CN120082652A - 人结构特异性核酸酶fen1活性的高灵敏可视化检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人结构特异性核酸酶FEN1活性的高灵敏可视化检测试剂盒及其应用。利用FEN1特异性切割FDP中翘起的flap结构生成具有切口的哑铃型DNA探针，在酶催化下该探针的切口处连接产生闭合环状哑铃型DNA探针，进而在扩增引物和酶存在下滚环扩增，且向扩增产物中加入脲酶修饰的信号探针，借助磁性微球分离扩增产物和信号探针互补物并加入到脲酶底物溶液中，利用互补物中脲酶高效催化溶液中尿素导致pH值改变，从而酚红指示剂颜色变化，实现FEN1活性的检测。本发明的试剂盒灵敏度高、操作简便、无需额外仪器设备、成本低、结果可肉眼观测，用于FEN1抑制剂候选药物的筛选，显著提高药物发现效率，应用潜力大。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及FEN1活性检测新方案，是一种基于滚环扩增和酶催化反应的FEN1活性的高灵敏可视化和低成本检测试剂盒，能够为FEN1肿瘤标志物的活性检测以及其抑制剂候选药物筛选提供应用。
背景技术
FEN1是一种兼备5’-3’Flap核酸内切酶、内切核酸酶以及外切核酸酶三大酶切活性的核酸酶。在DNA复制过程中，FEN1识别冈崎片段中5’-flap结构并与其结合，通过精确切割产生缺口，借助DNA连接酶连接该切口，从而完成冈崎片段的成熟。另外，FEN1还参与DNA损伤修复、端粒稳定性维持和细胞凋亡DNA片段化等多条DNA代谢途径。
FEN1功能的失调会导致基因组的稳定性和完整性下降，最终诱发包括肿瘤在内的多种染色体相关的疾病。据研究报道，FEN1过表达与多种恶性肿瘤风险包括肺癌、侵袭性乳腺癌、上皮卵巢癌、神经胶质瘤和消化道恶性肿瘤等相关。另外，抑制FEN1的活性可以阻碍肿瘤细胞中的DNA修复机制，从而达到抗肿瘤的目的。综上，作为一种公认的癌症过表达酶，FEN1已经成为癌症的生物标志物以及抗癌药物的靶标。因此，开发FEN1活性分析方法可为癌症诊断、预后预测、癌症机制的探索以及FEN1抑制剂候选抗肿瘤药物的筛选提供一种有力的工具。
目前投入使用的FEN1检测方法主要有Western-blot(WB)法和ELISA法，但以上方法价格昂贵、操作繁琐，并且仅能定量FEN1蛋白总量，无法测定其活性，更无法应用于FEN1抑制剂的筛选。
以上检测方法中，利用荧光核酸染料或CRISPR/Cas体系将核酸信号转化成可被检测的荧光信号。虽然，上述信号模式的传感体系具有优异的灵敏度和特异性，但存在依赖昂贵设备的问题，阻碍了方法的进一步转化应用。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种肿瘤标志物FEN1活性的高灵敏可视化和低成本检测试剂盒，并应用于FEN1抑制剂候选肿瘤药物的筛选。
本发明的技术方案如下：
一、一种FEN1活性的高灵敏可视化检测试剂盒：
所述试剂盒包括DNA探针、酶、滚环扩增反应液、生物素修饰的引物(B P)、信号探针(Urease-DNA)、链霉亲和素修饰的磁性微球(SA-MB)、封闭液、洗涤液、乙酸溶液、脲酶底物溶液、酚红溶液和FEN1标准品；
所述DNA探针采用具有flap结构的哑铃型DNA探针FDP；
其中所述信号探针采用脲酶修饰信号探针Urease-DNA，为氨基修饰信号探针(NH2-DNA)与脲酶的偶联物。
上述FDP、BP和NH2-DNA的序列如下：
所述具有flap结构的哑铃型DNA探针Flapped dumbbell DNA probe(FDP)
的基因序列为SEQ ID No.1，即TTAACGACCATAGCTGCCCTATAGTGAGT CGTATTACAGCTATGGTTGCCGTCAGAATCTACACTTAGTAGAAATTATCT GACGGCAA；所述脲酶修饰信号探针Urease-DNA中的氨基修饰信号探针NH2-DNA的基因序列为SEQ ID No.2，即AmMC6T-TTTTTTTGACGGCAACCAT AGCTGCCCTATAGTGA，AmMC6T表示氨基；所述生物素修饰的引物Biotin-DNA primer(BP)的基因序列为SEQ ID No.3，即Biotin-TAATACGACTC，Biotin表示生物素。
所述滚环扩增反应液为1mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、1×Th ermoPol缓冲溶液、1×T4 DNA连接酶缓冲溶液和1×phi 29DNA聚合酶缓冲溶液的混合液；所述酶为T4DNA连接酶和phi 29DNA聚合酶；所述链霉亲和素修饰的磁性微球是由磁性微球表面被链霉亲和素修饰(SA-MB)形成，粒径为1.5μm。
所述封闭液为pH 7.5的洗涤液和质量终浓度为5％的脱脂奶粉的混合液；所述洗涤液为主要由10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、3mol/L氯化钠(NaCl)、1mmol/L氯化镁(MgCl2)和0.01％吐温20混合构成的、pH 7.5的混合液；所述乙酸溶液浓度为0.1mmol/L，pH为6.0；所述脲酶底物溶液为主要由3mol/L NaCl、60mmol/L MgCl2、50mmol/L尿素和1mmol/L HCl混合构成的pH 6.0的混合液；所述酚红溶液的质量浓度为0.04％。所述标准品即为为人结构特异性核酸酶FEN1。
本发明提供的试剂盒中，所述DNA(包括了FDP，BP和NH2-DNA)、酶、滚环扩增反应液和FEN1标准品均存放于-20℃环境，所述封闭液、洗涤液、乙酸溶液、脲酶底物溶液和酚红溶液均存放于4℃环境。
所述脲酶修饰信号探针按照以下方式制备获得：
(1)NH2-DNA激活：称取3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯MBS粉末溶于二甲亚砜DMSO溶液中得到6.4mmol/L的MBS溶液，再将1nmol氨基修饰信号探针NH2-DNA中加入3.2μL上述MBS溶液中，并加入1×PBS溶液至100μL后，置于室温条件下2h以激活氨基修饰信号探针NH2-DNA获得激活后的NH2-DNA溶液；
(2)超滤浓缩纯化激活的NH2-DNA：使用3KD的超滤管超滤浓缩上一步中激活后的NH2-DNA溶液，去除溶液中多余的3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯MBS，并用1×PBS溶液清洗三次后再用1×PBS溶液重悬处理得到纯化激活的NH2-DNA溶液；
(3)纯化激活的NH2-DNA与脲酶偶联：称取1.5mg脲酶粉末溶于1mL1×PBS溶液中得到脲酶溶液，将上一步获得的纯化激活的NH2-DNA溶液加入脲酶溶液中，在室温下放置1h，以使脲酶和激活的NH2-DNA偶联反应；
(4)然后使用300KD的超滤管超滤浓缩上述偶联反应后的溶液，再去除溶液中未与脲酶偶联的氨基修饰信号探针NH2-DNA，并用1×PBS溶液清洗三次后再用1×PBS溶液重悬处理得到纯化的NH2-DNA和脲酶偶联的脲酶修饰信号探针Urease-DNA。
本发明所述高灵敏可视化检测试剂盒在FEN1活性检测和浓度检测中的应用、在筛选FEN1候选抗肿瘤药物中应用。
上述在FEN1活性检测中的应用是能够进行FEN1活性可视化检测。
上述筛选FEN1候选抗肿瘤药物是通过筛选药物对FEN1的抑制情况，进而判断出FEN1抑制剂选出抗肿瘤药物。
本发明试剂盒的使用方法：当用于FEN1活性的检测时，在每次样品检测中均拟合随行标准曲线，通过将检测样品反应溶液的A570/A443值代入标准曲线计算其中FEN1活性。当用于筛选FEN1抑制剂时，无需随行标准曲线，需以无待测药物的FEN1标准品为阴性对照组。
二、一种高灵敏可视化检测试剂盒进行FEN1检测的方法，所述方法具体为：
本发明试剂盒第一个应用是应用于FEN1活性的高灵敏可视化检测。
S1、首先将已知浓度的FEN1标准品做梯度稀释，配制浓度为0.05U/ml～5000U/ml的溶液获得FEN1标准品的一系列梯度溶液，未加FEN1的水溶液为阴性对照组，接着将FEN1标准品的一系列梯度溶液和未加FEN1的水溶液作为待测溶液分别使用所述高灵敏可视化检测试剂盒处理进行FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程，反应结束后测定反应溶液的吸光度比值参数，然后根据FEN1标准品的一系列梯度溶液的不同浓度及其对应吸光度比值参数之间的关系建立关系工作曲线；
S2、针对待测未知浓度的FEN1溶液，将待测FEN1溶液作为待测溶液使用所述高灵敏可视化检测试剂盒处理进行FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程，反应结束后测定反应溶液的吸光度比值参数，将吸光度比值参数代入关系工作曲线中进行判断，获得活性检测结果、浓度检测结果。
若当前吸光度比值参数大于关系工作曲线中吸光度比值参数的最小值，则当前待测未知浓度的FEN1溶液中的FEN1可以测定出活性，然后以关系工作曲线中和当前吸光度比值参数相同的吸光度比值参数对应的浓度作为当前待测未知浓度的FEN1溶液中的FEN1的浓度。
所述吸光度比值参数为443nm和570nm处吸光度A443和A570之间的比值。
其中FEN1切割FDP中5’-flap结构产生具有切口的哑铃型DNA探针，进而在T4 DNA连接酶催化下该切口连接产生闭合环状哑铃型DNA探针CDP。CDP在滚环扩增反应体系中与BP结合，以dNTP为原料，在phi 29DNA聚合酶催化下发生恒温滚环扩增，生成一条5’-biotin修饰的长重复的单链DNA产物。体系中加入的Urease-DNA链识别上述扩增产物中一段重复序列并与其互补结合，磁性微球上链霉亲和素与扩增产物上生物素的强偶联作用可将扩增产物和信号探针互补物从溶液中分离。然后加入脲酶底物和酚红溶液混合液中后，信号探针上修饰的脲酶在脲酶底物溶液中催化尿素产生NH3引起溶液pH值改变，从而导致溶液中酚红指示剂颜色由黄变为粉红，通过肉眼观测可判断FEN1活性高低，利用酶标仪测定吸光度可进行FEN1活性的精确定量，反应全程在37℃水浴中进行，具有灵敏度高、操作简便、无需额外仪器设备、成本低、结果可肉眼观测等特点。
为了达到FEN1活性的高灵敏可视化检测目的，具体采用的技术方案是：
(1)设计FEN1可特异性切割的具有5’-flap结构的哑铃型DNA探针(FDP)；
(2)根据FDP探针的序列设计RCA扩增所需生物素修饰引物(BP)和识别扩增产物的氨基修饰信号探针(NH2-DNA)；
(3)优化FEN1切割FDP中5’-flap结构生成具有切口的哑铃型探针和T4DNA连接酶连接切口生成闭合环状哑铃型DNA探针(CDP)的反应条件；
(4)将NH2-DNA与脲酶偶联获得脲酶修饰信号探针(Urease-DNA)；
(5)筛选最优的BP与Urease-DNA序列，并优化RCA扩增条件以获得较高扩增效率和较低背景信号；
(6)将已知浓度的FEN1标准品做梯度稀释，配制浓度为0.05U/ml～5000U/ml的溶液，未加FEN1的水溶液为阴性对照组，加入体系中触发FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的发生，反应结束后测定反应溶液分别在443nm和570nm处吸光度A443和A570，A443和A570分别表示443nm和570nm处的吸光度，拟合建立A570/A443比值和FEN1浓度之间关系的工作曲线，利用工作曲线对待测情况下的A570/A443比值判断活性并提取浓度。
更具体地，FEN1活性的高灵敏可视化检测过程为：
FEN1切割5’-flap结构的反应体积为20μL，4μL FEN1标准品或待测样本、2μL500nmol/L的FDP、2μL 10×ThermoPol缓冲溶液和12μL DEPC处理水，吹打混匀后，37℃水浴加热1h。
随后向其中加入20μL T4 DNA连接反应溶液(含有2μL 10×T4 DNA连接酶缓冲溶液、60U T4 DNA连接酶和DEPC处理水)，吹打混匀后，37℃水浴加热45min。
而后向其中加入10μL RCA扩增反应液(含有1μL 10×phi 29DNA聚合酶缓冲溶液、1μL 10mmol/L dNTP、5U phi 29DNA聚合酶、2μL BP、2μL Urease-DNA和DEPC处理水)，吹打混匀后，37℃水浴加热1h。
与此同时，向15μL 5mg/mLSA-MB中加入100μL封闭液，置于37℃水浴锅中恒温孵育1h后，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取弃去上清溶液。
向封闭后的MB中加入FEN1反应溶液和50μL封闭液，置于水浴锅中恒温孵育15min，磁性分离弃去上清液后，用100μL洗涤液洗涤三次以去除MB表面非特异性结合物。而后用60μL 0.1mM pH 6.0的乙酸溶液重悬MB，加入20μL0.04％的酚红溶液和100μL脲酶底物溶液，置于室温反应1h后，磁性分离吸取上清后肉眼观测颜色变化并测定A443和A570。
所述方法具体为：
本发明的第二个应用是通过检测待筛药物存在时FEN1活性，考察药物对FEN1的抑制情况，筛选出FEN1抑制剂作为候选抗肿瘤药物，经过初筛缩小抑制剂候选范围，显著提高药物发现效率。
为了达到筛选FEN1抑制剂候选抗肿瘤药物的目的，所述方法具体为：
L1、配制特定浓度的500U/ml的FEN1标准品溶液；
L2、将已知浓度的待测药物标准品做梯度稀释配制一系列不同药物浓度的药物溶液，将一系列不同药物浓度的药物溶液分别加入步骤1)的FEN1标准品溶液中获得一系列不同浓度的药物、FEN1混合溶液，以不加待测药物的FEN1标准品溶液为阴性对照组，将一系列不同浓度的药物、FEN1混合溶液和不加待测药物的FEN1标准品溶液作为待测溶液分别使用所述高灵敏可视化检测试剂盒处理进行FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程，反应结束后测定反应溶液的吸光度比值参数，并进行判断：
若一系列药物FEN1混合溶液对应获得的吸光度比值参数均小于不加待测药物的FEN1标准品溶液对应获得吸光度比值参数，则当前待测药物为FEN1抑制剂，作为候选抗肿瘤药物；
然后根据一系列药物FEN1混合溶液的不同药物浓度及其对应吸光度比值参数之间的关系建立FEN1抑制拟合曲线，并计算半抑制浓度IC50，通过半抑制浓度比较不同药物之间的抑制作用。(当对比好几个药物的抑制作用的时候，如果A药物的半抑制浓度小于B药物的半抑制浓度，则可认为A药物抑制作用更强。)
所述半抑制浓度IC50是利用Graphpad Prism软件建立FEN1抑制拟合曲线，软件根据拟合曲线算出。
更具体地，FEN1抑制剂筛选实验过程为：
将已知浓度的待测药物标准品做梯度稀释，配制为系列浓度溶液，取4μL待测药物溶液与4μL 500U/ml的FEN1标准品溶液混合，以加4μL DEPC处理水的FEN1为阴性对照组。
取以上8μL的FEN1和不同浓度待测药物混合溶液、2μL 500nmol/L的FDP、2μL 10×ThermoPol缓冲溶液和8μL DEPC处理水，吹打混匀后，37℃水浴加热1h。随后向其中加入20μL T4 DNA连接反应溶液(含有2μL 10×T4DNA连接酶缓冲溶液、60U T4 DNA连接酶和DEPC处理水)，吹打混匀后，37℃水浴加热45min。而后向其中加入10μL RCA扩增反应液(含有1μL10×phi 29DNA聚合酶缓冲溶液、1μL 10mmol/L dNTP、5U phi 29DNA聚合酶、2μL BP、2μLUrease-DNA和DEPC处理水)，吹打混匀后，37℃水浴加热1h。与此同时，向15μL 5mg/mL SA-MB中加入100μL封闭液，置于37℃水浴锅中恒温孵育1h后，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取弃去上清溶液。向封闭后的MB中加入FEN1反应溶液和50μL封闭液，置于水浴锅中恒温孵育15min，同样磁性分离弃去上清液后，用100μL洗涤液洗涤三次以去除MB表面非特异性结合物。而后用60μL 0.1mM pH 6.0的乙酸溶液重悬MB，加入20μL0.04％的酚红溶液和100μL脲酶底物溶液，置于室温反应1h后，磁性分离吸取上清后肉眼观测并测定A443和A570，建立FEN1的相对无待测药物存在时的活性和待测药物浓度之间的FEN1抑制拟合曲线，计算半抑制浓度(IC50)。
活性检测结果报告：①以不同浓度的FEN1标准品在本试剂盒中检测到的A570/A443值与FEN1浓度建立标准曲线，作为样品定量的标准。
②检测样品的A570/A443值，根据上述标准曲线，计算待测样品中FEN1的浓度。
抑制剂筛选结果报告：以不同浓度的待测药物组在本试剂盒中FEN1的相对无待测药物存在时的活性与待测药物浓度建立抑制拟合曲线，计算药物对FEN1的IC50值。
所述FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程具体为：
1)将待测溶液加入到由500nmol/L的具有flap结构的哑铃型DNA探针FDP、10×ThermoPol缓冲溶液和DEPC处理水构成的混合溶液中，经吹打混匀后在37℃水浴加热一段时间1h；
2)随后向其中加入T4 DNA连接反应溶液，T4 DNA连接反应溶液中含有10×T4 DNA连接酶缓冲溶液、T4 DNA连接酶和DEPC处理水，经吹打混匀后在37℃水浴加热一段时间45min；
3)而后向其中加入RCA扩增反应液，RCA扩增反应液含有10×phi 29DNA聚合酶缓冲溶液、10mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸dNTP、phi 29DNA聚合酶、生物素修饰的引物BP、脲酶修饰信号探针Urease-DNA和DEPC处理水，经吹打混匀后在37℃水浴加热一段时间1h，获得FEN1样品溶液；
4)与此同时，向5mg/mL的链霉亲和素修饰的磁性微球溶液SA-MB中加入封闭液置于离心管中，再将离心管置于37℃水浴锅中恒温孵育一段时间1h后，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取弃去上清溶液，获得封闭后的MB溶液；
5)向封闭后的SA-MB溶液中加入步骤3)获得的FEN1样品溶液和封闭液，置于水浴锅中恒温孵育一段时间15min，磁性分离弃去上清液后，用洗涤液洗涤三次以去除SA-MB表面的非特异性结合物；
6)最后用0.1mM pH 6.0的乙酸溶液重悬处理SA-MB，再加入酚红溶液和脲酶底物溶液置于室温反应一段时间1h后，磁性分离吸取上清液作为反应溶液。
本发明中FEN1特异性切割FDP中翘起的flap结构生成具有切口的哑铃型DNA探针，在T4 DNA连接酶催化下该探针的切口处连接产生闭合环状哑铃型DNA探针(CDP)，进而在扩增引物和phi 29DNA聚合酶存在下进行滚环扩增。为满足高灵敏可视化检测需求，本发明中向扩增产物中加入脲酶修饰的信号探针，借助磁性微球分离扩增产物和信号探针互补物并加入到脲酶底物溶液中，利用互补物中脲酶高效催化溶液中尿素产生NH3导致pH值改变，从而引起加入溶液中酚红指示剂颜色变化的特点，实现FEN1活性的检测。
本发明将脲酶修饰核酸探针作为识别FEN1活性触发的核酸扩增产物的信号探针，将FEN1活性信号转化为脲酶催化反应的比色信号，具有简便快捷、即时检测和结果肉眼可见等优势，可实现FEN1活性的快速高灵敏可视化检测，并可应用于FEN1抑制剂候选药物的筛选。
本发明的有益效果是：
本发明为了克服现有的检测方法仅能定量FEN1蛋白含量，无法测定活性进而无法筛选FEN1抑制剂，而测定活性的方法仪器设备昂贵等不足点，提供了一种高灵敏可视化低成本的FEN1活性检测技术——基于FEN1切割5’-flap结构触发RCA扩增，以及酶标核酸信号探针检测扩增产物的方法用于FEN1活性检测的试剂盒。本发明试剂盒反应全程在37℃水浴中进行，检测限是0.05U/mL，实现了高灵敏检测，另外具备操作简便、无需额外仪器设备、成本低、结果可肉眼观测等特点。
另外，该方法可用于FEN1抑制剂候选药物的筛选，经过初筛缩小抑制剂候选范围，显著提高药物发现效率，在FEN1抑制剂抗肿瘤药物发现中具有较大的应用潜力。
附图说明
图1是本试剂盒中FEN1活性检测原理图；
图2是本试剂盒检测FEN1活性的标准曲线和比色图(a：标准曲线；b：比色图)；
图3是本试剂盒用于FEN1活性检测的选择性和比色图(a：A570/A443值对比图；b：比色图)；
图4是利用本试剂盒检测FEN1经典抑制剂金精三羧酸(ATA)对FEN1抑制作用的拟合曲线和比色图(a：抑制拟合曲线；b：比色图)。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步阐述，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。
本发明是基于FEN1切割触发滚环扩增法和酶催化反应可视化信号放大技术的FEN1活性高灵敏可视化检测试剂盒，利用FEN1特异性切割5’-flap结构，进而触发滚环扩增将FEN1活性信号转化为放大的核酸信号，并利用酶修饰核酸信号探针识别扩增产物，发挥酶催化反应可视化和高效率的优势，将核酸信号进一步转化为放大的比色信号的方法对FEN1活性进行检测。
如图1所示，基于FEN1的5’-flap核酸内切酶活性，设计具有5’-flap结构的哑铃型DNA探针(FDP)，当体系中存在FEN1时，特异性切割FDP中flap结构，生成具有切口的哑铃型DNA探针，并在T4 DNA连接酶作用下该切口连接生成闭合环状哑铃型DNA探针(CDP)。
选取CDP中一段序列，设计滚环扩增引物并用生物素修饰，在具有链置换活性的phi 29DNA聚合酶和原料dNTP存在下，生物素修饰引物(BP)与CDP结合，启动滚环扩增合成长重复序列的DNA链。选取该扩增产物一段重复序列作为识别单元，设计NH2修饰的信号探针(NH2-DNA)，并将其与脲酶偶联获得脲酶修饰信号探针(Urease-DNA)。
随着滚环扩增反应不断生成扩增产物，扩增产物中的重复序列识别单元与Urease-DNA碱基互补配对，使Urease-DNA结合到扩增产物上。由于BP引发的扩增产物5’端仍然具有生物素修饰，因此利用链霉亲和素修饰磁性微球(SA-MB)可从溶液中磁分离出滚环扩增产物和Urease-DNA互补物。向其中加入脲酶底物尿素和酚红指示剂混合液，触发脲酶催化尿素产生NH3的反应，引起溶液pH值提高，从而导致酚红指示剂颜色变红。
当体系中没有FEN1或FEN1活性被抑制剂抑制时，FDP不能被切割产生具有切口的哑铃型探针，从而无法生成CDP。FDP并不呈环状，因此不能发生滚环扩增产生具有重复序列的DNA链，导致Urease-DNA游离在溶液中。利用SA-MB仅能将体系中BP分离出，而无法同时捕获Urease-DNA，从而导致不能触发后续的脲酶催化尿素的反应，酚红指示剂颜色不改变。通过肉眼观测溶液颜色变化(由黄色转变为粉红色)，可判断体系中FEN1的活性，而通过测定溶液在443nm和570nm处的吸光度A443和A570，计算A570/A443可对FEN1活性进行精确定量。
试剂盒灵敏度高、操作简便、无需额外仪器设备、成本低、结果可肉眼观测，且可用于FEN1抑制剂候选药物的筛选，经过初筛缩小抑制剂候选范围，显著提高药物发现效率，在FEN1抑制剂抗肿瘤药物发现中具有较大的应用潜力。
本实施例的试剂盒可应用于FEN1抑制剂候选抗肿瘤药物的筛选。
本发明的实施例如下：
实施例1
具体实施中，试剂盒包括：具有flap结构的哑铃型DNA探针(FDP)、酶(T4 DNA连接酶和phi 29DNA聚合酶)、滚环扩增反应液(dNTP、ThermoPol缓冲溶液、T4 DNA连接酶缓冲溶液和phi 29DNA聚合酶缓冲溶液)、生物素修饰的引物(BP)、脲酶修饰信号探针(Urease-DNA，脲酶与氨基修饰的DNA探针偶联获得)、粒径为1.5μm的链霉亲和素修饰的磁性微球(SA-MB)、洗涤液(10mmol/L Tris-HCl、3mol/L NaCl、1mmol/L MgCl2和0.01％吐温20，pH7.5)、封闭液(洗涤液和5％脱脂奶粉，pH 7.5)、乙酸溶液(0.1mmol/L，pH 6.0)、脲酶底物溶液(3mol/L NaCl、60mmol/L MgCl2、50mmol/L尿素和1mmol/L HCl，pH 6.0)、0.04％酚红溶液、标准品(FEN1)。
1、材料与方法
1.1、引物与探针
本试剂盒中FDP、BP和氨基修饰的信号探针(NH2-DNA)的序列：
Flapped dumbbell DNA probe(FDP):TTAACGACCATAGCTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAGCTATGGTTGCC GTCAGAATCTACACTTAGTAGAAATTATCTGACGGCAA；
Biotin-DNA primer(BP)：Biotin-TAATACGACTC；
NH2-DNA：AmMC6T-TTTTTTTGACGGCAACCATAGCTGCCCTATAGTGA。
1.2、脲酶修饰信号探针的制备(酶与核酸偶联)
(1)NH2-DNA激活：称取2mg(6.4μmol)3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)粉末溶于1mL二甲亚砜(DMSO)溶液中得到6.4mmol/L的MBS溶液。1nmol NH2-DNA中加入3.2μL 6.4mol/L的MBS溶液，并加入1×PBS溶液至100μL后，置于室温条件下2h以激活NH2-DNA。
(2)超滤浓缩纯化激活的NH2-DNA：使用3KD(NANOSEP OMEGA,PallIncorporation)的超滤管超滤浓缩上一步中激活的NH2-DNA溶液，去除溶液中多余的MBS，并用50μL 1×PBS溶液清洗三次后用100μL 1×PBS溶液重悬得到纯化的激活NH2-DNA。
(3)激活的NH2-DNA与脲酶偶联：称取1.5mg(3.3nmol)脲酶(Urease)粉末溶于1mL1×PBS溶液中得到脲酶溶液，将上一步中NH2-DNA溶液加入脲酶溶液中，室温下放置1h，以使脲酶和激活的NH2-DNA偶联。使用300KD(NANOSEP OMEGA,Pall Incorporation)的超滤管超滤浓缩上述溶液，去除溶液中未与脲酶偶联的NH2-DNA，并用50μL 1×PBS溶液清洗三次后用100μL1×PBS溶液重悬得到纯化的NH2-DNA和脲酶偶联的脲酶修饰信号探针(Urease-DNA)。
(4)Urease-DNA浓度的计算：
Urease-DNA偶联物的浓度根据以下公式计算：
A260UrD ＝ A260urease + A260DNA (1)
A280UrD ＝ A280urease + A280DNA (2)
A260DNA / A280DNA ＝ α (3)
A260urease / A280urease ＝ β (4)
将公式(3)和(4)分别代入(1)和(2)中得到：
A260UrD ＝βA280urease + A260DNA (5)
A280UrD ＝ A280urease + (A260DNA × 1/α) (6)
将公式(5)代入(6)中得到：
A260DNA ＝ (αA260UrD - αβA280UrD)/(α-β) (7)
A280urease ＝ (αA280UrD - A260UrD)/(α-β) (8)
用Nanodrop 2000/2000c分别测定NH2-DNA，脲酶溶液和Urease-DNA溶液在260nm和280nm处的吸光度A260DNA，A280DNA，A260urease，A280urease，A260UrD和A280UrD。其中α＝1.72，β＝0.72，A260UrD＝0.082，A280UrD＝0.082，将其代入(7)和(8)中得到：
A260DNA＝(1.72×0.082-1.72×0.72×0.082)/(1.72-0.72)＝0.02296
A280urease＝(1.72×0.082-0.082)/(1.72-0.72)＝0.05904
根据Lambert-Beers-Law：c＝A/(ε×L)，得到
cDNA ＝ A260DNA/(εDNA×L) (9)
curease ＝ A280urease/(εurease×L) (10)
根据OligoAnalyzer 3.1(http://www.idtdna.com/calc/analyzer)，NH2-DNA的ε＝329600M-1·cm-1，而脲酶的ε＝54780M-1·cm-1，使用Nanodrop 2000/2000c时，L＝0.1cm，将以上值代入公式(9)和(10)得到：
cDNA＝0.02296/(329600M-1·cm-1×0.1cm)＝1.2μmol/L
curease＝0.05904/(54780M-1·cm-1×0.1cm)＝10.78μmol/L
根据上述计算，Urease-DNA中1.2μmol/L的DNA，相当于约10.78μmol/L的脲酶单体。已知脲酶以六聚体的形式存在，因此，DNA/脲酶比率为0.67。
1.3、实验条件优化
根据实验的需求，对实验当中BP引物和Urease-DNA探针序列、FDP探针浓度、BP引物浓度、FEN1切割反应时间、T4 DNA连接酶量、T4 DNA连接时间、phi 29DNA聚合酶量、RCA扩增时间、dNTP浓度等实验条件进行优化，以建立最佳的检测方法。通过信噪比，即(A570/A443样品)/(A570/A443阴性对照)来评价各个实验参数，取信噪比最大值为最优实验条件。
1.4、FEN1标准品的测定
将FEN1标准品溶液稀释到不同浓度，即0.05U/mL、0.1U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、100U/mL、500U/mL、1000U/mL、5000U/mL和10000U/mL，用本试剂盒进行检测，以FEN1浓度的对数为横坐标，A570/A443为纵坐标，绘制标准曲线。
1.5、ATA抑制FEN1活性实验
将ATA标准品溶液稀释到不同浓度，即0.2μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、14μmol/L、16μmol/L、18μmol/L、20μmol/L、30μmol/L和40μmol/L，分别取4μL不同浓度ATA标准品与4μL500U/ml FEN1标准品混合，以4μL DEPC处理水与4μL500U/ml FEN1标准品混合溶液为阴性对照组，分别加入本试剂盒检测体系进行FEN1活性检测，以ATA浓度为横坐标，不同浓度ATA组中FEN1的相对阴性对照组活性为纵坐标，绘制抑制拟合曲线，计算ATA对FEN1的IC50。
2、FEN1活性检测
2.1、FEN1活性高灵敏可视化检测的反应体系及反应条件
FEN1切割flap结构的反应体积为20μL，4μL FEN1标准品或待测样本、2μL500nmol/L的FDP、2μL 10×ThermoPol缓冲溶液和12μL DEPC处理水，吹打混匀后，37℃水浴加热1h。
随后向其中加入20μL T4 DNA连接反应溶液(含有2μL 10×T4 DNA连接酶缓冲溶液、60U T4 DNA连接酶和DEPC处理水)，吹打混匀后，37℃水浴加热45min。
而后向其中加入10μL RCA扩增反应液(含有1μL 10×phi 29DNA聚合酶缓冲溶液、1μL 10mmol/L dNTP、5U phi 29DNA聚合酶、2μL BP、2μL Urease-DNA和DEPC处理水)，吹打混匀后，37℃水浴加热1h。与此同时，向15μL 5mg/mL SA-MB中加入100μL封闭液，置于37℃水浴锅中恒温孵育1h后，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取弃去上清溶液。
向封闭后的MB中加入FEN1反应溶液和50μL封闭液，置于水浴锅中恒温孵育15min，同样磁性分离弃去上清液后，用100μL洗涤液洗涤三次以去除MB表面非特异性结合物。
最后用60μL 0.1mM pH 6.0的乙酸溶液重悬MB，加入20μL 0.04％的酚红溶液和100μL脲酶底物溶液，置于室温反应1h后，磁性分离吸取上清后肉眼观测颜色变化(由黄色向粉色转变)，并测定A443和A570，计算A570/A443。
2.2、FEN1活性检测标准曲线建立
将FEN1标准品溶液稀释到不同浓度，即0.05U/mL、0.1U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、100U/mL、500U/mL、1000U/mL、5000U/mL和10000U/mL，以不加FEN1组为阴性对照组，用本试剂盒进行FEN1活性检测，以FEN1浓度的对数值为横坐标，A570/A443为纵坐标，绘制标准曲线。
如图2所示，FEN1浓度在0.05U/mL～5000U/mL范围内(图2a)，该标准曲线线性良好(R2＝0.9850)，肉眼观测到最低浓度为5U/mL(图2b)。建立的FEN1活性检测法可通过测定样品反应溶液A570/A443值，实现FEN1活性的定量检测。(溶液中无FEN1时，溶液呈现黄色，而当FEN1浓度大于5U/mL时，溶液颜色逐渐变深，浓度越高，粉色越明显。在图2中可以看到5U/mL时，颜色已经变深了。)
2.3、选择性实验
本发明创建的方法以FEN1活性为目标进行检测。因此，实验对其他常见限制性内切酶HindIII、ExoIII、Lambda Exo、ExoI、T4PNK、TdT以及人血清白蛋白(HSA)对该方法检测FEN1活性的干扰进行了选择性考察。
分别考察体系中存在4μL 100U/mL和无FEN1时，体系中加入4μL 100U/mL的以上内切酶或1μL 1mg/mL的人血清白蛋白，并以反应缓冲溶液体系(无以上干扰因素)为阴性对照组，通过A570/A443值分析该方法的选择性，每个样品平行3份检测。
结果如图3a所示，含有FEN1的样品A570/A443值约为2，而不含FEN1的样品A570/A443值均小于0.3，且可通过肉眼观测判断体系中FEN1的活性(图3b)。表明建立的方法能够有效辨别FEN1和其他常见限制性内切酶HindIII、ExoIII、Lambda Exo、ExoI、T4PNK、TdT，且血清白蛋白组的结果也显示了本方法具有较强的抗基质干扰能力。
3、ATA抑制FEN1活性实验
通过用ATA进行抑制实验，考察了使用本试剂盒筛选FEN1抑制剂的可行性。将ATA标准品溶液稀释到不同浓度，即0.2μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、14μmol/L、16μmol/L、18μmol/L、20μmol/L、30μmol/L和40μmol/L，分别取4μL不同浓度ATA标准品与4μL500U/ml FEN1标准品混合，以4μL DEPC处理水与4μL 500U/ml FEN1标准品混合溶液为阴性对照组，分别加入本试剂盒检测体系进行FEN1活性检测，以ATA浓度为横坐标，不同浓度ATA组中FEN1活性相对阴性对照组中FEN1活性的百分比为纵坐标，绘制抑制拟合曲线。
在抑制剂ATA存在时，随着ATA浓度的增加，最终反应溶液的颜色逐渐变淡(图4b)，表明ATA通过抑制FEN1活性，从而阻断切割诱导的DNA连接以及由此触发的核酸扩增和酶催化显色反应的一系列反应链。
如图4a所示，随着ATA浓度从0增加到40μmol/L，FEN1的相对无抑制剂存在时的活性以浓度依赖的方式降低，ATA对FEN1的半抑制浓度(IC50)为0.9888μmol/L。以上结果表明，该发明在FEN1抑制剂抗肿瘤药物发现中具有较大的应用潜力。
4、不同浓度FEN1的血清样品检测
空白血清样品中加入FEN1，配制成含有低浓度0.5U/mL、中浓度10U/mL和高浓度500U/mL的样品，以不加FEN1的空白血清样品作为阴性对照，测定各浓度FEN1样品的A570/A443值，每个浓度平行3份检测，代入标准曲线计算测得样品FEN1活性。
经测试，本试剂盒检测法低中高浓度下精密度分别为2.17％、0.84％和4.96％，准确度分别为116.1％、106.8％和101.6％，结果显示本试剂盒具有较好的精密度和准确度，可作为FEN1活性检测的试剂盒。
由此实施可见，本发明的试剂盒灵敏度高、操作简便、无需额外仪器设备、成本低、结果可肉眼观测，可用于FEN1抑制剂候选药物的筛选，经过初筛缩小抑制剂候选范围，显著提高药物发现效率，在FEN1抑制剂抗肿瘤药物发现中具有较大的应用潜力。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。
本发明设计的基因序列如下：
SEQ ID No.1；
名称：具有flap结构的哑铃型DNA探针的DNA序列
DNA类型：other DNA
生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/synthetic construct
TTAACGACCATAGCTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAGCTATGGTT GCCGTCAGAATCTACACTTAGTAGAAATTATCTGACGGCAA
SEQ ID No.2；
名称：氨基修饰信号探针的DNA序列
DNA类型：other DNA
生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/synthetic construct
TTTTTTTGACGGCAACCATAGCTGCCCTATAGTGA
SEQ ID No.3；
名称：生物素修饰的引物的DNA序列
DNA类型：other DNA
生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/synthetic constructTAATACGACTC。
Claims (9)
1.一种FEN1活性的高灵敏可视化检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒包括DNA探针、酶、滚环扩增反应液、生物素修饰的引物、信号探针、链霉亲和素修饰的磁性微球、封闭液、洗涤液、乙酸溶液、脲酶底物溶液、酚红溶液和FEN1标准品；
所述DNA探针采用具有flap结构的哑铃型DNA探针FDP；
其中所述信号探针采用脲酶修饰信号探针Urease-DNA，为氨基修饰信号探针与脲酶的偶联物。
2.根据权利要求1所述的一种FEN1活性的高灵敏可视化检测试剂盒，其特征在于，所述具有flap结构的哑铃型DNA探针的基因序列为SEQ ID No.1，即TTAACGACCATAGCTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAGCTATGGTTGC CGTCAGAATCTACACTTAGTAGAAATTATCTGACGGCAA；
所述氨基修饰信号探针的基因序列为SEQ ID No.2，即AmMC6T-TTTTTT TGACGGCAACCATAGCTGCCCTATAGTGA，AmMC6T表示氨基；
所述生物素修饰的引物的基因序列为SEQ ID No.3，即Biotin-TAATACGA CTC，Biotin表示生物素。
3.根据权利要求1所述的一种FEN1活性的高灵敏可视化检测试剂盒，其特征在于，所述滚环扩增反应液为1mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸、1×Therm oPol缓冲溶液、1×T4 DNA连接酶缓冲溶液和1×phi 29DNA聚合酶缓冲溶液的混合液；
所述酶为T4 DNA连接酶和phi 29DNA聚合酶；
所述链霉亲和素修饰的磁性微球是由磁性微球表面被链霉亲和素修饰形成，粒径为1.5μm。
4.根据权利要求1所述的一种FEN1活性的高灵敏可视化检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为pH 7.5的洗涤液和质量浓度为5％的脱脂奶粉的混合液；
所述洗涤液为主要由10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、3mol/L氯化钠、1mmol/L氯化镁和0.01％吐温20混合构成的、pH 7.5的混合液；
所述乙酸溶液浓度为0.1mmol/L，pH为6.0；
所述脲酶底物溶液为主要由3mol/L NaCl、60mmol/L MgCl2、50mmol/L尿素和1mmol/LHCl混合构成的pH 6.0的混合液；
所述酚红溶液的质量浓度为0.04％。
5.根据权利要求1所述的一种FEN1活性的高灵敏可视化检测试剂盒，其特征在于，所述脲酶修饰信号探针按照以下方式制备获得：
(1)NH2-DNA激活：称取3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯MBS粉末溶于二甲亚砜DMSO溶液中得到MBS溶液，再将氨基修饰信号探针NH2-DNA中加入上述MBS溶液中，并加入1×PBS溶液至100μL后，置于室温条件下以激活氨基修饰信号探针NH2-DNA获得激活后的NH2-DNA溶液；
(2)超滤浓缩纯化激活的NH2-DNA：使用超滤管超滤浓缩上一步中激活后的NH2-DNA溶液，去除溶液中多余的3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯MBS，并用1×PBS溶液清洗三次后再用1×PBS溶液重悬处理得到纯化激活的NH2-DNA溶液；
(3)纯化激活的NH2-DNA与脲酶偶联：称取脲酶粉末溶于1×PBS溶液中得到脲酶溶液，将上一步获得的纯化激活的NH2-DNA溶液加入脲酶溶液中，在室温下放置使脲酶和激活的NH2-DNA偶联反应；
(4)然后使用超滤管超滤浓缩上述偶联反应后的溶液，再去除溶液中未与脲酶偶联的氨基修饰信号探针NH2-DNA，并用1×PBS溶液清洗三次后再用1×PBS溶液重悬处理得到纯化的NH2-DNA和脲酶偶联的脲酶修饰信号探针Urease-DNA。
6.权利要求1-5任一所述高灵敏可视化检测试剂盒的应用，其特征在于，
包括在FEN1活性检测和浓度检测中的应用、在筛选FEN1候选抗肿瘤药物中的应用。
7.利用权利要求1-5任一所述高灵敏可视化检测试剂盒进行FEN1检测的方法，其特征在于，所述方法具体为：
S1、首先将已知浓度的FEN1标准品做梯度稀释，配制浓度为0.05U/ml～5000U/ml的溶液获得FEN1标准品的一系列梯度溶液，接着将FEN1标准品的一系列梯度溶液和未加FEN1的水溶液作为待测溶液分别使用所述高灵敏可视化检测试剂盒处理进行FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程，反应结束后测定反应溶液的吸光度比值参数，然后根据FEN1标准品的一系列梯度溶液的不同浓度及其对应吸光度比值参数之间的关系建立关系工作曲线；
S2、针对待测FEN1溶液，将待测FEN1溶液作为待测溶液使用所述高灵敏可视化检测试剂盒处理进行FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程，反应结束后测定反应溶液的吸光度比值参数，将吸光度比值参数代入关系工作曲线中进行判断，获得活性检测结果、浓度检测结果。
8.利用权利要求1-5任一所述高灵敏可视化检测试剂盒候选FEN1抗肿瘤药物的方法，其特征在于，所述方法具体为：
L1、配制FEN1标准品溶液；
L2、将已知浓度的待测药物标准品做梯度稀释配制一系列不同药物浓度的药物溶液，将一系列不同药物浓度的药物溶液分别加入步骤1)的FEN1标准品溶液中获得一系列不同浓度的药物、FEN1混合溶液，将一系列不同浓度的药物、FEN1混合溶液和不加待测药物的FEN1标准品溶液作为待测溶液分别使用所述高灵敏可视化检测试剂盒处理进行FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程，反应结束后测定反应溶液的吸光度比值参数，并进行判断：
若一系列药物FEN1混合溶液对应获得的吸光度比值参数均小于不加待测药物的FEN1标准品溶液对应获得吸光度比值参数，则当前待测药物为FEN1抑制剂，作为候选抗肿瘤药物；
然后根据一系列药物FEN1混合溶液的不同药物浓度及其对应吸光度比值参数之间的关系建立FEN1抑制拟合曲线，并计算半抑制浓度IC50，通过半抑制浓度比较不同药物之间的抑制作用。
9.根据权利要求7或8所述的高灵敏可视化检测试剂盒进行FEN1检测的方法，其特征在于，所述FEN1切割-DNA连接-RCA扩增-脲酶催化反应链的反应过程具体为：
1)将待测溶液加入到由具有flap结构的哑铃型DNA探针FDP、10×ThermoPol缓冲溶液和DEPC处理水构成的混合溶液中，经吹打混匀后在37℃水浴加热一段时间；
2)随后向其中加入T4 DNA连接反应溶液，T4 DNA连接反应溶液中含有10×T4 DNA连接酶缓冲溶液、T4 DNA连接酶和DEPC处理水，经吹打混匀后在37℃水浴加热一段时间；
3)而后向其中加入RCA扩增反应液，RCA扩增反应液含有10×phi 29DNA聚合酶缓冲溶液、三磷酸脱氧核糖核苷酸dNTP、phi 29DNA聚合酶、生物素修饰的引物BP、脲酶修饰信号探针Urease-DNA和DEPC处理水，经吹打混匀后在水浴加热一段时间，获得FEN1样品溶液；
4)向链霉亲和素修饰的磁性微球溶液SA-MB中加入封闭液置于离心管中，再将离心管置于37℃水浴锅中恒温孵育一段时间后，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取弃去上清溶液，获得封闭后的MB溶液；
5)向封闭后的SA-MB溶液中加入步骤3)获得的FEN1样品溶液和封闭液，置于水浴锅中恒温孵育一段时间，磁性分离弃去上清液后，用洗涤液洗涤三次；
6)最后用乙酸溶液重悬处理SA-MB，再加入酚红溶液和脲酶底物溶液置于室温反应一段时间后，磁性分离吸取上清液作为反应溶液。
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