CN120099015B - 膜蛋白Sec63基因及其dsRNA在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及膜蛋白Sec63基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。本发明对飞蝗的Sec63基因进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO：1的Sec63基因；然后选择序列为SEQ ID NO：2的该基因片段，用于双链RNA(dsRNA)的合成。该基因的dsRNA注入飞蝗的体腔后，可沉默特定的Sec63基因，导致飞蝗在蜕皮时无法顺利蜕出而死亡。本发明为基于RNA干扰的害虫防治提供新的特异性分子靶标，为害虫防治提供新的技术途径。

Description

膜蛋白Sec63基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及膜蛋白Sec63基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。

背景技术

核酸生物农药是利用害虫或病原自身的dsRNA，实现靶标基因转录水平的沉默，从而抑制害虫或病原体生长发育，达到防治病虫害的目的。相较于传统农药，核酸生物农药具有杀虫专一性强；靶标选择范围广；绿色安全等优点。然而核酸生物农药研发亟需突破高效特异抗虫dsRNA靶标筛选的瓶颈。表皮是害虫抵御外界不良坏境与病原物的第一道防线。昆虫在个体发育过程中旧表皮不断蜕去，新表皮随即形成，蜕皮是节肢动物特有的生物学现象，而人类和高等哺乳动物缺少这一生物学特性，因此，表皮作为害虫防治的安全靶标备受关注。

飞蝗Locusta migratoria，是一种洲际性的农业害虫。它具有暴发性、群集性和迁飞性的特点，一旦发生，不仅涉及面广，而且来势凶猛，致灾严重。Sec63是一种飞蝗膜蛋白，目前有关通过膜蛋白Sec63基因来防治害虫的RNA干扰技术未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供膜蛋白Sec63基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面是一种飞蝗膜蛋白Sec63基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是通过对飞蝗转录组数据库的搜索得到，该序列的开放阅读框2277bp，编码785个氨基酸。

本发明的第二方面是一种飞蝗膜蛋白Sec63基因片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

本发明的第三方面是一种飞蝗膜蛋白Sec63基因的dsRNA，其是利用第二方面所述的飞蝗膜蛋白Sec63基因片段合成。

本发明的第四方面是第三方面所述的飞蝗膜蛋白Sec63基因的dsRNA的合成方法，包括如下步骤：根据序列SEQ ID NO：1设计如SEQ ID NO：3所示的上游引物和如SEQ ID NO：4所示的下游引物，然后通过PCR扩增获得如SEQ ID NO：2所示的产物，其经过纯化、转录后合成dsRNA。

本发明的第五方面是第三方面所述的飞蝗膜蛋白Sec63基因的dsRNA在害虫防治中的应用。

进一步地，将dsRNA制备成喷洒式杀虫剂或者饵剂，或者将dsRNA转入害虫摄食植物体。

进一步地，害虫为飞蝗。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明飞蝗膜蛋白Sec63基因的dsRNA注入飞蝗的体腔后，可以特异性地沉默飞蝗膜蛋白Sec63基因的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡，为基于RNA干扰的害虫防治提供新的特异性分子靶标，为害虫防治提供新的技术途径。

附图说明

图1：3龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后对Sec63基因mRNA表达的影响(其中**P<0.005)。

图2：3龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后对飞蝗表型的影响(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA，即dsLmSec63)。

图3：5龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后对Sec63基因mRNA表达的影响(其中***P<0.001)。

图4：5龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后对飞蝗表型的影响(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA，即dsLmSec63)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1：飞蝗膜蛋白Sec63基因cDNA全长序列及基因片段的获得

基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗膜蛋白Sec63基因cDNA序列进行搜索，获得飞蝗膜蛋白Sec63基因cDNA全长序列，采用primer premier 5.0软件设计上下游引物用于验证cDNA全长序列，并送往上海生物工程股份有限公司合成。选取生长健康，大小一致雌雄各半的5龄飞蝗若虫4头，并冷冻于液氮中。依照TaKaRa RNAiso Plus试剂盒提取RNA，采用HiScript III qRT SuperMix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此cDNA为模板，结合设计的上下游引物，通过PCR扩增Sec63基因cDNA全长序列。将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，并送往上海生物工程股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：1。

实施例2：飞蝗膜蛋白Sec63基因dsRNA的合成

1)飞蝗膜蛋白Sec63基因dsRNA引物的设计

基于实施例1所得到飞蝗膜蛋白Sec63基因的序列SEQ ID NO：1，采用primerpremier5.0软件设计dsRNA引物，引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，上下游引物均携带T7启动子序列。所有引物均由上海生物工程股份有限公司合成。

2)飞蝗膜蛋白Sec63基因dsRNA的合成

利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的上下游引物，以实施例中1的cDNA模板进行PCR扩增。将扩增的PCR产物，其序列为SEQ ID NO：2，经FastPure Gel DNAExtraction MiniKit(Vazyme)试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA(即dsLmSec63)。使用NANODROP 2000(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到2μg/μL。保存于-80℃超级低温冰箱备用。

实施例3：飞蝗膜蛋白Sec63基因dsRNA致死3龄飞蝗实验

1)飞蝗膜蛋白Sec63基因dsRNA注射

选取3龄第一天大小均一、健康状况一致的若虫用于注射实施例2合成的dsRNA。25μl规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，顺着血液流动的方向，侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，要避开气门。注射dsRNA的量为3μg，并设置dsGFP(3μg)的对照组，每组10头虫子，3个生物学重复，共计30头。注射完毕后，将虫子用1L的烧杯至于人工气候箱中进行饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)，给以新鲜小麦幼苗和适当的光照，喷水保持湿度。

2)3龄飞蝗膜蛋白Sec63基因沉默检测

分别收集注射dsGFP和dsLmSec63 24h后若虫进行总RNA提取，对照和注射dsLmSec63组各4个生物学重复，每个生物学重复3头试虫，并反转录成第一链cDNA，采用RT-qPCR方法分别检测目的基因(LmSec63)和管家基因(β-actin)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsLmSec63组试虫LmSec63基因表达显著降低(图1)。

3)注入dsRNA后3龄飞蝗表型的观察

3龄若虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组5天后开始蜕皮并全部成功蜕至4龄，蜕至4龄后虫体形态活力正常。注射dsLmSec63的处理组30头若虫中有24头均不能完成蜕皮，最终死亡，表型如图2所示：头胸部旧表皮均能够开裂但新旧表皮无法分离，最终导致死亡。

实施例4：飞蝗膜蛋白Sec63基因dsRNA致死5龄飞蝗实验

1)飞蝗膜蛋白Sec63基因dsRNA注射

选取5龄第三天大小均一、健康状况一致的若虫用于注射实施例2合成的dsRNA。25μl规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，顺着血液流动的方向，侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，要避开气门。注射dsRNA的量为10μg，并设置dsGFP(10μg)的对照组，每组10头虫子，3个生物学重复，共计30头。注射完毕后，将虫子用1L的烧杯至于人工气候箱中进行饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)，给以新鲜小麦幼苗和适当的光照，喷水保持湿度。

2)5龄飞蝗膜蛋白Sec63基因沉默检测

分别收集注射dsGFP和dsLmSec63 24h后若虫进行总RNA提取，对照和注射dsLmSec63组各4个生物学重复，每个生物学重复3头试虫，并反转录成第一链cDNA，采用RT-qPCR方法分别检测目的基因(LmSec63)和管家基因(β-actin)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsLmSec63组试虫LmSec63基因表达显著降低(图3)。

3)注入dsRNA后5龄飞蝗表型的观察

5龄若虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组7天后开始蜕皮并全部成功蜕至成虫，蜕至成虫后虫体形态活力正常。注射dsLmSec63的处理组30头若虫中有25头均不能完成蜕皮，最终死亡，表型如图4所示：头胸部旧表皮均能够开裂但新旧表皮无法分离，最终导致死亡。

以上所述仅为更好解释本发明的实施例，并非对其限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或同等替换，均属本发明所涵盖的范围内。

SEQ ID NO：1

ATGGGTGGACAAAAATTTCAGTATGATGAAAGCGGTGGAACGTTTTTCTACTTCTTATTGTCATTTTTGGCCTTACTTCTCATACCAGGAACTTATTATTGGTGGCCACGTAAACGACGTGAAGATCCGGCCAAATATGAAAAGGAATGCCATTGTGATGACTGCAAAAAGAAAAAACTTATACTCCAAGCAAATGAGCCCTGGAAAGGCACAAAACAGATGCTTACGAAACTTCTTATTATATCTGGATGGTTGATATTAGCACTTTTGGCATATAAGGTTTCCCAGTTTGATTATGAGTATGCAAATTTTGATCCATATGAGATTCTTGGAATACCTCTGGGTGCTTCACAAGCTGATATCCGTAAACAGTACCGTAAACTGTCACTTATTCTGCATCCAGATAAGGAAACGGGAAATGAAAAGGCATTTATGAAACTGACAAAAGCTTATCAGGCTCTGACTGATGAGGAGGCACGGCGTAACTGGGAGAAGTACGGCAACCCTGATGGACCTGGTGCAATGAGTTTTGGTATAGCACTTCCATCGTGGATCGTTGAGAAAGAGAACTCCGTCTGGGTTCTTGGATTGTATGCTCTTGTTTTCATGGTTGCTTTGCCCACTGTTGTGGGAATGTGGTGGTACAAGTCTATTCGATATTCTGGAGACCAGGTTCTGCTTAATACTACACAGATGTATTACTATTTCTTTCACAAAACACCTTCAATGGCTCTAAAAAGAGTAATTATGATCCTTGCAGCCTCTCTGGAGTTTGAGAAGAAGCACAACAGTGAGATTGTTGAGAGACCTACTGACAATGAAGAAGTTCCTCATCTCATTAAACAGATATCAAACCTCAGTGAGAAGAATCGTGAGCGGCCTCTGTGCTTCCTGTATTCTTTGAAGGCACGTGCTATCATTCATGCGCATCTGTCTCGAATTCCACTCAACCCAGAAACCTTGGACAAGGATCGGCAGTACATAGTTAAAAAATGCCCATATCTTATTCAAGAAATGGTCAACTGCGTGTCCCAGCTCATTCTTCTGGCATATGCCAGGCGAATACCGAGACTGCCAAATATTGAGACAATAGAAAACTGCATGAAACTGTGTCCAATGATAGTACAGGCTATGTGGGAATATAAAAGTCCACTCTTACAGCTACCATATGTTACGGATGACAACCTGAAGTATTTTGTAAATAAAAAAAGATATATAAAAACGATCCAACAGTTTGCACAACTGAAACATGAAGATAGGAGAAGCATTTTACGAAATCTTTCTGATGAACAATACAATGATGTTATGAAGGTGGCAGGAAAAATGCCTTACGTTGAGTTCAAAGTGAAATCTGAAGTGATTGATGATGAAAATCCAACTGTCTACACAGCAGGGGCAATTGTCACAGTAACTGTAACACTAATACGTCATGATATGAGCATCCTCTTTGGGGATGATACAAAGGCAGCACAAAATGCTCCTCCTCAGGAGACAGTGGAGGACTTAGCAGAGAAAGAAAAAGAGCAGCCTGCAAAGAAAGAAGAGCAGGCCAAAAAACCAGTGTGGCAAAAGCAACAAAAGAAGGGTAAAAAAACTAACAAGAAGAGCTCGAGGAGTCAAAAAGCTTCATCTAGAAGTACACCTGCCAAGAAGGCTGATGAAAAGCCTCAAGCAACAAATGAGACCCAGGATGTACCTACAAAGAAGGCTACTGCAGAGTCAGGAGATGAAAGTGATACATCAGATGATGAAGTAGAGCGGTCTGATGATGAAGAAAATGAAAACAGTCAGGGAGACAAGAAGGGTTCTTCTGTGGAAGAGGATGACGTTGAGTGGGAGAAATTTCGAGCACGGTTACATAAACGAGAAAAAGTGTTGGAGGGTAGAAGTAAGCAGTCTCACAGTGTCCACTGCCCATTTTTCCCAGAGGATAAACAGGAATATTGGTGGGTATACATCAGTGATCGCAAGAGCCACACTTTATTAACATCTCCATACCACGTGACAGATCTTGTGGAGGAAGAGGAAGTACAGTTAAAATTTACAGCCCCACGATGGCCTGGCATCTATACATTCACTGTTTGTCTGAGGTCAGACTCGTATCTTGGGTTTGACCAAATGCAGGACATAAAGTTGGATGTGAAAGAAGCACCTGAAATACCAACAGAGCATCCTCAGTGGGAAATGTCAGATGAAGAGGAAGATGAACAAGAGGCAGAAGGCAGTGACGTGTCAGAGTTCACGACTGATGAGGATGTTGAAGATGATCAAGATTAA

SEQ ID NO：2

MGGQKFQYDESGGTFFYFLLSFLALLLIPGTYYWWPRKRREDPAKYEKECHCDDCKKKKLILQANEPWKGTKQMLTKLLIISGWLILALLAYKVSQFDYEYANFDPYEILGIPLGASQADIRKQYRKLSLILHPDKETGNEKAFMKLTKAYQALTDEEARRNWEKYGNPDGPGAMSFGIALPSWIVEKENSVWVLGLYALVFMVALPTVVGMWWYKSIRYSGDQVLLNTTQMYYYFFHKTPSMALKRVIMILAASLEFEKKHNSEIVERPTDNEEVPHLIKQISNLSEKNRERPLCFLYSLKARAIIHAHLSRIPLNPETLDKDRQYIVKKCPYLIQEMVNCVSQLILLAYARRIPRLPNIETIENCMKLCPMIVQAMWEYKSPLLQLPYVTDDNLKYFVNKKRYIKTIQQFAQLKHEDRRSILRNLSDEQYNDVMKVAGKMPYVEFKVKSEVIDDENPTVYTAGAIVTVTVTLIRHDMSILFGDDTKAAQNAPPQETVEDLAEKEKEQPAKKEEQAKKPVWQKQQKKGKKTNKKSSRSQKASSRSTPAKKADEKPQATNETQDVPTKKATAESGDESDTSDDEVERSDDEENENSQGDKKGSSVEEDDVEWEKFRARLHKREKVLEGRSKQSHSVHCPFFPEDKQEYWWVYISDRKSHTLLTSPYHVTDLVEEEEVQLKFTAPRWPGIYTFTVCLRSDSYLGFDQMQDIKLDVKEAPEIPTEHPQWEMSDEEEDEQEAEGSDVSEFTTDEDVEDDQD

SEQ ID NO：3

TGGATTGTATGCTCTTGTT

SEQ ID NO：4

TGAGACAATAGAAAACTGC

SEQ ID NO：5

TGGATTGTATGCTCTTGTTTTCATGGTTGCTTTGCCCACTGTTGTGGGAATGTGGTGGTACAAGTCTATTCGATATTCTGGAGACCAGGTTCTGCTTAATACTACACAGATGTATTACTATTTCTTTCACAAAACACCTTCAATGGCTCTAAAAAGAGTAATTATGATCCTTGCAGCCTCTCTGGAGTTTGAGAAGAAGCACAACAGTGAGATTGTTGAGAGACCTACTGACAATGAAGAAGTTCCTCATCTCATTAAACAGATATCAAACCTCAGTGAGAAGAATCGTGAGCGGCCTCTGTGCTTCCTGTATTCTTTGAAGGCACGTGCTATCATTCATGCGCATCTGTCTCGAATTCCACTCAACCCAGAAACCTTGGACAAGGATCGGCAGTACATAGTTAAAAAATGCCCATATCTTATTCAAGAAATGGTCAACTGCGTGTCCCAGCTCATTCTTCTGGCATATGCCAGGCGAATACCGAGACTGCCAAATATTGAGACAATAGAAAACTGC。

Claims (3)

1.一种飞蝗膜蛋白Sec63基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的序列为利用如SEQ IDNO:5所示的膜蛋白Sec63基因片段合成。

2.权利要求1所述的飞蝗膜蛋白Sec63基因的dsRNA在飞蝗防治中的应用。

3.根据权利要求2所述的飞蝗膜蛋白Sec63基因的dsRNA在飞蝗防治中的的应用，其特征在于，将dsRNA制备成喷洒式杀虫剂或者饵剂，或者将dsRNA转入害虫摄食植物体。