CN120081836A - 一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针及其制备方法与用途。所述响应型近红外荧光探针以带正电荷的半花菁为强吸电子基团、碳碳双键及噻吩为桥连单元，再与带有BChE识别基团的苯基环丙酸羧酸酯连接而成，从而形成具有典型D‑π‑A结构的有机小分子荧光化合物。这类荧光化合物不仅延长共轭结构使其达到近红外区，且表现出良好的生物相容性，无明显毒副作用，与AD主要标志物BChE结合，由无荧光转化为荧光模式，为解决单靶标响应的缺陷，让荧光模式探针进一步结合Aβ蛋白，特异性响应增强，有效解决单靶点假阳性的问题。

Description

一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光 探针及其制备方法与应用

技术领域

本申请属于荧光探针技术领域，具体涉及一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease,AD)是一种进行性中枢神经系统变性病。该疾病隐匿性较强，潜伏期可长达十几年。由于AD早期症状不明显，导致发现时病情已经发展到非常严重，往往会延误治疗，因此阿尔茨海默症的早期诊断显得尤为重要，它可以帮助病人早发现、早治疗，有效的控制病情，延缓病情恶化的速度，对保障人民的身体健康和提高生活品质具有重要意义。在目前的临床诊断方法中，脑脊液(CSF)检测具有较高的准确性，但脑脊液穿刺的采集过程是侵入性的，因此不被广泛接受。

成像技术主要有荧光成像(FI)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)等。目前，临床上对AD的诊断和治疗效果需经过多次复查、长期观察来进行评估。这些成像技术在实时监测和评估方面都无法实现。

由于AD的病因复杂，尽管对它的研究已经进行了100多年，但到目前为止，AD的确切病因还没有完全弄清楚。这就导致在过去几十年的研究中，基于单一靶标的AD药物开发策略并没有取得过成功。显然，单靶标药物不足以改善AD病理状况甚至是延缓其进展。因此，该疾病的复杂机制和多种因素之间的相互作用，使得需要开发针对多个靶标的诊疗方法。

目前已开发的分子探针存在选择性差的现象，容易出现假阳性结果。比如脑中同时存在乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)两种水解酶，而AChE和BChE的结构和功能都十分相似，导致许多探针对其选择性不高。靶向丁酰胆碱酯酶的探针在AD中已有报道，但是脑部胆碱酯酶水平的异常同样关系到其他的疾病比如帕金森症、额颞叶痴呆和路易体痴呆等，容易混淆。因此双靶点的探针准确性更高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针，将探针与AD主要标志物BChE结合，由无荧光转化为荧光模式，在荧光模式下探针进一步结合Aβ蛋白，增强特异性响应，有效解决了单靶点假阳性的问题。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针，具有如下结构通式：其中，R选自甲基或者乙基。

按上述方案，R选自甲基或者乙基时，所述响应型近红外荧光探针分别缩写为HCy-Me或者HCy-Et，具体结构如下所示：

本发明中，所述响应型近红外荧光探针是以带正电荷的半花菁部分为吸电子部分，苯基环丙酸羧酸酯部分作为BChE的识别基团，两者通过碳碳双键与桥连单元噻吩基团相连而成的。HCy-Me和HCy-Et在DMSO溶液中的最大紫外吸收波长分别为475nm左右和480nm左右，发射波长分别为647nm左右和622nm左右。HMy-OH和HEy-OH在DMSO溶剂中的最大紫外吸收波长分别为515nm左右和520nm左右，发射波长分别为652nm左右和653nm左右。

上述响应型近红外荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

1)2，3，3-三甲基-3H-吲哚与碘化物发生取代反应，在N上引入取代基合成电子受体部分，即带正电荷的半花菁，结构通式为R是甲基或者乙基；

2)4-羟基苯硼酸与5-溴噻吩-2-甲醛通过铃木(Suzuki)偶联反应，得到电子供体部分，即5-(4-羟基苯基)噻吩-2-甲醛，结构通式为

3)将步骤1)和步骤2)的产物通过克脑文盖尔(Knovengel)缩合反应，得到中间化合物R为甲基或者乙基；其中，R为甲基时，该中间化合物为HMy-OH；R为乙基时，该中间化合物为HEy-OH，结构分别如下：

4)将化合物HMy-OH与HEy-OH分别与环丙基甲酰氯发生亲核取代反应，得到结构分别为HCy-Me或者HCy-Et的响应型近红外荧光探针。

按上述方案，步骤1)中，所述碘化物选自碘甲烷或者碘乙烷中的一种或两种；2，3，3-三甲基-3H-吲哚与碘化物之间的摩尔比在(1～3)：3范围内即可发生步骤1)的取代反应；取代反应的时间为10～16h，温度为55～85℃。

按上述方案，步骤1)中，采用乙腈作为反应溶剂，碘化物在乙腈中的浓度以0.5～3mol/L为宜；取代反应结束后，加入冷乙醚(0℃)沉淀出固体产物，并且采用乙醚进行洗涤，然后过滤干燥即可。

按上述方案，步骤2)中，4-羟基苯硼酸与5-溴噻吩-2-甲醛的摩尔比在(1～3)：1范围内即可发生步骤2)的铃木偶联反应；该铃木偶联反应的时间为10～22h和温度为50～90℃。

按上述方案，步骤2)中，铃木偶联反应采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，四氢呋喃作为反应溶剂，氮气或者惰性气体或者真空等保护气氛；催化剂在反应溶剂中的投加量为3～8mg/mL；4-羟基苯硼酸与5-溴噻吩-2-甲醛先各自在保护气氛下溶解在四氢呋喃中，分别得到浓度为0.5～1.5mmol/mL的4-羟基苯硼酸溶液、浓度为0.5～1.5mmol/mL的5-溴噻吩-2-甲醛溶液；然后再把5-溴噻吩-2-甲醛溶液注入4-羟基苯硼酸溶液中(催化剂预先加入4-羟基苯硼酸溶液中)，再加入碳酸钠水溶液调整pH至8.5～9，升温至70～90℃反应10～22小时；铃木偶联反应结束后，用水和二氯甲烷体系进行萃取，然后在以石油醚和乙酸乙酯按体积比(4～6):1混合成洗脱液进行柱层析，得到步骤2)的产物。

按上述方案，步骤3)中，步骤1)的产物和步骤2)的产物按照摩尔比1：(1～3)发生克脑文盖尔缩合反应，反应的时间为1.5～3h，温度为50～80℃。

按上述方案，步骤3)采用乙醇作为反应溶剂，并且反应溶剂中还有少量哌啶，哌啶的体积为乙醇的2～3％，步骤2)的产物在乙醇中的浓度为0.02～0.05mmol/mL；反应过程中采用氮气或者惰性气体或者真空等保护气氛；反应结束后，将二氯甲烷和甲醇按体积比(15～25)：1混合成洗脱液进行柱层析。

按上述方案，步骤4)中，步骤3)所得中间化合物与环丙基甲酰氯的摩尔比为(0.5～1.5)：2，反应的时间为1.5～3h，温度为-5℃～0℃。

按上述方案，步骤4)中，采用二氯甲烷作为反应溶剂，环丙基甲酰氯在反应溶剂中的投加浓度为0.03-0.05mmol/mL，并且需要加入一定量的三乙胺，三乙胺在反应溶剂中的浓度为2-5mg/mL；反应过程中采用氮气或者惰性气体或者真空等保护气氛；反应结束后，采用将二氯甲烷和甲醇按体积比(15～25)：1混合成洗脱液进行柱层析。

本发明的技术构思如下：

本发明涉及的响应型近红外荧光探针包括HCy-Me和HCy-Et，其初始状态荧光较弱或无荧光，它们在与丁酰胆碱酯酶(BChE)接触后，迅速在酯键水解断裂，变回为HMy-OH与HEy-OH(此时可以称为水解荧光探针)，荧光瞬间增强。而后探针与标志物β淀粉样蛋白结合过程中，HMy-OH和HEy-OH的羟基分别与β淀粉样蛋白上的活性位点F20形成了2个或1个氢键，氢键的作用力限制了探针分子的扭转运动，从而抑制了分子内电荷转移(ICT)过程。ICT过程通常会导致荧光猝灭，因此其抑制会使荧光显著增强。在AD患者脑内，探针HCy-Me和HCy-Et能灵敏检测主要标志物BChE，由无荧光转化为荧光模式，而后在让荧光模式探针进一步结合Aβ蛋白，并特异性响应增强，可以帮助AD患者早发现、早治疗，有效的控制病情。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提出一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针，其结构上是先通过半花菁结构与碘化物反应，在N上引入取代基，形成更具有强吸电子能力的电子受体，分子结构中间由乙烯基和杂环组成，用来扩大共轭体系；BChE的结合基团主要由苯基环丙酸羧酸酯组成，环丙酸羧酸酯为离去基团，最后形成酚羟基作为供电子基团。这类荧光化合物可以拓展原有结构的共轭程度，使其波长红移。

2、本发明提出的响应型近红外荧光探针在与BChE结合后，探针的环丙酸羧酸酯部分水解离去，由无荧光状态转化为荧光模式；同时，羟基苯基团可以作为供电子基团，与吲哚基团形成“推-拉”结构。这种探针对环境溶剂非常敏感，容易产生聚集导致发光淬灭(ACQ)，在水溶液中荧光量子产率很低。但该探针与Aβ蛋白结合后，分子内的旋转受限，由于分子内电荷转移(ICT)效应使探针分子的荧光信号显著增强，解决了单靶点假阳性的问题以及单靶标响应的缺陷。上述新型响应型近红外荧光探针，增加了荧光探针诊断的准确性，为阿尔茨海默症的早期精准诊断提供新思路。

3、本发明所述响应型近红外荧光探针具有良好的脂溶性，可以快速通过血脑屏障，生物相容性好，成功在活体阿尔茨海默病模型鼠(C57BL/6，APP/PS1)进行了诊断成像，可以实现实时可视化和特异性地检测疾病早期的分子变化。

4、本发明所述响应型近红外荧光探针对BChE具有高选择性，BChE的活性位点与乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性位点在结构上存在差异，尤其是BChE的活性空腔较大，且缺乏AChE中狭窄的芳香氨基酸残基(如Tyr124和Phe337)。针对这一结构特点，本发明中通过引入位阻较大的基团-环丙基作为识别单元，调整对BChE的结合基团的大小来构建针对BChE的高选择性探针。

附图说明

图1为本发明荧光探针的合成路线图。

图2为本发明探针对BChE的响应及选择性研究。a-b为HCy-Me和HCy-Et(5μM，混合后最终浓度)在PBS(10mM，pH 7.4)中与不同浓度的BChE培养后的荧光发射光谱，(HCy-Me：λex＝475nm；HCy-Et：λex＝480nm)。c-d为荧光强度与BChE浓度的函数图。e-f为HCy-Me和HCy-Et与潜在竞争物质(金属离子、氨基酸、AChE等)和BChE的选择性研究。

图3为本发明Αβ原纤维的探针响应及选择性研究。a-b为水解荧光探针HMy-OH与HEy-OH在PBS(10mM，pH 7.4)中与不同浓度的Αβ聚集物培养后的荧光发射光谱，(HMy-OH：λex＝515nm；HEy-OH：λex＝520nm)。c-d为HMy-OH与HEy-OH的荧光强度与Αβ聚集物浓度的函数图。e为HMy-OH与HEy-OH与潜在竞争物质和Αβ聚集物的选择性研究。

图4为本发明荧光探针HCy-Me和HCy-Et在脑切片中的荧光成像研究，

图5为本发明水解荧光探针HMy-OH与HEy-OH在脑切片中的荧光成像研究，(HMy-OH：λex＝515nm，λem＝640～650nm；HEy-OH：λex＝520nm，λem＝640～650nm)；其中，a，b为使用HMy-OH和ThT对年龄匹配的Tg小鼠(APP/PS1，12月龄)，d,e为WT小鼠(12月龄)的脑切片进行体外荧光染色，c,f是它们的合并图。j,h为使用HEy-OH和ThT对年龄匹配的Tg小鼠(APP/PS1，12月龄)，h-k为WT小鼠(12月龄)的脑切片进行体外荧光染色，i,l是它们的合并图。

图6为本发明BChE的体内荧光成像，(HCy-Me：λex＝475nm，λem＝640～650nm；HCy-Et：λex＝480nm，λem＝620～640nm)；其中，a,b分别为野生型小鼠和APP/PS1小鼠(12月龄)经尾静脉注射HCy-Me和HCy-Et前后不同时间点的荧光图像。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

参照图1所示，一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针(缩写为HCy-Me)的合成方法，具体包括以下步骤：

(1)化合物1的合成：

将碘甲烷(0.93mL，15mM)和2，3，3-三甲基-3H-吲哚(1.6mL，10mM)，然后加入乙腈(15mL)充当反应溶剂。将它们置于油浴锅，在剧烈搅拌下80℃回流反应12h，得到粉红色溶液。停止搅拌，将粉红色溶液自然冷却至室温，加入过量的冷乙醚，使固体沉淀，减压过滤后，用乙醚洗涤3次，得到滤饼。将滤饼放入真空干燥箱干燥，得到干净产物，即化合物1，该产物无需进一步纯化。化合物1为粉红色固体，收率为78.0％(1.7g)。

(2)化合物3的合成：

将四(三苯基膦)钯(0.1g)置于三口烧瓶中，将4-羟基苯硼酸(10mmol)溶于10mL四氢呋喃在氮气保护条件下注射入所述三口烧瓶，并使用注射器将5-溴噻吩-2-甲醛(10mmol)溶于10mL四氢呋喃后注入上述三口烧瓶，再将碳酸钠(2.76g)溶于水(6mL)注入后，此时pH为8.5～9，升温至80℃搅拌反应16h。反应结束后将温度降至室温，后加入100mL水，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取，所得有机相用无水硫酸钠干燥，过滤蒸发，得到粗产物。粗产物以石油醚和乙酸乙酯(体积比5/1)为洗脱液，经柱层析得到黄色固体化合物3(136mg，67％)。

(3)化合物HMy-OH的合成:

化合物1(162.5mg,0.93mmol)和化合物3(300mg,1.40mmol)混合溶于乙醇(30mL)和哌啶(4滴)中，然后在氮气下加热至60℃搅拌2h。反应结束后，过滤蒸发，得到粗产物。粗产物以DCM/MeOH(20/1，二氯甲烷和甲醇的体积比)为洗脱液，经柱层析得到深红色固体化合物HMy-OH(134mg，40％)。

(4)化合物HCy-Me的合成:

化合物HMy-OH(100mg,0.27mmol)和环丙基甲酰氯(56mg,0.54mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，缓慢滴加三乙胺(54mg)，然后在氮气气氛下0℃搅拌反应2h。反应结束后，过滤蒸发，得到粗产物。粗产物以DCM/MeOH(20/1，体积比)为洗脱液，经柱层析得到深红色固体化合物HCy-Me(86mg，75％)，即靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针(缩写为HCy-Me)。

实施例2

参照图1所示，一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针(缩写为HCy-Et)的合成方法，具体包括以下步骤:

(1)化合物2的合成:

将碘乙烷(1.20mL，15mM)和2，3，3-三甲基-3H-吲哚(1.6mL，10mM)，然后加入甲苯(15mL)充当反应溶剂。将它们置于油浴锅，在剧烈搅拌下80℃回流反应12h，得到粉红色溶液。停止搅拌，将粉红色溶液自然冷却至室温，加入过量的冷乙醚，使固体沉淀，减压过滤后，用乙醚洗涤3次，得到滤饼。将滤饼放入真空干燥箱干燥，得到干净产物，得到化合物2，该产物无需进一步纯化。化合物2为粉红色固体，收率为75.0％(1.7g)。

(2)化合物3的合成：与实施例1相同。

(3)化合物HEy-OH的合成：

化合物2(100mg,0.53mmol)和化合物3(163mg,0.8mmol)混合溶于乙醇(30mL)和哌啶(4滴)中，然后在氮气气氛下60℃加热搅拌反应2h。反应结束后，过滤蒸发，得到粗产物。粗产物以DCM/MeOH(20/1，体积比)为洗脱液，经柱层析得到深红色固体化合物HEy-OH(79mg，40％)。

(4)化合物HCy-Et的合成：

化合物HEy-OH(180mg,0.48mmol)和环丙基甲酰氯(100mg,0.96mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，缓慢滴加三乙胺(97mg)，然后在氮气气氛下0℃搅拌反应2h。反应结束后，过滤蒸发，得到粗产物。粗产物以DCM/MeOH(20/1，体积比)为洗脱液，经柱层析得到深红色固体化合物HCy-Et(160mg，75％)，即靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针(缩写为HCy-Et)。

应用例1

对实施例1-2制备的响应型近红外荧光探针HCy-Me和HCy-Et进行了应用测试，测试探针对BChE的响应能力、特异性。

测试探针对BChE的响应能力具体操作为：将BChE(0～1.6U/mL，该浓度指的是在PBS中的最终浓度，下同)分别与HCy-Me和HCy-Et(5μM)在PBS(pH 7.4)混合，涡旋10秒后放置无震荡恒温培养箱37℃孵育60分钟，测试获得它们的荧光发射光谱。测试探针对BChE的特异性选择具体操作：将探针HCy-Me和HCy-Et(5μM，该浓度指的是混合后最终浓度，下同)分别与1:Na⁺(10μM),2:Mg²⁺(10μM),3:K⁺(10μM),4:Fe²⁺(10mM),5:Cu²⁺(10μM),6:Ca²⁺(10μM),7:Zn²⁺(10μM),8:Ser.(10μM),9:Lys(10μM),10:Arg.(10μM),11:GSH(10μM),12:Gly.(10μM),13:Phe.(10μM),14:Cys(10μM),15:Ala.(10μM),16:Pepsin(10mg/mL),17:HSA(10mg/mL),18:BSA(10mg/mL),19:AChE(1U/mL),20:BChE(1U/mL)在PBS(pH 7.4)混合，置于37℃恒温培养箱中孵育30分钟，然后测试其荧光发射光谱。所有样品均配置三份，作为自身对照组。

由图2a,b可知，探针HCy-Me和HCy-Et的荧光随着BChE的浓度增加而增强，这表明探针HCy-Me和HCy-Et能灵敏识别BChE。图2c,d为探针荧光强度与BChE浓度之间的函数关系，可得知这两者之间存在较好的线性关系。由图2e,f可知，探针在部分金属离子、氨基酸、AChE的环境中并没有观察到荧光发射增强或猝灭的现象，而与标志物BChE结合后显示出荧光强度明显增强的现象，说明探针对标志物BChE的确具有特异性响应。

应用例2

对实施例1-2制备的水解荧光探针HMy-OH与HEy-OH进行了应用测试，测试探针对Aβ原纤维的响应能力、特异性。

测试探针对Aβ₄₂的响应能力具体操作为：将孵育的Aβ₄₂聚集体(0-10μM，该浓度指的是混合后最终浓度，下同)分别与HMy-OH与HEy-OH(10μM)混合，涡旋10秒后放置无震荡恒温培养箱37℃孵育30分钟，测试获得它们的荧光发射光谱。测试探针对Aβ纤维的特异性选择具体操作：将荧光探针HMy-OH与HEy-OH(10μM)分别与Aβ单体，Aβ寡聚体和Aβ聚集体在PBS(pH 7.4)混合，置于37℃恒温培养箱中孵育30分钟，然后测试其荧光发射光谱。所有样品均配置三份，作为自身对照组。

由图3a,b可知，探针HMy-OH与HEy-OH的荧光随着Aβ的浓度增加而增强，这表明探针HMy-OH与HCy-OH能灵敏识别Aβ。图3c,d为探针荧光强度与Aβ浓度之间的函数关系，由图中可得知这两者之间存在较好的线性关系。由图3e,f的数据可得知，探针在Aβ单体，Aβ寡聚体的环境中并没有观察到荧光发射增强或猝灭的现象，而与标志物Aβ聚集体结合后显示出荧光强度明显增强的现象，说明探针对标志物Aβ的确具有特异性响应。

应用例3

对实施例1-2制备的荧光探针HCy-Me和HCy-Et进行体外切片染色效果进行测试。具体过程为：将8月龄APP/PS1小鼠和同龄正常小鼠的脑组织灌流下取出，脑组织切片后，相邻两层切片分别用HCy-Me(10μM，由pH 7.4的PBS配制)和HCy-Et(10μM，由pH7.4的PBS配制)充分浸润组织，室温下共同孵育15分钟，而后用生理盐水清洗组织切片。结果如图4所示，显示正常小鼠均不见荧光信号；在ΑD模型小鼠相邻的脑切片，荧光强度明显增加，从而证明探针HCy-Me和HCy-Et均具有特异性识别BChE的能力。

应用例4

对实施例1-2制备的水解荧光探针HMy-OH与HEy-OH进行体外切片染色效果进行测试，具体过程为：将8月龄APP/PS1小鼠和同龄正常小鼠的脑组织灌流下取出，脑组织切片后，相邻两层切片分别用HMy-OH(10μM，由pH 7.4的PBS配制)和HCy-OH(10μM，由pH 7.4的PBS配制)染色分浸润组织，室温下共同孵育15分钟，而后用生理盐水清洗组织切片，再用ThT(10μM，由pH 7.4的PBS配制)染色分浸润组织，室温下共同孵育15分钟，用生理盐水再次清洗组织切片。结果如图5所示，显示正常小鼠均不见荧光信号；在ΑD模型小鼠相邻的脑切片，ThT和水解荧光探针HMy-OH与HCy-OH的染色区域重合。证明水解荧光探针HMy-OH与HCy-OH均具有特异性靶向Aβ的能力。

应用例5

对实施例1-2制备的荧光探针HCy-Me和HCy-Et进行体内成像。具体操作为：分别将探针HCy-Me(浓度10mM,100uL，由pH 7.4的PBS配制)和HCy-Et(10mM,100uL，由pH 7.4的PBS配制)对小鼠进行尾静脉注射。采用IVIS系统采集荧光图像，激发波长为450±10nm，发射波长为620±10nm，采集时间为2s。结果如图6所示。从图中可以看出，在注射荧光探针HCy-Me(图6,a)和HCy-Et(图6,b)后1h时，荧光达到最高，而对照组的正常小鼠脑无明显荧光信号变化。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种靶向丁酰胆碱酯酶与β淀粉样蛋白的响应型近红外荧光探针，其特征在于所述响应型近红外荧光探针具有如下结构通式：

其中，R选自甲基或者乙基。

2.根据权利要求1所述的响应型近红外荧光探针，其特征在于，所述响应型近红外荧光探针包括以下化合物：

3.权利要求2所述的响应型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，主要步骤如下：

1)2，3，3-三甲基-3H-吲哚与碘化物发生取代反应，在N上引入取代基合成电子受体部分，即带正电荷的半花菁，结构通式为R是甲基或者乙基；

2)4-羟基苯硼酸与5-溴噻吩-2-甲醛通过铃木偶联反应，得到电子供体部分，即5-(4-羟基苯基)噻吩-2-甲醛，结构通式为

3)将步骤1)和步骤2)的产物通过克脑文盖尔缩合反应，得到中间化合物，结构通式为R为甲基或者乙基；

4)将步骤3)所得中间化合物与环丙基甲酰氯发生亲核取代反应，到结构分别为HCy-Me或者HCy-Et的响应型近红外荧光探针。

4.根据权利要求3所述的响应型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述碘化物选自碘甲烷或者碘乙烷中的一种或两种；2，3，3-三甲基-3H-吲哚与碘化物之间的摩尔比在(1～3)：3范围内；取代反应的时间为10～16h，温度为55～85℃。

5.根据权利要求3所述的响应型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中，4-羟基苯硼酸与5-溴噻吩-2-甲醛的摩尔比在(1～3)：1范围内；铃木偶联反应的时间为10～22h和温度为50～90℃。

6.根据权利要求3所述的响应型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)中，步骤1)的产物和步骤2)的产物的摩尔比为1：(1～3)；反应的时间为1.5～3h，温度为50～80℃。

7.根据权利要求3所述的响应型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤4)中，步骤3)所得中间化合物与环丙基甲酰氯的摩尔比为(0.5～1.5):2，反应的时间为1.5～3h，温度为-5～0℃。

8.权利要求1所述的响应型近红外荧光探针作为诊断试剂在阿尔兹海默症中的应用。