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CN120040600A - Mstn重组疫苗及应用 - Google Patents

Mstn重组疫苗及应用 Download PDF

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CN120040600A
CN120040600A CN202311585056.3A CN202311585056A CN120040600A CN 120040600 A CN120040600 A CN 120040600A CN 202311585056 A CN202311585056 A CN 202311585056A CN 120040600 A CN120040600 A CN 120040600A
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mstn
protein
recombinant
nucleic acid
adjuvant
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查丽莎
李成山
周宇杭
金一兰
陈道松
吴茂柏
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Shenzhen Hertz Life Science Technology Co ltd
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Shenzhen Hertz Life Science Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及MSTN重组疫苗及应用。本发明提供了MSTN重组蛋白，其抗原纯度高，安全性好，将其用于动物免疫，制成的MSTN重组疫苗，对小鼠等动物没有致病性，容易通过安全性评价，同时该疫苗具有高效的抗原呈递方式，能够有效诱导免疫系统产生免疫保护应答，激发动物肌肉生长，在肌肉萎缩等的相关疾病防治领域具有重要的应用前景。

Description

MSTN重组疫苗及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及MSTN重组疫苗及应用。
背景技术
肌肉生长抑制素(MSTN，myostatin)也称GDF-8(growth differentiation factor8)，是转化生长因子-β(TGF-β)家族成员，主要由骨骼肌分泌，在肌肉生长发育过程中起负调控作用。美国学者McPherron等在1997年首次克隆到MSTN基因，并证明其作用。采用CRISP/Cas9系统、RNA干扰、抗MSTN抗体等技术敲除或抑制MSTN基因的表达可增加机体肌肉的重量、改善肌肉的功能。在动物方面，MSTN丧失其抑制功能后可使得牛、猪、羊等脊椎动物的骨骼肌显著增生，产生“双肌”表型，如自然突变造成的比利时蓝牛和皮尔蒙特牛的双肌臀现象，其产肉率远超于其他品种的牛品种，进一步证明MSTN基因的功能，目前，该品种牛已经推广到20多个国家。所以，基于MSTN基因改造的畜禽育种方法，已被学者广泛应用和推广。对人类疫病治疗方面，针对人类肌肉萎缩的相关疾病，如贝克型肌肉萎缩症、杜氏肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症、胰腺癌、晚期肾病等引起的肌肉萎缩或流失，抗MSTN单克隆抗体或亲和物已被广泛研究，并有超过10个相应的生物药进入临床试验。也有试验表明，MSTN单抗或亲和物可治疗2型糖尿病患者后期的肥胖症状，相关药物已进入临床试验阶段。
MSTN产生作用前，以没有活性的状态存在，其由N-末端区和C-末端区两部分组成前体蛋白，在两个末端区之间有一个蛋白酶水解位点，人MSTN蛋白酶切位点在266位氨基酸，经蛋白酶水解后，形成N端蛋白和C端蛋白两部分，但两者仍以结合体形式存在于血液中，没有活性，直到N端蛋白第75位天冬氨酸被金属蛋白酶家族(Family ofmetalloproteases)酶裂解后，C端蛋白才能释放出来，形成有活性的C端蛋白，起到抑制骨骼肌蛋白合成的作用。
MSTN由375个氨基酸组成，不同物种之间，MSTN同源性较高，尤其是C端活性区。小鼠、猪、狗、猫、鸡MSTN的C端活性区与人的一致，牛、山羊、绵羊也在95％以上。也有其他抑制骨骼肌合成的蛋白，如GDF-11，其原理与MSTN相似。
目前，在畜禽方面，针对MSTN靶点的研究，主要是畜禽育种方面的研究，主要利用自然杂交，筛选MSTN基因突变的子代，但自然杂交筛选时间较长，后代遗传稳定性也有待考证；如果使用基因工程手段突变MSTN基因，存在转基因生物安全的风险。
另外，在针对人类肌肉萎缩的疾病方面，研究较多的是使用针对MSTN的抗体或亲和物，然而，MSTN抗体或其亲和物存在半衰期短、排斥效应、生产成本高、需要频繁注射等问题。虽然有十几个相关药物进入临床，但目前尚未有相关药物批准。
在MSTN疫苗研究方面，因MSTN属于机体本身的蛋白，直接免疫MSTN很难引起机体自身的免疫效应，有学者将MSTN蛋白进行突变后或添加T细胞抗原表位制备成疫苗，但制备的疫苗免疫原较差。也有学者研究MSTN的多肽疫苗，但多肽疫苗靶点单一，也存在免疫原性差的缺点。也有研制MSTN核酸疫苗的报道，但核酸疫苗生产成本高，使用不方便，注射的MSTN核酸有整合到机体的风险，且核酸疫苗表达的MSTN也有与天然MSTN结构相似，难以激发自身免疫效应的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供MSTN重组疫苗及应用。
本发明提供了重组蛋白，其包括病毒样颗粒蛋白、纳米颗粒蛋白、Fc或MBP中的至少一种和MSTN；
所述病毒样颗粒蛋白包括AP205、Qβ，MS2、T4、TMV、CPMV、CMV、PapMV、FHV、HBsAg和/或IFUV；
所述纳米颗粒蛋白包括Ferritin；
本发明中，所述MSTN的来源包括人或其他动物，具体的如犬、猫、猪、鸡等或氨基酸序列同源性达90％以上的序列，本发明对此不作限定。
本发明中，所述MSTN的数量可以为n个，所述n为1～10之间的整数，具体的，可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个MSTN之间可以通过linker连接，也可以通过化学偶联，也可以直接化学合成，本发明对此不作限定，所述linker为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个。
本发明中，所述病毒样颗粒蛋白、纳米颗粒蛋白、Fc或MBP中的至少一种可以位于MSTN的N端，也可以位于MSTN的C端，本发明一些具体实施例中，所述病毒样颗粒蛋白、纳米颗粒蛋白、Fc或MBP中的至少一种位于MSTN的C端；本发明的另一些实施例中，所述病毒样颗粒蛋白、纳米颗粒蛋白、Fc或MBP中的至少一种位于MSTN的N端。
进一步的，本发明所述的MSTN重组蛋白中，所述MSTN具有如下所示的氨基酸序列：
(1)、如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或
(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)、与如(1)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列；
本发明中，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的MSTN为天然MSTN蛋白，简称W-MSTN；在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的基础上经氨基酸序列突变(D75A、R263S、R266A)后获得的突变MSTN，简称M-MSTN，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的MSTN为MSTN的C端活性区域，简称C-MSTN，为MSTN的267～375位氨基酸区段。
具体的，W-MSTN蛋白氨基酸序列为：
M-MSTN蛋白氨基酸序列为：
C-MSTN氨基酸序列为：
所述W-MSTN、M-MSTN、C-MSTN，其制备方法包括：生物合成和/或固相合成，所述生物合成为：通过将W-MSTN、M-MSTN、C-MSTN所示氨基酸序列对应的核苷酸序列克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得；所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的W-MSTN、M-MSTN、C-MSTN。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-AP205重组蛋白、M-MSTN-AP205重组蛋白或C-MSTN-AP205重组蛋白，所述AP205来自AP205噬菌体衣壳。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述AP205位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述AP205的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述AP205的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码AP205的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的AP205。
本发明提供了W-MSTN-AP205、M-MSTN-AP205或C-MSTN-AP205重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码AP205的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-AP205、M-MSTN-AP205或C-MSTN-AP205重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码AP205的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-AP205、M-MSTN-AP205或C-MSTN-AP205重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与AP205通过化学偶联获得W-MSTN-AP205、M-MSTN-AP205或C-MSTN-AP205重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与AP205通过化学偶联获得W-MSTN-AP205、M-MSTN-AP205或C-MSTN-AP205重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-Qβ重组蛋白、M-MSTN-Qβ重组蛋白或C-MSTN-Qβ重组蛋白，所述Qβ来自Qβ噬菌体衣壳。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述Qβ位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述Qβ的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述Qβ的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码Qβ的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的Qβ。
本发明提供了W-MSTN-Qβ、M-MSTN-Qβ或C-MSTN-Qβ重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码Qβ的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-Qβ、M-MSTN-Qβ或C-MSTN-Qβ重组蛋白其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码Qβ的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-Qβ、M-MSTN-Qβ或C-MSTN-Qβ重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与Qβ通过化学偶联获得W-MSTN-Qβ、M-MSTN-Qβ或C-MSTN-Qβ重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与Qβ通过化学偶联获得W-MSTN-Qβ、M-MSTN-Qβ或C-MSTN-Qβ重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-MS2重组蛋白、M-MSTN-MS2重组蛋白或C-MSTN-MS2重组蛋白，所述MS2来自MS2噬菌体衣壳。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述MS2位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述MS2的氨基酸序列包括：
如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
或在SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
所述MS2包括外壳蛋白和成熟酶蛋白，所述外壳蛋具有如下所示氨基酸序列：
所述成熟酶蛋白具有如下所示氨基酸序列：
本发明中，所述MS2的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码MS2的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：6或SEQID NO：7所示的MS2。
本发明提供了W-MSTN-MS2、M-MSTN-MS2或C-MSTN-MS2重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码MS2的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-MS2、M-MSTN-MS2或C-MSTN-MS2重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码MS2的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-MS2、M-MSTN-MS2或C-MSTN-MS2重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与MS2通过化学偶联获得W-MSTN-MS2、M-MSTN-MS2或C-MSTN-MS2重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与MS2通过化学偶联获得W-MSTN-MS2、M-MSTN-MS2或C-MSTN-MS2重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-T4重组蛋白、M-MSTN-T4重组蛋白或C-MSTN-T4重组蛋白，所述T4来自T4噬菌体衣壳。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述T4位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述T4的氨基酸序列包括：
如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
或在SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
T4包括外壳蛋白Soc和Hoc；所述Soc具有如下所示的氨基酸序列：
MASTRGYVNIKTFEQKLDGNKKIEGKEISVAFPLYSDVHKISGAHYQTFPSEKAAYSTVYEENQRTEWIAANEDLWKVTG(SEQ ID NO：8)；
Hoc具有如下所示的氨基酸序列：
本发明中，所述T4的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码T4的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：9所示的T4。
本发明提供了W-MSTN-T4、M-MSTN-T4或C-MSTN-T4重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码T4的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-T4、M-MSTN-T4或C-MSTN-T4重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码T4的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-T4、M-MSTN-T4或C-MSTN-T4重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与T4通过化学偶联获得W-MSTN-T4、M-MSTN-T4或C-MSTN-T4重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与T4通过化学偶联获得W-MSTN-T4、M-MSTN-T4或C-MSTN-T4重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-TMV重组蛋白、M-MSTN-TMV重组蛋白或C-MSTN-TMV重组蛋白，所述TMV来自烟草花叶病毒。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述TMV位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述TMV的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述TMV的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码TMV的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的TMV。
本发明提供了W-MSTN-TMV、M-MSTN-TMV或C-MSTN-TMV重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码TMV的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-TMV、M-MSTN-TMV或C-MSTN-TMV重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码TMV的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-TMV、M-MSTN-TMV或C-MSTN-TMV重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与TMV通过化学偶联获得W-MSTN-TMV、M-MSTN-TMV或C-MSTN-TMV重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与TMV通过化学偶联获得W-MSTN-TMV、M-MSTN-TMV或C-MSTN-TMV重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-CPMV重组蛋白、M-MSTN-CPMV重组蛋白或C-MSTN-CPMV重组蛋白，所述CPMV来自豇豆花叶病毒。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述CPMV位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述CPMV的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述CPMV的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码CPMV的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的CPMV。
本发明提供了W-MSTN-CPMV、M-MSTN-CPMV或C-MSTN-CPMV重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码CPMV的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-CPMV、M-MSTN-CPMV或C-MSTN-CPMV重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码CPMV的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-CPMV、M-MSTN-CPMV或C-MSTN-CPMV重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与CPMV通过化学偶联获得W-MSTN-CPMV、M-MSTN-CPMV或C-MSTN-CPMV重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与CPMV通过化学偶联获得W-MSTN-CPMV、M-MSTN-CPMV或C-MSTN-CPMV重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-CMV重组蛋白、M-MSTN-CMV重组蛋白或C-MSTN-CMV重组蛋白，所述CMV来自来自黄瓜花叶病毒。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述CMV位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述CMV的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述CMV的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码CMV的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的CMV。
本发明提供了W-MSTN-CMV、M-MSTN-CMV或C-MSTN-CMV重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码CMV的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-CMV、M-MSTN-CMV或C-MSTN-CMV重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码CMV的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-CMV、M-MSTN-CMV或C-MSTN-CMV重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与CMV通过化学偶联获得W-MSTN-CMV、M-MSTN-CMV或C-MSTN-CMV重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与CMV通过化学偶联获得W-MSTN-CMV、M-MSTN-CMV或C-MSTN-CMV重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-PapMV重组蛋白、M-MSTN-PapMV重组蛋白或C-MSTN-PapMV重组蛋白，所述PapMV来自来自木瓜花叶病毒。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述PapMV位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述PapMV的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述PapMV的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码PapMV的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的PapMV。
本发明提供了W-MSTN-PapMV、M-MSTN-PapMV或C-MSTN-PapMV重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码PapMV的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-PapMV、M-MSTN-PapMV或C-MSTN-PapMV重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码PapMV的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-PapMV、M-MSTN-PapMV或C-MSTN-PapMV重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与PapMV通过化学偶联获得W-MSTN-PapMV、M-MSTN-PapMV或C-MSTN-PapMV重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与PapMV通过化学偶联获得W-MSTN-PapMV、M-MSTN-PapMV或C-MSTN-PapMV重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述W-MSTN-PapMV、M-MSTN-PapMV或C-MSTN-PapMV重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-FHV重组蛋白、M-MSTN-FHV重组蛋白或C-MSTN-FHV重组蛋白，所述FHV来自兽棚病毒。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述FHV位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述FHV的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述FHV的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码FHV的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的FHV。
本发明提供了W-MSTN-FHV、M-MSTN-FHV或C-MSTN-FHV重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码FHV的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-FHV、M-MSTN-FHV或C-MSTN-FHV重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码AP205的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-FHV、M-MSTN-FHV或C-MSTN-FHV重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与FHV通过化学偶联获得W-MSTN-FHV、M-MSTN-FHV或C-MSTN-FHV重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与FHV通过化学偶联获得W-MSTN-FHV、M-MSTN-FHV或C-MSTN-FHV重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-HBsAg重组蛋白、M-MSTN-HBsAg重组蛋白或C-MSTN-HBsAg重组蛋白，所述HBsAg来自乙型肝炎表面抗原。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述HBsAg位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述HBsAg的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述HBsAg的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码HBSAG的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的HBsAg。
本发明提供了W-MSTN-HBsAg、M-MSTN-HBsAg或C-MSTN-HBsAg重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码HBsAg的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-HBsAg、M-MSTN-HBsAg或C-MSTN-HBsAg重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码HBsAg的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-HBsAg、M-MSTN-HBsAg或C-MSTN-HBsAg重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与HBsAg通过化学偶联获得W-MSTN-HBsAg、M-MSTN-HBsAg或C-MSTN-HBsAg重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与HBsAg通过化学偶联获得W-MSTN-HBsAg、M-MSTN-HBsAg或C-MSTN-HBsAg重组蛋白
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-IFUV重组蛋白、M-MSTN-IFUV重组蛋白或C-MSTN-IFUV重组蛋白，所述IFUV来自流感基质M1蛋白。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述IFUV位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述IFUV为流感病毒M1基质蛋白与HA蛋白共表达形成的病毒样颗粒。所述M1的氨基酸序列为：
所述HA的氨基酸序列为：
所述IFUV的氨基酸序列包括：
如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
或在SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述IFUV的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码IFUV的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的IFUV。
本发明提供了W-MSTN-IFUV、M-MSTN-IFUV或C-MSTN-IFUV重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码IFUV的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-IFUV、M-MSTN-IFUV或C-MSTN-IFUV重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码IFUV的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-IFUV、M-MSTN-IFUV或C-MSTN-IFUV重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与IFUV通过化学偶联获得W-MSTN-IFUV、M-MSTN-IFUV或C-MSTN-IFUV重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与IFUV通过化学偶联获得W-MSTN-IFUV、M-MSTN-IFUV或C-MSTN-IFUV重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-Ferritin重组蛋白、M-MSTN-Ferritin重组蛋白或C-MSTN-Ferritin重组蛋白，所述Ferritin来自幽门螺旋杆菌，为幽门螺旋杆菌的铁蛋白形成的纳米颗粒。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述Ferritin位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述Ferritin的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述Ferritin的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码Ferritin的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ IDNO：18所示的Ferritin。
本发明提供了W-MSTN-Ferritin、M-MSTN-Ferritin或C-MSTN-Ferritin重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸和编码Ferritin的核酸分别或以蛋白的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-Ferritin、M-MSTN-Ferritin或C-MSTN-Ferritin重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码Ferritin的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-Ferritin、M-MSTN-Ferritin或C-MSTN-Ferritin重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与Ferritin通过化学偶联获得W-MSTN-Ferritin、M-MSTN-Ferritin或C-MSTN-Ferritin重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与Ferritin通过化学偶联获得W-MSTN-Ferritin、M-MSTN-Ferritin或C-MSTN-Ferritin重组蛋白
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-Fc重组蛋白、M-MSTN-Fc重组蛋白或C-MSTN-Fc重组蛋白，所述Fc来源于人，为人IgG抗体的Fc端蛋白。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述Fc位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述Fc的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述Fc的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码Fc的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的Fc。
本发明提供了W-MSTN-Fc、M-MSTN-Fc或C-MSTN-Fc重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN、C-MSTN的核酸和编码Fc的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-Fc、M-MSTN-Fc或C-MSTN-Fc重组蛋白，其中，所述融合为将编码W-MSTN、M-MSTN、C-MSTN的核酸通过编码hinge和/或linker的核酸与Fc相连重组，所述hinge的氨基酸序列包括：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：20)；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-Fc、M-MSTN-Fc或C-MSTN-Fc重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与Fc通过化学偶联获得W-MSTN-Fc、M-MSTN-Fc或C-MSTN-Fc重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与Fc通过化学偶联获得W-MSTN-Fc、M-MSTN-Fc或C-MSTN-Fc重组蛋白。
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明具体实施例中，所述MSTN重组蛋白为W-MSTN-MBP重组蛋白、M-MSTN-MBP重组蛋白或C-MSTN-MBP重组蛋白，所述MBP为麦芽糖结合蛋白。所述W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN数量为n个，所述n为1～10的整数，具体的可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述n个W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN之间通过linker连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述MBP位于W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的N端或C端。
所述MBP的氨基酸序列包括：
或在SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；
或与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明中，所述MBP的制备方法包括固相合成和/或生物合成；所述生物合成为：通过将编码MBP的核酸克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得。所述固相合成为利用固相合成技术合成氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示的MBP。
本发明提供了W-MSTN-MBP、M-MSTN-MBP或C-MSTN-MBP重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括生物合成、固相合成或化学偶联。所述生物合成为将编码W-MSTN、M-MSTN、C-MSTN的核酸和编码MBP的核酸分别或以融合的形式克隆到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主后经表达获得W-MSTN-MBP、M-MSTN-MBP或C-MSTN-MBP重组蛋白，其中，所述融合包括利用编码linker的核酸将编码W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN的核酸与编码MBP的核酸连接，所述linker的序列为由GS组成的柔性片段，所述柔性片段包括(GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，具体的可以包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个；所述固相合成为利用固相合成技术合成W-MSTN-MBP、M-MSTN-MBP或C-MSTN-MBP重组蛋白的氨基酸序列；所述化学偶联包括将生物合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与MBP通过化学偶联获得W-MSTN-MBP、M-MSTN-MBP或C-MSTN-MBP重组蛋白，或将固相合成的W-MSTN、M-MSTN或C-MSTN分别与MBP通过化学偶联获得W-MSTN-MBP、M-MSTN-MBP或C-MSTN-MBP重组蛋白
相对应的，本发明还提供了：
I)、编码所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物；
本发明还提供了含有所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中还包括佐剂。本发明所述的疫苗中，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂，本发明对此不做限定。一些实施例中，采用铝佐剂制备所述MSTN重组蛋白的疫苗。所述疫苗中GnRH-VLP的浓度为800、400、200、100μg/mL，优选的，浓度为200μg/mL。
以该疫苗对动物进行免疫，能够获得增加体重、增加肌肉重量、提升骨骼肌力量、降低体脂的效果。因此，本发明还提供了上述疫苗在人或动物中增加肌肉、提升力量或某些疾病中降低体脂的应用。相应的，本发明还提供了偶联疫苗效力检验的方法，包括给予如前所述的疫苗。所述给予的免疫剂量为25μg、50μg、100μg和/或200μg，经免疫后14～100天，体重或骨骼肌增加5％～40％，具体为5％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％，抓力增加为3％～5％、5％～10％、10％～15％，体脂率降低0.5％～1.0％，1.0％～2.0％，2.0％～3.0％。
本发明提供了所述MSTN重组蛋白的制备方法，包括培养所述的宿主细胞，获得含有所述MSTN重组蛋白的培养产物。
本发明提供了组合物，包括所述的MSTN重组蛋白、MSTN抗原或任何激发或抑制动物骨骼肌生长的抗原。
进一步的，所述组合物还包括可以接受的佐剂，所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂。
本发明提供了所述MSTN重组蛋白、所述生物材料或所述组合物在制备亚单位疫苗中的应用。
本发明提供了MSTN重组疫苗，其包括本发明所述的MSTN重组蛋白或所述的组合物。
进一步的，所述的MSTN重组蛋白可以是W-MSTN-AP205重组蛋白、M-MSTN-AP205重组蛋白、C-MSTN-AP205重组蛋白、W-MSTN-Qβ重组蛋白、M-MSTN-Qβ重组蛋白、C-MSTN-Qβ重组蛋白、W-MSTN-MS2重组蛋白、M-MSTN-MS2重组蛋白、C-MSTN-MS2重组蛋白、W-MSTN-T4重组蛋白、M-MSTN-T4重组蛋白、C-MSTN-T4重组蛋白、W-MSTN-TMV重组蛋白、M-MSTN-TMV重组蛋白、C-MSTN-TMV重组蛋白、W-MSTN-CPMV重组蛋白、M-MSTN-CPMV重组蛋白、C-MSTN-CPMV重组蛋白、W-MSTN-CMV重组蛋白、M-MSTN-CMV重组蛋白、C-MSTN-CMV重组蛋白、W-MSTN-PapMV重组蛋白、M-MSTN-PapMV重组蛋白、C-MSTN-PapMV重组蛋白、W-MSTN-FHV重组蛋白、M-MSTN-FHV重组蛋白、C-MSTN-FHV重组蛋白、W-MSTN-HBsAg重组蛋白、M-MSTN-HBsAg重组蛋白、C-MSTN-HBsAg重组蛋白、W-MSTN-IFUV重组蛋白、M-MSTN-IFUV重组蛋白、C-MSTN-IFUV重组蛋白、W-MSTN-Ferritin重组蛋白、M-MSTN-Ferritin重组蛋白、C-MSTN-Ferritin重组蛋白、W-MSTN-Fc重组蛋白、M-MSTN-Fc重组蛋白、C-MSTN-Fc重组蛋白、W-MSTN-MBP重组蛋白、M-MSTN-MBP重组蛋白或C-MSTN-MBP重组蛋白，本发明对此不作限定。
在本发明的一些实施例中，所述MSTN重组疫苗为MSTN偶联病毒样颗粒、纳米颗粒，或与外源融合蛋白融合表达配制的疫苗；所述MSTN蛋白为人或其他动物的MSTN蛋白，如犬、猫、猪、鸡等，或同源性有90％以上的蛋白，MSTN为全长蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白；所述VLP包括AP205、Qβ，MS2、T4、TMV、CPMV、CMV、PapMV、FHV、HBsAg和/或IFUV，所述纳米颗粒包括Ferritin等，所述外源融合蛋白如Fc、MBP等，本发明对此不做限定。
本发明提供的VLP、纳米颗粒、外源融合蛋白，具有多种VLP、纳米颗粒、外源融合蛋白平台，对于VLP、纳米颗粒、外源融合蛋白的种类不做限定，增加了MSTN联合蛋白疫苗的种类和数量。
本发明还提供了所述MSTN重组疫苗的制备方法，包括将所述的MSTN重组蛋白与佐剂混合；或将所述的组合物与缓冲液混合。
本发明提供了动物增加体重、增加骨骼肌、增加肌肉力量、减少体脂的方法，包括给予本发明所述的MSTN重组疫苗。
能够应用的动物包括鸟类和哺乳动物等。
本发明提供了MSTN重组蛋白，其抗原纯度高，安全性好，将其用于动物免疫，制成的MSTN重组疫苗，对小鼠等动物没有致病性，容易通过安全性评价，同时该疫苗具有高效的抗原呈递方式，能够有效诱导免疫系统产生免疫保护应答，激发动物肌肉生长，在肌肉萎缩等的相关疾病防治领域具有中药的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了MSTN重组疫苗及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明中，所述的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。所述基因序列可以采用野生型序列，也可经过密码子优化，本发明对此不做限定。
本发明中，所述的表达单元包括本发明所述的核酸以单个或多个串联形式与启动子、终止子组成的表达单元，本发明对此不做限定。
本发明中，所述重组表达载体是指核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对细菌中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。所述重组表达载体根据宿主进行选择。本发明中所述的表达载体可为环状亦可为线性，本发明对此不做限定。
进一步的，本发明所述的宿主包括细菌、真菌、病毒或动物。所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于大肠杆菌。所述真菌包括霉菌、酵母、蕈菌；所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、毕赤酵母和假丝酵母等。所述病毒包括但不限于包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、阮病毒。所述动物包括人、鼠、兔、猪、斑马鱼等。所述编码重组蛋白的核酸在宿主中的表达方式可以为整合型也可为游离型，本发明对此亦不做限定。
以原核宿主为例，其可以是大肠杆菌，也可以是芽孢杆菌，还可以是链霉菌或者蓝细菌等；其质粒可以为pET系列质粒、pGEX系列质粒、pKBP系列质粒或pcDNA系列质粒。
本发明所述佐剂为免疫调节剂或免疫增强剂，包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂。
在本发明的一些实施例中，所述佐剂为氢氧化铝佐剂。
本发明中，所述肌肉萎缩相关疾病包括贝克型肌肉萎缩症、杜氏肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症、胰腺癌、晚期肾病等引起的肌肉萎缩或流失等。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白的制备
(1)重组质粒的构建：将人W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白(C-MSTN)，在C端添加6个组氨酸(His)标签，其核酸序列经密码子优化后，由华大基因合成并克隆至到pcDNA3.4载体上。
(2)HEK293F细胞准备：提前一天接种适量的HEK293F细胞(约1.5×106cell/mL)至培养瓶中，当细胞活率达到90％以上时，密度为23×106cell/mL，即可进行转染实验。
(3)瞬时转染和表达：用150mM的NaCl或不含血清的培养基稀释20μg pcDNA3.4质粒至总体积为0.5mL；用150mM的NaCl或不含血清的培养基稀释60μL PEI转染试剂(1mg/mL)至总体积为0.5mL，将PEI与pcDNA3.4质粒混合，静置约10min，使PEI-DNA复合物形成。将转染液逐滴加入到细胞培养液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回摇床继续培养，旋松瓶口以满足后续细胞高密度生长的溶氧以及CO2排放需求，防止因CO2积累导致培养液pH值过低(培养液呈黄色)，影响细胞生长。
(4)蛋白纯化：转染的细胞培养72～96h后，离心取上清，0.22μm滤膜过滤后，使用过镍柱进行亲和层析，上样平衡后，用0.8mol/L咪唑洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰。即为纯化后的W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白。
实施例2CMV VLP制备
(1)重组质粒的构建：将表达CMV的核酸序列经密码子优化后，由通用生物公司合成到pET28a质粒的NdeI酶切位点及XhoI酶切位点之间，到得到重组质粒CMV-pET28a；
(2)重组质粒转染至表达菌株：将CMV-pET28a重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，得到重组表达菌株CMV-pET28a-BL21；
(3)重组菌的培养及目的蛋白诱导表达：将重组表达菌株CMV-pET28a-BL21，涂布在含100μg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～2.0。将其转接到500mL含100μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～1.5左右。加入终浓度为0.5mmol/L的β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导剂，20℃过夜诱导表达。
(4)菌体收集及破碎：菌液经过8000rpm离心后，收集菌体。取离心后的菌体，按照重量与体积比1∶10，加入0.01mol/L的PBS溶液，重悬，设定高压均质机参数为900bar，2～8℃高压破碎2次。
(5)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(6)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的CMV病毒样颗粒蛋白。
实施例3PapMV VLP制备
(1)重组质粒的构建：将表达PapMV的核酸序列经密码子优化后，由华大基因公司合成到pET28a质粒的NdeI酶切位点及XhoI酶切位点之间，到得到重组质粒PapMV-pET28a；
(2)重组质粒转染至表达菌株：将PapMV-pET28a重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，得到重组表达菌株PapMV-pET28a-BL21；
(3)重组菌的培养及目的蛋白诱导表达：将重组表达菌株PapMV-pET28a-BL21，涂布在含100μg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～2.0。将其转接到500mL含100μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～1.5左右。加入终浓度为0.5mmol/L的β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导剂，20℃过夜诱导表达。
(4)菌体收集及破碎：菌液经过8000rpm离心后，收集菌体。取离心后的菌体，按照重量与体积比1∶10，加入0.01mol/L的PBS溶液，重悬，设定高压均质机参数为900bar，2～8℃高压破碎2次。
(5)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(6)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的PapMV病毒样颗粒蛋白。
实施例4AP205 VLP的制备
(1)重组质粒的构建：将表达AP205的核酸序列经密码子优化后，由华大基因公司合成到pET28a质粒的NdeI酶切位点及XhoI酶切位点之间，到得到重组质粒AP205-pET28a；
(2)重组质粒转染至表达菌株：将AP205-pET28a重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，得到重组表达菌株AP205-pET28a-BL21；
(3)重组菌的培养及目的蛋白诱导表达：将重组表达菌株AP205-pET28a-BL21，涂布在含100μg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～2.0。将其转接到500mL含100μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～1.5左右。加入终浓度为0.5mmol/L的β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导剂，20℃过夜诱导表达。
(4)菌体收集及破碎：菌液经过8000rpm离心后，收集菌体。取离心后的菌体，按照重量与体积比1∶10，加入0.01mol/L的PBS溶液，重悬，设定高压均质机参数为900bar，2～8℃高压破碎2次。
(5)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(6)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的AP205病毒样颗粒蛋白。
实施例5QβVLP的制备
(1)重组质粒的构建：将表达Qβ的核酸序列经密码子优化后，由华大基因公司合成到pET28a质粒的NdeI酶切位点及XhoI酶切位点之间，到得到重组质粒Qβ-pET28a；
(2)重组质粒转染至表达菌株：将Qβ-pET28a重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，得到重组表达菌株Qβ-pET28a-BL21；
(3)重组菌的培养及目的蛋白诱导表达：将重组表达菌株Qβ-pET28a-BL21，涂布在含100μg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～2.0。将其转接到500mL含100μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～1.5左右。加入终浓度为0.5mmol/L的β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导剂，20℃过夜诱导表达。
(4)菌体收集及破碎：菌液经过8000rpm离心后，收集菌体。取离心后的菌体，按照重量与体积比1∶10，加入0.01mol/L的PBS溶液，重悬，设定高压均质机参数为900bar，2～8℃高压破碎2次。
(5)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(6)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的Qβ病毒样颗粒蛋白。
实施例6MS2 VLP的制备
大肠杆菌MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子。研究发现，体外将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因以及包含基因调节元件的5’非编码序列的基因克隆到表达载体中，诱导表达后的蛋白可自我组装为成熟的类病毒颗粒(virus like particles，VLPs)，且在其外壳蛋白基因的特定位点处插入几个基因可以表达成外源氨基酸展示的VLPs状。
(1)重组质粒的构建：将成熟酶蛋白、外壳蛋白基因序列委托基因公司合成到pET28a质粒载体，得到重组质粒MS2-pET28a。
(2)重组质粒转入表达菌株：将重组质粒MS2-pET28a转入BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株，获得MS2-pET28a-BL21重组表达菌株。
(3)重组质粒MS2-pET28a制备：将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5μL接种到5mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃震荡培养14～16小时，培养后取1mL菌液送测序。剩余菌液用质粒小提取试剂盒提取质粒，Nanodrop2000核酸检测仪检测核酸浓度。
(4)菌体培养及MS2 VLP表达：转化BL21(DE3)表达菌株，摇菌后离心浓缩，涂布卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，刮取菌落，接种10mL含卡那霉素的LB培养基，37℃200rpm摇菌至菌液OD600值0.8左右。将其转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃180rpm摇菌至菌液OD600值0.8左右。加入IPTG诱导剂，30℃过夜表达。第三天4500rpm，15min离心收集菌体。超声破碎菌体30min。超声结束后，9500rpm，20min，4℃收集上清液。
(5)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(6)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的Qβ病毒样颗粒蛋白。
实施例7T4 VLP的制备
噬菌体T4衣壳含有两种非必需的外部蛋白Soc和Hoc，允许以肽、结构域、全长蛋白甚至多亚基复合物的形式高密度排列抗原表位。噬菌体T4 VLP具有很高的免疫原性，不需要佐剂，并对细菌和病毒病原体提供完全保护。将T4衣壳基因序列Soc或Hoc基因序列克隆到原核表达载体得到重组表达载体，通过大肠杆菌表达系统的表达和纯化可以获得T4VLP。
(1)重组质粒的构建：将T4 Soc或Hoc基因序列委托基因公司合成到pET28a质粒载体，得到重组质粒T4-pET28a。
(2)重组质粒转入表达菌株：将重组质粒T4-pET28a转入BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株，获得T4-pET28a-BL21重组表达菌株。
(3)重组质粒T4-pET28a制备：将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5μl接种到5mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃震荡培养14～16小时，培养后取1mL菌液送测序。剩余菌液用质粒小提取试剂盒提取质粒，Nanodrop2000核酸检测仪检测核酸浓度。
(4)菌体培养及T4 VLP表达：转化BL21(DE3)表达菌株，摇菌后离心浓缩，涂布卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，刮取菌落，接种10mL含卡那霉素的LB培养基，37℃200rpm摇菌至菌液OD600值0.8左右。将其转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃180rpm摇菌至菌液OD600值0.8左右。加入IPTG诱导剂，30℃过夜表达，收获菌液。
(5)菌体收集及破碎：菌液经过8000rpm离心后，收集菌体。取离心后的菌体，按照重量与体积比1∶10，加入0.01mol/L的PBS溶液，重悬，设定高压均质机参数为900bar，2～8℃高压破碎2次。
(6)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(7)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的T4病毒样颗粒蛋白。
实施例8TMV VLP制备
烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)是一种植物病毒，不能感染动物细胞，但已证明能与哺乳动物树突状细胞相互作用并刺激它们，激发免疫反应。
(1)重组质粒的构建：将TMV基因密码子优化后，委托华大基因合成到pKBP121表达载体，得到重组质粒TMV-pKBP121。
(2)重组质粒转入植物表达系统：将重组质粒TMV-pKBP121瞬时转染烟草中(Nicotiana benthamiana，Nb)。
(3)TMV-pKBP121纯化：收获转染的植物，分离可溶性蛋白组分，并通过蛋白A亲和性和阴离子交换色谱组合纯化TMV VLP。
实施例9CPMV VLP制备
(1)重组质粒的构建：将表达CPMV的核酸序列经密码子优化后，由华大基因公司合成到pET28a质粒的NdeI酶切位点及XhoI酶切位点之间，到得到重组质粒CPMV-pET28a；
(2)重组质粒转染至表达菌株：将CPMV-pET28a重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，得到重组表达菌株CPMV-pET28a-BL21；
(3)重组菌的培养及目的蛋白诱导表达：将重组表达菌株CPMV-pET28a-BL21，涂布在含100μg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～2.0。将其转接到500mL含100μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm摇菌至菌液OD600为0.8～1.5左右。加入终浓度为0.5mmol/L的β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导剂，20℃过夜诱导表达。
(4)菌体收集及破碎：菌液经过8000rpm离心后，收集菌体。取离心后的菌体，按照重量与体积比1∶10，加入0.01mol/L的PBS溶液，重悬，设定高压均质机参数为900bar，2～8℃高压破碎2次。
(5)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(6)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的CPMV病毒样颗粒蛋白。
实施例10FHV VLP制备
兽棚病毒(Flock House Virus，FHV)，一种无包膜昆虫RNA病毒，二十面体衣壳由180个相同的外壳蛋白亚基组成。基于其遗传简单性、特殊产量和高物理化学稳定性，并且由于在动物和人类中应用FHV没有已知的安全问题，该病毒非常适合各种生物技术应用。
(1)重组质粒的构建：将FHV外壳蛋白基因序列密码子优化后，委托基因公司合成到pBacPAK9质粒载体，得到重组质粒FHV-pBacPAK9；
(2)重组质粒转入昆虫细胞：将重组质粒FHV-pBacPAK9瞬时转染到昆虫细胞中，收集上清，再次用上清感染SF9昆虫细胞；
(3)FHV VLP纯化：当SF9细胞活率下降到30％以下时，离心收集上清，0.22μm滤膜过滤后，经Q柱层析后，使用100KD膜包浓缩换液，再使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的PapMV病毒样颗粒蛋白。
实施例11HBsAg VLP制备
乙型肝炎疫苗基于主要的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，这种蛋白质能够组装成所谓的病毒样颗粒(VLPs)。
(1)重组质粒的构建：将HBsAg基因密码子优化后，委托基因公司合成到酵母表达载体pPIC9K中，得到重组质粒HBs-pPIC9K；
(2)重组质粒线性化：将重组质粒进行单酶切，然后进行线性化；
(3)电转酵母GS115菌株：将重组质线性化的粒HBs-pPIC9K电转酵母GS115菌株，接种含MD平板上进行筛选；
(4)蛋白表达：从MD平板上选取单克隆以及含5.0mg/mL G418的YPD平板上的所有克隆，在含有20mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，28℃、200rpm培养，当培养物OD600达到20～24时，将细胞重悬于含有20mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，每24h往培养瓶中加入纯甲醇，浓度为1～5％，进行诱导表达。诱导96h后，10000g离心，收集培养物。
(5)菌体收集及破碎：取离心后的菌体，按照重量与体积比1∶10，加入0.01mol/L的PBS溶液，重悬，设定高压均质机参数为1300bar，2～8℃高压破碎3次。
(6)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，使用离子交换层析柱进行初步纯化。再使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的HBsAgVLP。
实施例12IFUV VLP制备
(1)重组质粒的构建：流感病毒的HA基因、M1基因密码子优化后，委托基因合成公司合成到pFastBac I上，获得pFastBac-M1-HA双基因串联表达的供体质粒。
(2)重组Bacmid构建及鉴定：将获得pFastBac-M1-HA双基因串联表达的供体质粒2μl转染DH10Bac感受态细胞，在SOC培养基中，37℃、200rpm培养4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养48h以上，待蓝白菌落明显时，挑取白色单一菌落至5mL卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。PCR产物经鉴定正确后，提取重组杆粒。
(3)将重组杆粒转染SF9昆虫细胞，培养72h后，收集上清病毒液。
(4)VLP的制备及纯化：将收集的病毒液接种悬浮培养的SF9细胞，27℃摇床110rpm培养至细胞活力在20％以下，收获病毒液。离心取上清，0.22μm滤膜过滤后，经Q柱层析后，使用100KD膜包浓缩换液，再使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的IFUV VLP。
实施例13Ferritin纳米颗粒制备
(1)重组质粒的构建：将表达Ferritin的核酸序列经密码子优化后，由基因合成公司合成到pET28a质粒的NdeI酶切位点及XhoI酶切位点之间，到得到对应的重组质粒Ferritin-pET28a；
(2)重组质粒转入表达菌株：将上述重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，得到重组表达菌株；
(3)菌体培养及病毒样颗粒纯化：培养所述重组表达菌株，IPTG诱导表达获得相应的病毒样颗粒。
(4)内毒素去除：菌体破碎后，8000rpm离心取上清液，加入Triton X-114至终浓度1.5％，2～8℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，离心去除沉淀，收集上清液。按上述方法重复处理2次。
(5)蛋白纯化：去除内毒素的蛋白液经100KD膜包浓缩换液后，使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后的病毒样颗粒蛋白。
实施例14W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白融合Fc表达
(1)重组质粒的构建：将人W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白通过hinge(氨基酸序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG)连接到Fc端，然后将连接的蛋白基因经密码子优化后，由基因合成公司并克隆至到pcDNA3.4载体上。
(2)HEK293F细胞准备：提前一天接种适量的HEK293F细胞(约1.5×106cell/mL)至培养瓶中，当细胞活率达到90％以上时，密度为2-3×106cell/mL，即可进行转染实验。
(3)瞬时转染和表达：用150mM的NaCl或不含血清的培养基稀释20μg pcDNA3.4质粒至总体积为0.5mL；用150mM的NaCl或不含血清的培养基稀释60μL PEI转染试剂(1mg/mL)至总体积为0.5mL，将PEI与pcDNA3.4质粒混合，静置约10min，使PEI-DNA复合物形成。将转染液逐滴加入到细胞培养液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回摇床继续培养，旋松瓶口以满足后续细胞高密度生长的溶氧以及CO2排放需求，防止因CO2积累导致培养液pH值过低(培养液呈黄色)，影响细胞生长。
(4)蛋白纯化：转染的细胞培养72～96h后，离心取上清，使用ProteinA亲和层析进行亲和层析，上样平衡后，洗脱，收集洗脱峰。即为纯化后的W-MSTN或M-MSTN或MSTN的C端活性区域融合Fc蛋白。
实施例15W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白融合MBP表达
(1)重组质粒的构建：将人W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白通过GS或GGS或GGGS或GGGGS或GSG)m，所述m为1～10之间的整数，连接到MBP的N端，然后将连接的蛋白基因经密码子优化后，由基因合成公司并克隆至到pcDNA3.4载体上。
(2)HEK293F细胞准备：提前一天接种适量的HEK293F细胞(约1.5×106cell/mL)至培养瓶中，当细胞活率达到90％以上时，密度为(2～3)×106cell/mL，即可进行转染实验。
(3)瞬时转染和表达：用150mM的NaCl或不含血清的培养基稀释20μg pcDNA3.4质粒至总体积为0.5mL；用150mM的NaCl或不含血清的培养基稀释60μL PEI转染试剂(1mg/mL)至总体积为0.5mL，将PEI与pcDNA3.4质粒混合，静置约10min，使PEI-DNA复合物形成。将转染液逐滴加入到细胞培养液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回摇床继续培养，旋松瓶口以满足后续细胞高密度生长的溶氧以及CO2排放需求，防止因CO2积累导致培养液pH值过低(培养液呈黄色)，影响细胞生长。
(4)蛋白纯化：转染的细胞培养72～96h后，离心取上清，使用ProteinA亲和层析进行亲和层析，上样平衡后，洗脱，收集洗脱峰。即为纯化后的W-MSTN或M-MSTN或MSTN的C端活性区域融合MBP蛋白。
实施例16W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白与AP205 VLP、QβVLP，MS2 VLP、T4 VLP、TMV VLP、CPMV VLP、CMV VLP、PapMV VLP、FHV VLP、EILV VLP、HBsAgVLP、Ferritin纳米颗粒偶联
(1)偶联：利用化学试剂SMPH，即琥珀酰亚胺6-((β-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸)，TCEP.HCL，即三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，进行蛋白间的化学偶联。其中，SMPH与VLP或Ferritin纳米颗粒的摩尔浓度比为5～10∶1进行混合；TCEP.HCL与W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白摩尔浓度比为5～10∶1混合；分别于25℃，400rpm的恒温器里混匀30min，使其偶联。然后再将2种偶联的蛋白溶液，按照1∶2的摩尔浓度比进行混合，25℃，400rpm的恒温器里混匀30min。即获得偶联蛋白的VLP。
(2)镍离子亲和层析纯化：将偶联的蛋白液过镍柱，上样平衡后，用0.8mol/L咪唑洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰。
(3)分子筛层析：使用S300分子筛层析填料进行层析纯化，收集目的蛋白峰，即为纯化后W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白偶联的VLP，或W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白的纳米颗粒。
实施例17MSTN联合蛋白疫苗的配制及对普通小鼠体重、肌肉、肌肉收缩力的检测
(1)配苗与免疫：取纯化后的W-MSTN蛋白或M-MSTN蛋白或MSTN的C端活性区域蛋白偶联的VLP或纳米颗粒，或与Fc融合表达的重组蛋白，或与MBP融合表达的重组蛋白，分别与氢氧化铝佐剂按照体积比1∶1混合配制疫苗，病毒样颗粒浓度为蛋白浓度为，200μg/mL，取5周龄体重相似的雄性C57BL/6J小鼠，每组5只，进行免疫，0.5mL/只，免疫程序为在0天、14天各免疫1次，同时设置注射相同剂量佐剂对照组5只，注射相同剂量生理盐水对照组5只。
(2)检测：分别于0天、14天、28天、42天，检测这些小鼠的体重；免后42天，使用定量核磁共振仪检测小鼠体脂，从而计算出除体脂外的重量，以间接分析小鼠整体的肌肉生长量；使用抓力器检测小鼠的抓力，对比各组小鼠的抓力，已检验肌肉的力量；处死小鼠后，检测腿部肌肉的重量。
实施例18MSTN联合蛋白疫苗的对肥胖小鼠减肥效果检测
(1)免疫：取5周龄体重相似的肥胖C57BL/6J小鼠，此小鼠为基因突变引起的肥胖小鼠，每组5只，进行免疫，0.5mL/只，免疫程序为在0天、14天各免疫1次，同时设置注射相同剂量佐剂对照组5只，注射相同剂量生理盐水对照组5只。
(2)体重、体脂、腿部肌肉重量检测：分别于免后0天、14天、28天、42天，检测这些小鼠的体重，使用定量核磁共振仪检测小鼠体脂，从而计算出除体脂外的重量，以间接分析小鼠整体的肌肉生长量。处死小鼠，剥离小鼠皮，拍照，打开小鼠腹腔，拍照，以直观观察小鼠体脂和肌肉形态和量。剥离小鼠后腿部肌肉，称重，以对比腿部肌肉的重量。
(3)血清学检测：处死小鼠时，采血测定MSTN抗体水平。检测血常规(血糖、血脂、Leptin(瘦素)、胆固醇)以及胰岛素水平。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.MSTN重组蛋白，其特征在于，包括病毒样颗粒蛋白、纳米颗粒蛋白、Fc或MBP中的至少一种和MSTN；
所述病毒样颗粒蛋白包括AP205、Qβ，MS2、T4、TMV、CPMV、CMV、PapMV、FHV、HBsAg和/或IFUV；
所述纳米颗粒蛋白包括Ferritin。
2.根据权利要求1所述的MSTN重组蛋白，其特征在于，所述MSTN具有如下所示的氨基酸序列：
(1)、如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或
(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)、与如(1)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列；
所述AP205来自AP205噬菌体衣壳；
所述Qβ来自Qβ噬菌体衣壳；
所述MS2来MS2噬菌体衣壳；
所述T4来自T4噬菌体衣壳；
所述TMV来自烟草花叶病毒；
所述CPMV来自豇豆花叶病毒；
所述CMV来自黄瓜花叶病毒；
所述PapMV来自木瓜花叶病毒；
所述FHV来自兽棚病毒；
所述HBsAg来自乙型肝炎表面抗原；
所述IFUV来自流感基质M1蛋白；
所述Ferritin来自幽门螺旋杆菌；
所述Fc蛋白为IgG抗体的Fc端蛋白；
所述MBP为麦芽糖结合蛋白。
3.生物材料，其特征在于，包括如下任意项：
I)、编码权利要求1或2所述MSTN重组蛋白的核酸；
II)、含有如I)所述核酸的表达单元；
III)、含有如I)所述核酸或如II)所述表达单元的重组载体；
IV)、转化或转染有如III)所述重组载体的宿主细胞；
V)、如IV)所述宿主细胞的培养产物。
4.权利要求1或2所述MSTN重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求3中所述的宿主细胞，获得含有权利要求1或2所述MSTN重组蛋白的培养产物。
5.组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的MSTN重组蛋白、MSTN抗原或任何激发或抑制动物肌肉生长的抗原。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，还包括可以接受的佐剂；所述佐剂包括铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂或聚集体结构佐剂。
7.权利要求1或2所述的MSTN重组蛋白、权利要求3所述的生物材料或权利要求5或6所述的组合物在制备重组疫苗和/或防治肌肉萎缩相关疾病的药物中的应用。
8.MSTN重组疫苗，其特征在于，原料包括权利要求1或2所述的MSTN重组蛋白或权利要求5或6所述的组合物。
9.权利要求8所述MSTN重组疫苗的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1或2所述的MSTN重组蛋白与佐剂混合；或将权利要求5或6所述的组合物与缓冲液混合。
10.激发动物肌肉生长的方法，其特征在于，包括给予权利要求8所述的MSTN重组疫苗。
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