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CN120053657B - 用于治疗aplaid的药物及药物组合物 - Google Patents

用于治疗aplaid的药物及药物组合物

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CN120053657B
CN120053657B CN202510233408.1A CN202510233408A CN120053657B CN 120053657 B CN120053657 B CN 120053657B CN 202510233408 A CN202510233408 A CN 202510233408A CN 120053657 B CN120053657 B CN 120053657B
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aplaid
irf5
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leu8455er
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彭琪
黎四平
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于治疗APLAID的药物及药物组合物，所述药物为靶向IFNβ信号通路的抑制剂，所述药物组合物包括靶向IFNβ信号通路的抑制剂，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。本发明利用PLCγ2p.Leu845Ser突变巨噬细胞和小鼠模型进行的分子机制研究表明，巨噬细胞中上调的IFNβ是APLAID的重要驱动因素，p.Leu845Ser突变的PLCγ2通过增强其与IRF5的结合和促进IRF5核转位来上调IFNβ的表达。本发明首次揭示了巨噬细胞中活化的IRF5/IFNβ信号传导是APLAID发展的关键驱动因素，并为APLAID患者提供了一种新的治疗靶点。

Description

用于治疗APLAID的药物及药物组合物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于治疗APLAID的药物及药物组合物。
背景技术
APLAID是一种罕见的自身炎症性疾病，APLAID的主要临床特征包括发病早、复发性炎症性肠病和眼病、起泡性皮肤病变、关节疼痛和肺部炎症病变。由于APLAID的分子机制尚不清楚，因此没有针对APLAID患者的标准治疗指南。现有的治疗方法多集中于免疫抑制治疗，效果有限，且存在一定的副作用。因此，迫切需要寻找新的治疗策略，尤其是针对疾病的分子机制和病理过程中的关键分子靶点。
研究表明，PLCγ2(磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cγ2)是一个关键的免疫信号分子，其突变与APLAID的发生密切相关。我们前期研究发现PLCγ2基因p.Leu845Ser突变，能够增强与IRF5(干扰素调节因子5)的结合，促进IRF5的核转位，并最终导致IFNβ的过度表达。IFNβ(干扰素β)是免疫系统中一种重要的细胞因子，广泛参与免疫应答与炎症反应。我们首次研究发现IFNβ的过度表达是该疾病发生和发展的一个关键因素。因此，靶向IFNβ信号通路，尤其是通过调节PLCγ2/IRF5/IFNβ信号轴，可能为APLAID的治疗提供新的思路和策略。
本发明旨在提供一种新的治疗APLAID的方法及药物组合物。具体来说，所述药物为靶向IFNβ信号通路的抑制剂，能够有效干预IFNβ的异常激活及相关信号传导，减轻巨噬细胞及其他免疫细胞的炎症反应，从而缓解APLAID的临床症状。通过PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠模型及巨噬细胞实验，本发明首次揭示了IFNβ在APLAID中的关键作用，并为APLAID的治疗提供了新的药物靶点。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供用于治疗APLAID的药物及药物组合物。
本发明的目的通过下述技术方案实现：靶向IFNβ信号通路的抑制剂在制备用于治疗APLAID的药物中的应用。
优选的，所述靶向IFNβ信号通路的抑制剂包括IFNβ抗体、IFNAR拮抗剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂和IRF抑制剂中的任意一种。IFNβ抗体可以直接中和IFNβ，阻止其与IFNAR结合，如：抗IFNβ单克隆抗体。IFNAR拮抗剂可以阻断IFNAR1或IFNAR2，抑制IFNβ信号传导，如：Anifrolumab。JAK抑制剂可以抑制JAK1和TYK2激酶，阻断IFNβ下游信号传导。如：Tofacitinib(JAK1/3抑制剂)、Baricitinib(JAK1/2抑制剂)、Deucravacitinib(TYK2抑制剂)。STAT抑制剂可以抑制STAT1或STAT2的磷酸化或二聚化，阻断ISGF3的形成。IRF抑制剂可以抑制IRF家族成员，阻断ISGF3的功能。
优选的，所述IFNAR拮抗剂阿尼鲁单抗，所述JAK抑制剂为乌帕替尼，所述IRF抑制剂为IRF5抑制剂YE6144。
本发明的另一个目的通过下述技术方案实现：用于治疗APLAID的药物，所述药物为靶向IFNβ信号通路的抑制剂。
优选的，所述靶向IFNβ信号通路的抑制剂包括IFNβ抗体、IFNAR拮抗剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂和IRF抑制剂中的任意一种。
优选的，所述IFNAR拮抗剂阿尼鲁单抗，所述JAK抑制剂为乌帕替尼，所述IRF抑制剂为IRF5抑制剂YE6144。
本发明的还一个目的通过下述技术方案实现：用于治疗APLAID的药物组合物，所述药物组合物包括靶向IFNβ信号通路的抑制剂，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
优选的，所述靶向IFNβ信号通路的抑制剂包括IFNβ抗体、IFNAR拮抗剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂和IRF抑制剂中的至少一种。
优选的，所述IFNAR拮抗剂阿尼鲁单抗，所述JAK抑制剂为乌帕替尼，所述IRF抑制剂为IRF5抑制剂YE6144。
优选的，所述药物组合物还包括汉黄芩素。
本发明的再一个目的通过下述技术方案实现：靶向PLCγ2的siRNA在制备用于治疗APLAID的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明利用PLCγ2p.Leu845Ser突变巨噬细胞和小鼠模型进行的分子机制研究表明，巨噬细胞中上调的IFNβ是APLAID的重要驱动因素，p.Leu845Ser突变的PLCγ2通过增强其与IRF5的结合和促进IRF5核转位来上调IFNβ的表达。重要的是，靶向IRF5或IFNβ可以显著逆转PLCγ2突变巨噬细胞和小鼠的炎症表型。本发明首次揭示了巨噬细胞中活化的IRF5/IFNβ信号传导是APLAID发展的关键驱动因素，并为APLAID患者提供了一种新的治疗靶点。
附图说明
图1是PLCγ2突变导致巨噬细胞明显浸润；其中，A为PLCγ2p.Leu845Ser突变的APLAID患者的血常规检查结果；B为HE染色和IHC检测患者肠组织中CD68和MPO的表达；C为激光共聚焦技术检测了PLCγ2和CD68在肠组织中的表达和定位；D为PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠的血常规检查结果；E为HE染色和IHC检测CD68和MPO检测PLCγ2突变小鼠炎症部位CD68和MPO的表达；F为激光共聚焦技术检测了PLCγ2和F4/80在PLCγ2突变小鼠炎症皮肤组织中的表达和定位。
图2是PLCγ2突变激活巨噬细胞中的IFNβ通路；其中，A为热图显示了THP1mut和THP1nc细胞中细胞因子的差异表达；B为THP1mut细胞中差异表达基因的KEGG通路富集；C-G为qPCR检测M0(PMA)或M1(PMA/LPS)状态下THP1mut和THP1nc细胞中STAT1、STAT2、ISG15、CXCL10和TNFSF10的表达；H为Wb评估了THP1nc和THP1mut细胞中PLCγ2、STAT1、STAT2、pSTAT1和pSTAT2的蛋白质水平；(I-J为Elisa检测M0或M1状态下THP1mut和THP1nc细胞中IFNβ和IFNα的浓度；K-P为qPCR检测了经PMA或LPS治疗的APLAID患者(P)和健康供体(H)的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF7、IFNβ、CXCL10和TNFSF10的表达；Q为Wb评估了经PMA治疗的APLAID患者(P)和健康供体(H)的PBMC中STAT1、STAT2、pSTAT1和pSTAT2的蛋白水平；R为IHC检测APLAID患者肠组织中IFNβ、P-STAT1和ISG15的表达；S-X为qPCR检测了PLCγ2突变小鼠皮肤组织中STAT1、STAT2、IFNβ、ISG15、CXCL10和TNFSF10的mRNA水平；Y为Wb检测了PLCγ2突变小鼠皮肤组织中STAT1和pSTAT1的蛋白水平；Z为IHC检测了PLCγ2突变小鼠皮肤组织中IFNβ、pSTAT1和ISG15的表达；其中qPCR和Elisa数据显示为平均值±标准差，使用学生t检验，统计显著性为***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，ns，不显著。
图3是突变PLCγ2促进IFNβ表达；其中，A为qPCR检测转染了靶向PLCG2的siRNA或非编码siRNA的THP1mut细胞中PLCG2的表达；B为Elisa评估了转染PLCG2的siRNA或非编码siRNA的THP1mut细胞中IFNβ的浓度；C-F为qPCR分析了PLCG2敲除对THP1mut细胞中STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10表达的影响；G为萤光素酶报告基因测定评估了PLCG2敲除对IFNβ启动子活性的影响；H为Wb分析了PLCG2siRNA转染的THP1mut细胞中PLCG2、STAT1、STAT2、P-STAT1和P-STAT2的蛋白质水平；I-L和M-P分别为qPCR检测了用I型干扰素受体抑制剂(Anifro)或Upadacitinib(Upa)处理的THP1mut细胞中STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10的mRNA水平；Q-R为Wb检测了用Anifro或Upa处理的THP1mut细胞中STAT1、STAT2、P-STAT1和P-STAT2的蛋白质水平；其中，qPCR数据显示为平均值±标准差，使用学生t检验，统计显著性确定为***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，ns，不显著。
图4是PLCγ2突变巨噬细胞抑制肠上皮细胞的增殖；其中，A为使用THP1mut或THP1nc细胞与NCM460细胞的上清液的共培养模型图；B-C为用THP1mut上清液或IFNβ处理的NCM460细胞中差异表达基因的KEGG通路富集；D为EDU法检测用THP1mut细胞、THP1nc细胞、1μg/mLIFNβ上清液处理的NCM460细胞的增殖情况；E为EDU检测用PLCG2siRNA处理的THP1mut细胞上清液处理的NCM460细胞的增殖；J-K为EDU检测由Anifro或Upa处理的THP1-mut细胞上清处理的NCM460细胞的扩散；F、H、L、N为统计分析了D、E、J、K组中EDU测定中EDU阳性细胞的比例；G、I、M、O为CCK8测定检测了用Anifro或Upa处理的THP1mut细胞上清液处理的NCM460细胞的细胞活力；其中，CCK8和EDU统计数据显示为平均值±标准差，使用学生t检验，统计显著性确定为***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，ns，不显著。
图5是突变PLCγ2通过增强IRF5核定位上调IFNβ；其中，A为使用Flag抗体对THP1mut蛋白裂解物进行免疫沉淀，Wb分析了从IP获得的蛋白复合物中PLCγ2的含量；B为对IP复合物中的蛋白质进行质谱分析，并对鉴定的蛋白质进行途径富集；C为热图显示了IP蛋白复合物中与I型干扰素相关的蛋白质的丰度；D为使用Flag或IRF5抗体对THP1mut蛋白裂解物进行免疫沉淀，Wb分析了从IP获得的蛋白质复合物中PLCγ2和IRF5的含量；E为激光共聚焦技术检测了PLCγ2和IRF5在THP1-mut和THP1nc细胞中的分布和共定位；F为在293T细胞中共转染FlagPLCγ2(wt)/IRF5或FlagPLCβ2(mut)/IRF5-过表达质粒，使用Flag或IRF5抗体对293T蛋白裂解物进行免疫沉淀，Wb分析了从IP获得的蛋白质复合物中PLCγ2和IRF5的含量；G为激光共聚焦技术检测了PLCγ2和IRF5在293T细胞中的共定位，这些细胞与FlagPLCγ2(wt)/IRF5或FlagPLCβ2(mut)/IRF5-过表达质粒共转染；H为Wb分析了PLCγ2和IRF5在共转染293T细胞的细胞质和细胞核中的分布；I-J为激光共聚焦技术检测了IRF5抑制剂YE6144对THP1mut细胞和共转染293T细胞中PLCγ2和IRF5共定位的影响。
图6是IRF5抑制剂抑制IFNβ转录和功能；其中，A为Elisa分析了YE6144对M0和M1状态下THP1mut细胞中IFNβ浓度的影响；B为萤光素酶报告子分析了YE6144对MCF7细胞中IFNβ启动子活性的影响；C-G为qPCR检测了用YE6144处理的THP1mut细胞中IFNβ、STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10的mRNA水平；H为Wb分析了用YE6144处理的THP1mut细胞中STAT1、STAT2、pSTAT1和pSTAT2的蛋白质水平；I-J为EDU测定检测了用YE6144处理的M0或M1stateTHP1mut细胞上清液处理的NCM460细胞的增殖；K-L为统计分析I-J图中EDU测定中EDU阳性细胞的比例；M-N为CCK8测定检测了用YE6144处理的M0或M1stateTHP1mut细胞上清液处理的NCM460细胞的细胞活力；其中，图A-G、K-N中的数据显示为平均值±标准差，使用学生t检验，统计显著性确定为***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05，ns，不显著。
图7是Anifrolumab改善了APAID小鼠的炎症表型；A为PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠接受或不接受Anifro治疗的血常规检查结果；B为HE染色分析了PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠炎症组织的病理状态；C为Wb分析了炎症皮肤组织中STAT1和pSTAT1的蛋白水平；D为IHC检测了PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠炎症组织中STAT1和F4/80的表达；E为激光共聚焦技术检测了PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠炎症组织中PLCγ2和F4/80的表达；F-I为qPCR检测了PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠在接受或不接受Anifro治疗的炎症皮肤组织中STAT1、CXCL10、TNFSF10和ISG15的mRNA水平；其中，图F-I中的数据显示为平均值±标准差，统计显著性为***P<0.001，**P<0.01。
图8是炎症性肠病患者受损肠组织中PLCγ2和IFNβ的表达；A为IHC检测了炎症性肠病患者受损肠组织中PLCγ2的表达；B为IHC检测了炎症性肠病患者受损肠组织中IFNβ的表达。
图9是英夫利昔单抗和汉黄芩素改善APAID小鼠的炎症；A-D为qPCR检测经英夫利昔单抗(Rem)和汉黄芩素处理的THP1mut细胞中STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10的表达；E为Wb检测了用英夫利昔单抗(Rem)和汉黄芩素处理的THP1mut细胞中STAT1、STAT2、pSTAT1和pSTAT2的蛋白水平。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-9对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
本发明靶向IFNβ信号通路的抑制剂在制备用于治疗APLAID的药物中的应用。作为一些具体的实施方式，所述靶向IFNβ信号通路的抑制剂包括IFNβ抗体、IFNAR拮抗剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂和IRF抑制剂中的任意一种。作为一些更具体的实施方式，所述IFNAR拮抗剂阿尼鲁单抗，所述JAK抑制剂为乌帕替尼，所述IRF抑制剂为IRF5抑制剂YE6144。
本发明用于治疗APLAID的药物及药物组合物，所述药物为靶向IFNβ信号通路的抑制剂，所述药物组合物包括靶向IFNβ信号通路的抑制剂，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。作为一些具体的实施方式，所述靶向IFNβ信号通路的抑制剂包括IFNβ抗体、IFNAR拮抗剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂和IRF抑制剂中的任意一种。作为一些更具体的实施方式，，所述IFNAR拮抗剂阿尼鲁单抗，所述JAK抑制剂为乌帕替尼，所述IRF抑制剂为IRF5抑制剂YE6144。作为一些具体的实施方式，所述药物组合物还包括汉黄芩素。
本发明靶向PLCγ2的siRNA在制备用于治疗APLAID的药物中的应用。所述靶向PLCγ2的siRNA的序列为：
si-PLCG2-F：5’-GCAUGACUUCCAGAGGUUUTT-3’；
si-PLCG2-R：5’-AAACCUCUGGAAGUCAUGCTT-3’。
对照组序列为：
si-NC-F：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
si-NC-R：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
实施例一
1、PLCγ2p.Leu845Ser突变导致巨噬细胞明显浸润
此前，我们发现了一名患有PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的APLAID患者，他表现出严重的IBD。我们收集了患者受损的肠组织和外周血，分别进行了病理和免疫细胞分析。血常规检查结果显示单核细胞显著升高，中性粒细胞略有增加(图1A)。同时，对患者炎症性肠组织的病理检查显示，巨噬细胞(CD68+)和少量中性粒细胞(MPO+)大量存在(图1B)。与这一发现一致，PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠外周血单核细胞的数量和比例显著增加(图1D)。随后的组织病理学检查(HE)实验证实，PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠在耳朵中显示出明显的炎症表现(图1E)，并伴有炎症部位巨噬细胞(F4/80+)的广泛浸润(图1E)。免疫荧光分析进一步显示，PLCγ2主要在APAID患者和小鼠炎症组织浸润的巨噬细胞中表达(图1C和图1F)。
这些发现表明，PLCγ2高表达的巨噬细胞可能在与APLAID相关的IBD的发展中起着至关重要的作用。此外，我们检测了16名临床诊断为溃疡性结肠炎或克罗恩病的IBD患者的肠组织样本中PLCγ2的表达。值得注意的是，我们发现9名患者的肠组织中PLCγ2表达显著阳性(图8A)，进一步表明PLCγ2高表达与IBD的发生之间存在相关性。
2、PLCγ2p.Leu845Ser突变激活巨噬细胞中的IFNβ通路
为了研究巨噬细胞在APLAID中的作用，我们建立了稳定表达PLCγ2p.Leu845Ser的THP1细胞(命名为THP1mut)和对照细胞(命名为了THP1nc)。首先，我们进行了转录组测序，以分析THP1mut和THP1nc细胞之间差异表达的基因。转录组测序结果显示，THP1mut细胞中各种炎症因子(包括CXCL10、CCL2、TNFSF10和CSF1)显著上调(图2A)。差异表达基因的途径富集分析表明，I型干扰素途径显著富集(图2B)。此外，qPCR实验证实了THP1mut细胞中I型干扰素相关基因，如ISG15、STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10的显著上调(图2C-2G)。
广泛的研究表明，I型干扰素通过激活JAK/STAT信号通路来增强炎症因子的表达。为了评估JAK/STAT通路在THP1mut细胞中的激活状态，我们进行了蛋白质印迹(Wb)，发现THP1mut细胞中STAT1和STAT2的表达和磷酸化水平明显强于THP1nc细胞(图2H)。鉴于I型干扰素主要由IFNα和IFNβ组成，为了确定哪一种负责激活I型干扰素途径，我们进行了ELISA测定，观察到THP1mut细胞中IFNβ的分泌增加了十倍，而IFNα的分泌没有显著变化(图2I-2J)。
我们进一步研究了携带PLCγ2p.Leu845Ser突变的APLAID患者外周血单个核细胞中IFNβ途径的激活状态。qPCR结果显示，与健康对照组相比，APLAID患者外周血单个核细胞中IFNβ、ISG15、STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10等I型干扰素相关基因的表达增加(图2K-2P)。Wb结果表明，APLAID患者外周血单个核细胞中STAT1和STAT2的表达和磷酸化水平增加(图2Q)。IHC实验表明，APLAID患者病变肠组织中IFNβ、P-STAT1和ISG15的表达呈显著阳性(图2R)。此外，我们检测了另外16名临床诊断为IBD的患者肠道组织中IFNβ的表达。我们发现，在9例PLCγ2阳性的IBD患者中，8例同时呈现IFNβ阳性(图8B)，这进一步验证了PLCγ2和IFNβ之间的调节关系。
此外，我们证实了PLCγ2p.Leu845ser突变小鼠中IFNβ信号通路的激活状态。同样，我们观察到PLCγ2突变小鼠的PBMCs中IFNβ和IFNβ途径激活相关基因STAT1、STAT2、ISG15、CXCL10和TNFSF10的表达显著增加(图2S-2X)。Wb的结果表明，PLCγ2突变小鼠的PBMCs中STAT1的表达和磷酸化显著增强(图2Y)。IHC实验进一步证实，在PLCγ2突变小鼠的炎症组织中，IFNβ、P-STAT1和ISG15呈显著阳性表达(图2Z)。总之，这些发现表明，由PLCγ2p.Leu845Ser突变驱动的巨噬细胞中IFNβ通路的激活可能在PLCγ2突变相关APLAID的发展中起重要作用。
3、突变PLCγ2促进巨噬细胞中IFNβ的表达
为了进一步证实PLCγ2p.Leu845Ser突变可导致巨噬细胞中IFNβ的上调和I型干扰素途径的激活，我们最初利用两种PLCγ2siRNA来敲低THP1mut细胞中PLCγ2的表达。qPCR和ELISA检测表明，PLCγ2敲低导致IFNβ和与I型干扰素途径相关的基因显著下调，包括STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10(图3A-3F)。双荧光素酶报告基因检测表明，降低PLCγ2的表达可以显著抑制IFNβ启动子的荧光素酶活性(图3G)。Wb分析表明，PLCγ2敲低显著降低了THP1mut细胞中STAT1和STAT2的表达和磷酸化(图3H)。
我们进一步研究了通过I型干扰素抑制剂Anifrolumab和JAK/STAT途径抑制剂Upadacitinib抑制I型干扰素途径对PLCγ2突变巨噬细胞的影响。qPCR实验结果表明，Anifrolumab和Upadacitinib均显著逆转了PLCγ2突变巨噬细胞中STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10的上调(图3I-3P)。Wb分析显示，Anifrolumab和Upadacitinib显著抑制了THP1mut细胞中STAT1和STAT2的表达和磷酸化水平(图3Q-3R)。
汉黄芩素已被报道可阻断PLCG2/PKC信号通路。在这里，我们进一步测试了汉黄芩素对PLCγ2p.Leu845Ser突变巨噬细胞的影响。我们的研究结果显示，汉黄芩素可显著抑制STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10的mRNA表达；此外，STAT1和STAT2的磷酸化也受到显著抑制(图9)。
4、PLCγ2突变巨噬细胞通过上调IFNβ抑制肠上皮细胞增殖
大量研究表明，I型干扰素是一种具有抗病毒、抗增殖和免疫调节特性的多功能细胞因子。为了探讨携带PLCγ2p.Leu845Ser突变的巨噬细胞中IFNβ升高对肠组织的影响，将人正常肠上皮细胞NCM460暴露于30％的THP1nc细胞或THP1mut细胞上清液中，并将含有10ng/mL重组人IFNβ的完全培养基作为阳性对照。我们最初对用上述条件处理的NCM460细胞进行了转录组测序。差异表达基因的途径富集分析强调了与细胞增殖和I型干扰素信号传导相关的途径的显著富集(图4A-4C)。CCK8和EDU细胞增殖试验表明，与用THP1nc培养上清液处理的NCM460细胞相比，用THP1mut培养上清液或10ng/mL重组人IFNβ处理的NCM4 60细胞的增殖活性显著降低(图4D和图4F-4G)。我们进一步的研究表明，使用siRNA敲低THP1mut细胞中PLCγ2的表达显著逆转了THP1muts培养上清液对NCM460细胞的抑制作用(图4E和图4H-4I)。
大量文献表明，不仅I型干扰素可以抑制细胞增殖，而且由I型干扰素途径激活产生的各种炎症因子，如CXCL10和TNFSF10，也可以显著抑制细胞增殖。为了进一步验证参与I型干扰素信号通路激活的炎症因子对肠上皮细胞增殖的抑制作用，我们用I型干扰素抑制剂Anifrolumab和JAK/STAT通路抑制剂Upadacitinib预处理THP1mut细胞，然后收集培养上清液处理NCM460细胞。CCK8和EdU细胞增殖试验表明，Anifrolumab和Upadacitinib都可以显著逆转THP1mut细胞对NCM460细胞的增殖抑制作用(图4J-4O)。这些发现表明，PLCγ2p.Leu845Ser突变诱导的I型干扰素途径的激活在PLCγ2突变相关IBD的发病机制中起着关键作用，主要是通过抑制肠上皮细胞的增殖。
5、突变PLCγ2通过增加IRF5转录活性上调IFNβ
为了进一步阐明PLCγ2p.Leu845Ser突变诱导IFNβ上调的分子机制，我们使用flag抗体对表达flag PLCγ2(p.Leu845Ser)的THP1mut细胞的蛋白裂解物进行共免疫沉淀(Co-IP)实验。对从Co-IP实验中获得的蛋白质复合物进行质谱和途径富集分析。结果表明，PLCγ2(p.Leu845Ser)蛋白复合物含有许多参与免疫调节的蛋白质，其中I型干扰素调节基因IRF5的丰度很高(图5A-5C)。该基因已被证明参与I型干扰素的转录调控。Wb实验还证实，IRF5是PLCγ2(p.Leu845Ser)蛋白复合物的一个成分(图5D)。同样，使用用于Co-IP的IRF5抗体获得的蛋白质复合物可以特异性检测PLCγ2(图5D)。此外，激光共聚焦成像清楚地显示了PLCγ2与IRF5的共定位，表达p.Leu845Ser突变的PLCγ2的巨噬细胞表现出PLCγ2/IRF5复合物的增强核定位(图5E)。
此外，我们在293T细胞中同时过表达IRF5以及野生型或p.Leu845Ser突变的PLCγ2。通过Co-IP实验和激光共聚焦成像，我们进一步证实p.Leu845Ser突变的PLCγ2对IRF5的结合能力增强，PLCγ2/IRF5复合物的核定位增加(图5F-5G)。此外，我们采用细胞质和核分级技术来评估PLCγ2和IRF5在细胞质和核区室之间的分布。Wb结果表明，与过表达野生型PLCγ2的293T细胞相比，过表达p.Leu845Ser突变的PLCγ2细胞的细胞核中PLCγ2和IRF5水平显著升高(图5H)。最终，我们的研究使用IRF5抑制剂YE6144治疗THP1mut细胞和过表达PLCγ2(p.Leu845Ser)/IRF5的293T细胞。激光共聚焦成像结果显示，YE6144对PLCγ2/IRF5复合物的核定位表现出明显的抑制作用(图5I-5J)。这些数据表明，PLCγ2p.Leu845Ser突变引起的IRF5核转位的增加可能在驱动IFNβ转录上调方面发挥重要作用。
6、IRF5的功能抑制抑制IFNβ的转录和生物学功能。
p.Leu845Ser突变的PLCγ2通过促进IRF5核转位来增强IFNβ转录的假设，我们最初使用IRF5抑制剂YE6144来抑制IRF5的功能，进行了qPCR和双荧光素酶报告分析来评估IRF5抑制对IFNβ翻译的影响。我们的研究结果表明，在IRF5功能抑制后，IFNβ的表达和启动子活性均显著降低(图6A-6C)。此外，还研究了YE6144对JAK/STATs通路激活的影响。qPCR检测表明，YE6144显著抑制了THP1mut巨噬细胞中STAT1、STAT2、CXCL10和TNFSF10等多种炎症因子的表达(图6D-6G)。与此一致的是，Wb实验进一步证明YE6144显著抑制STAT1和STAT2的表达和磷酸化(图6H)。此外，EDU染色和CCK8细胞增殖试验均表明，用YE6144处理的THP1mut巨噬细胞上清液对NCM460细胞增殖的抑制作用显著降低(图6I-6N)。总之，这些数据表明，IRF5/IFNβ调节轴可以作为PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的APLAID个体的治疗靶点。
7、靶向IFNβ信号通路可显著改善PLCγ2突变小鼠的炎症表型。
为了阐明I型干扰素通路是否可以作为携带PLCγ2p.Leu845Ser突变的APLAID个体的潜在治疗靶点，我们评估了IFNAR拮抗剂Anifrolumab对APLAID小鼠的治疗效果。全血细胞计数结果表明，与未治疗的小鼠相比，用Anifrolumab治疗的突变小鼠的单核细胞数量和比率显著降低(图7A)。组织病理学检查(HE)结果表明，Anifrolumab显著改善了APLAID小鼠耳朵病变区域的炎性细胞浸润(图7B)。Wb分析表明，Anifrolumab显著降低了APLAID小鼠炎症组织中STAT1蛋白的表达和磷酸化(图7C)。与此一致，IHC实验还表明，接受Anifrolumab治疗的小鼠炎症组织中磷酸化STAT1的水平显著降低(图7D)。此外，激光共聚焦成像显示，Anifrolumab治疗的APLAID小鼠炎症组织中F4/80阳性巨噬细胞的数量显著减少，PLCγ2的表达显著降低(图7H)。qPCR检测显示，Anifrolumab显著抑制了APLAID小鼠炎症组织中IFNβ通路相关基因如STAT1、TNFSF10、CXCL10和ISG15的表达(图7F-7I)。总之，这些发现表明，Anifrolumab可以通过抑制I型干扰素途径有效减轻PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的APLAID小鼠的炎症反应并改善其病理状况。
本发明基于PLCγ2(p.Leu845Ser)突变导致的APLAID患者的病理特征，通过建立PLCγ2突变细胞模型和小鼠模型，对PLCγ2p.Leu845Ser突变APLAID发病机制的分子机制进行了全面研究。我们的主要发现如下：
1、我们首次揭示了PLCγ2(p.Leu845Ser)突变引起APLAID的发生与巨噬细胞中IFNβ途径的激活密切相关。
2、PLCγ2(p.Leu845Ser)突变通过增强IFNβ与IRF5的结合和促进IRF5核转位来促进IFNβ的表达，IRF5的功能抑制可以显著逆转PLCγ2突变巨噬细胞的炎症表型。
3、我们的实验首次表明，美国食品药品监督管理局批准的1型干扰素受体抗体药物Anifrolumab可以显著逆转APLAID小鼠的炎症表型，为PLCγ2(p.Leu845Ser)突变导致的APLAID个体提供了一种有效的治疗策略。
尽管全球已有多例由PLCγ2基因突变导致的APLAID病例的报道，但大多数APLAID患者都会出现典型的多器官炎症性病变，如皮肤炎症和炎症性肠病(IBD)。然而，PLCγ2与IBD发生之间的关系尚未见报道。在这项研究中，我们首次使用IHC分析了16名IBD患者患病肠组织中PLCγ2的表达，发现约60％的IBD患者的患病肠组织PLCγ2呈阳性(图8A)。因此，我们的研究初步揭示了PLCγ2与IBD发生之间的相关性。
PLCγ2突变导致的APLAID病例报告显示，APLAID患者外周血中性粒细胞和单核细胞的比例显著增加。Seth L.Masters等人利用小鼠模型研究了PLCγ2p.Ser707Tyr突变导致的APLAID的分子机制。他们的病理结果表明，中性粒细胞是PLCγ2p.Ser707Tyr突变小鼠PAWS、耳朵和脾脏中存在的主要炎性细胞，而巨噬细胞仅局限于脾脏。不幸的是，这一观察结果在携带PLCγ2p.Ser707Tyr突变的APLAID患者的炎症组织中没有得到证实。他们的分子机制研究表明，外周血中G-CSF的升高是PLCγ2p.Ser707Tyr突变个体引发自身炎症性疾病的主要原因。相比之下，我们观察到PLCγ2p.Leu845Ser突变患者和小鼠外周血中单核细胞的绝对数量和比例均显著增加，而中性粒细胞水平保持不变。此外，对PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的APLAID患者和小鼠的炎症组织的病理分析表明，巨噬细胞是主要的炎性细胞，而中性粒细胞在炎症组织中的定位较弱。此外，我们的机制研究表明，巨噬细胞中IFNβ信号通路的异常激活在PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的APLAID的发病机制中起着至关重要的作用。总的来说，我们的研究为巨噬细胞在PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的APLAID中的作用提供了新的见解，并确定上调的IFNβ是关键驱动因素。
大量研究表明，IFNβ的转录调控是一个涉及多种转录因子和信号通路的复杂过程，包括I型干扰素调节因子IRF3、IRF7、IRF5、TLR和NF-κB。我们采用免疫沉淀和质谱技术分析了与p.Leu845Ser突变的PLCγ2特异性结合的蛋白质。与之前的研究一致，我们发现p.Leu845Ser突变的PLCγ2可以结合多种I型干扰素相关转录因子，包括IRF5、IRF3和NF-κB，其中IRF5最丰富(图5A-5C)。功能实验表明，IRF5抑制剂显著逆转了PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的IFNβ转录上调和下游炎症途径的激活。据我们所知，我们的研究首次揭示了p.Leu845Ser突变的PLCγ2通过增强其与IRF5的结合和促进IRF5核转位来促进IFNβ的上调，并首次表明IRF5/IFNβ调节轴可以作为PLCγ2p.Leu845Ser突变体APLAID的潜在治疗靶点。
由于发病机制的分子机制尚不清楚，PLCγ2突变导致的APLAID个体缺乏精确的治疗药物。针对APLAID的临床治疗药物主要包括糖皮质激素、环孢菌素、他克莫司等免疫抑制剂和英夫利昔单抗等少数生物制剂，这些药物难以维持疾病的长期缓解。基于我们的研究结果，我们测试了1型干扰素受体抑制剂Anifrolumab对PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠的治疗效果，我们发现Anifralumab显著抑制了APLAID小鼠的炎症症状。在这里，我们的研究首次表明，美国食品药品监督管理局批准的治疗系统性红斑狼疮(SLE)的药物Anifrolumab是PLCγ2p.Leu845Ser突变导致的APLAID个体的潜在治疗剂。此外，考虑到PLCγ2功能获得性突变会导致DAG的过度释放，从而导致炎症途径的异常激活，研究表明，中草药提取物汉黄芩素可以抑制DAG的产生。在此基础上，我们测试了汉黄芩素在PLCγ2p.Leu845Ser突变细胞中的作用。我们的结果表明，汉黄芩素可以显著抑制PLCγ2p.Leu845Ser突变巨噬细胞中炎症因子的表达和STAT1通路的激活(图9)。这表明，基于汉黄芩素的药物也可能成为PLCγ2p.Leu845Ser突变体APLAID的潜在治疗剂。
实验材料及方法
本发明所使用试剂的详细信息如表1所示，本发明所使用的引物序列如表2所示。
表1本发明所使用的试剂的详细信息
表2本发明所使用的引物序列
细胞培养：THP1、NCM460、293T和MCF7细胞系购自中国苏州Hysigen Biosciences。THP1、NCM460和MCF7细胞在添加了10％FBS的RPMI 1640培养基中培养，而293T细胞在添加10％FBS的DMEM培养基中培育。所有细胞均在5％CO2、37℃的环境中培养。实验中使用的试剂列于表1中。
慢病毒与稳定的细胞系生成：表达p.Leu845Ser突变体PLCγ2的THP1mut细胞系和THP1nc细胞系由中国广州迅迅生物医药科技有限公司构建。表达p.Leu845Ser突变体PLCγ2或野生型PLCγ2的慢病毒购自广州ICE生物技术公司。广州ICE生物技术有限公司构建了包括pcDNA3.1-PLCγ2、pcDNA3.1-BLCγ2(p.Leu845Ser)、pcDNA3.1-IRF5、pcDNA 3.1载体、pGL3basic IFNβ启动子在内的质粒。
巨噬细胞极化：THP1-mut和THP1-nc细胞以每孔1x106个细胞的密度在6孔板中培养。用100ng/mL PMA诱导24小时后，获得M0巨噬细胞，再加入含有100ng/mL LPS的新鲜361培养基24小时，获得M1巨噬细胞。
药物治疗：分别使用10μM或50μM汉黄芩素、500nM Upadacitinib和18μg抗IFNAR1治疗M0巨噬细胞24小时。1μMYE6144用于治疗M0和M1巨噬细胞以及293T细胞。
人外周血单个核细胞分离：分别从健康个体和患者采集外周血(10mL)，并按照操作说明使用人单核细胞分离试剂盒获得PBMC。试剂的详细信息如表1所示。
siRNA干扰：PLCγ2siRNA由上海基因制药设计合成。转染前24小时，THP1 mut M0巨噬细胞在6孔板中以每孔8x105个细胞的密度培养。使用RNAiMAX转染siRNA并将细胞再培养48小时，然后收集上清液并提取RNA和蛋白质。转染试剂的详细信息如表1所示。siRNA序列列于表2中。
共培养实验：在共培养前24小时，NCM460细胞在6孔板中以每孔5x105个细胞的密度培养。第二天，将THP1mut或THP1nc巨噬细胞的细胞上清液以30％的比例加入NCM460细胞中，以1μg/mL IFNβ作为阳性对照。将细胞再培养48小时，然后收获用于细胞增殖检测和转录组测序。
CCK8测定：使用CCK-8试剂盒分析细胞增殖活性。简而言之，将CCK8溶液以1:10的体积比加入细胞培养基中，在37℃下孵育1小时，使用微孔板读数器在450nm处读取吸光度。每种细胞类型都进行了三次测试。CCK8试剂盒的详细信息见表1。
Edu测定：根据BeyoClickTMEdU-488操作说明，细胞与EdU一起孵育2小时。随后，进行了固定和渗透。最后，用DAPI对细胞核进行染色，并捕获荧光显微镜图像。为每组细胞设置三个复制孔，并计算EdU阳性细胞的比例。BeyoClickTMEdU-488试剂盒392的详细信息如表1所示。
RNA提取和qPCR检测：RNA纯化试剂盒用于从细胞和组织样本中提取总RNA，并使用NanoDrop测量RNA浓度。使用Color逆转录试剂盒将1μg RNA逆转录为cDNA。qPCR试剂用于检测靶基因的表达水平，与β-actin作为对照基因相比，使用2-ΔΔCt法进行评估。靶基因的引物序列列于表2中。
Co-IP试验：使用PierceTMIP裂解缓冲液提取总细胞蛋白。将Flag和IRF5 IP特异性抗体与蛋白质裂解缓冲液以1:50的比例混合，并在4℃下孵育过夜。使用G蛋白磁珠获得相应的蛋白质复合物，然后将蛋白质复合物用于蛋白质谱检测和蛋白质印迹检测。Co-IP试剂的详细信息如表1所示。
双荧光素酶报告检测：广州ICE生物技术公司设计并构建了IFNβ启动子表达载体pGL3basic IFNβ和pcDNA3.1-IRF5过表达载体。MCF7细胞在6孔板中培养，用PLCγ2siRNA处理48小时。使用lipo3000将1μg pGL3-IFNβ和0.1μg pRL-TK转染到siRNA处理和未处理的MCF7细胞中。未经处理的细胞在没有1μM IRF5抑制剂YE6144的情况下处理48小时。然后，根据双荧光素酶报告试剂盒的说明进行双荧光酶报告试剂盒测定。使用Victor Nivo多功能酶标仪读取萤火虫和肾菌的荧光值。
细胞质核分离实验：将5μg pcDNA3.1-PLCγ2或pcDNA3.1-BLCγ2(p.Leu845Ser)过表达载体分别与5μg的pcDNA3.1-IRF5过表达载体同时转染293T细胞。48小时后，按照核和细胞质蛋白提取试剂盒的说明提取细胞质和核蛋白。核和细胞质蛋白提取试剂盒的详细信息如表1所示。
蛋白质印迹：使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从细胞和小鼠组织中提取蛋白质。使用增强型BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白质浓度。将蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，并转移到PVDF膜上。在TBST中用5％的脱脂乳阻断后，将包括STAT1、STAT2、pSTAT1、pSTAT2、PLCγ2、IRF5和GAPDH在内的一抗在4℃下以1：1000的比例孵育过夜随后，将膜与山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG以1：2500的比例在室温下孵育1小时，最后获取图像。抗体的详细信息见表1。
HE染色：患者和小鼠的组织用4％多聚甲醛固定三天，并制备石蜡切片。所有组织切片均按照苏木精和伊红染色试剂盒方法脱蜡并用苏木精和伊红染色，然后在摄影前进行梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性胶密封。苏木精和曙红染色试剂盒的详细信息见表1。
免疫组织化学：根据SABC免疫组织化学试剂盒的说明，按照SABC免疫组化试剂盒(小鼠/兔)的方案，组织切片经历了脱蜡、EDTA抗原回收、H2O2消除内源性过氧化物酶和5％BSA阻断的顺序过程。包括IFNβ、pSTAT1、PLCγ2、IRF5、F4/80、CD68和MPO在内的抗体以1:200的比例稀释(稀释剂：5％BSA)，并在4℃下孵育过夜。随后，将生物素标记的山羊抗小鼠/兔IgG在37℃下孵育30分钟，然后在37℃下孵育SABC 30分钟。DAB染色后，苏木精复染、脱水、清洁、贴装，最后拍照。抗体和SABC试剂盒的详细信息见表1。
激光共焦成像：对于THP1和293T细胞样品，最初，将受试细胞铺在载玻片上。随后，它们依次用4％多聚甲醛固定15分钟，用0.3％Triton X-100渗透10分钟，用5％BSA封闭，在4℃下与第一抗体溶液一起孵育过夜，在室温下与第二抗体溶液一起温育30分钟。最后，用含DAPI的密封试剂密封。对于组织样本，在进行抗原修复、消除内源性过氧化物酶并用5％BSA阻断后，将其与上述制备的第一和第二抗体溶液一起孵育，然后用含DAPI的密封试剂密封。使用Leica Stellaris5激光共聚焦显微镜对密封后的细胞和组织切片进行成像。
PLCγ2和IRF5(sc-56714)抗体与3％BSA溶液以1：200的体积比混合，用作第一抗体反应溶液。将山羊抗小鼠IgG-488和山羊抗兔IgG-594与3％BSA溶液以1：500的体积比混合，用作二次抗体反应溶液。表1列出了抗体的详细信息。
酶联免疫吸附试验：使用人干扰素αELISA试剂盒和人干扰素βELISA试剂盒检测收集的上清液中干扰素α和干扰素β的含量。每个样本测试三次，使用标准曲线计算IFNα和IFNβ的浓度。ELISA试剂盒的详细信息列于表1中。
动物实验：F0代PLCγ2p.Leu845Ser突变小鼠由上海模式生物中心构建，SPF级C57BL/6小鼠购自广东省医学实验动物中心。所有小鼠都饲养在SPF级环境中。将7周龄的雄性F0代基因突变小鼠与同龄的雌性C57BL/6小鼠交配，获得F1代基因突变的小鼠。在3周龄时，通过腹腔注射30μg抗IFNAR1治疗F1代基因突变小鼠，连续5天给药。其他F1代基因突变小鼠和同龄的C57BL/6小鼠注射了相同体积的PBS作为对照。在小鼠达到5周龄后，从眼球中采集血液进行常规血液分析。对小鼠的组织样本进行免疫组织化学、共聚焦激光扫描检测、蛋白质印迹和qPCR分析。所有动物实验均获得广东医科大学生命科学伦理审查委员会的伦理批准。
统计分析：使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析，对所有实验进行学生t检验。统计学意义定义为P<0.05。显著性水平如下：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，***表示P<0.0001。ns用于表示没有统计学上的显著差异。
稳定表达PLCγ2p.Leu845Ser的THP1细胞构建方法：合成PLCG2点突变基因载体，交由广州艾基生物技术有限公司构建慢病毒，在此基础上感染THP1细胞，通过添加嘌呤霉素筛选获得THP1-Mut(p.Leu845Ser)细胞系。
一、通过基因合成的方法合成PLCG2(2534T>C)的基因，采用限制性内切酶分别酶切合成的PCG2基因以及pCDH-CMV慢病毒载体，通过T4DNA酶连接，获得pCDH-CMV-PLCG2-845-3xFLAG-EF1-puro质粒。采用核酸凝胶电泳对质粒进行检测；
二、对构建的质粒进行测序，并进行慢病毒包装
1、细胞准备
1)第一天，复苏一管293T细胞；
2)第二天，复苏的细胞进行换液；
3)第三天，293T细胞按照2.0x106cell/T75进行传代；
4)第五天，293T细胞按照4.5x106的细胞密度接种细胞至直径10cm培养皿中；
2、慢病毒包装
1)转导当天，观察细胞能否包装病毒。主要观察的指标是：细胞是否接种均匀，细胞的密度是否达到80％～90％。若细胞的状态合适，则去除293T细胞中的培养液，加入10ml病毒包装用培养液；
注：避免细胞脱壁，培养液应沿壁加新鲜入培养液。
2)准备DNA-转染试剂复合物:
A、准备一个15mL离心管中加入无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒混合物(PSPAX2和PMD2G)和慢病毒表达质粒，充分振荡混匀；
B、准备另外一个15mL离心管，加入无血清Opti-MEM培养液和质粒转染试剂轻轻振荡混匀。
室温孵育10分钟；
C、10分钟后，把含有质粒DNA的无血清Opti-MEM培养液加入到含质粒转染试剂的无血清Opti-MEM培养液，轻轻振荡混匀，室温孵育10-15分钟；
3)把DNA复合物加到293T细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养；
4)转导4-6小时后更换新鲜培养基，放置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
3、收集和浓缩病毒
1)转导后48小时，收集含有病毒的培养液上清至50mL离心管中；
2)4℃、1500xg离心4分钟，去除细胞碎片，回收上清；
3)将离心后的病毒上清液用0.45μM的滤器过滤至50mL离心管；
4)根据滤液体积加入对应量的PEG浓缩液。充分均匀混合液，静置放置于4℃沉淀过夜；
5)次日4℃、1500xg离心30分钟后倒掉上清；
6)用移液枪吸除多余上清，然后用1mL的HBSS重悬病毒沉淀，用枪头缓慢而充分地吹打沉淀至单个病毒悬液；按照规定的病毒液分装到冻存管中，放置-80℃保存。
三、病毒滴度检测
1、病毒感染
1)第一天，按1.5x105个细胞每孔接种12孔板；
2)第二天，观察细胞状态和密度情况，然后更换培养基并加入Polybrene(终浓度为5ug/mL)；
3)按一定量项目病毒加入对应孔的细胞中；
4)混匀后放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，4-6h后观察细胞情况并换液；
5)感染48h后将细胞进行拍照记录，并收集细胞进行DNA抽提；
2、DNA抽提
1)吸去细胞培养液，用1xPBS洗涤细胞2-3次，以去除残留的血清，加入适量Trypsi-EDTA，室温放置5分钟后反复吹打细胞，将细胞移入一个1.5mL的EP管。
2)离心，去除上清；
3)用350uL ElutionBufcr重悬细胞，然后加入等体积的AVL溶液裂解细胞；
4)加入20uL proteinasK充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心出除管壁内水珠；
5)加入350uL无水乙醇，充分震荡混匀15s；
6)吸取混合液加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液；
7)向离心柱中加入600uL的Wash1，8000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液；
8)向离心柱中加入600uL的Wash2，8000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液；
9)12000rpm空离心3min，使吸附膜完全变干；
10)将离心柱放置到新的1.5mLEP管上，向离心柱中央加入50uL的ElutionBufcr水，盖上盖子，室温放置3min；
11)12000rpm离心2min，将所得的DNA放置-20℃保存；
3、qPCR
1)反应体系：2×Ipure SYBR Green Qper Master Mix：10μL、10μM上游引物：1.0μL、10μM下游引物：1.0μL、样品溶液2.0μL、ddH2O 6.0μL，总体积20.0μL。
2)反应条件：A、预变性95℃10min；B、循环过程使用三步法扩增：95℃变性15s、57℃退火20s、65℃延伸30s，40个循环；C、溶解曲线：95℃，15s；60℃，60s；95℃，1s。
四、THP1-PLCG2(845)稳转细胞系的构建
试验开始前，将THP1细胞培养于96孔细胞培养板中，使每孔细胞数量为10000个。次日取细胞按照每孔加病毒量(μL)＝MOIx细胞数/病毒滴度(TU/mL)×1000公式分别将pCDH-CMV-3xFLAG-EF1-puro及pCDH-CMV-PLCG2-845-3xFLAG-EF1-puro与THP1细胞混合，在37℃孵育30min后，经过1000rpm离心10min，弃去上清液，将细胞培养于96孔板中，24h后，添加嘌呤霉素筛选，使每孔中嘌呤霉素的终浓度为1μg/mL，继续培养细胞96h后，细胞经过1000rpm离心10min后，再次使用嘌呤霉素筛选。经过10代筛选后，使用Western-blot进行鉴定。
PLCG2突变小鼠模型的构建：采用CRISPR/Cas9技术建立knockin小鼠。该技术为通过设计针对目的基因的guide RNA引导Cas9核酸酶对插入位置的基因组进行修饰,从而造成该基因修饰区域同源重组效率增加,将目的片段同源重组到目的位点。该技术制备基因敲入小鼠的路线如下：
1、设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列,并根据序列将其进行体外转录获得针对该基因的guideRNA；
2、构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒；
3、将体外转录的guideRNA及donor DNA重组质粒进行受精卵注射，获得F0代小鼠；
4、通过PCR及测序的办法对获得的F0代小鼠进行基因型鉴定；
5、F0代小鼠与WT小鼠繁殖,获得阳性F1代杂合子小鼠；
6、将6-8周龄阳性F1代小鼠进行交付。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.靶向IFNβ信号通路的抑制剂在制备用于治疗APLAID的药物中的应用，其特征在于：所述靶向IFNβ信号通路的抑制剂为Anifrolumab。
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