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CN120099197A - 一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法及其应用 - Google Patents

一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法及其应用 Download PDF

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CN120099197A
CN120099197A CN202510273977.9A CN202510273977A CN120099197A CN 120099197 A CN120099197 A CN 120099197A CN 202510273977 A CN202510273977 A CN 202510273977A CN 120099197 A CN120099197 A CN 120099197A
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CN
China
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bacteria
detection method
rapid detection
sample
dna
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CN202510273977.9A
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张小芃
史国放
杜巧燕
唐振宇
夏斯琴
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Hanning Chemical Shanghai Co ltd
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Hanning Chemical Shanghai Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法及其应用。所述检测方法包括以下步骤：(1)取待测样品在增菌液中进行增菌培养，离心收集增菌培养的菌体，对菌体进行DNA提取；(2)对提取到的DNA进行PCR扩增，根据扩增结果确定待测样品中是否含有日勾维多细菌源菌；所述PCR扩增的靶标基因为A8H26_RS01130基因。本发明涉及的检测方法以A8H26_RS01130基因为PCR扩增的靶标基因，能够24小时内完成精准识别日勾维多细菌源菌的少量污染，可为化妆品行业提供高效、可靠的质量控制方案。

Description

一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法及其应用。
背景技术
近年来，化妆品微生物污染问题备受关注，其中日勾维多细菌源菌(Pluralibacter gergoviae)的污染风险日益凸显。该菌虽未列入《化妆品安全技术规范》强制检测项目，但作为条件致病菌，在免疫力低下人群中可引发泌尿系统及呼吸道感染，具有潜在的公共卫生威胁。研究表明，日勾维多细菌对传统防腐剂(如对羟基苯甲酸酯类)表现出显著耐受性，且在面膜、膏霜等化妆品中较常见，其危害性不容忽视。
目前，化妆品微生物检测主要依赖传统平板培养法，培养周期较长，无法满足生产质控的时效性需求，且依赖人工判读，易引入主观误差。此外，目前现行标准均未收录日勾维多细菌源菌的特异性检测方法，市售试剂盒虽可检测肠杆菌科细菌，但其靶向基因为产生碳青霉烯酶的基因，缺乏对日勾维多细菌源菌的特异性检测。更关键的是，相比其他致病菌株，日勾维多细菌源菌的毒性较弱，企业及监管部门对其防控和重视不足，这些问题导致无法及时且准确地检测出化妆品中的日勾维多细菌源菌，可能对消费者的健康造成潜在威胁。
CN116287342A公开的核酸质谱方法可同时检测4种肠杆菌科细菌及8种耐碳青霉烯基因，但缺乏对日勾维多细菌源菌的特异性识别。
CN105803064A公开了基于LAMP技术的检测体系，通过筛选到的肠杆菌科致病菌共有基因序列提高了检测效率，但其靶标基因局限于肠杆菌科，仍无法适配日勾维多细菌源菌的检测需求。
CN116790778A公开了基于日勾维多细菌源菌看家基因(gyrB、infB、ropB和atpD)的双重qPCR检测方法，但多重扩增可能引入交叉反应，影响检测特异性，且未涉及DNA提取过程对日勾维多细菌源菌检测结果的影响，难以实现快速、高通量的工业级应用。
综上所述，如何开发一种能够快速、高灵敏度且特异性强的检测化妆品中日勾维多细菌源菌污染的检测方法，成为目前亟待解决的技术问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法及其应用。本发明涉及的检测方法以A8H26_RS01130基因为PCR扩增的靶标基因，能够24小时内完成精准识别日勾维多细菌源菌的少量污染，可为化妆品行业提供高效、可靠的质量控制方案。
第一方面，本发明提供一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)取待测样品在增菌液中进行增菌培养，离心收集增菌培养的菌体，对菌体进行DNA提取。
(2)对提取到的DNA进行PCR扩增，根据扩增结果确定待测样品中是否含有日勾维多细菌源菌。
所述PCR扩增的靶标基因为A8H26_RS01130基因(编码假定蛋白，GeneBank登录号：NZ_CP020388)。
本发明创造性地选择A8H26_RS01130基因作为PCR扩增的靶标基因，经BLAST比对验证为日勾维多细菌源菌独有。该基因在日勾维多细菌源菌中高度保守且无同源序列，避免了交叉反应，提高了检测的特异性。
同时，本发明在对菌体进行DNA提取前将待测样品在增菌液中进行增菌培养，可以显著提升对低浓度菌的富集效率，降低了检测限。
优选地，步骤(1)所述待测样品与增菌液的质量体积比为1:(50-150)g/mL。
其中50-150中的具体点值可以选择50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、110mL、120mL、130mL、140mL、150mL等。
本发明中，将待测样品与增菌液的质量比控制在1:(50-150)，可以利于特定的日勾维多细菌源菌的生长，提高增菌培养后增菌液中细菌的菌浓度。
优选地，步骤(1)所述增菌液包括SCDLP培养基。
优选地，步骤(1)所述增菌液还包括组氨酸。
本发明中，在增菌液中添加组氨酸，可以降低待测样品中防腐剂等干扰物质对日勾维多细菌源菌增菌效果的不良影响。
优选地，所述增菌液中组氨酸的添加量为3.0-6.0g/L。
其中，3.0-6.0g/L中的具体点值可以选择3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/L、5.5g/L、6.0g/L等。
优选地，步骤(1)所述DNA提取包括以下步骤：
(a)将菌体与裂解液混合，机械破碎，进行裂解反应。
(b)对菌体裂解的产物进行磁珠吸附、洗涤、洗脱，得到DNA。
本发明中，在DNA提取的过程中，机械破碎可以利于细菌中核酸的释放。
优选地，步骤(a)所述裂解反应的温度为60-70℃，时间为15-30min。
其中，60-70℃中的具体点值可以选择60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃等，15-30min中的具体点值可以选择15min、17min、19min、21min、23min、25min、27min、30min等。
本发明中，将裂解温度控制在60-70℃，可以提高裂解效率，提高提取得到的核酸浓度和核酸质量。
优选地，步骤(a)所述菌体与裂解液混合的过程中，増菌培养后的増菌液与裂解液的质量比为(2-5):1。
其中，2-5中的具体点值可以选择2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等。
优选地，步骤(2)所述PCR扩增的正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列，SEQ ID NO:1的具体序列为：GCGGCGACAATATAGACCGAC。
优选地，所述PCR扩增的反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列，SEQID NO:2的具体序列为：CGAGATTAGCGCTGCTGGAG。
优选地，所述PCR扩增的Taqman探针的核酸序列包括SEQ ID NO:3所示的序列，SEQID NO:3的具体序列为：CAGGATCAGGCCGCCGAAATAGACCA。
优选地，所述Taqman探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM荧光基团，所述淬灭基团包括BHQ1淬灭基团。
本发明中，上述引物序列与靶标基因A8H26_RS01130基因特异性好，利用上述引物序列进行PCR扩增和检测，可以提高检测结果的准确性。
优选地，步骤(2)所述PCR扩增包括qPCR、数字PCR或ddPCR中的任意一种。
优选地，步骤(2)所述PCR扩增的体系中，正向引物、反向引物和Taqman探针的终浓度各自独立地为0.1-0.5μM。
其中，0.1-0.5μM中的具体点值可以选择0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM等。
优选地，步骤(2)所述PCR反应的程序包括：
步骤1：94-96℃，20-50s；步骤2：94-96℃，3-7s；步骤3：60-62℃，30-60s；步骤2和步骤3重复35-45个循环。
其中，94-96℃中的具体点值可以选择94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃等，60-62℃中的具体点值可以选择60℃、60.5℃、61℃、61.5℃、62℃等，20-50s中的具体点值可以选择20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s等，3-7s中的具体点值可以选择3s、4s、5s、6s、7s等，30-60s中的具体点值可以选择30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s等，35-45个中的具体点值可以选择35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45等。
优选地，步骤(2)所述确定待测样品中是否含有日勾维多细菌源菌的标准为：
待测样品三次重复试验的DNA纯度为1.8-2.0，Ct差值≤0.3-0.6，且qPCR扩增曲线的Ct值≤Ct阈值，则判断为阳性；qPCR扩增曲线的Ct值＞Ct阈值，则判断为阳性；所述DNA纯度为A260/A280的值，所述Ct阈值为32-36。
其中，1.8-2.0中的具体点值可以选择1.8、1.85、1.9、1.95、2.0等，0.3-0.6中的具体点值可以选择0.3、0.4、0.5、0.6等，32-36中的具体点值可以选择32、33、34、35、36等。
第二方面，本发明提供一种用于检测日勾维多细菌源菌的实时荧光检测试剂盒，所述实时荧光检测试剂盒中含有第一方面中所述的正向引物、反向引物和Taqman探针。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的快速检测方法和/或第二方面所述的实时荧光检测试剂盒在化妆品检测中的应用。
优选地，所述化妆品包括爽肤水、乳液、面膜、膏霜、洗发水或沐浴露中的任意一种。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法，检测方法以A8H26_RS01130基因为PCR扩增的靶标基因，该基因在日勾维多细菌源菌中高度保守且无同源序列，避免了交叉反应，提高了检测的特异性，能够24小时内完成精准识别日勾维多细菌源菌的少量污染，检测灵敏度达102CFU/mL。
进一步地，本发明在对菌体进行DNA提取前将待测样品在增菌液中进行增菌培养，可以显著提升对低浓度菌的富集效率，降低了检测限；并且，在增菌液中添加组氨酸，可以降低待测样品中防腐剂等干扰物质对日勾维多细菌源菌增菌效果的不良影响。
进一步地，在DNA提取的过程中，机械破碎可以更好地释放细菌中的核酸；此外，将裂解温度控制在55-65℃，可以提高裂解效率，提高提取得到的核酸浓度和核酸质量。进一步地，通过使用机械破碎与控制裂解温度，结合磁珠吸附技术，能够显著提高DNA得率与质量，单批次处理时间≤1h。
进一步地，在PCR扩增过程中，正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列，反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列，Taqman探针的核酸序列包括SEQ IDNO:3所示的序列，上述引物序列与靶标基因A8H26_RS01130基因特异性好，利用上述引物序列进行PCR扩增和检测，可以提高检测结果的准确性。
进一步地，本发明涉及的检测方法通过全流程质控设计，可有效避免假阳性/假阴性结果，单批次可处理96样本，为化妆品行业提供高效、可靠的质量控制方案。
附图说明
图1是阳性对照与阴性对照样品对靶标基因检测的扩增曲线。
图2是不同浓度日勾维多细菌源菌污染沐浴露样品对靶标基因检测的扩增曲线。
图3是不同浓度日勾维多细菌源菌污染膏霜样品对靶标基因检测的扩增曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中涉及的日勾维多细菌源菌来源于上海保藏生物技术中心，菌株编号为SHBCC D18003。
实施例1
取样与増菌：
(1)取样：
分别从已知污染了日勾维多细菌源菌的乳液化妆品中称取0.10g或1.0g样品。
(2)增菌液配置：
(2.1)含组氨酸的SCDLP增菌液配置：酪蛋白胨15.0g、大豆蛋白胨5.0g、氯化钠3.0g、葡萄糖2.5g、磷酸氢二钾3.0g、组氨酸4.0g、卵磷脂1.5g、吐温-80 8.0g，蒸馏水加至1L。将上述成分加热溶解后，调pH值为7.2，在121℃高压灭菌20min，得到含组氨酸的SCDLP增菌液。
(2.2)不含组氨酸的SCDLP增菌液配置：其与步骤(2.1)配方的区别仅在于不包含组氨酸，其余组分与步骤(2.1)保持一致，配置得到不含组氨酸的SCDLP增菌液。
(3)増菌培养：
分别将0.10g样品与9.9mL灭菌的含组氨酸的SCDLP增菌液(质量体积比为1:99)、1.00g样品与9.0mL灭菌的含组氨酸的SCDLP增菌液(质量体积比为1:9)、0.10g样品与19.9mL灭菌的含组氨酸的SCDLP增菌液混合(即质量体积比为1:199)混合，涡旋振荡后于35℃、200rpm条件下培养20h。
每组测试不少于3份样品，计算每组测试的平均增菌菌浓。各实验组増菌效果如表1所示，可见，污染了日勾维多细菌源菌的化妆品在含组氨酸的SCDLP增菌液中增菌后，尽管样品与SCDLP增菌液的质量体积比为1:9时增菌液中的初始污染量相对较高，但混合培养比例为1:99时增菌后的增菌液中的细菌数更多；然而，增加SCDLP增菌液的体积至混合培养比例为1:199时，増菌速度会显著降低，增菌时间延长，20h的増菌浓度同样低于混合培养比例为1:99时的增菌浓度。
此外，在SCDLP增菌液中添加组氨酸，可以进一步提升増菌浓度。
这表明本发明中待测样品与包含组氨酸的增菌液以质量体积比为1:(50-150)混合时，可以使用较少的待测样品増菌得到更高浓度的菌液，从而在缩短检测时间的同时，提高对日勾维多细菌源菌的检测能力。
表1
实施例2
DNA提取：
(1)取样：取增菌培养后的增菌液1mL，10,000g离心2min离心收集菌体，用无菌PBS洗涤3次。
(2)DNA提取：采用磁珠法DNA提取试剂盒(Magnetic Bacterial/Fungal DNA Kit)对菌体核酸进行提取，具体步骤如下：
(2.1)裂解：收集好的增菌菌体中加入300μL试剂盒中的裂解液，使用/不适用机械破碎，65℃/55℃/75℃水浴下振荡裂解20min；
(2.2)DNA提取：裂解完成后参照试剂盒说明加入磁珠悬浮液，高速涡旋10min使磁珠吸附DNA。之后加入试剂盒中的洗涤液A涡旋打散磁珠后转移至磁力架进行磁分离至溶液澄清，吸弃溶液后加入洗涤液B、C(操作同上，涡旋打散磁珠后转移至磁力架进行磁分离至溶液澄清)以去除杂质。吸弃洗涤液C后开盖干燥至洗涤液中的乙醇完全挥发。加入70μL洗脱液，高速涡旋并60℃温浴以洗脱DNA，转移至磁力架上进行磁分离至溶液澄清，吸取溶液并保存，获得高纯度DNA。
(2.3)使用Thermo Scientific NanoDrop分光光度计检测DNA浓度及纯度。
每组裂解条件的测试不少于3份样品，计算每组测试的DNA浓度和纯度。测试结果如表2所示，可见，机械破碎有助于日勾维多细菌源菌更加彻底地裂解，从而提取到浓度更高、质量更优的DNA。同时，将裂解温度控制在60-70℃，可以进一步提高裂解效率，提高核酸浓度和核酸质量，进而提升日勾维多细菌源菌检测的灵敏度。
表2
实验条件 核酸浓度(ng/μL) A260/280
机械破碎&65℃裂解 216.0±3.4 1.89
无机械破碎&65℃裂解 90.1±6.8 1.63
机械破碎&55℃裂解 113.7±5.6 1.78
机械破碎&75℃裂解 207.8±6.2 1.83
实施例3
特异性扩增检测：
(1)准备试样：
阳性对照：参照实施例1-2的方法提取日勾维多细菌源菌富集菌液(菌浓度为2.1×109CFU/mL)的DNA；
阴性对照：参照实施例1-2的方法分别提取大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯菌的DNA，将四种DNA进行等核酸浓度混合，混合得到浓度为228.4ng/μL的阴性对照DNA混液。
(2)扩增体系：
qPCR扩增的正向引物的核酸序列为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:1的具体序列为：GCGGCGACAATATAGACCGAC。
qPCR扩增的反向引物的核酸序列为SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:2的具体序列为：CGAGATTAGCGCTGCTGGAG。
qPCR扩增的Taqman探针的核酸序列为SEQ ID NO:3，且核酸序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，SEQ ID NO:3的具体序列为：CAGGATCAGGCCGCCGAAATAGACCA。
采用Probe qPCR SuperMix UDG试剂对步骤(1)提取的DNA进行扩增，20μL的扩增体系如表3所示。
表3
组分 体积 终浓度
模板 1μL /
正向引物(10μM) 0.4μL 0.2μM
反向引物(10μM) 0.4μL 0.2μM
探针(10μM) 0.4μL 0.2μM
qPCR反应缓冲液(2×) 10μL 1×
惰性参比染料(2×) 0.4μL 1×
无核酸酶水 至20μL -
总体积 20μL -
(3)扩增程序：
预变性：95℃，30s；
循环扩增(40次)：95℃，5s(变性)→62℃，40s(退火/延伸)。
(4)结果判读：
结果判定：若样品Ct值≤35且扩增曲线呈S型，判定为阳性；若样品Ct值＞35，判定为阴性；
重复性验证：同一样品设置3次重复，Ct值差异≤0.50。
检测结果如图1所示，阳性对照Ct值＜35，为阳性结果。而阴性对照Ct值无法测定(Ct值＞35)，为阴性结果。阳性对照和阴性对照的Ct值统计结果如表4所示，可以看出，本发明的方法能够很好地将日勾维多细菌源菌检出，即日勾维多细菌源菌扩增为阳性，而其他肠杆菌科菌株：大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌的混合菌的DNA扩增为阴性。
表4
样本类型 核酸浓度(ng/μL) A260/280 Ct值(均值±SD) 检测结果
阳性对照 204.5 1.84 15.968±0.23 阳性
阴性对照 228.4 1.87 Undetermined 阴性
实施例4
本实施例对沐浴露中日勾维多细菌源菌进行检测。
(1)制备模拟污染样本：
取0.09g无污染沐浴露样品与10μL梯度稀释后的富集菌液(102CFU/mL、103CFU/mL和104CFU/mL)混合(即沐浴露样品中的日勾维多细菌源菌污染量为101CFU/mL、102CFU/mL和103CFU/mL)，与9.9mL灭菌的含组氨酸的SCDLP增菌液混合，参照实施例1中的方法进行增菌培养。
(2)DNA提取：
参照实施例2的方法，使用机械破碎，65℃水浴下振荡裂解20min进行裂解，提取增菌液中的DNA。
(3)特异性扩增检测：
参照实施例3中的方法，进行特异性扩增检测。
检测结果显示如图2和表5所示，当模拟日勾维多细菌源菌污染沐浴露样品的污染量为102CFU/mL和103CFU/mL时，经过增菌培养、DNA提取及qPCR扩增后，Ct值均＜35，为阳性结果。本发明方法能够有效检测出沐浴露中污染的日勾维多细菌源菌，检测灵敏度达102CFU/mL。
表5
实施例5
本实施例对膏霜中日勾维多细菌源菌进行检测，其与实施例4的区别仅在于，将步骤(1)的沐浴露样品替换为等质量的膏霜样本，其余步骤与实施例4保持一致。
检测结果显示如图3和表6所示，当模拟日勾维多细菌源菌污染膏霜样品的污染量为102CFU/mL和103CFU/mL时，经过增菌培养、DNA提取及qPCR扩增后，Ct值均＜35，为阳性结果。本发明方法能够有效检测出膏霜中污染的日勾维多细菌源菌，检测灵敏度达102CFU/mL。
表6
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种日勾维多细菌源菌的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)取待测样品在增菌液中进行增菌培养，离心收集增菌培养的菌体，对菌体进行DNA提取；
(2)对提取到的DNA进行PCR扩增，根据扩增结果确定待测样品中是否含有日勾维多细菌源菌；
所述PCR扩增的靶标基因为A8H26_RS01130基因。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品与增菌液的质量体积比为1:(50-150)g/mL。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)所述增菌液包括SCDLP培养基；
优选地，步骤(1)所述增菌液还包括组氨酸；
优选地，所述增菌液中组氨酸的添加量为3.0-6.0g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)所述DNA提取包括以下步骤：
(a)将菌体与裂解液混合，机械破碎，进行裂解反应；
(b)对菌体裂解的产物进行磁珠吸附、洗涤、洗脱，得到DNA。
5.根据权利要求4所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(a)所述裂解反应的温度为60-70℃，时间为15-30min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的正向引物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列；
优选地，所述PCR扩增的反向引物的核酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；
优选地，所述PCR扩增的Taqman探针的核酸序列包括SEQ ID NO:3所示的序列；
优选地，所述Taqman探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
优选地，所述PCR扩增包括qPCR、数字PCR或ddPCR中的任意一种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的体系中，正向引物、反向引物和Taqman探针的终浓度各自独立地为0.1-0.5μM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR反应的程序包括：
步骤1：94-96℃，20-50s；步骤2：94-96℃，3-7s；步骤3：60-62℃，30-60s；步骤2和步骤3重复35-45个循环。
9.一种用于检测日勾维多细菌源菌的实时荧光检测试剂盒，其特征在于，所述实时荧光检测试剂盒中含有权利要求6中所述的正向引物、反向引物和Taqman探针。
10.一种如权利要求1-8任一项所述的快速检测方法和/或权利要求9所述的实时荧光检测试剂盒在化妆品检测中的应用；
优选地，所述化妆品包括爽肤水、乳液、面膜、膏霜、洗发水或沐浴露中的任意一种。
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