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CN120076825A - 包含rsv f蛋白三聚体的免疫原组合物 - Google Patents

包含rsv f蛋白三聚体的免疫原组合物 Download PDF

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CN120076825A
CN120076825A CN202380071303.XA CN202380071303A CN120076825A CN 120076825 A CN120076825 A CN 120076825A CN 202380071303 A CN202380071303 A CN 202380071303A CN 120076825 A CN120076825 A CN 120076825A
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rsv
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combination
composition
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CN202380071303.XA
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M·A·加西亚
S·戈斯瓦米
胡磊
V·K·慕德西瓦尔泰
K·E·奥德纳尔
师帅
S·切莎洛夫
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Original Assignee
Pfizer Corp SRL
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Abstract

本发明涉及包含呈融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性及冻干的免疫原组合物。本发明进一步涉及储存包含呈融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性免疫原组合物的方法，以及冻干所述水性免疫原组合物的方法。

Description

包含RSV F蛋白三聚体的免疫原组合物
序列表参考
本申请通过专利中心以电子形式提交，包含以.xml格式电子提交的序列表。该.xml含有文件名为“PC072868Sequence Listing.xml”，创建于2022年8月12日，大小为15KB的序列表。该.xml文件中的序列表作为说明书的一部分，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包含呈融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性及冻干免疫原组合物。本发明进一步涉及储存包含呈融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性免疫原组合物的方法，以及冻干所述水性免疫原组合物的方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒(或RSV)是感染肺部及呼吸道的病毒。RSV是全球婴儿严重病毒性下呼吸道疾病的主要病因，也是老年人呼吸道疾病的重要病因。然而，目前尚无获批用于预防RSV疾病的疫苗。
RSV属于肺病毒科(Pneumoviridae)家族成员。其基因组由编码11种蛋白质的单链负义RNA分子组成，包括9种结构蛋白(3种糖蛋白及6种内部蛋白)及两种非结构蛋白。结构蛋白包括三种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白G、融合蛋白F及小疏水蛋白SH。RSV分为A和B两种亚型，主要区别在于G糖蛋白，而F糖蛋白的序列在两种亚型间较为保守。
成熟的F糖蛋白具有三个结构域：胞外结构域(ED)、跨膜结构域(TM)及细胞质尾部(CT)。CT含有一个棕榈酰化半胱氨酸残基。
人类RSV的F糖蛋白最初从mRNA翻译为单个574个氨基酸的前体多肽(称为“F0”或“F0前体”)，其N端含信号肽序列(氨基酸1-25)。翻译后，信号肽在内质网中被信号肽酶切除。剩余的F0前体部分(即，残基26-574)可进一步在两个多碱基位点(氨基酸109/110及136/137)被细胞蛋白酶(尤其是弗林蛋白酶)切割，去除称作pep27的27个氨基酸的间插序列(氨基酸110-136)，生成称作F1(C端部分，氨基酸137-574)和F2(N端部分，氨基酸26-109)的两个共价连接的片段。F1包含疏水性融合肽(N端)及两个七肽重复区域(HRA和HRB)。HRA靠近融合肽，HRB靠近TM结构域。F1和F2片段通过两个二硫键连接形成F2-F1异源二聚体。无信号肽序列的未切割F0蛋白或F1-F2异源二聚体可形成RSV F原聚体。三个原聚体组装成成熟的三聚体RSV F蛋白，其是三个原聚体的同源三聚体。
A亚型和B亚型的F蛋白的氨基酸序列约90％一致。A亚型的F0前体多肽的一个实例序列如SEQ ID NO:5所示(A2毒株，GenBank GI:138251，Swiss-Prot P03420)，B亚型的F0前体多肽的一个实例序列如SEQ ID NO:6所示(18537毒株，GenBankGI:138250，Swiss-ProtP13843)。SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6之信号肽序列亦报导为氨基酸1-25(GenBank及UniProt)。在两种序列中，TM结构域是来自大约氨基酸530至550，但替代地报导为525-548。细胞质尾部始于氨基酸548或550且止于氨基酸574，其中棕榈酰化半胱氨酸残基位于氨基酸550处。
RSV F是针对RSV疫苗所探索之主要抗原。RSV F介导病毒体膜与宿主细胞膜之间之融合且亦促进合胞体之形成。在与宿主细胞膜融合之前之病毒体中，F分子之最大群体形成棒棒糖型结构，其中TM结构域锚定于病毒包膜中[Dormitzer,P.R.,Grandi,G.,Rappuoli,R.,Nature Reviews Microbiol,10,807,2012.；McLellan JS,Ray WC,PeeplesME.Structure and function of respiratory syncytial virus surfaceglycoproteins.Curr Top Microbiol Immunol2013；372:83-104]。此构象称为融合前构象。融合前RSV F可由单克隆抗体(mAb)D25、AM22及MPE8识别，而不区分寡聚状态。AM14是结合四级表位且对RSV融合前F之三聚体形式具有特异性之mAb[Gilman MS,Moin SM,Mas V等人，Characterization of a prefusion-specific antibody that recognizesaquaternary,cleavage-dependent epitope on the RSV fusion glycoprotein.PLoSPathogens,11(7),2015]。在RSV进入细胞中期间，F蛋白经由不可逆过程自亚稳定融合前状态(其可在本文中称为“preF”)经由中间延伸结构重排成高度稳定之融合后状态(“后-F”)。在此重排期间，融合前分子之C-末端卷曲螺旋解离成其三个组成链，所述组成链然后环绕于球形头周围并接合三个其他螺旋以形成融合后6螺旋束。若使融合前RSV F三聚体经受愈加苛刻之化学或物理条件(例如升高温度)，则其发生结构变化。最初，损失三聚体结构(至少在分子内之局部)，且然后重排成融合后形式，且然后结构域发生变性。
为防止病毒进入，在病毒包膜与细胞膜融合之前，F特异性中和抗体可能必须结合病毒体上之F融合前构象或可能延伸中间体。因此，F蛋白之融合前形式可视为作为期望疫苗抗原之优选构象[Ngwuta,J.O.,Chen,M.,Modjarrad,K.,Joyce,M.G.,Kanekiyo,M.,Kumar,A.,Yassine,H.M.,Moin,S.M.,Killikelly,A.M.,Chuang,G.Y.,Druz,A.,Georgiev,I.S.,Rundlet,E.J.,Sastry,M.,Stewart-Jones,G.B.,Yang.Y.,Zhang,B.,Nason,M.C.,Capella,C.,Peeples,M.,Ledgerwood,J.E.,Mclellan,J.S.,Kwong,P.D.,Graham,B.S.,Science Translat.Med.,14,7,309(2015)]。在使用表面活性剂(例如TritonTM X-100、TritonTM X-114、NP-40、BrijTM-35、BrijTM-58、TweenTM 20、TweenTM80、辛基糖苷、辛硫基糖苷、SDS、CHAPS、CHAPSO)自膜提取或表达为胞外结构域、经受物理或化学应力或储存时，F糖蛋白易于转化成融合后形式[McLellan JS,Chen M,Leung S等人，Structure of RSVfusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizingantibody.Science 340,1113-1117(2013)；Chaiwatpongsakorn,S.,Epand,R.F.,Collins,P.L.,Epand R.M.,Peeples,M.E.,J Virol.85(8):3968-77(2011)；Yunus,A.S.,JacksonT.P.,Crisafi,K.,Burimski,I.,Kilgore,N.R.,Zoumplis,D.,Allaway,G.P.,Wild,C.T.,Salzwedel,K.Virology.2010Jan 20；396(2):226-37]。因此，作为疫苗抗原之融合前F之制备仍是一个挑战。因中和及保护抗体通过干扰病毒进入发挥作用，故假设不诱发融合前特异性抗体之F抗原预计不能有效作为诱发融合前特异性抗体之F抗原。因此，更期望考虑利用含有呈融合前形式之F蛋白免疫原之F蛋白疫苗。已提供RSV F蛋白之突变体以增加融合前稳定性(例如参见PCT申请案第WO2017/109629号)且是有前景之疫苗候选者。
RSV F蛋白是尤其不稳定之蛋白质，此乃因其倾向于转化成非活性及高度稳定之融合后形式。已产生RSV F蛋白之构建体以旨在将呈三聚体形式之RSV F蛋白稳定于融合前构象。所述构建体包括(例如)RSV F蛋白之可溶性形式，该RSV F蛋白包含稳定突变以(例如)在F胞外结构域以及外源性C-末端融合之三聚化结构域内产生二硫键。然而，所述构建体尽管稳定，但可能(例如)在温度、pH或渗透压之较极端条件下不稳定，且在所述条件下可视为不稳定且易于聚集或损失融合前构象。
因此，需要包含呈期望三聚体及融合前构象之RSV F蛋白之水性免疫原组合物，且其中最小化RSV F蛋白之聚集及融合前含量之损失。所述水性免疫原组合物应较为稳定并适于用作疫苗。理想地，亦可冻干及/或储存该组合物，且同时最小化组合物中之融合前含量损失及/或RSV F蛋白聚集。亦可有利地最小化冻干过程之持续时间，且同时维持可接受之聚集水平及融合前含量以使得能够大规模生产免疫原组合物。
发明概述
本发明涉及包含以下各项之水性免疫原组合物：
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度介于约20mM与约250mM之间；
(iii)蔗糖、甘露醇及甘氨酸中之至少一者，其浓度介于约5mg/mL与约100mg/mL之间；及
(iv)缓冲液；
其中该组合物之pH介于约7与约8之间。
本发明亦涉及储存包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之方法，其包含在至少约15℃之温度下储存组合物。
本发明进一步涉及冻干包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之方法，其包含冷冻组合物之步骤，其中该步骤包含以至少约0.3℃/min之冷冻斜变速率(freezing ramp rate)将温度降至介于-40℃与-60℃之间之冷冻温度。
本发明进一步涉及通过本文所公开之任一冻干方法获得或可获得之冻干免疫原组合物。
本发明进一步涉及包含该冻干组合物及用于复水重构冻干组合物之稀释剂之试剂盒。
附图简述
图1展示各种包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物在T0下或在25℃下储存1或3周之后的高分子量物质百分比(％HMMS)。
图2展示各种包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物在T0下或在5℃下储存1或3周之后的％HMMS。
图3展示各种包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物在T0下或在-20℃下储存3周之后的％HMMS。
图4展示各种包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物在T0下或在25℃下储存1或3周之后的融合前含量。
图5展示各种包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物在T0下或在5℃下储存1或3周之后的融合前含量。
图6A及6B展示pH对在5℃(图6A)及25℃(图6B)下保持2周之含有4.5％蔗糖、50mMNaCl之制剂之相对融合前含量的影响。
图6C及6D展示pH对在5℃(图6C)及25℃(图6D)下保持2周之含有4.5％蔗糖、50mMNaCl之制剂之％HMMS的影响。
图7A及7B展示蔗糖含量对在5℃(图7A)及25℃(图7B)下保持2周之含有50mM NaCl之pH 7制剂之相对融合前含量的影响。
图7C及7D展示蔗糖含量对在5℃(图7C)及25℃(图7D)下保持2周之含有50mM NaCl之pH7制剂之％HMMS的影响。
图8A及8B展示NaCl含量对在5℃(图8A)及25℃(图8B)下保持2周之含有4.5％蔗糖之pH 7制剂之相对融合前含量的影响。
图8C及8D展示NaCl含量对在5℃(图8C)及25℃(图8D)下保持2周之含有4.5％蔗糖之pH7制剂之％HMMS的影响。
图9A公开在冻干包含亚型A及B之RSV F蛋白三聚体之各种组合物之后融合前含量变化的百分比，如通过AM14 ELISA及％HMMS变化所测量。图9A中展示为#1至#10之组合物对应于表12中之#1至#10制剂。
图9B公开在冻干包含亚型A及B之RSV F蛋白三聚体之各种组合物之后融合前含量变化的百分比，如通过AM22 Fab滴定及％HMMS变化所测量。图9A中展示为#1至#10之组合物对应于表12中之#1至#10制剂。
发明详述
参照下列本发明实施方案之详细阐述及其中所包括实施例可更易于理解本发明。应理解，本发明不限于具体制备方法且制备方法当然可有所变化。亦应理解，本文所使用之术语仅是出于阐述特定实施方案之目的，而并非意欲为限制性。
1.本发明之实例性实施方案(E)
本文所提供之本发明之实例性实施方案(E)包括：
E1.一种水性免疫原组合物，其包含
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度介于约20mM与约250mM之间；
(iii)蔗糖、甘露醇及甘氨酸中之至少一者，其浓度介于约5mg/mL与约100mg/mL之间；及
(iv)缓冲液；
其中该组合物之pH介于约7与约8之间。
E2.如E1之水性免疫原组合物，其中氯化钠之浓度为约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250mM。
E3.如E1之水性免疫原组合物，其中氯化钠之浓度介于约20mM与约100mM之间。
E4.如E1之水性免疫原组合物，其中氯化钠之浓度介于约40mM与约60mM之间。
E5.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度介于约10mg/mL与约100mg/mL之间。
E6.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/mL。
E7.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度介于约10mg/mL与约90mg/mL之间。
E8.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度介于约10mg/mL与约50mg/mL之间。
E9.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约22.5mg/mL。
E10.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约30mg/mL。
E11.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约60mg/mL
E12.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约90mg/mL。
E13.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度介于约10mg/mL与约100mg/mL之间。
E14.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度为约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/mL。
E15.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度介于约10mg/mL与约90mg/mL之间。
E16.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度介于约10mg/mL与约50mg/mL之间。
E17.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度为约22.5mg/mL。
E18.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度为约30mg/mL。
E19.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度为约60mg/mL
E20.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘氨酸之浓度为约90mg/mL。
E21.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度介于约10mg/mL与约100mg/mL之间。
E22.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度为约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/mL。
E23.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度介于约10mg/mL与约90mg/mL之间。
E24.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度介于约10mg/mL与约50mg/mL之间。
E25.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度为约22.5mg/mL
E26.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度为约30mg/mL。
E27.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度为约60mg/mL
E28.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度为约90mg/mL。
E29.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度介于约10mg/mL与约70mg/mL之间且甘露醇之浓度介于约10mg/mL与约70mg/mL之间。
E30.如E29之水性免疫原组合物，其中蔗糖对甘露醇之比率介于1:1与1:5之间，优选地介于1:2与1:4之间。
E31.如E30之水性免疫原组合物，其中蔗糖对甘露醇之比率为1:2。
E32.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约30mg/mL且甘露醇之浓度为约60mg/mL。
E33.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约22.5mg/mL且甘露醇之浓度为约45mg/mL。
E34.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度介于约10mg/mL与约70mg/mL之间且甘氨酸之浓度介于约10mg/mL与约70mg/mL之间。
E35.如E34之水性免疫原组合物，其中蔗糖对甘氨酸之比率介于1:1与1:5，优选地1:2与1:4之间。
E36.如E35之水性免疫原组合物，其中蔗糖对甘氨酸之比率为1:2。
E37.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约30mg/mL且甘氨酸之浓度为约60mg/mL。
E38.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中蔗糖之浓度为约22.5mg/mL且甘氨酸之浓度为约45mg/mL。
E39.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度介于约10mg/mL与约70mg/mL之间且甘氨酸之浓度介于约10mg/mL与70mg/mL之间。
E40.如E39之水性免疫原组合物，其中甘露醇对甘氨酸之比率介于1:1与1:5之间，优选地介于1:2与1:4之间。
E41.如E40之水性免疫原组合物，其中甘露醇对甘氨酸之比率为1:2。
E42.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度为约30mg/mL且甘氨酸之浓度为约60mg/mL。
E43.如E1至E4中任一项之水性免疫原组合物，其中甘露醇之浓度为约22.5mg/mL且甘氨酸之浓度为约45mg/mL。
E44.如E1至E43中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物进一步包含表面活性剂。
E45.如E44之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂是选自聚山梨酯20(TweenTM20)、聚山梨酯40(TweenTM40)、聚山梨酯60(TweenTM60)、聚山梨酯65(TweenTM65)、聚山梨酯80(TweenTM80)、聚山梨酯85(TweenTM85)、TritonTM N-101、TritonTM X-100、辛苯醇醚40(oxtoxynol 40)、壬苯醇醚-9(nonoxynol-9)、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15、SolutolTM H15)、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯(CremophorELTM)、大豆卵磷脂、泊洛沙姆(poloxamer)、十六烷基胺、十八烷基胺、氨基酸十八烷基酯、溶血卵磷脂、二甲基-二-十八烷基溴化铵、甲氧基十六烷基甘油、普罗尼克(pluronic)多元醇、聚胺(例如吡喃、硫酸右旋糖酐、聚IC、卡波姆(carbopol))、肽(例如胞壁酰肽及二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽)、油乳液、矿物质凝胶(例如磷酸铝)及免疫刺激复合物(ISCOMS)。
E46.如E44之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂是聚山梨酯。
E47.如E46之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂是聚山梨酯20或聚山梨酯80。
E48.如E47之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂是聚山梨酯80。
E49.如E44至E48中任一项之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂之浓度为约0.01mg/ml至约10mg/ml、约0.01mg/ml至约5.0mg/ml、约0.01mg/ml至约2.0mg/ml、约0.01mg/ml至约1.0mg/ml、约0.1mg/ml至约1.0mg/ml、约0.1mg/ml至约0.5mg/ml、约0.1mg/ml至约0.3mg/ml或约0.1mg/ml至约0.25mg/ml。
E50.如E44至E48中任一项之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂之浓度为约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或0.30mg/mL。
E51.如E44至E48中任一项之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂之浓度为约0.15mg/mL。
E52.如E44至E48中任一项之水性免疫原组合物，其中该表面活性剂之浓度为约0.20mg/mL。
E53.如E1至E52中任一项之水性免疫原组合物，其中该缓冲液是选自由以下组成的组：组氨酸、磷酸盐、磷酸、抗坏血酸盐、马来酸、甘氨酸、抗坏血酸、碳酸氢盐及碳酸、葡萄糖酸盐、依地酸盐、苹果酸盐、咪唑、Tris、磷酸盐及其混合物。该缓冲液优选是组氨酸或Tris。
E54.如E53之水性免疫原组合物，其中该缓冲液是Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)。
E55.如E1至E54中任一项之水性免疫原组合物，其中该缓冲液之浓度介于约0.5mM与约50mM，优选地约5mM至约40mM、更优选地约10mM至约30mM、愈优选地约15mM至约25mM之间。优选地，该缓冲液之浓度为约15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM。
E56.如E1至E55中任一项之水性免疫原组合物，其中该缓冲液之浓度为约15mM。
E57.如E1至E55中任一项之水性免疫原组合物，其中该缓冲液之浓度为约20mM。
E58.如E1至E57中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物之pH为约7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0或介于约7.1与约7.7之间，或为约7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7、更优选地7.4。
E59.如E1至E58中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物之pH为约7.4。
E60.如E1之水性免疫原组合物，其中该组合物包含
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度介于约35mM与约65mM之间；
(iii)蔗糖，其浓度介于约20mg/mL与约40mg/mL之间；及甘露醇，其浓度介于约45mg/mL与约75mg/mL之间；
(iv)Tris缓冲液，其浓度介于约15mM与约25mM之间；
(v)聚山梨酯80，其浓度介于约0.1mg/mL与约0.3mg/mL之间；
其中该组合物之pH介于7.1与7.7之间。
E61.如E1之水性免疫原组合物，其中该组合物包含
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度为约50mM；
(iii)蔗糖，其浓度为约30mg/mL；及甘露醇，其浓度为约60mg/mL；
(iv)Tris缓冲液，其浓度为约20mM；
(v)聚山梨酯80，其浓度为约0.2mg/mL；
其中该组合物之pH为约7.4。
E62.如E1之水性免疫原组合物，其中该组合物包含
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度为约37mM；
(iii)蔗糖，其浓度为约22.5mg/mL；及甘露醇，其浓度为约45mg/mL；
(iv)Tris缓冲液，其浓度为约15mM；
(v)聚山梨酯80，其浓度为约0.15mg/mL；
其中该组合物之pH为约7.4。
E63.如E1至E62中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物进一步包含防腐剂，优选地选自由以下组成的组之防腐剂：苄索氯铵(benzethoniumchloride)、2-苯氧基乙醇、苯酚及硫柳汞(thimerosal)、更优选地2-苯氧基乙醇。该水性制剂中之防腐剂浓度为优选地至少9mg/mL、更优选地10mg/mL。
E64.如E1至E63中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白是亚型A之F蛋白。
E65.如E1至E63中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白是亚型B之F蛋白。
E66.如E64或E65之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体。
E67.如E66之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白相对于相应野生型RSV F蛋白之氨基酸序列显示引入氨基酸序列中之突变且对呈融合前构象之该野生型RSV F蛋白或对包含该野生型F蛋白之病毒具有免疫原性。所述突变可为(例如)相对于野生型RSV F蛋白之氨基酸取代、缺失或添加。
E69.如E1至E67中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体，其中所述所引入氨基酸突变是野生型RSV F蛋白中之一对氨基酸残基成为一对半胱氨酸之突变。所引入一对半胱氨酸残基残基容许在半胱氨酸残基之间形成二硫键，从而稳定蛋白质之构象或寡聚状态(例如融合前构象)。
E70.如E69之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含下列成对突变中之一者：55C及188C；155C及290C；103C及148C；或142C及371C，例如S55C及L188C；S155C及S290C；A103C及I148C；或L142C及N371C。
E71.如E64至E70中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含作为一或多个空腔填充突变之氨基酸突变。可以被空腔填充目标物置换之氨基酸之实例包括小脂肪族氨基酸(例如Gly、Ala及Val)或小极性氨基酸(例如Ser及Thr)及埋入融合前构象中但在融合后构象中暴露于溶剂之氨基酸。置换氨基酸之实例包括大脂肪族氨基酸(Ile、Leu及Met)或大芳香族氨基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。
E72.如E71之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含选自由以下组成的组之空腔填充突变：
(1)在位置55、62、155、190或290处使用I、Y、L、H或M取代S；
(2)在位置54、58、189、219或397处使用I、Y、L、H或M取代T；
(3)在位置151处使用A或H取代G；
(4)在位置147或298处使用I、L、H或M取代A；
(5)在位置164、187、192、207、220、296、300或495处使用I、Y、H取代V；及
(6)在位置106处使用W取代R。
E73.如E72之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含至少一个选自由以下组成的组之空腔填充突变：T54H、S190I及V296I。
E74.如E64至E73中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含静电突变，所述静电突变会降低在蛋白质折叠结构中彼此靠近之残基之间之离子排斥或增加离子吸引。
E75.如E74之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含静电取代，该静电取代会减小与来自RSV F三聚体之另一原聚体之Glu487及Asp489之酸性残基的排斥性离子相互作用或增加吸引性离子相互作用。
E76.如E74之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含选自由以下组成的组之静电突变：
(1)在位置82、92或487处由D、F、Q、T、S、L或H取代E；
(2)在位置315、394或399处由F、M、R、S、L、I、Q或T取代K；
(3)在位置392、486或489处由H、S、N、T或P取代D；及
(4)在位置106或339处由F、Q、N或W取代R。
E77.如E64至E76中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含选自经改造二硫化物突变、空腔填充突变及静电突变之两种或更多种不同类型突变之组合。
E78.如E64至E77中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白之突变之组合，其中该突变组合是选自由以下组成的组：
(1)103C、148C、190I及486S，优选地A103C、I148C、S190I及D486S之组合；
(2)54H、55C、188C及486S之组合，优选地T54H S55C L188C D486S；
(3)54H、103C、148C、190I、296I及486S之组合，优选地T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S之组合；
(4)54H、55C、142C、188C、296I及371C之组合，优选地T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之组合；
(5)55C、188C及486S之组合，优选地S55C、L188C及D486S之组合；
(6)54H、55C、188C及190I之组合，优选地T54H、S55C、L188C及S190I之组合；
(7)55C、188C、190I及486S之组合，优选地S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(8)54H、55C、188C、190I及486S之组合，优选地T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(9)155C、190I、290C及486S之组合，优选地S155C、S190I、S290C及D486S之组合；
(10)54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S之组合，优选地T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之组合；
(11)54H、155C、190I、290C及296I之组合，优选地T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之组合，及
(12)155C、190F、290C及207L之组合，优选地S155C、S190F、S290C及V207L之组合。
E79.如E64至E67中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白之突变之组合，其中该突变组合是选自由以下组成的组：
(1)215P及486N，优选地S215P及D486N之组合，
(2)66E、215P及486N，优选地K66E、S215P及D486N之组合，
(3)66E、76V、215P及486N，优选地K66E、I76V、S215P及D486N之组合，及
(4)66E、67I、76V、215P及486N，优选地K66E、N67I、I76V、S215P及D486N之组合。
E80.如E64至E78中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含突变103C、148C、190I及486S，优选地A103C、I148C、S190I及D486S。
E81.如E64至E80中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含三聚化结构域。RSV F蛋白包含称为F1(C-末端部分；氨基酸137-574)及F2(N-末端部分；氨基酸26-109)之两个共价连接片段。F1及F2片段经由两个二硫键连接至一起以形成F2-F1异源二聚体。无信号肽序列之未裂解F0蛋白或F1-F2异源二聚体可形成RSV F原聚体。三个所述原聚体组装形成成熟三聚体RSV F蛋白，后者是三个原聚体之同源三聚体。三聚化结构域有利于形成三个F2-F1异源二聚体之三聚体。若干有利于形成可溶性蛋白之稳定三聚体之外源性多聚化结构域为本领域已知。三聚化结构域优选地选自由以下组成的组：
(1)GCN4亮氨酸拉链(Harbury等人，1993Science 262:1401-1407)；(2)来自肺表面活性蛋白之三聚化基序(Hoppe等人，1994FEB S Lett344:191-195)；(3)胶原(McAlinden等人，2003Biol Chem 278:42200-42207)；及(4)噬菌体T4 fibritin折叠子(foldon)(Miroshnikov等人，1998Protein Eng11:329-414)。
E82.如E81之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域是SEQ ID NO:7之噬菌体T4fibritin折叠子。
E83.如E81或E82之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域连接至F1多肽之C-末端处之第一RSV蛋白。
E84.如E83之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域经由连接体连接至F1多肽之C-末端处之第一RSV蛋白。
E85.如E84之水性免疫原组合物，其中该连接体选自GG、GS或SAIG。
E86.如E81之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域是T4折叠子fibritin结构域且经由SAIG连接体连接至F1多肽之C-末端处之第一RSV蛋白。
E87.如E64至E86中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含两条单独多肽链，所述单独多肽链是F1多肽及F2多肽。
E88.如E87之水性免疫原组合物，其中该F2多肽通过一个、两个、三个、四个或五个二硫键连接至该F1多肽以形成F2-F1异源二聚体。
E89.如E64至E86中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白呈单链蛋白之形式，其中该F2多肽通过肽键或连接体连接至该F1多肽。
E90.如E89之水性免疫原组合物，其中该连接体是选自G、GG、GGG、GS或SAIG。
E91.如E89之水性免疫原组合物，其中该连接体是全长pep27序列或其片段。
E92.如E87至E91中任一项之组合物，其中该第一RSV F蛋白之该F1多肽缺乏整个细胞质结构域或整个细胞质结构域及整个跨膜结构域之一部分。
E93.如E87至E92之水性免疫原组合物，其中氨基酸残基514至574不存在于该第一RSV F蛋白之该F1多肽中。
E94.如E87至E93之水性免疫原组合物，其中该F2多肽链与相应野生型RSV F蛋白之全长F2多肽具有相同长度；或具有缺失，例如自该F2多肽之N-末端或C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基。
E95.如E1至E65中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白是如WO2017/109629中所公开之RSV蛋白突变体，该案件之全部内容以引用方式并入本文中。
E96.如E1至E65中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白是如WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、WO2017/174564、WO2017/005844、WO2022/002894及WO2018/109220中所公开之RSV蛋白突变体，所述案件之全部内容皆以引用方式并入本文中。
E97.如E1至E96中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物进一步包含呈融合前构象之第二RSV F蛋白三聚体。
E98.如E97之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白是亚型A之F蛋白。
E99.如E97之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白是亚型B之F蛋白。
E100.如E97至E99中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体。
E101.如E100之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白相对于相应野生型RSVF蛋白之氨基酸序列显示引入氨基酸序列中之突变且对呈融合前构象之该野生型RSV F蛋白或对包含该野生型F蛋白之病毒具有免疫原性。所述突变可为(例如)相对于野生型RSV F蛋白之氨基酸取代、缺失或添加。
E102.如E97至E101中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体，其中所述所引入氨基酸突变是野生型RSV F蛋白中之一对氨基酸残基成为一对半胱氨酸之突变。所引入一对半胱氨酸残基残基容许在半胱氨酸残基之间形成二硫键，从而稳定蛋白质之构象或寡聚状态(例如融合前构象)。
E103.如E102之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含下列成对突变中之一者：55C及188C；155C及290C；103C及148C；或142C及371C，例如S55C及L188C；S155C及S290C；A103C及I148C；或L142C及N371C。
E104.如E97至E103中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含作为一或多个空腔填充突变之氨基酸突变。可以被空腔填充目标物置换之氨基酸之实例包括小脂肪族氨基酸(例如Gly、Ala及Val)或小极性氨基酸(例如Ser及Thr)及埋入融合前构象中但在融合后构象中暴露于溶剂之氨基酸。置换氨基酸之实例包括大脂肪族氨基酸(Ile、Leu及Met)或大芳香族氨基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。
E105.如E104之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含选自由以下组成的组之空腔填充突变：
(1)在位置55、62、155、190或290处使用I、Y、L、H或M取代S；
(2)在位置54、58、189、219或397处使用I、Y、L、H或M取代T；
(3)在位置151处使用A或H取代G；
(4)在位置147或298处使用I、L、H或M取代A；
(5)在位置164、187、192、207、220、296、300或495处使用I、Y、H取代V；及
(6)在位置106处使用W取代R。
E106.如E105之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含至少一个选自由以下组成的组之空腔填充突变：T54H、S190I及V296I。
E107.如E97至E106中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含静电突变，所述静电突变会降低在蛋白质折叠结构中彼此靠近之残基之间之离子排斥或增加离子吸引。
E108.如E107之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含静电取代，该静电取代会减小与来自RSV F三聚体之另一原聚体之Glu487及Asp489之酸性残基的排斥性离子相互作用或增加吸引性离子相互作用。
E109.如E107之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含选自由以下组成的组之静电突变：
(1)在位置82、92或487处由D、F、Q、T、S、L或H取代E；
(2)在位置315、394或399处由F、M、R、S、L、I、Q或T取代K；
(3)在位置392、486或489处由H、S、N、T或P取代D；及
(4)在位置106或339处由F、Q、N或W取代R。
E110.如E97至E109中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含选自经改造二硫化物突变、空腔填充突变及静电突变之两种或更多种不同类型突变之组合。
E111.如E97至E110中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白之突变之组合，其中该突变组合是选自由以下组成的组：
(1)103C、148C、190I及486S，优选地A103C、I148C、S190I及D486S之组合；
(2)54H、55C、188C、486S之组合，优选地T54H S55C L188C D486S；
(3)54H、103C、148C、190I、296I及486S，优选地T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S之组合；
(4)54H、55C、142C、188C、296I及371C，优选地T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之组合；
(5)55C、188C及486S，优选地S55C、L188C及D486S之组合；
(6)54H、55C、188C及190I，优选地T54H、S55C、L188C及S190I之组合；
(7)55C、188C、190I及486S，优选地S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(8)54H、55C、188C、190I及486S，优选地T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(9)155C、190I、290C及486S，优选地S155C、S190I、S290C及D486S之组合；
(10)54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S，优选地T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之组合；
(11)54H、155C、190I、290C及296I，优选地T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之组合，及
(12)155C、190F、290C及207L，优选地S155C、S190F、S290C及V207L之组合。
E112.如E97至E110中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白之突变之组合，其中该突变组合选自由以下组成的组：
(1)215P及486N，优选地S215P及D486N之组合，
(2)66E、215P及486N，优选地K66E、S215P及D486N之组合，
(3)66E、76V、215P及486N，优选地K66E、I76V、S215P及D486N之组合，及
(4)66E、67I、76V、215P及486N，优选地K66E、N67I、I76V、S215P及D486N之组合。
E113.如E97至E111中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含突变103C、148C、190I及486S，优选地A103C、I148C、S190I及D486S。
E114.如E97至E113中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含三聚化结构域。三聚化结构域促进形成三个F2-F1异源二聚体之三聚体。若干促进形成可溶性蛋白之稳定三聚体之外源性多聚化结构域为本领域已知。三聚化结构域优选地选自由以下组成的组：
(1)GCN4亮氨酸拉链(Harbury等人，1993Science 262:1401-1407)；(2)来自肺表面活性蛋白之三聚化基序(Hoppe等人，1994FEB S Lett344:191-195)；(3)胶原(McAlinden等人，2003Biol Chem 278:42200-42207)；及(4)噬菌体T4 fibritin折叠子(Miroshnikov等人，1998Protein Eng11:329-414)。
E115.如E114之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域是SEQ ID NO:7之噬菌体T4 fibritin折叠子。
E116.如E114或E115之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域连接至F1多肽之C-末端处之第二RSV蛋白。
E117.如E116之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域经由连接体连接至F1多肽之C-末端处之第二RSV蛋白。
E118.如E117之水性免疫原组合物，其中该连接体选自GG、GS或SAIG。
E119.如E114之水性免疫原组合物，其中该三聚化结构域是T4折叠子纤维蛋白结构域且经由SAIG连接体连接至F1多肽之C-末端处之第二RSV蛋白。
E120.如E97至E119中任一项之水性免疫原组合物，该第二RSV F蛋白包含两条单独多肽链，所述单独多肽链是F1多肽及F2多肽。
E121.如E120之水性免疫原组合物，其中该F2多肽通过一个、两个、三个、四个或五个二硫键连接至该F1多肽以形成F2-F1异源二聚体。
E122.如E97至E119中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白呈单链蛋白之形式，其中该F2多肽通过肽键或连接体连接至该F1多肽。
E123.如E122之水性免疫原组合物，其中该连接体选自G、GG、GGG、GS或SAIG。
E124.如E122之水性免疫原组合物，其中该连接体是全长pep27序列或其片段。
E125.如E120至E124中任一项之组合物，其中该第二RSV F蛋白之该F1多肽缺乏整个细胞质结构域或整个细胞质结构域及整个跨膜结构域之一部分。
E126.如E120至E125之水性免疫原组合物，其中氨基酸残基514至574不存在于该第二RSV F蛋白之该F1多肽中。
E127.如E120至E126之水性免疫原组合物，其中该F2多肽链与相应野生型RSV F蛋白之全长F2多肽具有相同长度；或具有缺失，例如自该F2多肽之N-末端或C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基。
E128.如E97之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白是如WO2017/109629中所公开之RSV蛋白突变体，该案件之全部内容以引用方式并入本文中。
E129.如E97中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白是如WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、WO2017/174564、WO2017/005844及WO2018/109220中所公开之RSV蛋白突变体，所述案件之全部内容皆以引用方式并入本文中。
E130.如E99至E129之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白是亚型A且该第二RSV F蛋白是亚型B。
E131.如E130之水性免疫原组合物，其中所述第一及第二RSV F蛋白包含突变A103C、I148C、S190I及D486S。
E132.如E130及E131之水性免疫原组合物，其中该第一及该第二RSV F蛋白包含
(a)F1多肽，其缺乏氨基酸残基514至574，及
(b)F2多肽，其至少通过一个二硫键连接至该F1多肽，及
(c)T4折叠子fibritin结构域，其经由SAIG连接体连接至F1多肽之C-末端。
E133.如E1至E63及E97至E129中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含SEQ ID NO:1之F1多肽及SEQ ID NO:2之F2多肽。
E134.如E97及E130至133中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含SEQ ID NO:3之F1多肽及SEQ ID NO:4之F2多肽。
E135.如E1至E134中任一项之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白之浓度为约0.01mg/mL至约10mg/mL，优选地约0.01mg/mL至约5mg/mL、更优选地约0.01mg/mL至约1mg/mL。
E136.如E135之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白之该浓度为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.88、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1mg/mL。
E137.如E136之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白之该浓度为约0.08mg/mL。
E138.如E136之水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白之该浓度为约0.12mg/mL。
E139.如E97至E138中任一项之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白之浓度为约0.01mg/mL至约10mg/mL，优选地约0.01mg/mL至约5mg/mL、更优选地约0.01mg/mL至约1mg/mL。
E140.如E138之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白之该浓度为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.88、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1mg/mL。
E141.如E138之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白之该浓度为约0.08mg/mL。
E142.如E138之水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白之该浓度为约0.12mg/mL。
E143.如E1至E142中任一项之水性免疫原组合物，其中该水性免疫原组合物进一步包含佐剂。
E144.如E143之水性免疫原组合物，其中该佐剂是选自铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝；皂苷，例如StimulonTMQS-21(Antigenics,Framingham,MA.)；脂质体中3-O-去酰基-4′-单磷酰基脂质A(MPLTM)及QS-21之组合，例如AS01或ALFQ；或合成多核苷酸，例如含有CpG基序之寡核苷酸。在一优选实施方案中，佐剂是氢氧化铝。在另一优选实施方案中，佐剂是含有CpG基序之寡核苷酸。在另一优选实施方案中，佐剂包含氢氧化铝及含有CpG基序之寡核苷酸。在另一优选实施方案中，佐剂是AS01或ALFQ。
E145.如E1至E144中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持1周之后之HMMS百分比小于约25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10％。
E146.如E1至E144中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持1周之后之HMMS百分比小于约20％。
E147.如E1至E144中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持1周之后之HMMS百分比小于约15％。
E148.如E1至E144中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持1周之后之HMMS百分比小于约10％。
E149.如E1至E148中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持2周之后之HMMS百分比小于约25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10％。
E150.如E1至E148中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持2周之后之HMMS百分比小于约20％。
E151.如E1至E148中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持2周之后之HMMS百分比小于约15％。
E152.如E1至E148中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持2周之后之HMMS百分比小于约10％。
E153.如E1至E152中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物在25℃下保持3周之后之HMMS百分比小于约25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10％。
E154.如E1至E152中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物在25℃下保持3周之后之HMMS百分比小于约20％。
E155.如E1至E152中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物在25℃下保持3周之后之HMMS百分比小于约15％。
E156.如E1至E152中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物在25℃下保持3周之后之HMMS百分比小于约10％。
E157.如E145至E156中任一项之水性免疫原组合物，
其中该组合物中之该HMMS百分比是通过大小排阻层析(SEC-HPLC)所测量，优选地如实施例1中所公开。
E158.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约60％。
E159.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。
E160.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约65％。
E161.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约70％。
E162.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约75％。
E163.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约80％。
E164.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约85％。
E165.如E1至E157中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持1周之后之百分比高于约90％。
E166.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约60％。
E167.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。
E168.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约65％。
E169.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约70％。
E170.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约75％。
E171.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约80％。
E172.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约85％。
E173.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持2周之后之百分比高于约90％。
E174.如E1至E165中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约60％。
E175.如E1至E174中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。
E176.如E1至E174中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约65％。
E177.如E1至E174中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约70％。
E178.如E1至E174中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约75％。
E179.如E1至E174中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约80％。
E180.如E1至E174中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约85％。
E181.如E1至E174中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白在25℃下保持3周之后之百分比高于约90％。
E182.如E158至E181中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白之百分比是根据SEC-Fab滴定测定法使用特异性结合至呈该融合前构象之该RSV F蛋白之抗体所测量，优选地如实施例1中公开。
E183.如E158至E182中任一项之水性免疫原组合物，其中该组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白之百分比是根据Elisa分析使用特异性结合至呈该融合前构象之该RSV F蛋白之抗体所测量，优选地如实施例1中公开。
E184.如E182或E183之水性免疫原组合物，其中该抗体是AM22。
E185.如E182或E183中任一项之水性免疫原组合物，其中该抗体是AM14。
E186.如E1至E185中任一项之水性免疫原组合物，其用作疫苗。
E187.如E1至E185中任一项之水性免疫原组合物，其用于在受试者中诱发对RSV之免疫反应。
E188.如E1至E185中任一项之水性免疫原组合物，其用于减少或预防受试者之RSV相关疾病。
E189.如E1至E185中任一项之水性免疫原组合物，其用以制造用于减少或预防受试者之RSV相关疾病之药物。
E190.一种诱发受试者中对RSV之免疫反应之方法，其包含向该受试者施用如E1至E185中任一项之水性免疫原组合物。
E191.一种减少或预防受试者之RSV相关疾病之方法，其包含向该受试者施用如E1至E185中任一项之水性免疫原组合物。
E192.如E186至E189之组合物或E190或E191之方法，其中该受试者是人类，优选地儿童、怀孕女性或至少50、55或60岁之人类。
E193.一种储存包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之方法，其包含在至少约15℃之温度下储存该组合物。
E194.如E193之方法，其中该温度介于约15℃与约30℃之间。
E195.如E194之方法，其中该温度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃。
E196.如E195之方法，其中该温度为约20℃。
E197.如E193至E196中任一项之方法，其中该RSV F蛋白是亚型A之F蛋白。
E198.如E193至E196中任一项之方法，其中该RSV F蛋白是亚型B之F蛋白。
E199.如E193至E198中任一项之方法，其中该RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体。
E200.如E193至E199中任一项之方法，其中该RSV F蛋白相对于相应野生型RSV F蛋白之氨基酸序列显示引入氨基酸序列中之突变且对呈融合前构象之该野生型RSV F蛋白或对包含该野生型F蛋白之病毒具有免疫原性。所述突变可为(例如)相对于野生型RSV F蛋白之氨基酸取代、缺失或添加。
E201.如E193至E200中任一项之方法，其中该RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体，其中所述所引入氨基酸突变是野生型RSV F蛋白中之一对氨基酸残基成为一对半胱氨酸之突变。所引入一对半胱氨酸残基容许在半胱氨酸残基之间形成二硫键，从而稳定蛋白质之构象或寡聚状态(例如融合前构象)。
E202.如E201之方法，其中该RSV F蛋白包含下列成对突变中之一者：55C及188C；155C及290C；103C及148C；以及142C及371C，例如S55C及L188C；S155C及S290C；A103C及I148C；以及L142C及N371C。
E203.如E193至E202中任一项之方法，其中该RSV F蛋白包含作为一或多个空腔填充突变之氨基酸突变。可以被空腔填充目标物置换之氨基酸之实例包括小脂肪族氨基酸(例如Gly、Ala及Val)或小极性氨基酸(例如Ser及Thr)及埋入融合前构象中但在融合后构象中暴露于溶剂之氨基酸。置换氨基酸之实例包括大脂肪族氨基酸(Ile、Leu及Met)或大芳香族氨基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。
E204.如E203之方法，其中该RSV F蛋白包含选自由以下组成的组之空腔填充突变：
(1)在位置55、62、155、190或290处使用I、Y、L、H或M取代S；
(2)在位置54、58、189、219或397处使用I、Y、L、H或M取代T；
(3)在位置151处使用A或H取代G；
(4)在位置147或298处使用I、L、H或M取代A；
(5)在位置164、187、192、207、220、296、300或495处使用I、Y、H取代V；及
(6)在位置106处使用W取代R。
E205.如E203之方法，其中该RSV F蛋白包含至少一个选自由以下组成的组之空腔填充突变：T54H、S190I及V296I。
E206.如E193至E205中任一项之方法，其中该RSV F蛋白包含静电突变，所述静电突变会降低在蛋白质折叠结构中彼此靠近之残基之间之离子排斥或增加离子吸引。
E207.如E206之方法，其中该RSV F蛋白包含静电取代，该静电取代会减小与来自RSV F三聚体之另一原聚体之Glu487及Asp489之酸性残基的排斥性离子相互作用或增加吸引性离子相互作用。
E208.如E206之方法，其中该RSV F蛋白包含选自由以下组成的组之静电突变：
(1)在位置82、92或487处由D、F、Q、T、S、L或H取代E；
(2)在位置315、394或399处由F、M、R、S、L、I、Q或T取代K；
(3)在位置392、486或489处由H、S、N、T或P取代D；及
(4)在位置106或339处由F、Q、N或W取代R。
E209.如E193至E208中任一项之方法，其中该RSV F蛋白包含选自经改造二硫化物突变、空腔填充突变及静电突变之两种或更多种不同类型突变之组合。
E210.如E193至E201中任一项之方法，其中该RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白之突变之组合，其中该突变组合是选自由以下组成的组：
(1)103C、148C、190I及486S，优选地A103C、I148C、S190I及D486S之组合；
(2)54H 55C 188C 486S，优选地T54H S55C L188C D486S之组合；
(3)54H、103C、148C、190I、296I及486S，优选地T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S之组合；
(4)54H、55C、142C、188C、296I及371C，优选地T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之组合；
(5)55C、188C及486S，优选地S55C、L188C及D486S之组合；
(6)54H、55C、188C及190I，优选地T54H、S55C、L188C及S190I之组合；
(7)55C、188C、190I及486S，优选地S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(8)54H、55C、188C、190I及486S，优选地T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(9)155C、190I、290C及486S，优选地S155C、S190I、S290C及D486S之组合；
(10)54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S，优选地T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之组合；
(11)54H、155C、190I、290C及296I，优选地T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之组合，及
(12)155C、190F、290C及207L，优选地S155C、S190F、S290C及V207L之组合。
E211.如E193至E201中任一项之水性免疫原组合物，其中该RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白之突变之组合，其中该突变组合是选自由以下组成的组：
(1)215P及486N，优选地S215P及D486N之组合，
(2)66E、215P及486N，优选地K66E、S215P及D486N之组合，
(3)66E、76V、215P及486N，优选地K66E、I76V、S215P及D486N之组合，及
(4)66E、67I、76V、215P及486N，优选地K66E、N67I、I76V、S215P及D486N之组合。
E212.如E193至E202中任一项之方法，其中该RSV F蛋白包含突变103C、148C、190I及486S，优选地A103C、I148C、S190I及D486S。
E213.如E193至E212中任一项之方法，其中该RSV F蛋白包含三聚化结构域。三聚化结构域有利于形成三个F2-F1异源二聚体之三聚体。若干有利于形成可溶性蛋白之稳定三聚体之外源性多聚化结构域为本领域已知。三聚化结构域优选地选自由以下组成的组：
(1)GCN4亮氨酸拉链(Harbury等人，1993Science 262:1401-1407)；(2)来自肺表面活性蛋白之三聚化基序(Hoppe等人，1994FEB S Lett344:191-195)；(3)胶原(McAlinden等人，2003Biol Chem 278:42200-42207)；及(4)噬菌体T4 fibritin折叠子(Miroshnikov等人，1998Protein Eng11:329-414)。
E214.如E213之方法，其中该三聚化结构域是SEQ ID NO:7之噬菌体T4fibritin折叠子。
E215.如E213或E214之方法，其中该三聚化结构域连接至F1多肽之C-末端处之第一RSV蛋白。
E216.如E215之方法，其中该三聚化结构域经由连接体连接至F1多肽之C-末端处之第一RSV蛋白。
E217.如E216之方法，其中该连接体选自GG、GS或SAIG。
E218.如E217之方法，其中该三聚化结构域是T4折叠子fibritin结构域且经由SAIG连接体连接至F1多肽之C-末端处之第一RSV蛋白。
E219.如E193至E218中任一项之方法，其中该第一RSV F蛋白包含两条单独多肽链，所述单独多肽链是F1多肽及F2多肽。
E220.如E219之方法，其中该F2多肽通过一个、两个、三个、四个或五个二硫键连接至该F1多肽以形成F2-F1异源二聚体。
E221.如E193至E218中任一项之方法，其中该第一RSV F蛋白呈单链蛋白之形式，其中该F2多肽通过肽键或连接体连接至该F1多肽。
E222.如E221之方法，其中该连接体选自G、GG、GGG、GS或SAIG。
E223.如E221之方法，其中该连接体是全长pep27序列或其片段。
E224.如E219至E223之方法，其中该第一RSV F蛋白之该F1多肽缺乏整个细胞质结构域或整个细胞质结构域及整个跨膜结构域之一部分。
E225.如E219至E224之方法，其中氨基酸残基514至574不存在于该第一RSV F蛋白之该F1多肽中。
E226.如E219至E225之方法，其中该F2多肽链与相应野生型RSV F蛋白之全长F2多肽具有相同长度；或具有缺失，例如自该F2多肽之N-末端或C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基。
E227.如E193至E198中任一项之方法，其中该RSV F蛋白是如WO2017/109629中所公开之RSV蛋白突变体，该案件之全部内容以引用方式并入本文中。
E228.如E193至E198中任一项之水性免疫原组合物，其中该RSV F蛋白是如WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、WO2017/174564、WO2017/005844及WO2018/109220中所公开之RSV蛋白突变体，所述案件之全部内容皆以引用方式并入本文中。
E229.如E193至E196中任一项之方法，其中该水性免疫原组合物是如E1至E189中任一项之组合物。
E230.一种冻干包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之方法，其包含冷冻该组合物之步骤，其中该步骤包含以至少约0.3℃/min之冷冻斜变速率将温度降至介于-40℃与-60℃之间之冷冻温度。
E231.如E230之方法，其中该冷冻温度介于约-45℃与约-55℃之间。
E232.如E231之方法，其中该冷冻温度为约-50℃。
E233.如E230至E232中任一项之方法，其中将该组合物在该冷冻温度下维持至少约45min，例如介于45min与120min之间。
E234.如E233之方法，其中将该组合物在该冷冻温度下维持至少约60min，例如介于60min与120min之间。
E235.如E233之方法，其中将该组合物在该冷冻温度下维持约60min。
E236.如E230至E235中任一项之方法，其中该冷冻斜变速率为至少约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1℃/min，例如至少约0.4℃/min。
E237.如E237之方法，其中该冷冻斜变速率为至少1℃/min。举例而言，该冷冻斜变速率为约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2℃/min。
E238.如E230至E237中任一项之方法，其中该水性免疫原组合物是如E1至E189中任一项之组合物。
E239.一种冻干包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之方法，其包含下列步骤：
(a)提供包含呈该融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物，
(b)冷冻该组合物，其中该步骤包含以至少约0.3℃/min(例如介于约0.3℃/min与约2℃/min之间)之冷冻斜变速率将温度降至介于约-40℃与约-60℃之间之冷冻温度，及
将该组合物在该冷冻温度下维持至少约30min，例如介于30min与120min之间。
(c)将经冷冻组合物退火；
(d)再冷冻经退火组合物，其中该步骤包含以至少0.3℃/min之再冷冻斜变速率将温度降至介于约-40℃与约-60℃之间之再冷冻温度，及
将该组合物在该再冷冻温度下维持至少约30min，例如介于30min与120min之间；
(e)干燥经再冷冻组合物，及
(f)获得包含呈该融合前构象之该RSV F蛋白三聚体之冻干组合物。
E240.如E239之方法，其中步骤(b)中之该冷冻温度介于约-45℃与约-55℃之间。
E241.如E240之方法，其中步骤(b)中之该冷冻温度为约50℃。
E242.如E239至E241中任一项之方法，其中将步骤(b)中之该组合物在该冷冻温度下维持至少约45min，例如介于45min与120min之间。
E243.如E242之方法，其中将步骤(b)中之该组合物在该冷冻温度下维持至少约60min，例如介于60min与120min之间。
E244.如E239至E243中任一项之方法，其中步骤(b)中之该冷冻斜变速率为至少约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1℃/min，例如介于约0.3℃/min与约2℃/min之间。
E245.如E244之方法，其中步骤(b)中之该冷冻斜变速率为至少约0.4℃/min。
E246.如E245之方法，其中步骤(b)中之该冷冻斜变速率为至少约1℃/min。
E247.如E239至E246中任一项之方法，其中该退火步骤是在介于约-25℃与约-5℃之间之退火温度下实施。
E248.如E247之方法，其中该退火温度介于约-15℃与约-5℃之间。
E249.如E248之方法，其中该退火温度为约-10℃。
E250.如E239至E249中任一项之方法，其中以介于约0.3℃/min与约1℃/min之间之斜变速率将该冷冻温度增至该退火温度。
E251.如E239至E250中任一项之方法，其中将该组合物在该退火温度下维持至少约60min，例如介于约60min与120min之间。
E252.如E239至E251中任一项之方法，其中步骤(d)中之该再冷冻温度介于约-45℃与约-55℃之间。
E253.如E252之方法，其中步骤(d)中之该再冷冻温度为约-50℃。
E254.如E239至E253中任一项之方法，其中将步骤(d)中之该组合物在该再冷冻温度下维持至少约45min，例如介于约45min与约120min之间。
E255.如E254之方法，其中将步骤(d)中之该组合物在该再冷冻温度下维持至少约60min。
E256.如E239至E255中任一项之方法，其中以介于约0.3℃/min与约2℃/min之间之再冷冻斜变速率将该退火温度降至该再冷冻温度。
E257.如E256之方法，其中步骤(d)中之该再冷冻斜变速率为至少约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1℃/min。
E258.如E257之方法，其中步骤(d)中之该再冷冻斜变速率为至少约0.4℃/min。
E259.如E258之方法，其中步骤(d)中之该再冷冻斜变速率为至少约1℃/min。
E260.如E239至E259中任一项之方法，其中步骤(e)包含实施于介于约-10℃与约20℃之间之第一干燥温度下之第一干燥步骤。
E261.如E260之方法，其中该第一干燥步骤是在介于-5℃与5℃之间之第一干燥温度下实施。
E262.如E261之方法，其中该第一干燥步骤是在0℃下实施。
E263.如E260至E262中任一项之方法，其中以介于约0.1℃/min与约1℃/min之间之第一干燥斜变速率将该再冷冻温度增至该第一干燥温度。
E264.如E263之方法，其中步骤(e)中之该第一干燥斜变速率为约0.5℃/min。
E265.如E260至E264中任一项之方法，其中将该第一干燥温度维持至少约1min，例如约1min与30min之间。
E266.如E260至E265中任一项之方法，其中该第一干燥步骤是在介于约150毫托与约250毫托之间之室压下实施。
E267.如E266之方法，其中该第一干燥步骤是在约200毫托之室压下实施。
E268.如E260至E267中任一项之方法，其中步骤(e)包含在该第一干燥步骤之后于介于约40℃与约60℃之间之第二干燥温度下实施之第二干燥步骤。
E269.如E268之方法，其中该第二干燥步骤是在介于约45℃与约55℃之间之温度下实施。
E270.如E269之方法，其中该第二干燥步骤是在约50℃下实施。
E271.如E268至E270中任一项之方法，其中以介于约0.1℃/min与约0.5℃/min之间之第二干燥斜变速率将该第一干燥温度增至该第二干燥温度。
E272.如E271之方法，其中步骤(e)中之该第二干燥斜变速率为约0.2℃/min。
E273.如E268至E272中任一项之方法，其中将该第二干燥温度维持至少约400min至约650min，优选地介于约500min与约600min之间。
E274.如E273之方法，其中将该第二干燥温度维持约575min。
E275.如E268至E274中任一项之方法，其中该第二干燥步骤是在介于约150毫托与约250毫托之间之室压下实施。
E276.如E275之方法，其中该第二干燥步骤是在约200毫托之室压下实施。
E277.如E239至E276中任一项之方法，其中步骤(a)中所提供水性组合物之体积介于约0.1mL与约10mL，优选地约0.1mL与约5mL、更优选地约0.1mL与约1mL之间。
E278.如E277之方法，其中步骤(a)中所提供水性组合物之该体积为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mL，优选地约0.5mL。
E279.如E277之方法，其中步骤(a)中所提供水性组合物之该体积为约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0mL，优选地约1.5mL。
E280.如E239至E279中任一项之方法，其中该冻干组合物中之残余水分小于约2％，优选地小于约1％。
E281.如E280之方法，其中该冻干组合物中之该残余水分小于约0.5％。
E282.如E239至E281中任一项之方法，其中在25℃下保持8个月之后该冻干组合物中呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比高于约65％、66％、67％、68％、69％或70％。
E283.如E282之方法，其中在25℃下保持8个月之后该冻干组合物中呈该融合前构象之RSV F蛋白之该百分比高于约70％。
E284.如E239至E283中任一项之方法，其中在40℃下保持8个月之后该冻干组合物中呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比高于约55％、56％、57％、58％、59％或60％。
E285.如E284之方法，其中在40℃下保持8个月之后该冻干组合物中呈该融合前构象之RSV F蛋白之该百分比高于约60％。
E286.如E282至E285中任一项之方法，其中该冻干组合物中呈该融合前构象之RSVF蛋白之该百分比是根据本文所公开之任一测定法所测量。
E287.如E282至E285中任一项之方法，其中该冻干组合物中呈该融合前构象之RSVF蛋白之百分比是根据SEC-Fab滴定测定法使用特异性结合至呈该融合前构象之该RSV F蛋白之抗体所测量。
E288.如E282至E287中任一项之方法，其中该冻干组合物中呈该融合前构象之RSVF蛋白之百分比是根据SEC-Fab滴定测定法使用特异性结合至呈该融合前构象之该RSV F蛋白之抗体、例如AM22或AM14，优选地AM14所测量。
E289.如E239至E288中任一项之方法，其中该水性免疫原组合物是如E1至E189中任一项之组合物。
E290.一种冻干免疫原组合物，其是通过如E239至E289中任一项之方法获得或可通过所述方法获得。
E291.一种冻干免疫原组合物，其是通过如E1至E189中任一项之冻干水性免疫原组合物获得。
E292.一种冻干免疫原组合物，其包含0.08mg如E64至E96中任一项所定义之第一RSV F蛋白三聚体、0.08mg如E98至E129中所定义之第二RSV F蛋白三聚体、0.15mg Tris碱、1.41mg Tris-HCl、15mg蔗糖、31mg甘露醇、0.10mg PS80及1.49mg NaCl。
E293.如E290或E292之冻干免疫原组合物，其中该残余水分小于约2％，优选地小于1％。
E294.如E290或E293之冻干免疫原组合物，其中该残余水分小于约0.5％。
E295.如E290至E294中任一项之冻干免疫原组合物，其中在25℃下保持8个月之后呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比高于约65％、66％、67％、68％、69％或70％。
E296.如E290至E294中任一项之冻干免疫原组合物，其中在25℃下保持8个月之后呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比高于约70％。
E297.如E290至E294中任一项之冻干免疫原组合物，其中在40℃下保持8个月之后呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比高于约55％、56％、57％、58％、59％或60％。
E298.如E290至E294中任一项之冻干免疫原组合物，其中在40℃下保持8个月之后呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比高于约60％。
E299.如E295至E298中任一项之冻干免疫原组合物，其中呈该融合前构象之RSV F蛋白之该百分比是根据本文所公开之任一测定法所测量。
E300.如E295至E298中任一项之冻干免疫原组合物，其中呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比是根据SEC-Fab滴定测定法使用特异性结合至呈该融合前构象之该RSV F蛋白之抗体所测量。
E301.如E295至E300中任一项之冻干免疫原组合物，其中呈该融合前构象之RSV F蛋白之百分比是根据SEC-Fab滴定测定法使用特异性结合至呈该融合前构象之该RSV F蛋白之抗体、例如AM22或AM14，优选地AM14所测量。
E302.一种试剂盒，其包含
i)如E290至E301中任一项之冻干组合物，及
ii)稀释剂，其用于复水重构该冻干组合物。
E303.如E302之试剂盒，其中该稀释剂是注射用水。
E304.如E302或E303之试剂盒，其中该复水重构用稀释剂之体积介于约0.1mL与约10mL，优选地约0.1mL与约5mL、更优选地约0.1mL与约1mL之间。
E305.如E304之试剂盒，其中该复水重构用稀释剂之该体积为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mL，优选地约0.50、0.55、0.60、0.65或0.70mL。
E306.一种试剂盒，其包含
i)冻干组合物，及
ii)稀释剂，其包含浓度介于约20mM与约300mM之间之氯化钠；
其中使用该稀释剂复水重构该冻干组合物产生如E1至E189中任一项之水性免疫原组合物。
E307.如E306之试剂盒，其中该复水重构用稀释剂之体积介于约0.1mL与约10mL，优选地约0.1mL与约5mL、更优选地约0.1mL与约1mL之间。
E308.如E306或E307之试剂盒，其中该稀释剂包含浓度为约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mM之氯化钠。
E309.如E302至E308之试剂盒，其中该稀释剂包含防腐剂。
E310.如E309之试剂盒，其中该防腐剂是选自由以下组成的组：氯丁醇、间-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄索氯铵、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、苯甲酸、苄醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
E311.如E310之试剂盒，其中该防腐剂是选自由以下组成的组：苄索氯铵、2-苯氧基乙醇、苯酚及硫柳汞。在一优选实施方案中，防腐剂是2-苯氧基乙醇。
E312.如E311之试剂盒，其中该防腐剂是2-苯氧基乙醇。
E313.如E309至E312中任一项之试剂盒，其中选择该稀释剂中之防腐剂浓度以通过使用该稀释剂复水重构该冻干组合物来达成该水性组合物中至少9mg/mL之防腐剂浓度。
E314.如E309至E312中任一项之试剂盒，其中选择该稀释剂中之防腐剂浓度以通过使用该稀释剂复水重构该冻干组合物来达成该水性组合物中10mg/mL之防腐剂浓度。
本文所用各章节标题仅出于组织目的，而不能理解为限制所阐述主题。
2.定义
如本文中所使用，术语“约”在用于修饰以数值方式定义之参数时意指，该参数可在该参数之所陈述数值上下变化最多10％。举例而言，约5mg之剂量意指5mg±10％，亦即，其可在4.5mg至5.5mg之间变化。
术语“F0多肽”(F0)是指RSV F蛋白之前体多肽，其由信号多肽序列、F1多肽序列、pep27多肽序列及F2多肽序列构成。除极少例外外，已知RSV毒株之F0多肽由574个氨基酸组成。
术语“F1多肽”(F1)是指成熟RSV F蛋白之多肽链。天然F1包括RSV F0前体之大约残基137-574且由(自N-末端至C-末端)细胞外区域(大约残基137-524)、跨膜结构域(大约残基525-550)及细胞质结构域(大约残基551-574)构成。如本文中所使用，该术语涵盖天然F1多肽及包括来自天然序列之修饰(例如氨基酸取代、插入或缺失)之F1多肽，所述修饰是(例如)经设计以稳定RSV F蛋白突变体或增强RSV F蛋白突变体之免疫原性之修饰。
术语“F2多肽”(F2)是指成熟RSV F蛋白之多肽链。天然F2包括RSV F0前体之大约残基26-109。如本文中所使用，该术语涵盖天然F2多肽及包括来自天然序列之修饰(例如氨基酸取代、插入或缺失)之F2多肽，所述修饰是(例如)经设计以稳定呈融合前构象之RSV F蛋白突变体或增强RSV F蛋白突变体之免疫原性之修饰。在天然RSV F蛋白中，F2多肽通过两个二硫键连接至F1多肽以形成F2-F1异源二聚体。
术语“折叠子”(foldon)或“折叠子结构域”是指能够形成三聚体之氨基酸序列。所述折叠子结构域之一实例是衍生自噬菌体T4 fibritin之肽序列，其具有GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:7)之序列。
术语“AM14”是指WO 2008/147196 A2中所阐述之抗体，其具有包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之重链可变结构域及包含SEQ ID NO:11之氨基酸序列之轻链可变结构域。
术语“AM22”是指WO 2011/043643 A1中所阐述之抗体，其具有包含SEQ ID NO:12之氨基酸序列之重链可变结构域及包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列之轻链可变结构域。
术语“D25”是指WO 2008/147196 A2中所阐述之抗体，其具有包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列之重链可变结构域及包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列之轻链可变结构域。
术语“融合前构象”是指由RSV F蛋白或其突变体采用之结构构象，其可特异性结合至(i)抗体D25或AM22(在RSV F蛋白或突变体呈单体或三聚体之形式时)或(ii)抗体AM14(在RSV F蛋白突变体呈三聚体之形式时)。融合前三聚体构象是融合前构象之子集。
术语“融合后构象”是指RSV F蛋白所采用不由D25、AM22或AM14特异性结合之结构构象。在病毒包膜与宿主细胞膜融合后，天然F蛋白采用融合后构象。RSV F蛋白亦可在融合事件背景之外呈现融合后构象，例如在应力条件下(例如热及低渗透压)、在自膜提取时，在表达为胞外结构域时或在储存时。
术语“可溶性蛋白”是指能够溶于水性液体中并保持溶解之蛋白质。蛋白质之溶解度可依赖于以下因素有所变化：基于水之液体中之蛋白质浓度、液体之缓冲条件、液体中其他溶质之浓度(例如盐及蛋白质浓度)及液体之温度。
术语“疫苗”是指包含免疫原之药物组合物，该免疫原能够在受试者中诱发预防性或治疗性免疫反应。通常，疫苗诱发对病原体(例如病毒病原体)之抗原之抗原特异性免疫反应。
术语“免疫原性”是指某一物质能够在动物中引起、诱发、刺激或诱导针对特定抗原之免疫反应，不论是在存在抑或不存在佐剂下。免疫原性可通过本领域已知之任何方法或测定法来测量，例如动物疫苗接种模型、血清杀细菌测定法(SBA)、流式细胞术及活体外功效测定。
术语“免疫反应”是指宿主哺乳动物中免疫系统之一或多种细胞对刺激物(例如免疫原)之任何可检测反应，包括(但不限于)先天性免疫反应(例如Toll受体信号传导级联之活化)、细胞介导之免疫反应(例如由T细胞(例如抗原特异性T细胞)及免疫系统之非特异性细胞介导之反应)及体液免疫反应(例如由B细胞介导之反应，例如抗体在血浆、淋巴及/或组织液中之生成及分泌)。免疫反应之实例包括Toll样受体活化、淋巴因子(例如细胞因子(例如Th1、Th2或Th17型细胞因子)或趋化因子)表达或分泌、巨噬细胞活化、树突状细胞活化、T细胞(例如CD4+或CD8+T细胞)活化、NK细胞活化、B细胞活化(例如抗体生成及/或分泌)、免疫原(例如抗原(例如免疫原性多肽)与MHC分子之结合、细胞毒性T淋巴球(“CTL”)反应之诱导、B细胞反应(例如抗体产生)之诱导及免疫系统细胞(例如T细胞及B细胞)之扩增(例如细胞群体之生长)之改变(例如增加)以及抗原呈递细胞对抗原之处理及呈递之增加。
术语“免疫反应”亦涵盖脊椎动物中免疫系统之一或多种组分在活体外对特定物质(例如抗原或免疫原)之任何可检测反应。术语“免疫原”是指如下文所定义具有免疫原性之化合物、组合物或物质。
术语“免疫原组合物”是指包含免疫原之组合物。
术语野生型RSV F蛋白之“突变体”、RSV F蛋白之“突变体”、“RSV F蛋白突变体”或“经修饰RSV F蛋白”是指相对于野生型F蛋白显示引入突变且对野生型F蛋白具有免疫原性之多肽。
术语“突变”是指与参考蛋白质或多肽之氨基酸序列相比蛋白质或多肽之氨基酸序列中氨基酸残基之缺失、添加或取代。在说明书及申请专利范围通篇中，蛋白质序列中一个特定位置处之氨基酸取代是指使用记号“(野生型蛋白质中之氨基酸残基)(氨基酸位置)(经改造蛋白质中之氨基酸残基)”来提及。举例而言，记号Y75A是指参考蛋白质中氨基酸序列之第75位处之酪氨酸(Y)残基由丙氨酸(A)残基取代(在参考蛋白质之突变体中)。倘若相同位置处之氨基酸残基在不同野生型序列中有所变化，则位置号前面之氨基酸代码可在记号中省略，例如“75A”。
术语“天然”或“野生型”蛋白质、序列或多肽是指尚未通过选择性突变人工修饰之天然蛋白质、序列或多肽。
术语“pep27多肽”或“pep27”是指在RSV F蛋白成熟期间自F0前体切下之27-氨基酸多肽。pep27之序列侧接有两个弗林蛋白酶裂解位点，所述位点在F蛋白成熟期间由细胞蛋白酶裂解以生成F1及F2多肽。
在抗体与既定靶分子之结合背景中，术语“特异性结合”是指抗体与靶分子以高于其与其他测试物质结合时之亲和力进行结合。举例而言，特异性结合至呈融合前构象之RSVF蛋白之抗体是结合呈融合前构象之RSV F蛋白之亲和力高于其结合至呈融合后构象之RSVF蛋白时的抗体。
如本文中所使用，术语“缓冲液”是指通常通过其酸-碱共轭组分之作用使液体抗体制剂抵抗pH变化之所添加组合物。在提及缓冲液之浓度时，所引述浓度意欲代表缓冲液之游离酸或游离碱形式之摩尔浓度。
3.RSV F蛋白
拟包括于本文所公开水性免疫原组合物中之RSV F蛋白可为任何呈融合前构象之RSV F蛋白。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型A之RSV F蛋白。在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型B之RSV F蛋白。在一些实施方案中，RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体。在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型A之野生型RSV F蛋白之突变体。在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型B之野生型RSV F蛋白之突变体。在一些实施方案中，突变体相对于相应野生型RSV F蛋白之氨基酸序列在氨基酸序列中显示引入突变，且对呈融合前构象之野生型RSV F蛋白或对包含野生型F蛋白之病毒具有免疫原性。突变体相对于野生型RSV F蛋白之氨基酸突变包括氨基酸取代、缺失或添加。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是如WO2017/109629中所公开之RSV蛋白突变体，该案件之全部内容以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是野生型RSV F蛋白之突变体，其中所引入氨基酸突变是野生型RSV F蛋白中之一对氨基酸残基成为一对半胱氨酸之突变(“经改造二硫化物突变”)。所引入一对半胱氨酸残基容许在半胱氨酸残基之间形成二硫键，从而稳定蛋白质之构象或寡聚状态(例如融合前构象)。所述突变之具体对之实例包括：55C及188C；155C及290C；103C及148C；及142C及371C，例如S55C及L188C；S155C及S290C；A103C及I148C；及L142C及N371C。
在再其他实施方案中，RSV F蛋白突变体包含作为一或多种空腔填充突变之氨基酸突变。可以被空腔填充目标物置换之氨基酸之实例包括小脂肪族氨基酸(例如Gly、Ala及Val)或小极性氨基酸(例如Ser及Thr)及埋入融合前构象中但在融合后构象中暴露于溶剂之氨基酸。置换氨基酸之实例包括大脂肪族氨基酸(Ile、Leu及Met)或大芳香族氨基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。在一些具体实施方案中，RSV F蛋白突变体包含选自由以下组成的组之空腔填充突变：
(1)在位置55、62、155、190或290处使用I、Y、L、H或M取代S；
(2)在位置54、58、189、219或397处使用I、Y、L、H或M取代T；
(3)在位置151处使用A或H取代G；
(4)在位置147或298处使用I、L、H或M取代A；
(5)在位置164、187、192、207、220、296、300或495处使用I、Y、H取代V；及
(6)在位置106处使用W取代R。
在一些特定实施方案中，RSV F蛋白突变体包含至少一个选自由以下组成的组之空腔填充突变：T54H、S190I及V296I。
在再其他实施方案中，RSV F蛋白突变体包含静电突变，所述静电突变会降低在蛋白质折叠结构中彼此靠近之残基之间之离子排斥或增加离子吸引。在若干实施方案中，RSVF蛋白突变体包括静电取代，该静电取代会减小与来自RSV F三聚体之另一原聚体之Glu487及Asp489之酸性残基的排斥性离子相互作用或增加吸引性离子相互作用。在一些具体实施方案中，RSV F蛋白突变体包含选自由以下组成的组之静电突变：
(1)在位置82、92或487处由D、F、Q、T、S、L或H取代E；
(2)在位置315、394或399处由F、M、R、S、L、I、Q或T取代K；
(3)在位置392、486或489处由H、S、N、T或P取代D；及
(4)在位置106或339处由F、Q、N或W取代R。
在再其他实施方案中，RSV F蛋白突变体包含选自经改造二硫化物突变、空腔填充突变及静电突变之两种或更多种不同类型突变之组合。在一些特定实施方案中，RSV F蛋白突变体相对于相应野生型RSV F蛋白包含突变组合，其中突变组合是选自由以下组成的组：
(1)A103C、I148C、S190I及D486S之组合；
(2)T54H S55C L188C D486S之组合；
(3)T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S之组合；
(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之组合；
(5)S55C、L188C及D486S之组合；
(6)T54H、S55C、L188C及S190I之组合；
(7)S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(8)T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之组合；
(9)S155C、S190I、S290C及D486S之组合；
(10)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之组合；
(11)T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之组合，及
(12)S155C、S190F、S290C及V207L之组合。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型A且包含突变S155C、S190F、S290C及V207L。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型B且包含突变S155C、S190F、S290C及V207L。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型A且包含突变A103C、I148C、S190I及D486S。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是亚型B且包含突变A103C、I148C、S190I及D486S。
在一些实施方案中，拟包括于本文所公开组合物中之RSV F蛋白包含三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域有利于形成三个F2-F1异源二聚体之三聚体。
有利于形成可溶性蛋白之稳定三聚体之若干外源性多聚化结构域为本领域已知。所述可连接至由本发明提供之突变体之多聚化结构域之实例包括：(1)GCN4亮氨酸拉链(Harbury等人，1993Science 262:1401-1407)；(2)来自肺表面活性蛋白之三聚化基序(Hoppe等人，1994FEB S Lett344:191-195)；(3)胶原(McAlinden等人，2003Biol Chem278:42200-42207)；及(4)噬菌体T4 fibritin折叠子(Miroshnikov等人，1998ProteinEng11:329-414)。在一些实施方案中，折叠子结构域在F1多肽之C-末端处连接至F突变体。在具体实施方案中，折叠子结构域是T4 fibritin折叠子结构域，例如氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:7)。
通常，多聚化结构域位于F1多肽之C-末端。其可直接接合至F1多肽链。视情况，多聚化结构域经由连接体(例如氨基酸连接体，例如序列GG、GS或SAIG)连结至F1多肽。连接体亦可为较长连接体(例如包括重复序列GG)。本领域已知许多可用于由本发明提供之突变体中之中性构象连接体。在一些实施方案中，包含折叠子结构域之F突变体包括用于自F1多肽去除折叠子结构域之蛋白酶裂解位点，例如F1多肽与折叠子结构域之间之凝血酶位点。在一优选实施方案中，拟包括于本文所公开组合物中之RSV F蛋白包含通过SAIG连接体连接于F1多肽之C-末端处之T4 fibritin折叠子结构域。
鉴于RSV F序列之实质性保守性，本领域技术人员可易于比较不同天然RSV F序列之间之氨基酸位置以鉴别不同RSV毒株及亚型之间的相应RSV F氨基酸位置。举例而言，在几乎所有鉴别之天然RSV F0前体蛋白中，弗林蛋白酶裂解位点位于相同氨基酸位置中。因此，天然RSV F蛋白序列在毒株及亚型中之保守性容许使用参考RSV F序列来比较RSV F蛋白中特定位置处之氨基酸。出于本发明目的(除非上下文另外指示)，否则RSV F蛋白氨基酸位置是参照RSV A2毒株(对应于GenInfo识别符GI 138251及Swiss Prot识别符P03420)中全长天然F前体多肽之氨基酸序列所给出。
在一些实施方案中，RSV F蛋白呈RSV F蛋白之成熟形式，其包含两条单独多肽链，亦即F1多肽及F2多肽。在一些其他实施方案中，F2多肽通过一或两个二硫键连接至F1多肽以形成F2/F1异源二聚体。在再其他实施方案中，RSV F突变体呈单链蛋白之形式，其中F2多肽通过肽键或肽连接体连接至F1多肽。可使用用于将两条多肽链接合至一起之任何适宜肽连接体。所述连接体之实例包括G、GG、GGG、GS及SAIG连接体序列。连接体亦可为全长pep27序列或其片段。
突变体之F1多肽链可与相应野生型RSV F蛋白之全长F1多肽具有相同长度；然而，其亦可具有缺失，例如自全长F1多肽之C-末端缺失1至60个氨基酸残基。RSV F突变体之全长F1多肽对应于天然RSV F0前体之氨基酸位置137-574，且包括(自N-末端至C-末端)细胞外区域(残基137-524)、跨膜结构域(残基525-550)及细胞质结构域(残基551-574)。应注意，位于天然F1多肽序列前面之氨基酸残基514是拟包括于本文所提供免疫原组合物中之RSV F蛋白之F1多肽中的可选序列，且由此可不存在于突变体之F1多肽中。
在一些实施方案中，RSV F突变体之F1多肽缺乏整个细胞质结构域。在其他实施方案中，F1多肽缺乏细胞质结构域及整个跨膜结构域之一部分或全部。在一些具体实施方案中，突变体包含不存在位置510、511、512、513、514、515、520、525或530至574之氨基酸残基之F1多肽。通常，对于连接至三聚化结构域(例如折叠子)之突变体而言，可不存在氨基酸514至754。因此，在一些具体实施方案中，突变体之F1多肽不存在氨基酸残基514至574。在再其他具体实施方案中，RSV F突变体之F1多肽包含天然F0多肽序列(例如备选的F0前体序列中之任一者，例如公开于WO2017109629之SEQ ID No:1、2、4、6及81-270中之任一个)之氨基酸残基137-513或由其组成。
另一方面，RSV F突变体之F1多肽可包括连至三聚化结构域(例如折叠子)之C-末端连接。本文所公开RSV F突变体之许多序列包括蛋白酶裂解位点(例如凝血酶裂解位点(LVPRGS))之序列、蛋白质标签(例如6x His标签(HHHHHH)及Streptag II(WSHPGFEK))之序列或对于RSV F蛋白之功能(例如用于诱导免疫反应)并非必不可少之连接体序列(例如GG及GS)(参见图1)。本领域技术人员应识别所述序列，且应理解在适当时理解，这些序列不包括于所公开RSV F突变体中。
在由本发明提供之RSV F突变体中，F2多肽链可与相应野生型RSV F蛋白之全长F2多肽具有相同长度；其亦可具有缺失，例如自F2多肽之N-末端或C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基。
呈F0形式(亦即包含接合至F1多肽之F2多肽且含有或不含部分或全长pep 27之单链多肽)或F2-F1异源二聚体形式之突变体可形成原聚体。突变体亦可呈包含三个相同原聚体之三聚体形式。另外，突变体可为糖基化蛋白(亦即糖蛋白)或非糖基化蛋白。呈F0形式之突变体可包括或可缺乏信号肽序列。
引入一或多个突变之RSV F蛋白突变体之F1多肽及F2多肽可来自本领域已知或将来发现之任何野生型RSV F蛋白，包括(但不限于)RSV亚型A及亚型B毒株(包括A2 Ontario及Buenos Aires)或任何其他亚型之F蛋白氨基酸序列。在一些实施方案中，RSV F突变体包含来自RSV A病毒之F1及/或F2多肽，例如来自WO2017109629之SEQ ID NO:1、2、4、6及81-270中之任一者中所陈述RSV F0前体蛋白之引入一或多个突变的F1及/或F2多肽。在一些其他实施方案中，RSV F突变体包含来自RSV B病毒之F1及/或F2多肽，例如来自WO2017/109629之SEQ ID NO:2及211-263中之任一者中所陈述RSV F0前体蛋白之引入一或多个突变的F1及/或F2多肽。在再其他实施方案中，RSV F突变体包含来自RSV牛病毒之F1及/或F2多肽，例如来自WO2017109629之SEQ ID NO:264-270中之任一者中所陈述RSV F0前体蛋白之引入一或多个突变的F1及/或F2多肽。
在一些实施方案中，RSV F蛋白是如WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、WO2017/174564、WO2017/005844及WO2018/109220中所公开之RSV蛋白突变体。所述参考文献中所公开之RSV F蛋白之全部内容以引用方式并入本文中。
在一优选实施方案中，RSV F蛋白包含SEQ ID NO:1之F1多肽及SEQ ID NO:2之F2多肽。
在一优选实施方案中，RSV F蛋白包含SEQ ID NO:3之F1多肽及SEQ ID NO:4之F2多肽。
本文所公开水性免疫原制剂中所包括之RSV F蛋白可通过本领域已知之常规方法制得，例如通过使用适宜载体表达于重组宿主系统中。适宜重组宿主细胞包括(例如)昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、细菌及酵母细胞。适宜昆虫细胞之实例包括(例如)Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞及High Five细胞(衍生自亲代粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)BTI-TN-5B 1-4细胞系(Invitrogen)之纯系分离物)。适宜哺乳动物细胞之实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人类胚胎肾细胞(HEK293或Expi 293细胞，通常通过经剪切腺病毒5型DNA所转化)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞及HeLa细胞。适宜禽类细胞包括(例如)鸡胚胎干细胞(例如EBx.RTM.细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鹌鹑成纤维细胞(例如ELL-O)及鸭细胞。适宜昆虫细胞表达系统(例如以杆状病毒为载体之系统)为本领域技术人员所已知且阐述于(例如)Summers及Smith,Texas AgriculturalExperiment Station Bulletin No.1555(1987)中。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统之材料及方法可以试剂盒形式购自(尤其)Invitrogen,San Diego Calif。禽类细胞表达系统亦为本领域技术人员所已知且阐述于(例如)美国专利第5,340,740号、第5,656,479号、第5,830,510号、第6,114,168号及第6,500,668号中。类似地，细菌及哺乳动物细胞表达系统亦为本领域已知且阐述于(例如)Yeast Genetic Engineering(Barr等人编辑，1989)Butterworths,London中。
用于在昆虫或哺乳动物细胞中表达重组蛋白之诸多适宜载体为本领域所熟知及习用。适宜载体可含有诸多组分，包括(但不限于)下列各项中之一或多者：复制起点；选择标记基因；一或多种表达控制元件，例如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子)及/或一或多种翻译信号；及用于靶向所选宿主细胞(例如哺乳动物源或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种)中之分泌路径之信号序列或前导序列。举例而言，为表达于昆虫细胞中，使用适宜杆状病毒表达载体(例如pFastBac(Invitrogen))来产生重组杆状病毒颗粒。扩增杆状病毒颗粒并用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。为表达于哺乳动物细胞中，使用驱动构建体在期望哺乳动物宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)中表达之载体。拟包括于本文所公开组合物中之RSV F蛋白亦可根据WO2022/070129中所公开之方法制得。
可使用任何适宜方法来纯化本文所公开组合物中所使用之RSV F蛋白。举例而言，通过免疫亲和层析纯化RSV F蛋白突变体多肽之方法为本领域已知。Ruiz-Arguello等人，J.Gen.Virol.,85:3677-3687(2004)。本领域熟知纯化期望蛋白质之适宜方法，包括沉淀及各种层析类型(例如疏水性相互作用、离子交换、亲和力、螯合及大小排阻)。可使用这些或其他适宜方法中之两者或更多者来产生适宜纯化方案。若期望，则RSV F蛋白突变体多肽可包括促进纯化之“标签”，例如表位标签或组氨酸(HIS)标签。所述加标签多肽可便利地纯化，例如自条件化培养基、通过螯合层析或亲和层析。亦可根据WO2020/026147、WO2022/023895及WO2022/023896中所公开之方法来制备拟包括于本文所公开组合物中之RSV F蛋白。
4.包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之免疫原水性组合物
本发明之水性免疫原组合物公开于章节1之上述实施方案中。
如实施例中所证实，在包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物中存在在所公开浓度范围内之氯化钠及蔗糖、甘露醇及甘氨酸中之至少一者较为有利，此乃因其有助于稳定呈所需形式之该蛋白质(呈融合前构象之三聚体)且亦限制了组合物中HMMS之存在。
举例而言，如实施例2至5中所展示，氯化钠之存在减小了水性免疫原组合物中聚集蛋白之百分比。
同样，如通过实施例2所展示，在组合物中存在蔗糖有助于保持融合前构象含量并减小％HMMS之增加。
实施例亦表明，约7.0至8.0之pH范围适于最小化融合前含量之损失及％HMMS之增加。特定而言，实施例4表明，在pH小于6.5或高于8.0时聚集有所增加。
在某些实施方案中，本发明之免疫原组合物包含表面活性剂。表面活性剂(surfactant或surface-active agent)通常定义为(a)包含亲水性基团或部分及亲脂性(疏水性)基团或部分之分子或化合物及/或(b)降低或减小溶液之表面张力之分子、物质或化合物。如本文所定义，本发明之“表面活性剂”是降低免疫原组合物之表面张力之任何分子或化合物。
如本文所公开之组合物中所使用之表面活性剂包含稳定本文所阐述之免疫原组合物及抑制其聚集的任何表面活性剂或任何表面活性剂组合。因此，本文所公开组合物中所使用之表面活性剂包括(但不限于)聚山梨酯20(TweenTM20)、聚山梨酯40(TweenTM40)、聚山梨酯60(TweenTM60)、聚山梨酯65(TweenTM65)、聚山梨酯80(TweenTM80)、聚山梨酯85(TweenTM85)、TritonTM N-101、TritonTM X-100、辛苯醇醚40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15、SolutolH15)、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯(Cremophor ELTM)、大豆卵磷脂、泊洛沙姆、十六烷基胺、十八烷基胺、氨基酸十八烷基酯、溶血卵磷脂、二甲基-二-十八烷基溴化铵、甲氧基十六烷基甘油、普罗尼克多元醇、聚胺(例如吡喃、硫酸右旋糖酐、聚IC、卡波姆)、肽(例如胞壁酰肽及二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽)、油乳液、矿物质凝胶(例如磷酸铝)及免疫刺激复合物(ISCOMS)。
通过测量特定免疫原组合物制剂在存在及不存在表面活性剂下之表面张力，本领域技术人员可易于确定适宜表面活性剂或表面活性剂组合。或者，定性(例如微粒形成之目测检查)或定量(例如光散射、沉降速度离心、光学密度、抗原性)评估表面活性剂减小、抑制或防止免疫原组合物之聚集之能力。
在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯。在一些实施方案中，聚山梨酯是聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一些实施方案中，聚山梨酯是聚山梨酯80。在一些实施方案中，表面活性剂之浓度为约0.01mg/mL至约10mg/mL。
表面活性剂之浓度范围通常为约0.01mg/ml至约10mg/ml、约0.01mg/ml至约5.0mg/ml、约0.01mg/ml至约2.0mg/ml、约0.01mg/ml至约1.5mg/ml、约0.01mg/ml至约01.0mg/ml、约0.01mg/ml至约0.5mg/ml、约0.01mg/ml至约0.4mg/ml、约0.01mg/ml至约0.3mg/ml、约0.01mg/ml至约0.2mg/ml、约0.01mg/ml至约0.15mg/ml、约0.01mg/ml至约0.1mg/ml或约0.01mg/ml至约0.05mg/ml。进一步优选地，表面活性剂之浓度为约0.5mg/ml、约0.05mg/ml、约0.06mg/ml、约0.07mg/ml、约0.08mg/ml、约0.09mg/ml、约0.1mg/ml、约0.11mg/ml、约0.12mg/ml、约0.13mg/ml、约0.14mg/ml、约0.15mg/ml、约0.16mg/ml、约0.17mg/ml、约0.18mg/ml、约0.19mg/ml或约0.2mg/ml。优选地，表面活性剂之浓度为约0.01mg/mL至约0.05mg/mL。最优选地，表面活性剂之浓度为约0.02mg/mL
在某些实施方案中，本发明之免疫原组合物包含佐剂。佐剂是在与免疫原或抗原一起施用时增强免疫反应之物质。诸多细胞因子或淋巴因子已展示具有免疫调节活性，且由此可用作佐剂，包括(但不限于)介白素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(例如参见美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17及18(及其突变体形式)、干扰素α、β及γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF，例如参见美国专利第5,078,996号及ATCC登录号39900)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)及肿瘤坏死因子α及β(TNF)。可用于本发明中之再其他佐剂包括趋化因子，包括(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES。
在某些实施方案中，用于增强免疫原组合物制剂之免疫反应之佐剂包括(但不限于)MPLTM(3-O-去酰基化单磷酰基脂质A；Corixa,Hamilton,MT)，其阐述于美国专利第4,912,094号(其全部内容以引用方式并入本文中)中。亦适于用作佐剂者是合成脂质A类似物或氨基烷基葡萄糖胺磷酸盐化合物(AGP)或其衍生物或类似物，其可自Corixa(Hamilton,MT)获得且阐述于美国专利第6,113,918号(其全部内容以引用方式并入本文中)中。一种此类AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰基氧基十四烷酰基-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其亦称为529(先前称为RC529)。此529佐剂配制为水性形式或稳定乳液(RC529-SE)。
再其他佐剂包括矿物油及水乳液、铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等)、爱菲金(Amphigen)、阿夫立定(Avridine)、L121/角鲨烯、D-交酯-聚交酯/糖苷、普罗尼克多元醇、胞壁酰二肽、经杀死博徳特菌(Bordetella)、皂苷(例如阐述于美国专利第5,057,540号中之StimulonTMQS-21(Antigenics,Framingham,MA.)，该专利之全部内容以引用方式并入本文中)及自其生成之颗粒(例如ISCOMS(免疫刺激复合物))、包含免疫刺激剂组合之佐剂系统(例如于脂质体中之MPLTM及QS-21，例如AS01(如Immunopotentiators inModern Vaccines,p.265-285,2017Elsevier之第14章中所阐述，该文献之全部内容以引用方式并入本文中)或ALFQ(阐述于美国专利第10,434,167号中，该专利之全部内容以引用方式并入本文中)、ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)，阐述于美国专利第5,254,339号中)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、细菌脂多醣、合成多核苷酸(例如含有CpG基序之寡核苷酸，美国专利第6,207,646号，其全部内容以引用方式并入本文中)、IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria，阐述于欧洲专利第1,296,713号及第1,326,634号中)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌(E.coli)热不稳定毒素(LT)(尤其LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；例如参见国际专利公开案第WO 93/13302号及第WO 92/19265号，其全部内容以引用方式并入本文中)。
亦可用作佐剂(及载体蛋白)者是霍乱毒素及其突变体，包括阐述于所公开国际专利申请案第WO 00/18434号中的那些(其中氨基酸位置29处之谷氨酸由另一氨基酸(天冬氨酸除外)，优选地组氨酸代替)。类似CT毒素或突变体阐述于所公开国际专利申请案第WO02/098368号中(其中氨基酸位置16处之异亮氨酸由另一氨基酸代替，单独或组合地氨基酸位置68处之丝氨酸由另一氨基酸代替；且/或其中氨基酸位置72处之缬氨酸由另一氨基酸代替)。其他CT毒素阐述于所公开国际专利申请案第WO 02/098369号中(其中氨基酸位置25处之精氨酸由另一氨基酸代替；且/或在氨基酸位置49处插入氨基酸；且/或在氨基酸位置35及36处插入两个氨基酸)。
在某些实施方案中，本发明之水性免疫原组合物包含防腐剂。防腐剂是赋予对一或多种微生物之抗性之物质且可用于(例如)产生多剂量疫苗制剂，所述制剂具有关于不同抗原决定簇在所选免疫原组合物中之长期稳定性之有利性质。
在某些实施方案中，防腐剂是选自由以下组成的组：氯丁醇、间-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯甲酸、苄醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。在某些实施方案中，防腐剂是选自由以下组成的组：苄索氯铵、2-苯氧基乙醇、苯酚及硫柳汞。在一优选实施方案中，防腐剂是2-苯氧基乙醇。
在某些实施方案中，水性免疫原组合物中之防腐剂浓度为至少9mg/mL。在一实施方案中，水性免疫原组合物中之防腐剂浓度为10mg/mL。
5.包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之冻干免疫原组合物
本发明之冻干免疫原组合物公开于上述章节1之实施方案中。可通过使用本领域技术人员已知之冻干方法或优选地使用本文所公开之冻干方法冻干本文所公开之水性免疫原组合物来获得所述冻干组合物(参见章节1以及实施例6及7)。
可使用任何适宜稀释剂复水重构冻干免疫原组合物。在某些实施方案中，稀释剂是注射用水。在某些实施方案中，稀释剂包含优选地浓度介于约20mM与约300mM之间之氯化钠。
在某些实施方案中，稀释剂包含防腐剂。在某些实施方案中，防腐剂是选自由以下组成的组：氯丁醇、间-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯甲酸、苄醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。在某些实施方案中，防腐剂选自苄索氯铵、2-苯氧基乙醇、苯酚及硫柳汞。在一优选实施方案中，防腐剂是2-苯氧基乙醇。
在某些实施方案中，选择稀释剂中之防腐剂浓度以在复水重构组合物中达成至少9mg/mL之浓度。在一实施方案中，选择稀释剂中之防腐剂浓度以在复水重构组合物中达成10mg/mL之防腐剂浓度。
在某些实施方案中，拟用于复水重构冻干组合物之稀释剂之体积与填充体积(冻干前之组合物体积)相同。在某些实施方案中，拟用于复水重构冻干组合物之稀释剂之体积低于填充体积。在某些实施方案中，拟用于复水重构冻干组合物之稀释剂之体积大于填充体积。特定而言，可调节填充体积及用于复水重构之稀释剂体积以调节源自使用稀释剂复水重构冻干组合物之水性组合物之渗透性。
6.包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之用途
本发明亦涉及如章节1中所公开包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之用途，其用作疫苗。
在若干实施方案中，本发明提供诱发受试者中对RSV之免疫反应之方法，其包含向受试者施用如本文所公开包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物。
在一些特定实施方案中，本发明提供减少或预防受试者之RSV相关疾病之方法，其包含向受试者施用如本文所公开包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物。
在一些实施方案中，受试者是人类。在一些特定实施方案中，人类是儿童、例如婴儿。在一些其他特定实施方案中，人类是女性、尤其怀孕女性。在一些其他特定实施方案中，人类为至少50、55或60岁。
可选择用于预防之受试者包括因暴露或可能暴露于RSV而处于发生RSV感染之风险下的那些。因几乎所有人类至2岁时皆感染RSV，故包括整个出生小组作为用于免疫化之相关群体。此可(例如)通过在自出生至6个月年龄、6个月年龄至5岁之任何时间、在怀孕女性(或育龄女性，以通过被动转移抗体来保护其婴儿)、新生婴儿或仍在子宫中之彼等之家族成员及大于50岁之受试者中开始免疫化方案来进行。处于具有严重症状之RSV感染之最大风险下(例如需要住院)之受试者包括患有早产、支气管肺发育不良及先天性心脏病的儿童。
可(例如)使用标准施用途径来施用由本发明提供之组合物。非限制性实施方案包括肠胃外施用，例如真皮内、肌内、皮下、透皮、经黏膜或经口施用。
如本领域技术人员所已知，在一次施用期间提供至受试者之组合物之总剂量可有所变化。
亦可提供一或多种疫苗组合物之一或多次加强施用。若实施加强疫苗接种，则通常在首次向受试者施用组合物(其在所述情形下称为“引发疫苗接种”，例如用于RSV初始婴儿之主动免疫化)之后一周与10年之间，优选地两周与六个月之间之某一时刻向同一受试者施用此一加强疫苗接种。亦可以规则间隔(例如每年)实施加强疫苗接种以每一RSV季节维持最佳保护。该加强方案适用于(例如)成人，例如60岁以上之成人。在备选加强方案中，亦可在引发疫苗接种之后向受试者施用不同载体，例如一或多种腺病毒或其他载体(例如经修饰安卡拉牛痘病毒(modified vaccinia virus of Ankara,MVA)或DNA或蛋白质)。举例而言，可向受试者施用本文之重组病毒载体以供引发，并使用如本文所公开之水性免疫原组合物进行加强。
在某些实施方案中，施用包含引发施用及至少一次加强施用。在某些其他实施方案中，每年提供施用。在再其他实施方案中，每年提供施用以及流行性感冒疫苗。
可使用由本发明提供之疫苗以及一或多种其他疫苗。举例而言，在成人中，其可一起使用流行性感冒疫苗、肺炎球菌疫苗(Prevnar)、破伤风疫苗、白喉疫苗、百日咳疫苗或COVID-19疫苗。对于儿科应用而言，由本发明提供之疫苗可与指示用于儿科患者之任何其他疫苗一起使用。
为更好地理解本发明，阐述以下实施例。所述实施例仅用于阐释性目的且不应视为以任何方式限制本发明范围。以下实施例阐释本发明之一些实施方案。
实施例
实施例1-材料及方法
a)RSV F蛋白
除非另外指定，否则实施例中所使用之RSV F蛋白如下：
-包含SEQ ID NO:1之多肽及SEQ ID NO:2之多肽之亚型A的RSV F蛋白(下文实施例章节中之RSV A)。
-包含SEQ ID NO:3之多肽及SEQ ID NO:4之多肽之亚型A的RSV F蛋白(下文实施例章节中之RSV B)。
可在下文实施例中使用任何RSV F蛋白，包括阐述于WO2017/109629、WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、WO2017/174564、WO2017/005844、WO2022/002894及WO2018/109220中之任一者中的那些。
特定而言，WO2017/109629、WO2020026147及WO2022/002894中所公开之任何RSV F蛋白突变体可用于其中所公开之方法及组合物中及下文实施例之实验中。
b)呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之处理
因潜在聚集及融合前含量损失，呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体不应保持于2-8℃下或冰上。推荐拟解冻于25℃水浴中之大于1mL之冷冻试样。解冻的试样应在实施分析时保持于室温下，且在不使用时冷冻于≤-40℃下。推荐在储存于≤-40℃下之前使用液氮或乙醇/干冰浆液将试样速冻。
c)大小排阻层析(SEC-HPLC)。
通过大小排阻层析(SEC-HPLC)测量三聚体、HMMS及LMMS之百分比。SEC-HPLC是本领域技术人员已知之分析方法且用于测定通过本发明方法所获得亚型A或B试样之RSV F蛋白中高分子质量物质(HMMS)、三聚体及低分子质量物质(LMMS)之相对含量。SEC-HPLC根据流体动力学体积来分离分子。在将分析物施加至管柱床之头部时，小于堆积材料之孔隙之分子可扩散进出孔隙，而那些较大者则不进入孔隙。因此，较大分子较快地通过管柱且较小分子则较慢。在洗脱出物质后，检测它们的280nm UV吸光度。低分子质量物质(LMMS)是用于指依SEC-HPLC所测量表观分子质量小于三聚体之所有物质之术语。它们在三聚体峰之后洗脱出。高分子质量物质(HMMS)是用于指依SEC-HPLC所测量表观分子质量大于三聚体之所有峰之术语。它们在三聚体峰之前洗脱出且包括聚集物。
d)通过AM14 Fab滴定及SEC分析融合前及三聚体含量
经由与AM14 Fab结合来测定RSV F蛋白三聚体中之融合前构象含量。AM14 Fab结合至RSV F蛋白上呈三聚体且为融合前特异性之表位。呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体使用纯化水复水重构，并在溶液中与过量AM14 Fab依两种比率一起温育。然后通过大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)分离每一试样中之剩余游离AM14 Fab并通过280nm下UV吸光度根据AM14 Fab之单点标准曲线进行定量。基于1:1(RSV A及/或B单体:AM14 Fab)结合化学计量学来计算RSV组合物之AM14 Fab融合前含量。
e)通过AM14 Fab滴定及AM14 Elisa分析融合前及三聚体含量
在经连续稀释之RSV A、RSV B及组合物试样溶液中，以ELISA测量三聚体融合前特异性抗体与融合前F蛋白之剂量依赖性结合。若可行时，使用RSV A、RSV B及组合物参考材料涂覆微量滴定板(板1)。在单独稀释板(板2)中，将参考材料及试样之连续稀释液与三聚体融合前特异性抗体及二级辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(其结合至三聚体融合前特异性抗体以供信号检测)一起共同温育。添加过量三聚体融合前特异性抗体，且在此培育期间，三聚体融合前特异性抗体结合至存在于板2溶液中之任何三聚体融合前F蛋白。在温育之后，将板2中之内容物转移至板1中并温育。在此第二温育期间，板2中未结合至F蛋白之任何过量三聚体融合前特异性抗体将结合至涂覆于板1上之参考材料。在温育之后，洗涤板1，以去除任何未结合材料。添加过氧化物酶底物且以分光光度计测量比色反应。若可行时，基于测试试样之剂量反应与RSV A参考材料、RSV B参考材料或组合物参考材料之剂量反应之间的比较，评估融合前含量。
f)通过AM22 Fab滴定及SEC分析融合前含量
经由与AM22 Fab结合来测定RSV F蛋白中之融合前构象含量。AM22 Fab结合至RSVF蛋白上是融合前特异性之表位。使用纯化水复水重构呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体并在溶液中与过量AM22 Fab以两个比率一起温育。然后通过大小排阻高效液相层析(SE-HPLC)分离每一试样中之剩余游离AM22 Fab并通过280nm下UV吸光度根据AM22 Fab之单点标准曲线进行量化。基于1:1(RSV A及/或B单体:AM22 Fab)结合化学计量学来计算RSV组合物之AM22 Fab融合前含量。
实施例2.pH、缓冲液及赋形剂对包含呈融合前构象之亚型B之RSV蛋白F三聚体之水性免疫原组合物之聚集及融合前含量的效应
此研究之目的在于评估简单制剂以阐明拟用于包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之组合物中之所选缓冲液、赋形剂及pH的效应。RSV F蛋白是尤其不稳定之蛋白质，此乃因其倾向于转化成活性融合后形式。此研究中所使用之RSV F蛋白构建体已稳定于融合前构象。尽管较为稳定，但所述构建体仍视为不完全稳定。不稳定性质使得难以找到在延长储存期内保留质量属性之制剂。所述研究是使用如实施例1中所定义之RSV B来实施。
此研究中所使用之18种不同制剂阐述于表1中。通过溶解必要组分且随后滴定至适当pH来制备每一缓冲液。使用Amicon 10kDa MWCO过滤离心管来缓冲液交换每一制剂直至总缓冲液流量大于10x以获得具有期望组成之制剂。
表1-制剂说明
试样名称 缓冲液 pH 赋形剂
M01 20mM Tris 7.4 N/A
M02 20mM Tris 8.0 N/A
M03 20mM HEPES 7.4 N/A
M04 20mM Tris 7.4 50mM NaCl
M05 20mM Tris 8.0 50mM NaCl
M06 20mM HEPES 7.4 50mM NaCl
M07 20mM Tris 7.4 60mg/mL蔗糖
M08 20mM Tris 8.0 60mg/mL蔗糖
M09 20mM Tris 7.4 120mg/mL蔗糖
M10 20mM Tris 8.0 120mg/mL蔗糖
M11 20mM Tris 7.4 60mg/mL甘露醇
M12 20mM Tris 8.0 60mg/mL甘露醇
M13 20mM Tris 7.4 60mg/mL甘氨酸
M14 20mM Tris 8.0 60mg/mL甘氨酸
M15 20mM Tris 7.4 60mg/mL脯氨酸
M16 20mM Tris 8.0 60mg/mL脯氨酸
M17 20mM Tris 7.4 60mg/mL精氨酸
M18 20mM Tris 8.0 60mg/mL精氨酸
将试样在-20℃、5℃及25℃下储存表2中所列示之时间。
表2-稳定性时间表
温度 1周 3周
-20℃ NT X
2-8℃ X X
25℃ X X
所有实验之结果皆展示于图1至5中。通过SEC-HPLC获得HMMS之百分比且通过AM22-Fab滴定获得融合前含量，如实施例1中公开。此研究之结果指示，在所有测试试样中于所有条件下，Tris缓冲液皆提供大于HEPES之稳定性。实际上，M01(Tris,pH 7.4)及M03(HEPES,pH 7.4)在所有测试条件下之比较皆展示与HEPES相比在使用Tris时具有较低HMMS百分比及较高融合前含量。测试HEPES缓冲液是因为其在较低温度下具有较大pH稳定性，但在与Tris相比时其在5℃或-20℃条件下并不改良稳定性。然而，向缓冲液中添加50mM浓度之NaCl可减小缓冲液保持质量属性之能力之差异。
氯化钠展示可保持融合前含量并最小化聚集。该效应可(例如)通过在所有测试条件下比较M03(HEPES,pH 7.4)及M06(HEPES,pH 7.4,NaCl)来阐释。
测试作为NaCl之潜在替代者之精氨酸及脯氨酸，但其不提供任何大于NaCl之稳定性。
此研究之另一教导内容是蔗糖对聚集及融合前含量之效应。递增量之蔗糖在所测试时间范围内展示增加之融合前构象保留及较小之％HMMS增加。实际上，使用条件M01及M02(Tris,pH 7.4或8.0，无蔗糖)获得之％HMMS及融合前含量值及使用条件M07至M09(相同条件且使用60mg/mL或120mg/mL之蔗糖)获得之值之对比展示，在向组合物中添加蔗糖时可产生较低％HMMS及较高融合前含量。
温度是已知会影响蛋白质之稳定性之因素，且通常蛋白质在低温(例如4℃)下之稳定性大于(例如)室温下者(例如参见Campa等人，Vaccines 2021,9,1114)。然而，本研究明确证实，RSV F蛋白三聚体在25℃下之稳定性大于5℃下者。对于在25℃下保持三个周之后之每一制剂而言，与在5℃下保持三个周之后者相比％HMMS较低且融合前含量较高。研究亦展示，与25℃及5℃相比，-20℃下冷冻是RSV F蛋白融合前稳定性之较不有益条件。这些数据阐释了经稳定RSV融合前F蛋白之独特行为及设计包含该抗原之免疫原水性组合物之挑战。
图1至5之数据显示，氯化钠及蔗糖之存在有益于免疫原组合物中呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之稳定性。
所述数据亦指示，如本文及尤其实施方案E1至E189中所定义之水性组合物应有利地根据实施方案E193至E229之方法储存。
实施例3.蔗糖、NaCl及pH对包含呈融合前构象之亚型A之RSV蛋白F三聚体之水性免疫原组合物之聚集及融合前含量的效应
实施此研究以评估包含用作用于预防RSV疾病之疫苗之呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之组合物的组分。在实验动物模型中，以重组方式产生于CHO细胞中之呈融合前构象之抗原会诱发大于融合后抗原之RSV中和抗体效价。因融合前F蛋白之稳定化较为关键，故制剂研发之目标在于选择可在储存时间内维持融合前稳定性之赋形剂及条件。
使用RSV A实施研究以评估三种主要制剂因素：1)pH(6.0-8.0)；2)NaCl浓度(0-100mM)；及3)蔗糖浓度(0-9.0％)。研究设计阐述于表3中。
表3.用于评价包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之组合物之pH、NaCl及蔗糖的研究设计
试样a编号 pH NaCl(mM) 蔗糖(％)
1 8 100 0
2 8 0 0
3 8 0 9
4 6 50 4.5
5 6 100 9
6 7 0 4.5
7 6 100 0
8 7 50 0
9 8 50 4.5
10 7 50 4.5
11 7 50 9
12 8 100 9
13 7 100 4.5
14 7 50 4.5
15 6 0 9
16 6 0 0
17b 7 50 0(+4.5％海藻糖)
18c 7 50 3(+3％甘露醇)
19c 7 50 0(+3％海藻糖+3％甘露醇)
a.所有试样皆含有20mM His-Tris缓冲液及0.02％ PS 80
b.用于对比蔗糖与海藻糖
c.用于评价甘露醇对稳定性之效应
制备总共16种制剂以评价包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之组合物中之pH、NaCl及蔗糖之效应。包括另三种制剂以比较冷冻保护物质(蔗糖对海藻糖)之选择并评价甘露醇对抗原稳定性之效应。在含有0.02％ PS-80之20mM His-Tris缓冲液之基质中制备具有0.24mg/mL RSV A之试样。
使用His-Tris缓冲液系统之混合物，此乃因其能够良好地将pH控制在6.0-8.0之范围内。添加PS-80以减少吸附于容器上之任何潜在蛋白质。将试样在5℃及25℃下保持两周并监测融合前含量(通过AM14 ELISA)、聚集％(通过SEC-HPLC)、蛋白质浓度(通过UV280)、pH及外观。在蛋白质浓度、pH及外观中未观察到差异。AM14融合前含量及聚集结果汇总于表4中。
表4.在5℃及25℃下保持2周之制剂之研究结果
a.相对于标准
此实验之一些结果亦汇总于图6A至6D、7A至7D及8A至8D中。
在比较含有50mM NaCl及不同浓度之蔗糖之pH 7下制剂(表4中之试样F8、F11及F11)时，在两个温度下储存2周之后皆未观察到显著聚集差异(参见图7C及7D)。蔗糖及海藻糖制剂(表4中之试样F10及F17)之直接对比表明，其对于维持融合前稳定性具有类似效应。因此，并不进一步考虑海藻糖，且将蔗糖作为冷冻保护剂包括于制剂中以尤其最大化液体制剂在冻干之前于冷冻状态中之储存稳定性。
同样，NaCl展示高度有益于控制RSV F蛋白聚集(参见图8C及8D)。
实施例4-备选赋形剂及浓度含量对亚型B之RSV F蛋白之聚集之效应
除在实验设计(DoE)研究中评估之配制参数外，亦探索其他条件以探究是否可进一步改良蛋白质抗原之稳定性。选择来自不同种类之赋形剂以旨在进一步改良组合物。在不同赋形剂(表5)存在下制备含有0.5mg/mL RSV B之试样并在5℃及25℃下保持一周。使用衍生自实施例3之数据(20mM Tris、50mM NaCl、4％蔗糖、0.02％ PS 80，在pH 7.4下)之优选制剂作为对照。使用SEC评估在初始时及在3及7天之后之试样聚集水平。自进一步测试排除在初始时展现高聚集水平之试样。结果展示于下表5中且表明下列结论：
1)储存于5℃下之RSV F蛋白试样较25℃下更易于聚集；此证实了已在实施例2之实验中观察到之呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体的独特行为。
2)在与实施例2及3中所鉴别之组合物组分比较时，所探索赋形剂/条件未提供显著改良。
3)可使用不同量之蔗糖及氯化钠来减小聚集物百分比以及pH变化对聚集之影响。
表5-其他赋形剂筛选之聚集结果
a.在添加Glu时发现pH急升，此可引起高聚集
实施例5.用于评价包含亚型A及B之RSV F蛋白、蔗糖及氯化钠之组合物之稳定性的应力研究
为确保包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物能够承受在处理及处置期间所遇到之冷冻/解冻(F/T)及其他应力，在下列应力研究中评价本发明组合物(20mM Tris、50mM NaCl、4％蔗糖及0.02％ PS 80，在pH 7.4下)中亚型A及B之RSV F蛋白之稳定性：
1.3至5个-70℃至室温之冷冻及解冻循环；
2.在环境温度下搅拌24小时(500rpm)；
3.5℃及25℃下之一周液体稳定性。
将试样保持于聚丙烯管中以供RSV A F/T研究(在3mL管中填充1mL)，保持于1型玻璃小瓶中以供RSV B F/T研究，且实施RSVA及RSVB之搅拌及1周液体稳定性研究(在2mL小瓶中填充0.5mL)。监测试样之AM14融合前含量(使用实施例1中所公开之ELISA分析)、聚集(SEC HPLC，参见实施例1)及总蛋白质浓度。
结果(表6)证实，RSV A在所有测试条件下皆是稳定的。对RSV B而言，在25℃下储存一周后AM14融合前含量保持稳定且聚集增加5％。在5℃下，RSV B稳定性小于25℃下稳定性且展示11％之聚集增加。RSV B可稳定最多5个F/T循环。在搅拌时，RSV B展示AM14融合前含量与对照相比之轻微降低，此在分析可变性方面是可接受的。
表6.RSV A及RSV B在应力条件下之稳定性
实施例6.包含蔗糖、氯化钠及呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物之冻干
制备包含RSV A之组合物并在两个浓度水平：480μg/mL及120μg/mL下于以下2种不同基质中进行评价：1)9％蔗糖及2)2％蔗糖及4％甘露醇(二者皆于20mM Tris、50mM NaCl、0.02％ PS 80中且在pH 7.4下)。使用SP Scientific LyoStar且使用表7及表8中所公开之条件来冻干试样。在冻干前后以及5℃及25℃短期储存后监测关于AM14融合前含量、聚集、蛋白质浓度、pH及水分之稳定性。所有试样在冻干后皆具有可接受之饼状外观且水分低于0.5％。在复水重构后未观察到pH及蛋白质浓度之变化(数据未展示)。AM14融合前含量及聚集(SEC HPLC-参见实施例1)结果证实，冻干制剂对于本文所公开包含亚型A之RSV融合前F蛋白之水性组合物是可行的。AM14融合前含量在冻干之后得以维持并在评价其之短期内保持稳定。聚集增加在10％内(表9及10)。
表7.用于含有9％蔗糖之试样之冻干循环(96小时循环)
表8.用于含有2％蔗糖+4％甘露醇之试样之冻干循环(55hr循环)
表9-单价冻干RSV A在9％蔗糖基质中之短期稳定性
a.重复结果
表10-单价冻干RSV A在2％蔗糖及4％甘露醇基质中之短期稳定性
NT：未测试
亦评价包含仅RSV B融合前F(480μg/mL)或RSV A及RSV B(总共480μg/mL，各240μg/mL)之水性组合物在20mM Tris、50mM NaCl、0.02％ PS 80、2％蔗糖及4％甘露醇(pH7.4)中之冻干可行性。在冻干前及冻干后以及在5℃下储存2个月之后监测试样之AM14融合前含量及聚集％(SEC HPLC-参见实施例1)。初步数据(表11)表明，RSV B亦可冻干。与RSV A及RSV B二价组合物相比，在单价RSV B中观察到较大程度之聚集增加。
表11-冻干之单价RSV B及二价RSV A+RSV B在2％蔗糖及4％甘露醇基质中之短期稳定性
a.相对于标准
上述数据展示，可冻干本文所公开的包含亚型A及/或B之呈融合前构象之RSV蛋白F三聚体之水性免疫原组合物。举例而言，包含9％蔗糖之组合物可在96小时中冻干，且同时维持融合前含量并限制聚集增加。包含蔗糖及甘露醇之另一组合物可在55小时中冻干，且同时维持可接受之融合前含量及聚集水平。可有利地减小冻干时间以用于生产目的、尤其用于大规模生产。
如实施例2至5中所证实，自稳定性角度考虑、尤其就融合前含量及聚集百分比而言，包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体以及蔗糖及氯化钠之水性组合物是有利的。实施例6之数据表明，这些组合物甚至可通过包括另一糖(例如甘露醇)来进一步优化，从而可在短时间段内冻干组合物而不损害产物之稳定性。
实施例7-优化包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性组合物以减小冻干持续时间，且同时限制融合前含量损失及聚集物增加
为优化拟用于组合物中之稳定剂/增量剂之选择及比率，选择表12中所展示之10种不同基质并冻干。应用研发性冻干循环以产生含有蔗糖/甘露醇或蔗糖/甘氨酸之冻干组合物。使用表7中所公开之原始冻干循环(～96小时)来产生此研究中之对照。通过AM14ELISA及AM22 Fab滴定在冻干之前及之后使用实施例1中所公开之测定法来监测所有测试制剂之聚集(％HMMS)及融合前含量。
表12-RSV F蛋白组合物
冻干前及冻干后稳定性结果展示于图9中。聚集变化(％HMMS)与AM14融合前含量％之变化绘示于图9A中。类似地，聚集变化(％HMMS)与AM22融合前含量％之变化绘示于图9B中。
#1至#9制剂可皆在约24小时中冻干。对于含有蔗糖及甘露醇之组合物而言，含有3％蔗糖/6％甘露醇且含有或不含NaCl之两种组合物(表12中之#1及#2)在冻干时显示所有测试组合物中之最佳整体稳定性。#4组合物(2％蔗糖/5.5％甘露醇)及#9组合物(2％蔗糖/4％甘露醇与NaCl)在冻干时展示最大融合前含量下降及最大聚集增加，此指示非理想蔗糖/甘露醇水平及/或比率。另外，图9中之数据表明，在组合物中存在NaCl可在冻干时潜在地减小大部分组合物中之聚集速率。
对于含有蔗糖及甘氨酸之组合物而言，含有1％蔗糖/2.5％甘氨酸且含有或不含NaCl者(表12中之#7及#8)展示略优于含有1.5％蔗糖/3％甘氨酸且含有或不含NaCl者(表12中之#5及#6)之稳定性。
鉴于上述结论，在包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之组合物中纳入蔗糖及甘露醇或蔗糖及甘氨酸尤其有利于获得可冻干且其中融合前含量损失及聚集增加得以限制的组合物。特定而言，蔗糖对甘露醇或蔗糖对甘氨酸之比率介于1:1与1:4之间，优选地1:2至1:4、更优选地1:2之组合物提供了可在24H中冻干且其中融合前含量损失及聚集增加可接受之的组合物。
实施例8-用于呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之冻干过程之研发
冻干研发之目标在于通过优化冻干循环之每一阶段(包括冷冻、退火及干燥)之条件以产生具有可接受产物质量之视觉精美饼来研发目标冻干循环。在用以获得目标冻干循环之初始研发之后，通过挑战目标循环参数并评估对产物质量之影响来评价冻干循环之稳定性。在冻干过程研发期间评估之关键质量属性包括残余水分含量、HMMS及融合前含量。另外，冻干甘露醇-蔗糖制剂可使得存在多种多态形式之甘露醇，由此亦监测半水合甘露醇(MHH)之存在，此乃因此相可随时间变化对产物稳定性具有负面影响。
冻干过程中之主要步骤包括冷冻、退火、经由升华干燥及经由解吸残余水分干燥。必须在每一步骤中全程考虑若干参数，包括储存温度、斜变及保持时间、干燥期间之室压及整个循环中之产物温度。冷冻保持温度会影响冷冻基质之结构特性。纳入退火步骤通过促进结晶及冰晶大小之均质性及最大化甘露醇之结晶来减小通常在冷冻期间诱导之小瓶间异质性，此可最终最小化饼外观差异并减小干燥时间。在第一干燥斜变期间使用之循环时间、储存温度及室压直接影响冷冻基质之温度、升华速率以及经干燥饼之结构及外观。在第二干燥斜变期间利用之整体循环时间及储存温度主要影响经干燥饼中之残余水分含量。每一步骤之适当参数值之选择共同使得冻干循环能够在小瓶中产生具有期望精美饼外观与低残余水分含量(以证实药品之稳定化)之经干燥饼。
在药品制剂之热分析后，基于使用半结晶制剂之历史工序研发经验来选择用于实验室规模冻干循环之初始参数(参见下表13)。
表13-目标冻干循环
缩写：NA＝不适用
然后创建攻击性循环条件以证实关键工序参数并界定拟挑战以评价工序稳定性之上下边界。使用表15中所阐述之5个攻击性循环冻干RSV F蛋白组合物(参见表14)以证实关键工序参数并界定拟在工序稳定性研究中挑战之上下边界。所述循环通过挑战目标冻干循环之参数值来评价冷冻斜变速率、退火斜变速率及温度以及干燥斜变速率及温度等冻干参数。累积攻击性循环组合了缓慢冷冻及退火斜变速率与高冷冻温度、退火温度及干燥温度。如表15中所列示来执行个别循环且冷冻斜变速率、退火温度、退火斜变速率或干燥温度及斜变速率可有所变化，且同时保持所有其他参数与目标循环值一致。
表14-冻干前及冻干后之RSV A及B组合物
b亦称为缓血酸胺(Trometamol)及Tris碱
c亦称为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、氨丁三醇盐酸盐及缓血酸胺盐酸盐
d氨丁三醇+Tris盐酸盐组合物等效于20mM Tris
e氨丁三醇+Tris盐酸盐组合物等效于15mM Tris
f等效于50mM NaCl
g等效于37.5mM NaCl
表15-关键工序参数评价循环
所有实验皆是使用来自FTS System Inc之LyoStar3 Lyophilizer来实施。攻击性循环评价与使用目标循环产生之冻干组合物相比冷冻斜变速率、退火斜变速率及温度以及干燥斜变速率及温度对水分含量、融合前含量、HMMS及MHH之存在之影响。结果汇总于表16中。
累积攻击性循环对关键质量属性之影响指示较小影响，而HMMS在SE-HPLC之典型方法可变性内，观察到融合前含量相对于冻干前组成及使用目标循环获得之冻干组成之下降。
为鉴别有助于累积攻击性循环之观察结果之关键参数，评估个别地改变冷冻斜变速率、退火温度、退火斜变速率以及干燥温度及斜变等参数之循环之结果。结果指出，冷冻斜变速率对融合前含量具有最大影响且类似于累积攻击性循环中所观察之值。所述结果表明，与使用目标循环之冻干组合物相比，冷冻斜变速率是最显著影响冻干组合物之融合前含量之参数，此乃因退火温度、退火斜变速率及干燥参数攻击性循环之融合前含量在方法可变性内。
就水分含量及MHH之存在而言，评估目标循环、累积攻击性循环、退火温度及冷冻斜变攻击性循环，此乃因这些循环水分含量及MHH存在具有最高风险。所有循环皆产生具有0.2重量％至0.4重量％之低水分含量之冻干产物且通过粉末X射线衍射未证实MHH。
表16-结果：关键工序参数评价
a.通过AM14 Fab滴定及SEC测得之融合前含量值，如实施例1中所公开
b.T0
c.n＝2个结果之平均值
d.2个试样之最高报告值
缩写：MHH＝半水合甘露醇；N/A＝不适用；NT＝未测试；HMMS＝高分子量物质；LMMS＝低分子量物质；NMT＝不超过
在另一实验中，使用表18中所阐述之循环冻干表17之组合物以评价目标冻干循环之稳定性。所述循环评价冷冻斜变速率、退火斜变速率及温度以及干燥斜变速率等冻干参数。基于来自干燥优化循环及关键工序参数评价循环之研发经验以及使用半结晶制剂冻干之历史研发经验，创建三个循环以扩展温度、斜变速率及室压之靶值参数。使用表18中所列示之参数执行“低-快速”(低温、低室压、快速斜变速率)循环及两个“高-缓慢”循环(高温、高室压、缓慢斜变速率)。两个“高-缓慢”循环之区别仅在于冷冻斜变速率(0.25℃/min及0.4℃/min)且出于关键工序参数评价而创建，该评价将冷冻斜变速率鉴别为影响前述实验中之融合前含量之关键参数。
表17
b亦称为缓血酸胺及Tris碱
c亦称为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、氨丁三醇盐酸盐及缓血酸胺盐酸盐
d氨丁三醇+Tris盐酸盐组合物等效于20mM Tris
e氨丁三醇+Tris盐酸盐组合物等效于15mM Tris
f等效于50mM NaCl
g等效于37.5mM NaCl
表18-冻干过程稳定性研究循环
所有循环直至8个月在2-8℃、25℃及40℃下之融合前含量(如通过AM14Fab滴定及SEC所测量)呈现于表19中。SEC-Fab滴定之融合前含量％结果指示，在冻干时观察到融合前含量有所下降(如过去所观察)，但高-缓慢2、低-快速及目标之融合前含量损失量针对每一循环内方法可变性是类似的。所有循环在所有条件下皆在T0至T8M时间点显示融合前含量之最小损失，高-缓慢1循环在40℃下除外。应注意，所有循环在1个月及3个月时间点下皆观察到显著可变性。一般而言，在与其他循环比较时，高-缓慢1循环在每一条件下于1个月之后之所有时间点皆显示较低融合前含量，其中一些值位于接受标准之外。因该循环显示最缓慢冷冻速率，故其与关键参数评价研发中之先前发现(在与目标循环比较时，0.25℃/min之冷冻速率产生较大融合前含量损失)相关。
表19-通过AM14 Fab滴定及SEC分析融合前含量
液体RSV组合物(冻干前)及冻干RSV组合物(复水重构)之大小排阻层析
所有循环直至8个月在2-8℃、25℃及40℃下之SE HPLC结果呈现于表20中。SE-HPLC结果指示，通过高-缓慢2、低-快速及目标循环产生之试样在2-8℃及25℃下于T0至T8M(8个月)时间点下具有最小HMMS增加。在与其他循环比较时，高-缓慢1循环在每一条件下之所有时间点于25℃及40℃下皆显示较高HMMS含量以及较高速率之HMMS增加。因该循环显示最缓慢冷冻速率，故其与先前研发历史(较缓慢冷冻速率可导致HMMS增加)相关。
表20-通过SE-HPLC分析冻干组合物之三聚体、LMMS及HMMS
表19及20之数据证实，冷冻斜变速率是冻干包含呈融合前构象之RSV F蛋白三聚体之水性免疫原组合物之方法的关键参数。具体而言，据观察，0.2℃/min之冷冻斜变速率会导致融合前含量的实质性损失。
原始序列表
SEQ ID NO:1：亚型A之RSV F蛋白之F1多肽之构建体的氨基酸序列：
FLGFLLGVGSACASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTIKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSSEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:2：亚型A之RSV F蛋白之F2多肽之构建体的氨基酸序列：
QNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDA KVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPACNSRARR
SEQ ID NO:3：亚型B之RSV F蛋白之F1多肽之构建体的氨基酸序列：
FLGFLLGVGSACASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTIKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSSEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:4：亚型B之RSV F蛋白之F2多肽之构建体的氨基酸序列：
QNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDT KVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPACNNRARR
SEQ ID NO:5.天然RSV A2之全长F0之氨基酸序列(基因库GI:138251；Swiss ProtP03420)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO:6.天然RSV B之全长F0之氨基酸序列(18537毒株；基因库GI:138250；Swiss Prot P13843)
MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
SEQ ID NO:7：T4 fibritin折叠子之氨基酸序列：
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:8：抗体D25之重链可变结构域之氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:9：抗体D25之轻链可变结构域之氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO:10：抗体AM14之重链可变结构域之氨基酸序列：
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS
SEQ ID NO:11：抗体AM14之轻链可变结构域之氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV
SEQ ID NO:12：抗体AM22之重链可变结构域之氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:13：抗体AM22之轻链可变结构域之氨基酸序列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK

Claims (37)

1.一种水性免疫原组合物，其包含：
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度介于约20mM与约250mM之间；
(iii)蔗糖、甘露醇及甘氨酸中的至少一种，其浓度介于约5mg/mL与约100mg/mL之间；及
(iv)缓冲液；
其中该组合物的pH介于约7与约8之间。
2.根据权利要求1所述的水性免疫原组合物，其中氯化钠的浓度介于约20mM与约100mM之间。
3.根据权利要求1或2所述的水性免疫原组合物，其中蔗糖的浓度介于约10mg/mL与约100mg/mL之间。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的水性免疫原组合物，其中甘氨酸的浓度介于约10mg/mL与约100mg/mL之间。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的水性免疫原组合物，其中甘露醇的浓度介于约10mg/mL与约100mg/mL之间。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的水性免疫原组合物，其中蔗糖的浓度介于约10mg/mL与约70mg/mL之间且甘露醇的浓度介于约10mg/mL与约70mg/mL之间。
7.根据权利要求6所述的水性免疫原组合物，其中蔗糖与甘露醇的比例介于1:1与1:5之间，优选介于1:2与1:4之间。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的水性免疫原组合物，其中该组合物进一步包含表面活性剂。
9.根据权利要求8所述的水性免疫原组合物，其中该表面活性剂为聚山梨酯80。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的水性免疫原组合物，其中该缓冲液为Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)。
11.根据权利要求1所述的水性免疫原组合物，其中该组合物包含：
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度介于约35mM与约65mM之间；
(iii)蔗糖，其浓度介于约20mg/mL与约40mg/mL之间；及甘露醇，其浓度介于约45mg/mL与约75mg/mL之间；
(iv)Tris缓冲液，其浓度介于约15mM与约25mM之间；
(v)聚山梨酯80，其浓度介于约0.1mg/mL与约0.3mg/mL之间；
其中该组合物的pH介于7.1与7.7之间。
12.根据权利要求1所述的水性免疫原组合物，其中该组合物包含：
(i)第一RSV F蛋白三聚体，其呈融合前构象；
(ii)氯化钠，其浓度为约50mM；
(iii)蔗糖，其浓度为约30mg/mL；及甘露醇，其浓度为约60mg/mL；
(iv)Tris缓冲液，其浓度为约20mM；
(v)聚山梨酯80，其浓度为约0.2mg/mL；
其中该组合物的pH为约7.4。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白为亚型A的F蛋白。
14.根据权利要求13所述的水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白的突变组合，其中该突变组合选自由以下组成的组：
(1)103C、148C、190I及486S，优选A103C、I148C、S190I及D486S的组合；
(2)54H、55C、188C及486S，优选T54H、S55C、L188C及D486S的组合；
(3)54H、103C、148C、190I、296I及486S，优选T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S的组合；
(4)54H、55C、142C、188C、296I及371C，优选T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C的组合；
(5)55C、188C及486S，优选S55C、L188C及D486S的组合；
(6)54H、55C、188C及190I，优选T54H、S55C、L188C及S190I的组合；
(7)55C、188C、190I及486S，优选S55C、L188C、S190I及D486S的组合；
(8)54H、55C、188C、190I及486S，优选T54H、S55C、L188C、S190I及D486S的组合；
(9)155C、190I、290C及486S，优选S155C、S190I、S290C及D486S的组合；
(10)54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S，优选T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S的组合；
(11)54H、155C、190I、290C及296I，优选T54H、S155C、S190I、S290C及V296I的组合；
(12)155C、190F、290C及207L，优选S155C、S190F、S290C及V207L的组合。
15.根据权利要求13所述的水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白的突变组合，其中该突变组合选自由以下组成的组：
(1)215P及486N，优选S215P及D486N的组合；
(2)66E、215P及486N，优选K66E、S215P及D486N的组合；
(3)66E、76V、215P及486N，优选K66E、I76V、S215P及D486N的组合；
(4)66E、67I、76V、215P及486N，优选K66E、N67I、I76V、S215P及D486N的组合。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的水性免疫原组合物，其中该第一RSV F蛋白包含三聚化结构域。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的水性免疫原组合物，其中该组合物进一步包含呈融合前构象的第二RSV F蛋白三聚体。
18.根据权利要求17所述的水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白为亚型B的F蛋白。
19.根据权利要求17或18所述的水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白的突变组合，其中该突变组合选自由以下组成的组：
(1)103C、148C、190I及486S，优选A103C、I148C、S190I及D486S的组合；
(2)54H、55C、188C及486S，优选T54H、S55C、L188C及D486S的组合；
(3)54H、103C、148C、190I、296I及486S，优选T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S的组合；
(4)54H、55C、142C、188C、296I及371C，优选T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C的组合；
(5)55C、188C及486S，优选S55C、L188C及D486S的组合；
(6)54H、55C、188C及190I，优选T54H、S55C、L188C及S190I的组合；
(7)55C、188C、190I及486S，优选S55C、L188C、S190I及D486S的组合；
(8)54H、55C、188C、190I及486S，优选T54H、S55C、L188C、S190I及D486S的组合；
(9)155C、190I、290C及486S，优选S155C、S190I、S290C及D486S的组合；
(10)54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S，优选T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S的组合；
(11)54H、155C、190I、290C及296I，优选T54H、S155C、S190I、S290C及V296I的组合；
(12)155C、190F、290C及207L，优选S155C、S190F、S290C及V207L的组合。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含相对于相应野生型RSV F蛋白的突变组合，其中该突变组合选自由以下组成的组：
(1)215P及486N，优选S215P及D486N的组合；
(2)66E、215P及486N，优选K66E、S215P及D486N的组合；
(3)66E、76V、215P及486N，优选K66E、I76V、S215P及D486N的组合；
(4)66E、67I、76V、215P及486N，优选K66E、N67I、I76V、S215P及D486N的组合。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的水性免疫原组合物，其中该第二RSV F蛋白包含三聚化结构域。
22.一种储存包含呈融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性免疫原组合物的方法，其包括在至少约15℃的温度下储存该组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中该温度介于约15℃与约30℃之间。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中该RSV F蛋白为亚型A的F蛋白。
25.根据权利要求22或23所述的方法，其中该RSV F蛋白为亚型B的F蛋白。
26.根据权利要求22或23所述的方法，其中该水性免疫原组合物为权利要求1至21中任一项所述的组合物。
27.一种冻干包含呈融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性免疫原组合物的方法，其包括冷冻该组合物的步骤，其中所述步骤包括以至少约0.3℃/min的冷冻斜变速率，将温度降至介于-40℃与-60℃之间的冷冻温度。
28.一种冻干包含呈融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性免疫原组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供包含呈该融合前构象的RSV F蛋白三聚体的水性组合物；
(b)冷冻该组合物，其中所述步骤包括以至少约0.3℃/min(例如介于约0.3℃/min与约2℃/min之间)的冷冻斜变速率，将温度降至介于约-40℃与约-60℃之间的冷冻温度，并
将该组合物在该冷冻温度下维持至少约30分钟，例如介于30分钟与120分钟之间；
(c)将经冷冻的组合物退火；
(d)再冷冻经退火的组合物，其中所述步骤包括以至少0.3℃/min的再冷冻斜变速率，将温度降至介于约-40℃与约-60℃之间的再冷冻温度，并
将该组合物在该再冷冻温度下维持至少约30分钟，例如介于30分钟与120分钟之间；
(e)干燥经再冷冻的组合物；和
(f)获得包含呈该融合前构象的该RSV F蛋白三聚体的冻干组合物。
29.一种冻干的免疫原组合物，其通过权利要求27或28所述的方法获得或可获得。
30.一种试剂盒，其包含：
(i)根据权利要求29所述的冻干的组合物；及
(ii)稀释剂，其用于复水重构该冻干的组合物。
31.一种试剂盒，其包含：
(i)冻干的组合物；及
(ii)稀释剂，其用于复水重构该冻干的组合物；
其中使用该稀释剂复水重构该冻干的组合物产生权利要求1至21中任一项所述的水性免疫原组合物。
32.根据权利要求30或31所述的试剂盒，其中所述稀释剂为注射用水。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的试剂盒，其中所述稀释剂包含防腐剂。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述防腐剂为2-苯氧基乙醇。
35.一种试剂盒，其包含：
(i)冻干的组合物；及
(ii)稀释剂，其包含浓度介于约20mM与约300mM之间的氯化钠；
其中使用所述稀释剂复水重构所述冻干的组合物产生权利要求1至21中任一项所述的水性免疫原组合物。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述稀释剂包含防腐剂。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述防腐剂为2-苯氧基乙醇。
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