中，推顶销可以焊接或胶黏在桥上。推顶销可以是可调节的、可拆卸的、可更换的和/或柔性的，并且可以由塑料、金属、橡胶或其组合制成。推顶销可以进一步包括由材料诸如橡胶制成的端部帽、套筒或帽，其适于或用于限制容器或生物反应器盖的位移和破损。当这种推顶销与桥一起安装时，它将搁置在盖表面上或略高于盖表面。

在实施方式中，固定系统包括锚固装置，其能够将绑带放置并固定到搅拌系统上。在实施方式中，锚固装置使用本领域已知的任何技术锚固到搅拌系统的顶部或平台上。在实施方式中，锚固装置通过螺栓、焊接或其组合连接到搅拌系统上。在实施方式中，锚固装置由金属、塑料或其组合构成。在实施方式中，固定系统可以包括任意数量的锚固装置。在实施方式中，锚固装置安装在搅拌系统上。在实施方式中，锚固装置安装在搅拌系统上，用于将固定系统的绑带固持并连接到搅拌系统上。在实施方式中，锚固装置安装在搅拌装置的平台上。在实施方式中，锚固装置是钩，并且这些钩安装在搅拌系统的平台或顶部上。在实施方式中，存在四个钩222。在实施方式中，钩放置在搅拌系统的平台或顶部的角落处或附近，或者在搅拌装置顶部上的假想正方形的角落处。

在实施方式中，将锚固装置或钩定位，以与桥的轴线对齐且能够对绑带进行定位并固定生物反应器。在实施方式中，绑带的第一端部直接紧固在锚固装置上。在实施方式中，固定系统中每条绑带的两个端部都直接安装或紧固在锚固装置上。在实施方式中，一条或多条绑带以可释放的方式联接、紧固或固持在锚固装置上。在实施方式中，固定系统的绑带通过将绑带围绕锚固装置环绕而与锚固装置联接。在实施方式中，一条绑带围绕两个锚固装置环绕。在优选实施方式中，固定系统包括两条绑带，且每条绑带都围绕两个锚固装置环绕或联接到两个锚固装置上。在另一实施方式中，固定系统包括用于调节一条或多条绑带的装置。在实施方式中，用于调节绑带的装置是可释放的。在实施方式中，调节装置是可缩回的。在实施方式中，调节包括改变绑带的长度。可调节的绑带确保将生物反应器固持在搅拌系统上，并且固定系统对生物反应器施加适量的张力。此外，可调节的绑带使得搅拌装置能够适用于不同尺寸的容器或生物反应器。

用于调节一条或多条绑带的装置可以包括本领域已知的任何技术或装置，包括拉伸绑带。在另一实施方式中，调节装置可以包括夹具、棘轮、带扣、闩锁及其组合中的一种或多种。在实施方式中，调节装置包括棘轮。在优选实施方式中，固定系统包括两条绑带，且每条绑带都包括用于调节绑带长度的一个棘轮装置。棘轮装置或其他调节装置可以进一步促进绑带两个端部的闭合。图8分别示出了搅拌系统18和固定系统210的实施方式。在图8所示的实施方式中，固定系统包括两条绑带212A和212B。在实施方式中，每条绑带都包括棘轮装置224A和224B。棘轮装置及其组装和实施在本领域是公知的，以及本文所述的固定系统中使用的棘轮装置是棘轮张紧器系统，并且优选地，该棘轮张紧器系统是不锈钢的。

在实施方式中，第一绑带的第一端部穿入第一棘轮的第一端部，第一绑带的第二端部穿入第一棘轮的第二端部。优选每条绑带都有一个棘轮。优选地，固定系统包括两条绑带，其中每条绑带进一步包括用于调节绑带长度的一个棘轮。

如图8和图9所示，在实施方式中，固定系统包括：紧固至第一钩的第一绑带的一个端部，以及紧固至棘轮的第一端部的第一绑带的第二端部；第一延长绑带的第一端部紧固至与第一钩呈对角位置的第二钩，第一绑带的第二端部与棘轮的第二端部联接，并且第一绑带从第一钩开始，沿着桥的一部分并在桥的第一组凹部(也称为绑带引导件)中延伸至棘轮的第一端部，其中，棘轮的第二端部紧固至第一延长绑带的第二端部，并且其中所述棘轮是可调节的。如图8和图9进一步所示，固定系统可进一步包括：紧固至第三钩的第二绑带的第一端部，以及紧固至第二棘轮的第一端部的第二绑带的第二端部；第二延长绑带的第一端部紧固至与第三钩呈对角位置的第四钩，第二绑带的第二端部与第二棘轮的第二端部联接，并且第二绑带从第一钩开始，沿着桥的一部分并在桥的第二组凹部(绑带引导件)中延伸至第二棘轮的第一端部，并且其中，第二棘轮的第二端部紧固至第二延长绑带的第二端部，并且其中第二棘轮是可调节的。

图10示出了向生物反应器12或其他工艺相关的容器施加机械能的系统的一种实施方式，所述系统包括搅拌装置18和固定系统210。

在实施方式中，生物反应器包括结构化固定床，可能还包括螺旋缠绕的结构化固定床。在实施方式中，生物反应器包括细胞培养物、细胞培养收获物或来自细胞收获的一个或多个步骤的工艺溶液。在实施方式中，生物反应器包括细胞、细胞碎片和目标生物分子中的一种或多种。在实施方式中，细胞、细胞碎片和目标生物分子中的一种或多种被捕获在固定床中、附着在固定床上，或者与细胞或细胞碎片或其他生物分子聚集在一起。在实施方式中，铝桥214包括蛛形部分214A和四个悬垂的支腿结构214B，并且进一步包括环形结构部分，该环形结构部分安装在POM垫片220的顶部上，用于接收桥的环形部分。POM垫片和桥的环形部分被安装，并且任选地紧固至生物反应器帽的一部分。POM绑带引导件226安装在桥的蛛形部分上，该绑带引导件包括用于定位和支撑绑带的凹部。

第一绑带通过以下而被组装：将绑带的第一端部穿过第一棘轮224A的第一端部；将绑带的自由端部在第一锚固钩222A的上方或下方环绕；将绑带定位在绑带引导件中的第一凹部中，所述第一凹部以平行于与所述第一锚固钩对角定位的所述第二锚固钩延伸；将绑带的自由端部围绕第二锚固钩(未示出)环绕，并通过以下将绑带的端部带回至朝向第一锚固钩：将绑带引导件中的绑带叠放在绑带的第一层上并将绑带的端部穿入第一棘轮的第二端部；以及将第一棘轮张紧至对于搅拌系统运行适当的张力。通过将第二绑带的第一端部穿过第二棘轮224B的第一端部来组装第二绑带；将绑带的自由端部在第三锚固钩222B的上方或下方环绕；将绑带定位在绑带引导件中的第一凹部中，所述第一凹部以平行于与第三锚固钩对角定位的第四锚固钩222C延伸；将第二绑带的自由端部围绕第四锚固钩环绕，并通过以下将绑带的端部带回至朝向第三锚固钩：将绑带引导件中的绑带叠放在第二绑带的第一层上并将绑带的端部穿入第二棘轮的第二端部；以及将第二棘轮张紧至对于搅拌系统运行适当的张力。

在实施方式中，棘轮224预先安装有绑带(参见图14)。在另一实施方式中，根据以下步骤将固定系统安装到生物反应器上：

1.将生物反应器放置在振动台的占位件中。

2.将桥以开口的定向(适配器刻痕始终面向振动台前方)放置在生物反应器的顶部上。

3.确保中心突出销固持地放置在探头的正平行位置且位于探头左侧。

4.将第一绑带围绕相对的钩(在振动台上)并在绑带引导件上方与上层绑带固持器的下层部分连接，使两层绑带紧紧彼此相贴。在另一相对的钩上，将绑带围绕具有棘轮的钩环绕。

5.将绑带在棘轮钩下方环绕，然后拉过绑带，接着张紧棘轮，直到绑带绷紧。棘轮应尽可能靠近台但不接触台，以避免对振动产生干扰。

6.在适合的固持器中十字交叉第二绑带，并像第一连接的绑带一样，在适当的并置钩中连接，但将双绑带层放置在上部绑带引导件的上层部分的上方。

7.用绑带棘轮固持，直到张紧。

在另一实施方式中，振动台包括固持器，用于在振动台的搅拌过程中固持瓶子、容器或其他部件(见图15)。在实施方式中，使用绑带或臂236将固持器固持到振动台上。在实施方式中，固持器可逆地固持到振动台上。在实施方式中，固持器是柔性的、刚性的和/或半刚性的。在实施方式中，固持器是塑料的、金属的或其组合。在实施方式中，固持器由包括聚甲醛(POM)的材料制成。在实施方式中，固持器包括支架或夹具部分(234)和绑带或臂部分(236)。绑带部分将固持器固持到固定系统，夹具或支架部分接收瓶子或容器，从而将其固持就位并防止其在振动过程中翻倒。在实施方式中，固持器接收包括泡沫捕获器的瓶子。在实施方式中，瓶子是玻璃的或塑料的或其组合。在实施方式中，泡沫捕获器与生物反应器联接。

在实施方式中，泡沫捕获器与生物反应器流体连接238。在实施方式中，泡沫捕获器在细胞培养240过程中与生物反应器流体连接，且在放置并安装到振动台(搅拌系统)18上时随生物反应器移动(参见图11和图16)。

在另一实施方式中，在细胞培养系统240和搅拌系统18之间共享泵，以在细胞培养生长和细胞培养收获以及目标生物分子回收期间将流体泵入和泵出生物反应器。

本文和PCT公开WO2022/254039(其全部内容通过引用并入本文)中描述和公开的搅拌和固定系统可用于细胞脱离、种子培养、细胞收获和目标生物分子回收，尽管所公开的实施方式阐述了生物反应器，任选地具有固定床，从搅拌系统接收机械能，但可以设想搅拌和固定系统可以在生物分子生产的任何时候使用，其用途不限于生物反应器，而是包括例如收获容器，并且这种系统可以与任何容器一起使用。

非限制性实例：本文提供的实例并不旨在限制，而是提供本发明的工作实例。可以设想，所有量和实验变量，包括参数、浓度、量和条件，都可以在高于或低于所提供的范围内替代地执行。

实施例

实施例1：根据本发明实施方式获得AAV2的方法

AAV2是在scale-X hydro生物反应器中使用悬浮适应的细胞系生产的。

实施例1中采用的方法的工艺流程图见图1。

接种

悬浮细胞从SF(顺序发酵)中的预培养物以分批模式接种到Scale-X生物反应器中，其等效细胞密度为30,000个细胞/cm²。

细胞生长

几个小时后(4至24h之间)，启动再循环回路(含有细胞生长所需的培养基)，细胞生长3天(或4天，取决于细胞生长)。

转染

细胞通常在达到200-300,000个细胞/cm²时被转染。转染混合物在生物反应器外制备，并在培养基中预稀释。详细参见下文。生物反应器应部分清空，以便能够在生物反应器内部添加转染复合物。转染以减少体积(例如800ml)的分批模式进行，停止加碱。

转染后回路的变化

转染4小时后，重新启动再循环回路(回路中有新鲜培养基-部分培养基交换)。

生产

生产在再循环中进行3天。

收获

在运行结束时，收获上清液(细胞外AAV)，将生物反应器冲洗2X，并使用裂解缓冲液(Pluronic F-68、曲拉通X-100、盐和benzonase)裂解。进行洗涤步骤以恢复空隙体积。例如，在800ml处进行收获。收获以分批模式进行。收获流程图和收获AAV的以下步骤参见图4。

细胞外AAV的收获

在生产结束时，停止再循环。向生物反应器的培养基和再循环回路中添加0.1％(v/v)的Pluronic F-68，并继续控制运行多于30分钟。清空生物反应器容器(空隙体积～90mL)，并收集生物反应器和再循环回路的样品。

2X冲洗

加入(～0.7L)预热的(37℃)冲洗缓冲液，以将生物反应器填充至最高达～0.8L。

冲洗缓冲液包括：

-PBS

-2.5mM KCl

-1mM MgCl₂

-pH:7.0

-0.1％ Pluronic F-68

施加810rpm的搅拌速度5min，然后清空生物反应器。或者施加0.5-2cm/s的搅拌速度5min，然后清空生物反应器。因此，液位相对于固定床结构的移动以0.5至2cm/s的速度发生。这指的是生物反应器内部液体的(竖直)移动速度。重复用冲洗缓冲液填充、混合5min和清空步骤一次。

细胞裂解和AAV的收获(步骤#1)

向生物反应器中加入～0.7L预热的裂解溶液，在37℃下以810rpm混合2h，以达到0.8L。或者向生物反应器添加预热的裂解溶液并在37℃下以0.5-2cm/s混合2h。因此，液位相对于固定床结构的移动以0.5至2cm/s的速度发生。这指的是生物反应器内部液体的(竖直)移动速度。进行来回循环(每30min一次)，因为对固定床的洗出效果有助于回收病毒。这种来回循环允许一部分液体在固定床生物反应器的内部和外部之间移动(清空/填充步骤)。

裂解缓冲液#1(曲拉通-benzonase)包括：

·1％曲拉通(v/v)

·20U/mL benzonase

·含有137mM NaCl的PBS

·10mM Tris

·2mM MgCl₂

·0.1％(v/v)Pluronic F-68

·pH:8.0

在温育2小时后，通过使用5M NaCl储备溶液将NaCl浓度调节至最高达1M(最终浓度)来增加裂解缓冲液的离子强度(例如，添加140mL 5MNaCl——从收获容器内部去除一些体积，以便能够在0.8L下运行生物反应器)。施加搅拌30min，然后清空生物反应器。例如，施加810rpm的搅拌速度30min，然后清空生物反应器。进行来回循环(每15min一次)，因为对固定床的洗出效果有助于回收病毒。

细胞裂解和AAV的收获(步骤#2和#3)

将预热的裂解溶液添加到生物反应器中，在37℃下以810rpm混合30min。或者将预热的裂解溶液添加到生物反应器中，并在37℃下开始搅拌30min。进行来回循环(每15min一次)，因为对固定床的洗出效果有助于回收病毒。重复用冲洗缓冲液填充、混合30min和清空步骤一次。

裂解缓冲液#2(曲拉通-盐)包括：

-1％曲拉通(v/v)

-1M NaCl

-PBS

-10mM Tris

-2mM MgCl₂

-0.1％(v/v)Pluronic F-68

-pH:8.0

洗涤

加入0.7L的预热的洗涤缓冲液，以将生物反应器填充至最多达～0.8L。

洗涤缓冲液包括：

-PBS

-2.5mM KCl

-1mM MgCl₂

-10mM Tris

-pH:8.0

-0.1％(v/v)Pluronic F-68

施加搅拌速度5min，然后清空生物反应器。例如，施加810rpm的搅拌速度5min，然后清空生物反应器。重复用冲洗缓冲液填充、混合5min和清空步骤一次。

实施例2：根据本发明的实施方式，在固定床生物反应器中收获通过转染的 HEK293T细胞所产生的rAAV2的方案

简介

重组腺相关病毒(rAAV)是一种用于基因治疗的病毒载体。它由病毒蛋白构成的二十面体衣壳包裹着DNA片段(即转基因)组成。所生产的病毒载体被用于将转基因(治疗性基因)转移到患者细胞的细胞核中，作为治疗威胁生命疾病的一种疗法。

以下方案用于在固定床生物反应器中在HEK293T细胞进行瞬时转染后收获rAAV2。

已知rAAV的2型血清型很容易附着在细胞(用于转导的膜受体)或塑料材料表面(生物反应器的壁、管道)上，并且如果离子强度过低，则聚集。已进行了相关测试，以研究rAAV2对生物反应器固定床材料(PP和PET)的亲和力。令人满意的是，未检测到rAAV2与固定床材料之间的特异性亲和力。即使有一些rAAV2释放到了上清液(培养基)中，大多数仍余留在细胞内(存储在细胞中)。幸运的是，rAAV衣壳(以及rAAV2)具有很强的弹性和物理稳定性；因此，下游工艺可以利用通常避免的条件，诸如长时间暴露在升高的温下(rAAV2在37℃下稳定)或暴露于有机溶剂。考虑到在固定床生物反应器中大规模生产rAAV2，目前最适合的方法是通过使用洗涤剂进行化学裂解。收获的目标是有效地裂解细胞，而不影响产物的完整性，且也不促进其聚集或非特异性表面相互作用。图2展示了收获流程图。步骤和溶液的配方将在本文下面的方案说明中进行描述。

方案说明

一般注意事项：将所有使用的溶液在添加到生物反应器之前，先预热至37℃。除搅动和温度外，停止生物分子生产所需的其他规定；将温度维持在37℃，并且当生物反应器充满时，将搅拌保持在0.5至1cm/s之间。因此，液位相对于固定床结构的移动以0.5至1cm/s的速度发生。这指的是生物反应器内部液体的(竖直)移动速度。

步骤#1-排空生物反应器

在排空生物反应器前30分钟至1小时之间，向培养上清液中加入0.1％的Pluronic^TMF-68(v/v)。在一些培养基中已经存在0.1％(v/v)的Pluronic^TMF-68。即使培养基中已有Pluronic，添加Pluronic^TMF-68直至达到0.2％(v/v)可以是有用的。Pluronic^TMF-68是一种非离子型表面活性剂，通常用于控制剪切力、防止搅动培养物中产生泡沫以及减少细胞附接在亲水性表面上。还知道添加它可以防止AAV在储存期间粘附到塑料移液管和塑料容器上。对于AAV，通常建议的使用浓度在0.01％至0.2％之间。如果转染混合物再循环回路中没有Pluronic F-68，我们建议添加它。

步骤#2-冲洗生物反应器

使用中性溶液消除残留的培养基(可能会干扰裂解步骤的成分)，并继续收集rAAV2细胞外部分。一旦生物反应器清空，用冲洗溶液将其完全填充，然后再清空。进行两次冲洗步骤，因为据观察，对生物反应器进行填充/清空对rAAV的收获有积极影响。为此，使用其中添加了Pluronic的经典PBS-MK。

冲洗溶液配方：

-PBS

-2.5mM KCl

-1mM MgCl₂

-0.1％(v/v)Pluronic

-pH7

步骤#3-细胞裂解

这是该方案的核心步骤，因为大多数rAAV2是细胞内的。细胞与裂解溶液之间的接触时间，以及进行裂解的温度，都会影响裂解的效率。因此，建议在37℃下进行2小时的裂解步骤(可能因工艺而异)，同时保持0.5-1cm/s搅拌。因此，液位相对于固定床结构的移动以0.5至1cm/s的速度发生。这指的是生物反应器内部液体的(竖直)移动速度。可以定期开启/关闭搅动以扰乱流动。也可以进行来回循环(清空/填充步骤)，因为对固定床的洗出效果有助于回收病毒。替代地，裂解步骤可以进行2X，每次1(或2)小时。

根据科学文献，裂解步骤可能需要30min至若干个小时(最长达6小时)(例如4小时)，并对原始裂解物进行定期取样(例如在1、2、3、4小时后)。

裂解缓冲液配方如下：

-1％(v/v)吐温20或曲拉通X-100

-1M NaCl

-10mM Tris-pH8

-0.1％ Pluronic(v/v)

-20-50U/mL内切核酸酶(DNase)和1-2mM MgCl₂

使用吐温20或曲拉通X-100是因为洗涤剂破坏细胞膜。洗涤剂的使用与浓度和时间有关，据报道曲拉通X-100的浓度在0.1％至0.5％之间，吐温20的浓度在0.1％至1％(v/v)之间。两性离子洗涤剂(Zwittergent)3-14(Calbiochem)似乎也很有前景。由于欧洲REACH规定倾向于禁止使用曲拉通及其衍生物，因此使用吐温20或两性离子洗涤剂是有利的。已知曲拉通比吐温更有效。建议使用较高浓度的吐温(为使病毒充分释放所需的曲拉通或两性离子洗涤剂的浓度与吐温20相比更低。这与洗涤剂的固有属性——临界胶束浓度有关)。

添加NaCl是因为必须保持足够的离子强度，以避免rAAV2聚集以及与裂解过程中释放的其他细胞成分结合。在裂解步骤期间使用高盐浓度减少rAAV2的聚集以及与其他细胞成分的结合，并减少rAAV2与可能仍吸附在生物反应器表面的细胞或细胞碎片之间的表面相互作用。

使用10mM Tris-pH8的缓冲液，是因为观察到碱性溶液加上适量的洗涤剂诸如曲拉通X-100或吐温20，足以裂解包裹有rAAV的细胞，并释放病毒颗粒。根据不同的工艺，化学细胞裂解方案所报道的pH通常在8-9之间。酸性pH(3-4)对于收获病毒颗粒似乎也很有前景，但它可能会对病毒蛋白质的完整性产生影响。

0.1％ Pluronic(v/v)的作用与其在冲洗溶液中的作用类似。

裂解步骤期间核酸酶处理。添加DNase是为了：

1.在rAAV提取过程中消化宿主细胞的细胞核物质

2.避免形成细胞核物质与AAV的复合物

3.降低裂解物的粘度，以促进后续的过滤和色谱步骤。

为了限制由基因组DNA诱导的复合物和粘度，优选在细胞破裂的同时添加酶。然而，这一步骤可能与酶活性的最佳条件(pH和盐度，诸如NaCl)不兼容。在我们的案例中，如果我们使用广泛应用的Benzonase(Millipore Sigma)，pH8不影响酶的功效，因为它在pH7-9之间具有活性。然而，盐浓度过高(1M NaCl；需要将其降低至100-150mM以保持有效活性)。可以使用盐激活核酸酶(SAN-HQ；ArcticZymes)。报道了它在500mM NaCl下的活性。

在裂解步骤期间优选添加20-50U/mL之间的Benzonase，且最少温育时间为30-60min。此外，必须添加1-2mM MgCl₂以维持酶的活性。请注意，也可以使用更高浓度的Benzonase。

高离子强度(NaCl>150mM)对于避免病毒载体聚集很重要，但这些一价盐的浓度大大降低Benzonase的活性(例如，在150mM NaCl下，相对活性损失+/-70％)。为了确保有效收获，可以制定以下折衷方案：

首先，在不添加NaCl的情况下开始裂解步骤(注意：PBS缓冲液提供137mM)，以保持Benzonase的有效活性(生产商手册)。由于Mg²⁺是Benzonase的辅因子，其浓度必须准确。因此，我们建议添加2mM MgCl₂，该浓度对酶活性而言是最佳的。在这些盐度条件下，Benzonase保留有效活性，并且载体的聚集应该会受到限制，但在此之前应仔细测试。温育1(或2)小时后，通过将NaCl浓度调节至最高达1M来增加裂解缓冲液的离子强度。在这些条件下，Benzonase被抑制，但病毒载体聚集的风险降低，和/或病毒颗粒的聚集体溶解(如果这个过程是可逆的)。在这样的盐度下，病毒与塑料材料的相互作用应该会减少。

另一种可能性是在裂解后紧接着进行使用内切核酸酶/Benzonase的单独额外步骤，以限制细胞裂解和内切核酸酶活性之间的干扰。由于裂解步骤将在高离子强度下进行，因此使用内切核酸酶的这个额外步骤应该使用盐激活核酸酶来完成。

注意：如果添加了内切核酸酶，在通过qPCR对病毒滴度进行定量之前，需要检查是否需要使其灭活。

步骤#4-细胞裂解后洗涤生物反应器

细胞裂解2小时后，进行洗涤，以去除被捕获在固定床(纤维、细胞碎片、细胞外基质)中和/或与生物反应器壁相互作用的rAAV2。一旦生物反应器清空，用洗涤溶液将其填充，然后再清空它。再次重复此步骤。洗涤两次，因为如步骤#2中所述，对生物反应器进行填充/清空对rAAV的收获有积极影响。

洗涤溶液配方如下：

-PBS

-2.5mM KCl

-1mM MgCl₂

-0.1％(v/v)Pluronic

-10mM Tris-pH8

注意：与冲洗溶液相比，洗涤溶液的pH更偏碱性。

实施例3：根据本发明的实施方式，从固定床生物反应器中收获和回收目标生物分子的示例性流程

图3中描绘了在以1cm/s的搅拌(液位相对于固定床结构以1cm/s的速度移动)下，收获和回收目标生物分子的示例性流程，描述如下。

1.在细胞裂解之前，向SN(上清液)中添加0.1％的Pluronic(以达到0.2％的最终浓度)

2.使用包括2.5mM KCl、1mM MgCl₂、0.1％ Pluronic和Tris pH7的洗涤缓冲液，进行2次洗涤步骤。

3.使用包括曲拉通1％、NaCl 1M、0.1％ Pluronic和Tris pH8的裂解溶液，分别进行2次、每次30分钟的裂解步骤。

4.使用包括2.5mM KCl、1mM MgCl₂、0.1％ Pluronic和Tris pH8的冲洗缓冲液，进行2次冲洗步骤。

5.使用包括曲拉通1％、柠檬酸pH3.0、0.1％pluronic的裂解溶液，分别进行1次30分钟的裂解步骤。

6.使用包括2.5mM KCl、1mM MgCl₂、0.1％ Pluronic和Tris pH8的冲洗缓冲液——在37℃下预热，进行2次冲洗步骤。

7.在包括2.5mM KCl、1mM MgCl₂、0.1％pluronic和Tris pH8的缓冲液中，添加DNase(200U/ml)，在37℃下进行30分钟。

8.使用包括2.5mM KCl、1mM MgCl₂、0.1％ Pluronic和Tris pH8的冲洗缓冲液，进行2次冲洗步骤。

9.使用包括曲拉通1％、NaCl 1M、0.1％ Pluronic和Tris pH8的裂解溶液，进行1次30分钟的裂解步骤。

10.使用包括2.5mM KCl、1mM MgCl₂、0.1％ Pluronic和Tris pH8的冲洗缓冲液，进行2次冲洗步骤。

因此，洗涤缓冲液的pH为7，冲洗缓冲液的pH为8。

实施例4：从具有固定床的生物反应器(来自Univercells Technologies的 “scale-X hydro^TM”生物反应器)中收获AAV

图4中描绘了AAV的收获和回收的示例性流程，描述如下。

细胞外AAV的收获

在生产结束时，停止再循环。

向生物反应器的培养基和再循环回路中添加0.1％(v/v)的Pluronic F-68，并继续控制运行多于30分钟。清空生物反应器容器(空隙体积～90mL)，并收集生物反应器和再循环回路的样品。收集生物反应器和再循环回路的上清液的代表性样品，以估算在漂浮细胞中存在的AAV的量。

进行2次(或更多次)冲洗

加入～0.7L的预热的(37℃)冲洗缓冲液，以将生物反应器填充至最高达～0.8L。

冲洗缓冲液(pH7)包括：

-PBS

-2.5mM KCl

-1mM MgCl₂

-0.1％ Pluronic F-68

施加810rpm的搅拌速度5min，然后清空生物反应器。重复用冲洗缓冲液填充、混合5min和清空步骤一次。

细胞裂解和AAV的收获(步骤#1)

向生物反应器中加入～0.7L的预热的裂解溶液，并在37℃下以810rpm混合2h，以达到0.8L。进行来回循环(每30min一次)，因为对固定床的洗出效果有助于回收病毒。

曲拉通-benzonase裂解缓冲液#1(pH8)包括：

-1％曲拉通(v/v)

-20U/mL Benzonase

-含有137mM NaCl的PBS

-10mM Tris

-2mM MgCl₂

-0.1％(v/v)Pluronic F-68

在温育2小时后，通过使用5M NaCl储备溶液将NaCl浓度调节至最高达1M(最终浓度)来增加裂解缓冲液的离子强度(添加140mL的5MNaCl——从收获容器内部去除一些体积，以便能够在0.8L下运行生物反应器)。施加810rpm的搅拌速度30min，然后清空生物反应器。

进行来回循环(每15min一次)，因为对固定床的洗出效果有助于回收病毒。NaCl储备溶液包括5M NaCl。

细胞裂解和AAV的收获(步骤#2和#3)

向生物反应器中加入预热的裂解溶液，并在37℃下以810rpm混合30min。进行来回循环(每15min一次)，因为对固定床的洗出效果有助于回收病毒。重复用冲洗缓冲液填充、混合30min和清空步骤一次。

曲拉通-盐裂解缓冲液#2(pH8)包括：

-1％曲拉通(v/v)

-1M NaCl

-PBS

-10mM Tris

-2mM MgCl₂

-0.1％(v/v)Pluronic F-68

洗涤

洗涤缓冲液(pH8)包括：

-PBS

-2.5mM KCl

-1mM MgCl₂

-10mM Tris

-0.1％(v/v)Pluronic F-68

实施例5：结构化固定床生物反应器——通过加入振动步骤，AAV回收率提高了 15％。

运行1	总回收	/cm²	/细胞)
				上清液中的总AAV细胞	4.05E+12
进行振动的总细胞内	2.20E+14
				未进行振动的总细胞内	1.91E+14
进行振动的总AAV	2.25E+14	9.36E+09	5.35E+04
				未进行振动的总AAV	1.95E+14	8.11E+09	4.63E+04
振动增益	+15％
				进行振动的细胞内/细胞外	98％

运行2	总计	/cm²	/细胞)
				总上清液	1.13E+13
进行振动的总细胞内	6.36E+13
				未进行振动的总细胞内	3.95E+13
进行振动的总AAV	7.49E+13	3.12E+09	1.78E+04
				未进行振动的总AAV	5.08E+13	2.12E+09	1.21E+04
振动增益	+48％
				进行振动的细胞内/细胞外	85％

本发明绝不限于实施例中所描述的和/或附图中所示的那些实施方式。相反，根据本发明的方法可以在不脱离本发明范围的前提下，以许多不同的方式得以实现。

Claims

1.一种从固定床生物反应器中培养的细胞中获得一种或多种目标生物分子的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述机械作用选自搅拌、振动、涡旋或者移动所述生物反应器内部的溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述细胞的所述裂解之后，通过用洗涤溶液和/或灭活溶液填充和/或排空所述生物反应器来进行一个或多个洗涤步骤。

4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中，所述机械作用是施加于所述生物反应器的振动，所述振动具有在20至100Hz的频率。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述振动与移动所述生物反应器内部的溶液同时进行。

6.根据前述权利要求2至5中任一项所述的方法，其中，所述振动通过振动台施加。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述裂解溶液包括至少一种洗涤剂，诸如曲拉通X-100、吐温20或吐温80。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述裂解溶液进一步包括DNase和/或表面活性剂。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在裂解步骤和/或洗涤步骤期间使用包括0.5至1M NaCl的溶液。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述溶液是通过在所述裂解步骤期间增加所述裂解溶液的离子强度而获得的。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括使用具有低于或高于所述目标生物分子的等电点的pH的裂解溶液。

12.一种系统，包括：搅拌装置(18)和固定系统(210)，所述搅拌装置包括适于接收生物反应器的平台(202)；

以及，所述固定系统包括用于将所述生物反应器固持至所述平台(202)的至少一个紧固件(212)，以及适于安装至所述生物反应器并接收所述至少一个紧固件的桥结构(214)。

13.根据权利要求12所述的系统，其中，所述紧固件包括可调节绑带，以及其中所述固定系统进一步包括用于定位和引导所述绑带放置的一个或多个绑带引导件。

14.根据前述权利要求12-13中任一项所述的系统，其中，所述固定系统包括用于接合所述生物反应器的盖或罩的环形部分。

15.根据前述权利要求12-14中任一项所述的系统，其中，所述搅拌装置包括振动台，所述振动台包括所述生物反应器放置在其上的占位件。