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CN120041455A - 构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒及其构建方法和应用 - Google Patents

构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒及其构建方法和应用 Download PDF

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CN120041455A
CN120041455A CN202510510389.2A CN202510510389A CN120041455A CN 120041455 A CN120041455 A CN 120041455A CN 202510510389 A CN202510510389 A CN 202510510389A CN 120041455 A CN120041455 A CN 120041455A
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CN
China
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tbx19
mice
thr187ala
grna
kit
Prior art date
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Application number
CN202510510389.2A
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柳延虎
张亚平
谢海兵
黄翠萍
王雪冰
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Kunming Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Kunming Institute of Zoology of CAS
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Publication date
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒及其构建方法和应用。本发明提供的试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的gRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的单链Oligo donor DNA。本发明提供的试剂盒可以构建得到TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型，该小鼠模型可作为研究下丘脑‑垂体‑肾上腺轴功能减弱和促肾上腺皮质激素（ACTH）缺乏症模型发生发展病程的动物模型，以研究TBX19基因影响动物（小鼠）行为的分子和细胞机制，还可作为促肾上腺皮质激素缺乏症药物研发的动物模型。

Description

构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒及其构建 方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒及其构建方法和应用。
背景技术
T-box transcription factor 19（TBX19）基因定位于人的1q24.2，编码一个具有T-box结构域的转录因子。TBX19是调节下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的重要基因，通过与Pitx1的结合，启动POMC的表达，进而引起HPA轴相关激素水平改变。HPA轴是动物的压力应激中心，调控生物的生长发育、神经活动、应激反应等重要的生物活动。小鼠的TBX19基因在1号染色，全长22,919个碱基，NCBI ID：83993。该基因在小鼠基因组中有4个转录本。
rs80951600是位于家猪（Sscrofa11.1）第4号染色体TBX19基因上的突变位点，位于chr4：82,684,374，由T突变为C，属于错义突变，导致TBX19翻译的蛋白质第189位点的苏氨酸（Thr或T）转变为丙氨酸（Ala或A），根据蛋白质同源性，该位点在小鼠中的同源位点为第187位氨基酸，即小鼠TBX19Thr187Ala。基因组的研究发现该突变可能与家猪的HPA轴功能减弱相关，进而促使野猪驯化为温顺的家猪。目前关于TBX19基因的T187A影响小鼠行为的作用机制研究知之甚少，且也没有该位点被编辑的小鼠模型。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒及其构建方法和应用。本发明提供的试剂盒可以构建得到TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型，该小鼠模型可作为研究下丘脑-垂体-肾上腺轴功能减弱和促肾上腺皮质激素（ACTH）缺乏症模型发生发展病程的动物模型。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒，包括gRNA和单链Oligo donor DNA；所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链Oligodonor DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA和Cas9反应缓冲液。
本发明提供了上述技术方案所述的试剂盒在构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型中的应用。
本发明提供了一种构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的方法，包括以下步骤：
将Cas9 mRNA、gRNA、单链Oligo donor DNA和Cas9反应缓冲液混合，得到反应混合液；所述gRNA和单链Oligo donor DNA为上述技术方案所述的试剂盒中的所述gRNA和单链Oligo donor DNA；
将所述反应混合液注射到小鼠受精卵中后，将注射后存活的受精卵移植到受体母鼠体内，产出F0代小鼠；
测定所述F0代小鼠的TBX19基因的基因型，得到突变的阳性F0代小鼠；
将所述突变的阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠；
测定所述F1代小鼠的TBX19基因的基因型，得到阳性F1代小鼠；
将所述阳性F1代小鼠杂交，获得含有纯合TBX19 p.Thr187Ala点突变的F2代小鼠。
优选的，所述反应混合液中Cas9 mRNA的浓度为5ng/μl，gRNA的浓度为2ng/μl，单链Oligo donor DNA的浓度为100ng/μl。
优选的，所述测定使用的引物包括：TBX19基因的扩增引物和测序引物。
优选的，所述TBX19基因的扩增引物由上游引物和下游引物组成；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了上述技术方案所述方法构建得到的TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型在1）~3）任一项中的应用：
1）作为观察下丘脑-垂体-肾上腺轴功能减弱的动物模型；
2）作为促肾上腺皮质激素缺乏症的动物模型；
3）作为促肾上腺皮质激素缺乏症药物研发的动物模型。
优选的，2）所述的动物模型为促肾上腺皮质激素缺乏症发生和/或发展病程的动物模型。
有益效果：
本发明提供了一种构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒，包括gRNA和单链Oligo donor DNA；所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链Oligodonor DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的试剂盒可以构建得到TBX19p.Thr187Ala点突变小鼠模型，该小鼠模型可作为研究下丘脑-垂体-肾上腺轴功能减弱和促肾上腺皮质激素（ACTH）缺乏症模型发生发展病程的动物模型，以研究TBX19基因影响动物（小鼠）行为的分子和细胞机制，还可作为促肾上腺皮质激素缺乏症药物研发的动物模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明的流程示意图；
图2为TBX19基因点突变设计策略示意图；
图3为体外转录Cas9和gRNA电泳结果；
图4为F0代小鼠鉴定策略示意图；
图5为F0代小鼠PCR的凝胶电泳图；
图6为野生型小鼠突变位点附近峰形图；
图7为杂合突变型小鼠突变位点附近峰形图；
图8为纯合突变型小鼠突变位点附近峰形图。
具体实施方式
本发明提供了一种构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒，包括gRNA和单链Oligo donor DNA；所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链Oligodonor DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
5'-CTGCATAAATATGAACCTCAGGTTCATATAGTCCGTGTTGGAGGCGCCCATCGAATGGTCATGAACTGCTCATTTCCTGAAGCTCAGTTCATCGCTGTGACTGCCTATCAGAATGAGGAG-3'。
本发明所述单链Oligo donor DNA中第82位碱基G是目标突变位点，第75位碱基T是防止Cas9二次切割引入的同义突变，可以防止单链Oligo donor DNA插入基因组前后被Cas9-sgRNA识别并切割。
作为一种实施方式，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA和Cas9反应缓冲液。
作为一种实施方式，所述试剂盒中的Cas9 mRNA和gRNA是通过体外转录的方式得到有活性的gRNA和Cas9 mRNA，所述单链Oligo donor DNA是通过合成的方式得到。
本发明提供的试剂盒可以构建得到TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型，该小鼠模型可作为研究下丘脑-垂体-肾上腺轴功能减弱和促肾上腺皮质激素（ACTH）缺乏症模型发生发展病程的动物模型，以研究TBX19基因影响动物（小鼠）行为的分子和细胞机制，还可作为促肾上腺皮质激素缺乏症药物研发的动物模型。
基于上述优势，本发明提供了上述技术方案所述的试剂盒在构建TBX19p.Thr187Ala点突变小鼠模型中的应用。
本发明提供了一种构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的方法，包括以下步骤：
将Cas9 mRNA、gRNA、单链Oligo donor DNA和Cas9反应缓冲液混合，得到反应混合液；所述gRNA和单链Oligo donor DNA为上述技术方案所述的试剂盒中的所述gRNA和单链Oligo donor DNA；
将所述反应混合液注射到小鼠受精卵中后，将注射后存活的受精卵移植到受体母鼠体内，产出F0代小鼠；
测定所述F0代小鼠的TBX19基因的基因型，得到突变的阳性F0代小鼠；
将所述突变的阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠；
测定所述F1代小鼠的TBX19基因的基因型，得到阳性F1代小鼠；
将所述阳性F1代小鼠杂交，获得含有纯合TBX19 p.Thr187Ala点突变的F2代小鼠。
作为一种实施方式，所述反应混合液中Cas9 mRNA的浓度为5ng/μl，gRNA的浓度为2ng/μl，单链Oligo donor DNA的浓度为100ng/μl。
作为一种实施方式，所述小鼠受精卵是通过小鼠促排卵并经过体外受精培育获得的。
作为一种实施方式，所述测定使用的引物包括：TBX19基因的扩增引物和测序引物。
作为一种实施方式，所述TBX19基因的扩增引物由上游引物和下游引物组成；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为一种实施方式，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明基于上述技术方案所述的gRNA设计了Txb19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的构建方法，将Cas9 mRNA、gRNA、单链Oligo donor DNA和Cas9反应混合液显微注射到小鼠受精卵中，通过两步筛选和一次杂交，获得Thr187Ala点突变小鼠模型，运用CRISPR/Cas9系统，构建出点突变小鼠后可与不同的工具鼠灵活搭配运用，研究目的基因在不同组织器官，甚至不同细胞类型中的作用机制，为国内外提供有效的模型动物。
本发明提供了上述技术方案所述方法构建得到的TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型在1）~3）任一项中的应用：
1）作为观察下丘脑-垂体-肾上腺轴功能减弱的动物模型；
2）作为促肾上腺皮质激素缺乏症的动物模型；
3）作为促肾上腺皮质激素缺乏症药物研发的动物模型。
作为一种实施方式，2）所述的动物模型为促肾上腺皮质激素缺乏症发生和/或发展病程的动物模型。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的构建TBX19p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒及其构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立TBX19 Thr187Ala点突变小鼠模型的方法，流程示意图见图1，具体步骤如下：
一、TBX19基因的基本信息如下：
1）点突变基因名称（Gene ID号）：TBX19（83993）；
2）点突变基因名称（Ensemble）：TBX19（ENSMUSG00000026572）；
3）点突变针对的转录本（Ensemble号）：Tbx19-201（ENSMUST00000027859.12）；
4）点突变针对的外显子：3号外显子。
二、Cas9/gRNA的设计与构建：
TBX19基因点突变设计策略示意图，如图2所示，gRNAs设计在TBX19基因的外显子3目标突变附近。
1、打靶具体策略为：根据序列信息在TBX19基因的3号外显子序列中设计了1条gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
5'-CAGCGATGAACTGAGTTTCAGGG-3'。
2、以突变区域为中心（5'-TCCTGAAGCTCAGTTCATCGCTG-3'，SEQ ID NO.2），向上游外延74个碱基，向下游外延23个碱基，合成单链Oligo donor DNA（oligo donor DNA），总长120个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
5'-CTGCATAAATATGAACCTCAGGTTCATATAGTCCGTGTTGGAGGCGCCCATCGAATGGTCATGAACTGCTCATTTCCTGAAGCTCAGTTCATCGCTGTGACTGCCTATCAGAATGAGGAG-3'。
3、将gRNA、Cas9质粒（px330-T7-cas9质粒，上海南方模式生物科技股份有限公司自主构建）通过MEGAshortscript T7 kit（LifeTechnologies）体外转录试剂盒进行体外转录，得到进行显微注射的Cas9 mRNA、有活性的gRNA，并通过MEGAclear kit试剂盒进行纯化回收。
Cas9 mRNA合成过程：
1）酶切实验：将px330-T7-cas9质粒进行单酶切。酶切体系如下：px330-T7-cas9质粒5μg，10×Buffer 10μl，限制性内切酶XbaI 5μl，ddH2O补足至100μl。酶反应：37℃金属浴或恒温水浴2h；酶失活：65℃金属浴或恒温水浴20min。
2）纯化实验：
（1）酶切反应结束后，取2μl进行凝胶电泳实验，确认酶切是否完全。拿环状质粒进行对照。
（2）DNA纯化回收实验：
①加入200μl的无水乙醇，缓慢颠倒30s，直到出现絮状悬浮物；
②将加入乙醇的EP管在13000rpm转速下离心5min；
③离心完毕后，倒掉液体，加入75%乙醇清洗（不要洗掉管底沉淀物），清洗完倒掉乙醇，此步重复2次；
④烘干管中残留的乙醇，加入50μl ddH2O，在56℃溶解DNA，待充分溶解后测定浓度。
3）转录实验：按照ThermoFisher mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA 转录试剂盒（购自Thermo Fisher，货号为AM1345）使用说明进行实验。
4）RNA纯化回收实验：按照ThermoFisher MEGAclear™ 转录纯化试剂盒（购自TherThermo Fisher，货号为AM1908）使用说明进行实验。
最终的到转录好的Cas9 mRNA，进行凝胶电泳实验观察转录质量并测定浓度。电泳结果如图3所示。
三、TBX19 Thr187Ala的小鼠动物模型构建过程：
1）将上述体外转录的有活性的将Cas9 mRNA、gRNA和单链Oligo donor DNA按照本领域常规注入剂量显微注射入小鼠受精卵中，注射体系如下：Cas9 mRNA 0.5μg，gRNA 0.2μg，单链Oligo donor DNA 10μg，缓冲液补足至100ml；所述缓冲液由20μL 0.5mol/L的EDTA（pH=8.0）和1000uL 1mol/L的Tris-HCL组成（pH=7.5）。
按照《小鼠胚胎操作实验手册（第三版）》中的方法进行胚胎的显微注射，取注射后存活的受精卵移植到受体母鼠（ICR小鼠）体内，产出小鼠，即为F0代小鼠。
2）提取F0代小鼠尾部基因组DNA，PCR扩增并将产物进行测序鉴定，获得阳性F0代小鼠或疑似阳性F0代小鼠；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0小鼠为嵌合体。故以F0小鼠鼠尾DNA进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1小鼠基因型鉴定后确定。F0代小鼠基因型鉴定具体过程如下：
①鉴定引物设计：
引物设计原则如图4所示，两条引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）的前端和后端分别设计在TBX19基因的内含子2和内含子3中，通过扩增可以获取编辑后的完整序列。
②引物的核苷酸序列如下所示：
TBX19-F（引物Ⅰ）：5'-CTGAACGTAGATGAATCCAGAA-3'（SEQ ID NO.4）；
TBX19-R（引物Ⅱ）：5'-TCCTCAAAACTCTAAATTCCGT-3'（SEQ ID NO.5）；
③PCR扩增条件如下所示：
反应体系：ddH2O 13.2µl、PrimeStar GXL PCR Buffer（R050A，Takara）2µl、2.5mM的dNTP 2µl、TBX19-F（10pmol/µl）0.5µl、TBX19-R（10pmol/µl）0.5µl、PrimeStar GXLDNA Polymerase*（TaKaRa，R050A）0.8µl和基因组DNA 1µl。
反应条件：94预变性3 min；98变性15s，58退火15s，68延伸20s，共35个循环；68终延伸5min。
④F0代小鼠鼠尾基因型鉴定，首先对PCR扩增产物进行凝胶电泳，结果如图5所示，结果可知，通过PCR扩展可以特异地获得目标片段。对PCR产物进行Sanger测序获得目标片段的核苷酸序列。
测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
通过PCR鉴定和测序结果，确定突变的阳性F0代小鼠。共注射了16只小鼠，F0代得到11只野生型小鼠和5只点突变阳性小鼠。
3）将上述阳性F0代阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代小鼠；提取F1代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物进行测序鉴定，获得具有稳定基因型的阳性F1代小鼠。将阳性F1代小鼠杂交获得F2代小鼠，对F2代小鼠进行纯合子基因型的鉴定，获得F2代纯合子基因型的小鼠，即为TBX19基因Thr187Ala点突变小鼠动物模型。
F2代小鼠的基因型鉴定结果包括：纯合野生型小鼠如图6所述，杂合突变型小鼠如图7所述，纯合突变型小鼠如图8所述。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的试剂盒，其特征在于，包括gRNA和单链Oligo donor DNA；所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链Oligo donorDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA和Cas9反应缓冲液。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型中的应用。
4.一种构建TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Cas9 mRNA、gRNA、单链Oligo donor DNA和Cas9反应缓冲液混合，得到反应混合液；所述gRNA和单链Oligo donor DNA为权利要求1或2所述的试剂盒中的所述gRNA和单链Oligo donor DNA；
将所述反应混合液注射到小鼠受精卵中后，将注射后存活的受精卵移植到受体母鼠体内，产出F0代小鼠；
测定所述F0代小鼠的TBX19基因的基因型，得到突变的阳性F0代小鼠；
将所述突变的阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠；
测定所述F1代小鼠的TBX19基因的基因型，得到阳性F1代小鼠；
将所述阳性F1代小鼠杂交，获得含有纯合TBX19 p.Thr187Ala点突变的F2代小鼠。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应混合液中Cas9 mRNA的浓度为5ng/μl，gRNA的浓度为2ng/μl，单链Oligo donor DNA的浓度为100ng/μl。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述测定使用的引物包括：TBX19基因的扩增引物和测序引物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TBX19基因的扩增引物由上游引物和下游引物组成；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
9.权利要求4~8任一项所述方法构建得到的TBX19 p.Thr187Ala点突变小鼠模型在1）~3）任一项中的应用：
1）作为观察下丘脑-垂体-肾上腺轴功能减弱的动物模型；
2）作为促肾上腺皮质激素缺乏症的动物模型；
3）作为促肾上腺皮质激素缺乏症药物研发的动物模型。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，2）所述的动物模型为促肾上腺皮质激素缺乏症发生和/或发展病程的动物模型。
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