CN120058982A - 香菇来源免疫刺激剂及衍生物及dc疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种香菇来源免疫刺激剂及衍生物及DC疫苗及制备方法，提出了一种香菇来源免疫刺激剂的制备方法，该方法包括提纯、羧化等环节，提取出的羧甲基‑β‑葡聚糖经过实验验证可作为免疫刺激剂使用。不但如此，基于该方法提取出的香菇来源免疫刺激剂可以经过改良、加工后仍然具有强免疫活性，可以应对各种环境。与此同时，本发明还开发出一种香菇来源免疫刺激剂衍生物，在刺激APC细胞的同时还包含肿瘤抗原，更加有利于APC的肿瘤抗原呈递功能。

Description

香菇来源免疫刺激剂及衍生物及DC疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及免疫刺激剂领域，特别涉及一种香菇来源免疫刺激剂及衍生物及DC疫苗及制备方法。

背景技术

从传统中医时代以来，真菌一直是重要的药物前体来源。随着各类天然药物的萃取技术的进步及其有效成分的明确，真菌衍生产物已被证实可通过免疫、代谢等多个途径发挥抗炎、抗肿瘤的重要作用。

时至今日，真菌及其衍生物已成为食品和制药行业的重要组成部分，而其中尤其受关注的一类成分是β-葡聚糖，β-葡聚糖(β-Glucan，β-Glu)是组成真菌细胞壁基本骨架的主要成分，其在进化过程中相当保守，无论是结构简单的单细胞真菌(如酵母)还是大型真菌(香菇)，β-葡聚糖都广泛存在于其细胞壁结构之中。这些保守分子可作为病原体相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern，PAMP)发挥作用，哺乳动物先天免疫系统可将其有效识别为非自身分子，并帮助消除微生物病原体。β-葡聚糖的特异性受体是Toll样受体(TLR)和C型凝集素样受体：在后者中，dectin-1是表征最好的受体，主要在单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和自然杀伤(NK)细胞表面表达。细胞内信号转导遵循受体识别步骤，导致活化B细胞核因子k轻链增强子(nuclear factor k-light-chain-enhancer，NF-kB)的激活、炎症免疫基因的转录、细胞因子、一氧化氮(nitric oxide，NO)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生。

β-葡聚糖还可以调炎性IL-2和IL-11，并在病毒攻击后上调了IFN-1和IFN-γ，因此，β-葡聚糖也被应用于制备SARS和COVID-19等病毒的疫苗。β-葡聚糖作为食物或补充剂摄入后在没有任何胃消化的情况下到达小肠；它们被肠上皮细胞和/或巨噬细胞内化，并呈递给佩耶氏斑内的免疫细胞和远端淋巴器官。在淋巴节内β-葡聚糖刺激单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞，从而达到刺激机体免疫的作用。

且β-葡聚糖由于很好的安全性和刺激APC的特性，被应用于在了小分子药物的研发领域。一种自佐剂纳米疫苗(CPBG-Al@OVA)通过将氢氧化铝与β-1,3-葡聚糖官能化而构建，β-1,3-葡聚糖通过Dectin-1识别模式识别受体，从而起到准确、高效传递抗原的能力。羧甲基磷酸化β-1,3-葡聚糖(CPBG)已被合成并优化，以在保持水溶性的同时实现优异的佐剂性。后续该实验证明CPBG-Al@OVA在体内可以有效地引流到淋巴结，并发挥抗原呈递作用。

然而β-葡聚糖大都是通过葡萄糖1、3号位碳原子实现连接，但在β-葡聚糖的骨架上还可存在1,4或1,6连接的葡萄糖排列方式，这两种不同于1,3连接的排布方式，使得葡聚糖链的走行出现了偏倚：即形成偏离于1,3骨架的分支；而其中β-1,3-葡聚糖可以与APC细胞表面Dectin-1受体结合发挥免疫效能，因此各种真菌中β-1,3-葡聚糖的含量决定着免疫刺激能力的高低，常用的酵母中β葡聚糖的含量一般为5％-15％，且结构中1,3键少，并有大量的1,6键支链，因此其免疫效力大打折扣。

总而言之，β-葡聚糖在免疫调节及疾病方面具有十分广泛的应用，然而如何从合适的真菌中提取β-葡聚糖会直接影响到β-葡聚糖的后续研究和应用。

胶质瘤作为最常见的“脑癌”，在目前的主流治疗方案下(手术切除+术后放化疗+综合治疗手段)的预后效果不理想，其中位生存期也仅有14.6月，5年生存率仅为4.8％甚或更低。因此，新的治疗方式一直是国际上胶质瘤领域的研究热点。

树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是唯一可以诱导初始T细胞成熟的专职抗原呈递细胞(Antigen-Presenting Cell，APC)，DC的有效活化是各类不同形式的肿瘤疫苗产品实现有效记忆性免疫诱导的关键环节。不同于微生物疫苗，肿瘤疫苗具有抗原异源性弱以及免疫活化效能低的特点，因此在制备肿瘤疫苗的过程中，DC的激活有赖于外源性的佐剂的应用。佐剂主要有两方面作用：一是促进DC摄取疫苗制剂中的抗原成分；二是直接诱导DC向成熟表型转化，以便高效地向CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞进行抗原提呈，佐剂的这一功能依赖于人体固有免疫系统对异源性物质的识别，所以具有强烈外源信号的微生物成分常是佐剂开发的重要来源。

目前已有开发A2B5阳性细胞抗原装载至DC疫苗的案例，比如中国专利申请CN116496986A公开了一种靶向A2B5阳性肿瘤的树突状细胞，此方案在筛选出A2B5阳性细胞后，首先采用X光辐照肿瘤使其灭活(6Gy)，随后用研磨仪破坏了肿瘤细胞，此过程会损失一部分非水溶性抗原；其次此方案采用IFN-γ、LPS作为刺激DC疫苗成熟，LPS无法与DC细胞表面产生紧密链接，该疫苗静脉注射后LPS可能会播散到其他细胞，导致T细胞的“误伤”，严重时可能导致一系列自身免疫病。

CN101481677A公开了一种体外刺激树突状细胞成熟的方法，该方法从人源胶质瘤U87细胞系分离出肿瘤干细胞后，采用6Gy的剂量进行辐照，然后反复冻融得到肿瘤抗原，用来刺激DC细胞成熟。但是该方法反复冻融会丢失一部分水溶性抗原，无法像活细胞一样提供完全抗原。

区别于这些方案，β-葡聚糖可以作为免疫刺激剂用于DC疫苗的制备，目前也有开发β-葡聚糖作为疫苗佐剂的应用案例，如中国专利申请CN102600467A公开了利用可溶性β-葡聚糖在体外诱导DC冲击疫苗成熟的方法，但这一方案中未公布β-葡聚糖的制作过程，也未对“β-葡聚糖”的构型进行分析验证。

综上所述，目前市面上针对β-葡聚糖的制备及其在DC疫苗领域的应用的相关研究依旧存在空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香菇来源免疫刺激剂及衍生物及DC疫苗及制备方法，从香菇中提取β-葡聚糖得到可对APC细胞产生刺激的免疫刺激剂，基于该免疫刺激剂可制备可杀死肿瘤细胞以及刺激APC细胞的香菇来源免疫刺激剂衍生物，并基于香菇来源免疫刺激剂衍生物制备保全有A2B5阳性抗原的DC疫苗的佐剂，以刺激T细胞实现对胶质瘤肿瘤细胞的杀伤。

为实现以上目的，第一方面，本技术方案提供了一种香菇来源免疫刺激剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：提取香菇多糖：将香菇药材加入纯化水中在高温环境下进行提取得到提取液，将提取液冷却至室温环境后加入乙醇醇沉得到沉淀物，离心收集沉淀物后进行超滤处理得到香菇多糖；

S2：制备香菇来源免疫刺激剂：取香菇多糖悬浮于乙醇中并加入氯乙酸得到混合溶液，对混合溶液进行磁力搅拌后收集沉淀物，用乙醇清洗沉淀物后进行透析得到透析液，对透析液进行浓缩冻干制备得到香菇来源免疫刺激剂。

本方案制备的香菇来源免疫刺激剂为羧甲基-β-葡聚糖，香菇中的β-葡聚糖含量超过50％且大部分是β-1,3-葡聚糖，故本方案选择香菇作为真菌来源提取羧甲基-β-葡聚糖以作为免疫刺激剂，通过本方案提取出的羧甲基-β-葡聚糖经过实验验证可作为免疫刺激剂使用，关于本方案对香菇多糖进行羧甲基化处理得到香菇来源免疫刺激剂的反应式如下所示：

在“S1、提取香菇多糖”步骤中，称取香菇药材，提取2次，每次加入纯化水，100℃提取2h，将两次提取液合并浓缩，冷却至室温后加入乙醇醇沉，醇沉结束后离心收集沉淀物，加水充分溶解沉淀物后转移至陶瓷膜储罐，经50nm陶瓷膜超滤后收集透出液转移至卷式膜储罐，经PW卷式膜超滤，收集截留液浓缩冻干得香菇多糖。

在“制备香菇来源免疫刺激剂”步骤中，称取香菇多糖，悬浮于乙醇中，加入配以相同质量的氯乙酸，置于磁力搅拌器上反应2h，随后收集沉淀物，以乙醇清洗两次后获取沉淀物，取沉淀物加水溶解后以离心，上清装入透析袋中透析，收集透析液，浓缩冻干即得羧甲基β葡聚糖。

第二方面，本方案提供了香菇来源免疫刺激剂，根据上述香菇来源免疫刺激剂的制备方法制备得到，为提取自香菇的羧甲基-β-葡聚糖。

本申请人想要强调说明的是，虽然有研究报告了β-葡聚糖的生物学特性，特别是其抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用，但是现有技术β-葡聚糖相关的研究结论往往不一致甚至矛盾，因此β-葡聚糖对于人体的免疫刺激虽然是明确的，但是具体完整机制仍尚不明确，而本申请团队从香菇中提取β-葡聚糖得到香菇来源免疫刺激剂，并完整地探究其对人体的免疫刺激作用后发现香菇来源免疫刺激剂对APC有刺激作用。

在一些实施例中，通过上述方法合成的香菇来源免疫刺激剂用于对APC刺激，具体而言，该香菇来源免疫刺激剂单独应用可使得抗原提呈细胞向成熟表型转换，具有更强提呈抗原及激活初始T细胞的能力。

在一些实施例中，刺激APC的香菇来源免疫刺激剂的浓度为0～2000ug/ml，优选的，香菇来源免疫刺激剂的浓度为1000ug/ml。

另外，由于药物的溶解性、渗透性和稳定性较差，大量口服抗癌/胞嘧啶药物难以进入体循环发挥疗效，而本方案提供的香菇来源免疫刺激剂具有好的水溶性，且这种羧甲基-β-葡聚糖在非常低的浓度(1％)下也表现出高粘度，并且在很宽的pH值范围内都很稳定，这完美适配于胃肠道的pH环境，故本方案提取得到羧甲基-β-葡聚糖也有望作为主流的口服药物载体。

第三方面，本方案提供了香菇来源免疫刺激剂衍生物的制备方法，包括以下步骤：第一方面制备得到的香菇来源免疫刺激剂、BOP和三乙胺加入的溶解有多聚右旋赖氨酸的有机溶剂中反应一段时间后进行透析，冷冻干燥透析液得到香菇来源免疫刺激剂衍生物，其中香菇来源免疫刺激剂衍生物为β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸。

在一些实施例中，将多聚右旋赖氨酸溶解在DMSO中作为溶解有多聚右旋赖氨酸的有机溶剂，再将香菇来源免疫刺激剂、BOP和三乙胺加入的溶解有多聚右旋赖氨酸的有机溶剂中反应一段时间，将反应液装入透析袋用纯水透析后得透析液，浓缩冷冻干燥透析液得到β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸。

在具体实施例中，称取聚右旋赖氨酸溶解在DMSO中，加入羧甲基化葡聚糖、BOP和60mg三乙胺，40℃反应2h，装入到透析袋中透析(截留分子量30kDa)，纯水中透析24h，收集透析液冷冻干燥即得β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸。

更具体的，称取150mgε-聚右旋赖氨酸溶解在1.5mL DMSO中，加入250mg羧甲基化β葡聚糖、100mg BOP和60mg三乙胺，40℃反应2h，装入到透析袋中透析(截留分子量10kDa)，纯水中透析24h，收集透析液冷冻干燥即得产物103mg，即为β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸。

第四方面，本方案提供了香菇来源免疫刺激剂衍生物，根据第三方面提到的香菇来源免疫刺激剂衍生物的制备方法制备得到，香菇来源免疫刺激剂衍生物为β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸，由来源自香菇的羧甲基-β-葡聚糖和多聚右旋赖氨酸耦连而成。

在一些实施例中，香菇来源免疫刺激剂衍生物用于杀伤肿瘤细胞。具体的，本方案的香菇来源免疫刺激剂衍生物可粘附在肿瘤细胞表面，亦可增强抗原提呈细胞的提呈抗原能力和激活初始T细胞的能力。在一些实施例中，对应10⁶肿瘤细胞选择香菇来源免疫刺激剂衍生物的浓度小于1000μg/ml，优选的，对应10⁶肿瘤细胞选择香菇来源免疫刺激剂衍生物的浓度为500μg/ml。

第五方面，本方案提供了基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1：自人的外周血中分离PBMC；

S2：制备A2B5阳性胶质瘤细胞；

S3：在培养基中培养PBMC得到未成熟DC细胞，将A2B5阳性胶质瘤细胞和第四方面的香菇来源免疫刺激剂衍生物加入培养基中共培养得到成熟DC细胞作为DC疫苗。

香菇来源免疫刺激剂衍生物中的羧甲基-β-葡聚糖能够与树突状细胞的表面的Dectin-1受体结合，并触发树突细胞内一系列的信号传导通路以导致免疫细胞的激活和细胞因子的释放。对于DC细胞而言，羧甲基-β-葡聚糖激活DC细胞后，能够增强DC细胞的抗原提呈能力。在疫苗制备过程中，DC细胞的抗原提呈功能是关键环节，更好的抗原提呈能力意味着能够更有效地将肿瘤抗原(如A2B5阳性胶质瘤细胞抗原)呈递给T淋巴细胞，从而引发更强的抗肿瘤免疫反应。同时相较于其他来源的β-葡聚糖而言，香菇来源的羧甲基-β-葡聚糖在长期的饮食中被人体摄入以使得来自于香菇来源的羧甲基-β-葡聚糖在人体内有更好的安全性能。

关于未成熟DC细胞的获取：具体的，在步骤S3中，在培养基中培养PBMC一段时间后得到上清液，收集上清液内的贴壁细胞，并将贴壁细胞加入到1640培养基培养获得未成熟DC。

在一些实施例中，培养贴壁细胞的1640培养基内含有15％血清，100ng/ml rhGM-CSF、100ng/ml rhIL-4，并在1640培养基中培养5天得到未成熟DC。

而关于PBMC细胞的培养，收集的PBMC在1640培养基，在37℃、5％CO₂条件下在1640培养基内培养4h。

另外，步骤S3中，对应于1*10⁶A2B5阳性胶质瘤细胞，β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸的浓度小于1000μg/ml。本申请团队验证发现，在β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸的浓度大于1000μg/ml时，肿瘤细胞死亡数量明显增多，可推测β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸在超过此浓度时对正常细胞亦有杀伤，故本方案特别设定β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸的浓度小于1000μg/ml。

对应于1*10⁶A2B5阳性胶质瘤细胞，β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸的浓度为25、50、100、200、500、1000ug/ml。优选的，β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸的浓度为500ug/ml，在该浓度时β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸不会损失正常细胞，同时也能保证极大程度地促进未成熟的DC细胞成熟。

另外，本方案将A2B5阳性胶质瘤细胞和β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸加入培养基中置于37℃、5％CO₂条件下共培养1～48h得到成熟DC细胞作为DC疫苗。

关于PBMC的获取：

在步骤S1中，获取人的外周血于肝素抗凝管中并加入PBS按1：1稀释血液，在离淋巴细胞分离液上方沿试管壁徐徐加入稀释血液，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面,室温离心后小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞，加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min，得到PBMC。

在具体实施例中，取足5mL新鲜的外周血加入PBS按1：1稀释血液，并取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用，吸取稀释血液后在离淋巴细胞分离液上方1cm处沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上并与淋巴细胞分离液形成明显界面，室温，离心2000rpm，20min，此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状，小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞，加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

在步骤S2中，取消化及裂解胶质瘤组织并获得单细胞悬液，磁珠分选单细胞悬液，并用X射线辐照(25Gy 1min)A2B5阳性细胞，从而获得减毒的A2B5阳性细胞作为A2B5阳性胶质瘤细胞。

第六方面，本方案根据上述制备方法制备得到的基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗，对于胶质瘤细胞有杀伤作用。

相较现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果:

本方案提出了一种香菇来源免疫刺激剂的制备方法，该方法包括提纯、羧化等环节，提取出的羧甲基-β-葡聚糖经过实验验证可作为免疫刺激剂使用。不但如此，基于该方法提取出的香菇来源免疫刺激剂可以经过改良、加工后仍然具有强免疫活性，可以应对各种环境。与此同时，本发明还开发出一种香菇来源免疫刺激剂衍生物，在刺激APC细胞的同时还包含肿瘤抗原，更加有利于APC的肿瘤抗原呈递功能。

本方案选择香菇来源免疫刺激剂衍生物制作针对于胶质瘤肿瘤细胞的DC疫苗，其中香菇来源的羧甲基-β-葡聚糖可与DC细胞表面Dectin-1受体结合，激活DC细胞并增强其抗原提呈能力，有效将胶质瘤抗原呈递给T淋巴细胞，激发强烈的抗肿瘤免疫反应，直接作用于胶质瘤细胞，抑制其生长与扩散，从而对胶质瘤起到杀伤作用，为胶质瘤的治疗提供了一种创新且有潜力的免疫治疗途径。

另外，在细胞培养环节，PBMC的培养需在1640培养基中，于37℃、5％ CO₂条件下培养4小时，这一特定环境为PBMC的初期生长与稳定提供了适宜温床，保障细胞活性与后续分化的潜力，能够精准诱导PBMC向未成熟DC细胞分化，确保未成熟DC细胞具备良好的免疫调节基础功能；另外将A2B5阳性胶质瘤细胞和羧甲基-β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸加入培养基中，置于37℃、5％ CO₂条件下共培养1-48小时以获得成熟DC细胞作为DC疫苗，优选共培养48小时，在这个过程中，37℃的温度和5％ CO₂浓度模拟了体内生理环境，使细胞能够稳定地进行相互作用与功能转化。共培养时间的确定经过严谨验证，48小时既能保证A2B5阳性胶质瘤细胞充分释放抗原并被DC细胞有效摄取，又能让羧甲基-β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸充分发挥佐剂作用，激活DC细胞并促使其成熟，从而使成熟的DC疫苗能够精准识别并高效杀伤胶质瘤细胞。这种对培养条件和共培养条件的严格把控，为胶质瘤的免疫治疗奠定了坚实基础，有望在提升治疗效果的同时，最大程度减少因条件不当引发的细胞功能异常或治疗失败风险，为胶质瘤患者的康复带来新的曙光与可能。

附图说明

图1是羧甲基-β-葡聚糖的一维磁共振图。

图2是羧基基-β-葡聚糖的二维磁共振图。

图3是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的分子量和表面电位图。

图4是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的氢谱。

图5是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的碳谱。

图6是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的COSY谱。

图7是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的TOCSY谱。

图8是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的HSQC谱。

图9是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的ROESY谱。

图10是β-葡聚糖-多聚赖氨酸的HMBC谱。

图11是显微镜下观察到的分离的PBMC的图。

图12是显微镜下观察到的辐照25Gy后镜下A2B5阳性胶质瘤细胞图。

图13是培养5天后的显微镜下观察到的未成熟DC的图。

图14在未成熟DC细胞加入G-PL培养48H后显微镜下观察到的成熟DC+G-PL的混合体系的图。

图15是共聚焦监测FITC标记的G-PL与A2B5阳性胶质瘤细胞膜的附着情况的示意图。

图16是扫描、投射电镜观察G-PL与A2B5阳性胶质瘤细胞膜的附着情况的示意图。

图17是FITC标记的G-PL与肿瘤共孵育不同时间后的荧光强度的示意图。

图18是不同浓度β-葡聚糖对CD83、CD86的影响的结果图。

图19是使用1000ug/mlβ-葡聚糖时，流式细胞学分析对照组、肿瘤组和葡聚糖组的CD83、CD86表达的结果图。

图20是基于图19的统计样本分析的结果图。

图21是使用1000ug/mlβ-葡聚糖时，不同实验组的DC细胞分泌TNF-a、IFN-b的能力差异的结果示意图。

图22是使用1000ug/mlβ-葡聚糖时，不同实验组DC疫苗刺激T细胞分泌的流式细胞学结果分析图。

图23是使用1000ug/mlβ-葡聚糖时，不同实验组的T细胞分裂程度的结果分析图。

图24是不同浓度的β-葡聚糖-多聚赖氨酸对肿瘤细胞的杀伤结果示意图。

图25是使用500μg/mlβ-葡聚糖-多聚赖氨酸时，不同实验组对CD83、CD86的刺激作用的流式细胞学样本分析结果图。

图26是使用500μg/mlβ-葡聚糖-多聚赖氨酸时，不同实验组的DC细胞分泌TNF-a、IFN-b的能力差异的结果示意图。

图27是使用500μg/mlβ-葡聚糖-多聚赖氨酸时，不同实验组的T细胞分裂程度的结果分析图。

图28是不同浓度G-PL制备的全细胞肿瘤佐剂对于体外活化DC细胞的能力检测结果图。

图29是不同实验组对能刺激DC细胞分泌TNF-a、IFN-b的能力差异的结果示意图。

图30是不同实验组的DC细胞激活T细胞的结果示意图。

图31是体内归巢现象的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、香菇来源免疫刺激剂的制备：

(1)香菇多糖的提取：

称取2kg香菇药材，提取2次，每次加入20kg纯化水，100℃提取2h。将两次提取液合并浓缩至300ml，冷却至室温后加入750ml乙醇醇沉。醇沉结束后以4000r/min离心5分钟，收集沉淀，加水充分溶解后转移至陶瓷膜储罐，经50nm陶瓷膜超滤，收集透出液转移至卷式膜储罐，经PW卷式膜超滤，收集截留液浓缩冻干得香菇多糖20g。

(2)香菇多糖的羧甲基化

称取20g香菇多糖，悬浮于40ml乙醇中，加入40ml配以相同质量的氯乙酸，置于磁力搅拌器上以60℃、200r/min反应2h。随后收集沉淀，以20ml乙醇清洗两次。沉淀加水溶解后以5000r/min离心5min，上清装入透析袋中透析24h(截留分子量500Da)，收集透析液，浓缩冻干即得羧甲基β葡聚糖7.9g。

对该具体实施例的合成物进行理化性能检测，检测结果如图1和图2所示，图1是羧甲基β-葡聚糖的一维磁共振图，图2是羧甲基β-葡聚糖的二维磁共振图。对于糖类化合物来说，其核磁共振图谱会呈现明显的特征信号，例如其端基(异头)位置的质子在氢谱中一般出现在4.2～5.8ppm范围内，其中α-构型的一般会大于4.8ppm，而β构型一般会在4.2～4.8ppm范围内，而在碳谱中，α-构型的糖类物质其端基会在98～103ppm范围，β构型会在103～106ppm范围。从图2中可以看到本方案提取的香菇多糖的葡聚糖经过羧甲基化后，其在重水中的溶解性明显改善，在核磁共振氢谱中，可清晰观察到3.5～5.0ppm范围内多糖的特征质子信号，其中糖环的异头质子信号正好与在4.79ppm的溶剂(HDO)峰重叠，借助后面HSQC图谱可识别出来，图谱中其余的质子信号应来自与糖环以及羧甲基的相应基团。结合碳谱和HSQC谱，首先可观察到4.82/106.6ppm信号对应糖环异头位置(即1位)的氢/碳，由前述化学位移规律说明该糖环端基构型为β-型，即本方案提取得到的香菇多糖为β-葡聚糖；借助COSY图谱可依次归属糖环中2位，3位以及4位质子信号，对于5位及6位的氢信号归属可通过TOCSY谱中不同位置的氢之间的相关信号完成，借助HSQC图谱，依次完成对应的糖环的3位对应的氢/碳化学位移分别为3.78/88.1ppm，说明该位置形成了明显的苷化位移，结合ROESY谱中4.82/3.78ppm处的相关信号说明该葡聚糖结构中的糖环连接方式为β-1→3连接，即本方案提取到的香菇多糖为β-1,3-葡聚糖；对于羧甲基的归属，首先由HSQC图谱中3.99/74.5ppm处的亚甲基信号可得到清晰指认，而羧甲基的羰基在碳谱中位移为182.3ppm。糖环经羧甲基化修饰后，由于6位位阻较小，优先在该位置发生羧甲基化，在HSQC谱可清晰得到验证，糖环6位经羧甲基化后，在氢谱和碳谱中同样产生了明显苷化位移，对应的位移分别为4.35,4.11/75.3ppm，借助ROESY谱中4.35/3.99的相关性可以确证糖环的6位发生了羧甲基化，该羧甲基-β-葡聚糖的归属见表1所示。

表1羧甲基-β-葡聚糖的归属

。

二、香菇来源免疫刺激剂衍生物的制备：

称取150mg多聚右旋赖氨酸溶解在1.5mL DMSO中，加入250mg羧甲基化葡聚糖、100mg BOP和60mg三乙胺，40℃反应2h，装入到透析袋中透析(截留分子量10kDa)，纯水中透析24h，收集透析液冷冻干燥即得产物103mg。

该β-葡聚糖-多聚赖氨酸的合成过程与分子结构式如下示：

使用马尔文粒度仪检测β葡聚糖-多聚赖氨酸的分子量和表面电位如图3所示，可见G-PL表面点位为20mv，粒径为449nm，使G-PL粘附与细胞表面提供了电子驱动力的理论基础。

关于该实施例合成的β-葡聚糖--多聚赖氨酸的核磁共振图谱如图4至图10所示，图4是β-葡聚糖--多聚赖氨酸的氢谱，图5是β-葡聚糖--多聚赖氨酸的碳谱，图6是β-葡聚糖--多聚赖氨酸的COSY谱，图7是羧甲基-β-葡聚糖--多聚赖氨酸的TOCYS谱，图8是羧甲基-β-葡聚糖--多聚赖氨酸的HSQC谱，图9是羧甲基-β-葡聚糖--多聚赖氨酸的ROESY谱，图10是羧甲基-β-葡聚糖--多聚赖氨酸的HMBC谱，可见在氢谱和碳谱中首先可以识别出葡聚糖异头位置的氢/碳信号为4.81/105.3ppm，说明其为β构型，同样葡聚糖的其它位置的信号归属可依次借助其它二维图谱如COSY、TOCSY以及HSQC图谱完成，其中糖环中3位的碳信号出现了明显苷化位移，对应的氢/碳位移为3.80/86.0ppm。同时在ROESY图谱中可清晰观察到4.81/3.80的相关信号，该复合物中葡聚糖的连接方式为β-1→3。由HSQC图谱提供的信息可分别确认羧甲基基团中亚甲基信号为3.99/73.2ppm，4.36,4.07/73.9ppm的信号糖环的-O-6发生羧甲基化。在该复合物中同样可归属出聚赖氨酸的相应特征信号，1.43～1.48ppm、1.71～1.81ppm、3.01ppm处三组特征亚甲基与前述完成解析的α-聚赖氨酸结构一致，剩余的次甲基信号可借助HSQC图谱中4.30/56.6ppm指认出来，在COSY和TOCSY图谱中均可观察到高场区的亚甲基信号与该次甲基信号之间的相关峰。由此可解析出赖氨酸中特征信号分别为4.30/56.6ppm、3.02/42.0ppm、1.78/33.3ppm、1.71/29.1ppm和1.44/25.0ppm。

该α-聚赖氨酸的侧链氨基与羧甲基葡聚糖反应形成酰胺后，同样由于分子量过大，基团的不自由度增加，导致在ROESY及HMBC图谱中无法观察到赖氨酸的侧链亚甲基与来自羧甲基葡聚糖的之间的关键相关信号，但与反应前的多聚赖氨酸的氢谱对比可发现，经与羧甲基葡聚糖反应形成更大分子量聚合物后，聚赖氨酸的各个特征信号峰形明显发生了明显变化，说明该α-聚赖氨酸修饰在羧甲基β-葡聚糖羧酸上。

三、香菇来源免疫刺激剂衍生物制作的DC疫苗的制备：

S1：自人的外周血中分离PBMC：

1、抽取人的外周血于肝素抗凝管中，从中取足5mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液。2、取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。3、吸取稀释血液，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分淋巴细胞分离液上，并与分离液形成明显界面。4、室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。5、小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。此处分离得到的PBMC如图11所示。

S2：制备A2B5阳性胶质瘤细胞：

1.消化及裂解胶质瘤组织，获得单细胞悬液。2、磁珠分选步骤1单细胞悬液，获得A2B5阳性胶质瘤细胞。3、步骤2中A2B5阳性胶质瘤细胞用X射线辐照(25Gy 1min)，从而获得减毒的A2B5阳性细胞作为A2B5阳性胶质瘤细胞，用于后续G-PL合成，得到的A2B5阳性胶质瘤细胞如图12所示。

S3：在培养基中培养PBMC得到未成熟DC细胞，将A2B5阳性胶质瘤细胞和上面制备得到的香菇来源免疫刺激剂衍生物加入培养基中共培养得到成熟DC细胞作为DC疫苗，其中香菇来源免疫刺激剂衍生物为由来源自香菇的羧甲基-β-葡聚糖和多聚右旋赖氨酸耦连而成的羧甲基-β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸：

将收集的PBMC在1640培养基，在37℃、5％CO₂条件下在培养板培养4h；2.轻轻吸取步骤1液体上清液，收集贴壁细胞，加入含15％血清，100ng/ml rhGM-CSF、100ng/ml rhIL-4的1640培养基，培养5d获得未成熟的DC细胞，如图13所示；3.将A2B5阳性胶质瘤细胞与FITC标记的β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸(G-PL)共培养48H后得到装载全肿瘤干细胞抗原的成熟DC细胞，如图14所示。

共聚焦监测FITC标记的G-PL与A2B5阳性胶质瘤细胞膜的附着情况如图15所示，由于A2B5阳性胶质瘤细胞与FITC标记的β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸(G-PL)在共培养后因正电荷和负电荷产生的电动力，使G-PL吸附在肿瘤细胞表面，而B-葡聚糖无法吸附。为了进一步确认G-PL粘附肿瘤细胞后的表面分布，故对G-PL粘附后的肿瘤细胞做了透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)及扫描电镜(Scanning ElectronMicroscope，SEM)观察得到扫描、投射电镜观察G-PL与A2B5阳性胶质瘤细胞膜的附着情况如图16所示。进一步测试G-PL包被肿瘤所需要的时间以及持续时间得到结果如图17所示，发现G-PL与肿瘤细胞混合后即刻就能完成包被，并且能持续至少48H。

四、不同浓度羧甲基-β-葡聚糖对APC细胞的刺激：

考虑到不同浓度的羧甲基-β-葡聚糖对APC细胞刺激作用具有差异，CD83、CD86是成熟DC的表面标记物，可以反应羧甲基-β-葡聚糖的免疫效能。

图18是不同浓度的羧甲基-β-葡聚糖对CD83、CD86的影响，可以从图中看到在0-2000ug/ml之间羧甲基-β-葡聚糖对DC的刺激作用有很大差别，而且从图示结果显示羧甲基-β-葡聚糖在1000ug/ml时，DC向成熟变形转换最多，提示此浓度具有最佳免疫效果。

另外，为了比较不同免疫刺激源对DC的刺激效果，将实验分为3组：对照组(仅有PBS)、肿瘤组(仅有U87)和葡聚糖组(添加1000ug/ml的羧甲基-β-葡聚糖)，如图19所示的用流式细胞学分析三组实验的流式细胞学结果显示，图19中的Control表示对照组，Tumor表示肿瘤组，β-Glucan表示葡聚糖组，其中葡聚糖组的CD83、CD86表达最高，如图20所示可见，葡聚糖组相较对照组具有统计学差异(CD83：对照组VS.葡聚糖组，p:0.001；CD86：对照组VS.葡聚糖组，p＜0.0001)。

DC疫苗不直接杀伤肿瘤细胞，而是在淋巴结内刺激肿瘤特异性T细胞的分化增殖后产生效果，因此除了DC本身的一些外分泌因子外，T细胞的功能也是考量羧甲基-β-葡聚糖刺激后DC的重要指标。实验按照上述仍然分为三组，对照组(仅有PBS)、肿瘤组(仅有U87)和葡聚糖组(添加1000ug/ml的羧甲基-β-葡聚糖)，如图21所示的流式细胞学结果显示葡聚糖组的TNF-a、IFN-b显著增高，且差异具有统计学意义(TNF-α：对照组VS.葡聚糖组，p＜0.001；IFN-β：对照组VS.葡聚糖组，p＜0.001)，图21中的PBS对应的对照组，Tumor对应的是肿瘤组，β-Glucan对应的是葡聚糖组。

另外，在不同实验组加入T细胞培养72H后，如图22和图23所示的流式细胞学监测出葡聚糖组T细胞分裂显著增加(对照组VS.葡聚糖组，p＜0.001)，证明了羧甲基-β-葡聚糖在1000ug/ml时可以最大程度刺激APC细胞。

五、不同浓度β-葡聚糖-多聚赖氨酸(G-PL)对于肿瘤细胞的杀伤：

使用10⁶个A2B5⁺肿瘤细胞与1ml不同浓度的G-PL共培养，以7-Aminoactinomycin D(7-AAD)作为肿瘤希望死亡的标记物，如图24所示，在G-PL浓度大于1000μg/ml时，肿瘤细胞死亡数量明显增多，亦可推测G-PL在超过此浓度时对正常细胞亦有杀伤，因此在10⁶肿瘤细胞与G-PL共孵育时，G-PL浓度应当小于1000μg/ml，本专利后续实验使用500μg/ml浓度对应10⁶肿瘤细胞。

取500μg/mlβ-葡聚糖-多聚赖氨酸与10⁶肿瘤细胞组成的复合物刺激APC细胞。利用不用刺激源来刺激APC细胞，依旧将实验分为对照组(PBS)、肿瘤组(U87)和β-葡聚糖衍生物组(500μg/mlβ-葡聚糖-多聚赖氨酸)，如图25所示的实验结果显示，图25中的Control对应对照组，Tumor对应肿瘤组，β-GPDL对应β-葡聚糖衍生物组，可见，β-GPDL刺激后的DC细胞明显向成熟表型转换(衍生物组VS.对照组；CD83：p＜0.001；CD86：p＜0.001)。如图26所示的结果显示共培养24h后，β-GPDL组的上清液TNF-a和IFN-b含量显著提升(衍生物组VS.对照组；CD83：p＜0.001；CD86：p＜0.001)，且如图27所示的结果显示使用500μg/mlβ-GPDL时，葡聚糖衍生物组T细胞分裂程度显著高于对照组，p＜0.0001，实验结果证明了适宜浓度的β-GPDL与肿瘤结合后的衍生物依然具有强免疫源性。

六、不同浓度β-葡聚糖-多聚赖氨酸(G-PL)与A2B5细胞复合物对DC细胞的激活作用：

为检测不同浓度G-PL对DC细胞的激活作用，以不同浓度G-PL(0,25,50,100,200,500,1000ug/ml)孵育1×10⁶胶质瘤细胞20min后，制成新型全细胞肿瘤佐剂(以下简称Vaccine组),与等量DC细胞混合，在37°，5％二氧化碳情况下共培养48H，检测CD11c+的DC细胞的CD80、CD86、CD80表达量。如图28所示，随着G-PL浓度的上升，CD80、CD86、CD83展现出上调趋势，说明G-PL的浓度与DC成熟程度呈正相关。但由于前已证明超过1000ug/ml的G-PL会损伤正常细胞，因此我们选择安全的500ug/ml G-PL作为适宜浓度。同时该浓度G-PL相较可溶性b-葡聚糖对DC细胞亦有更强的激活作用。

七、香菇来源免疫刺激剂衍生物制作的DC疫苗对于T细胞的激活作用：

同上，以相同方法制备新型疫苗后，与1×10⁶T细胞共同培养。共设置DC+PBS、DC+A2B5阳性细胞、DC+A2B5阳性细胞+可溶性β-葡聚糖、DC+β-葡聚糖-多聚赖氨酸包被的A2B5阳性细胞，共4个组别。在共培养48H时同时检测了上清液TNF-a，INF-b的表达，结果如图29所示的结果显示，加入G-PL的共培养体系肿瘤坏死因子α(TNF-a)和β干扰素(INF-b)的分泌水平最高，显著高于可溶性β-葡聚糖组，而可溶性β-葡聚糖组分泌水平又高于A2B5阳性细胞组和PBS组，图29中的PBS对应DC+PBS(PBS组)，A2B6+Tumor对应DC+A2B5阳性细胞(A2B5阳性细胞组)、β-Glucan对应DC+A2B5阳性细胞+可溶性β-葡聚糖(可溶性β-葡聚糖组)，G-PL对应DC+β-葡聚糖-多聚赖氨酸。

在37°，5％二氧化碳条件下分别共孵育0h，12h，24h，48h后，收集共培养体系上清液，流式检测白细胞介素2(IL-2)的分泌水平，结果如图30所示，发现以上不同时间节点G-PL组均表现出最强的IL-2分泌功能，并且随着时间不短增强，最终在48H时最高，可见本方案的香菇来源免疫刺激剂衍生物和全肿瘤细胞抗原制作的DC疫苗在体外能够激活T细胞2瘤杀伤功能。

八、香菇来源免疫刺激剂衍生物制作的DC疫苗的体内归巢现象：

按照上述方法制备DC疫苗后，使用CD11c磁珠进行分选，得到纯DC细胞，使用Dialkylcarbocyanines(DID)染色标记DC细胞膜后以2x10⁵数量级对PBMC重建小鼠进行足垫注射，如图31所示，48H后可以看到红色被标记的DC细胞向小鼠腘窝淋巴结移动。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种香菇来源免疫刺激剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：提取香菇多糖：将香菇药材加入纯化水中在高温环境下进行提取得到提取液，将提取液冷却至室温环境后加入乙醇醇沉得到沉淀物，离心收集沉淀物后进行超滤处理得到香菇多糖；

S2：制备香菇来源免疫刺激剂：取香菇多糖悬浮于乙醇中并加入氯乙酸得到混合溶液，对混合溶液进行磁力搅拌后收集沉淀物，用乙醇清洗沉淀物后进行透析得到透析液，对透析液进行浓缩冻干制备得到香菇来源免疫刺激剂，其中香菇来源免疫刺激剂为羧甲基-β-葡聚糖。

2.一种香菇来源免疫刺激剂，其特征在于，根据权利要求1所述的香菇来源免疫刺激剂的制备方法制备得到，用于对APC刺激，且刺激APC的香菇来源免疫刺激剂的浓度为0～2000ug/ml。

3.一种香菇香菇来源免疫刺激剂衍生剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的香菇香菇来源免疫刺激剂、BOP和三乙胺加入的溶解有多聚右旋赖氨酸的有机溶剂中反应一段时间后进行透析，冷冻干燥透析液得到香菇来源免疫刺激剂衍生物，其中香菇来源免疫刺激剂衍生物为β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸。

4.一种香菇香菇来源免疫刺激剂衍生剂，其特征在于，根据权利要求3所述的香菇香菇来源免疫刺激剂衍生剂的制备方法制备得到，用于杀伤肿瘤细胞，对应10⁶肿瘤细胞选择香菇来源免疫刺激剂衍生物的浓度小于1000μg/ml。

5.一种基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：自人的外周血中分离PBMC；

S2：制备A2B5阳性胶质瘤细胞；

S3：在培养基中培养PBMC得到未成熟DC细胞，将A2B5阳性胶质瘤细胞和根据权利要求3所述的香菇来源免疫刺激剂衍生物加入培养基中共培养得到成熟DC细胞作为DC疫苗。

6.根据权利要求5所述的一种基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗的制备方法，其特征在于，在培养基中培养PBMC一段时间后得到上清液，收集上清液内的贴壁细胞，并将贴壁细胞加入到1640培养基培养获得未成熟DC。

7.根据权利要求5所述的一种基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗的制备方法，其特征在于，收集的PBMC在1640培养基，在37℃、5％CO₂条件下在1640培养基内培养4h。

8.根据权利要求5所述的一种基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗的制备方法，其特征在于，将A2B5阳性胶质瘤细胞和β-葡聚糖-多聚右旋赖氨酸加入培养基中置于37℃、5％CO₂条件下共培养1～48h得到成熟DC细胞作为DC疫苗。

9.一种基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗，其特征在于，根据权利要求5到8任一所述的基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗的制备方法制备得到，用于杀伤肿瘤细胞。

10.根据权利要求9所述的基于香菇来源免疫刺激剂衍生物的DC疫苗，其特征在于，用于杀伤胶质瘤肿瘤细胞。