CN120026059A

CN120026059A - 一种提高慢病毒包装滴度的组合物及慢病毒包装方法及其应用

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Publication number: CN120026059A
Application number: CN202510138535.3A
Authority: CN
Inventors: 李栋; 梁欣欣; 郭晶
Original assignee: Beijing Beiqi Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing Beiqi Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2025-02-08
Filing date: 2025-02-08
Publication date: 2025-05-23

Abstract

本发明提供了一种提高慢病毒包装滴度的组合物及慢病毒包装方法及其应用，属于慢病毒包装技术领域。一种提高慢病毒包装滴度的组合物，包括三质粒系统、转染试剂、宿主细胞、转染辅助试剂和浓缩用试剂；所述三质粒系统包括质量比的(1.8～10.2)：(1.8～10.2)：(0.8～1.2)的编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒；其中转染试剂包括PEI MAX；宿主细胞包括悬浮培养细胞；转染辅助试剂包括补充剂(Supplement)和增强剂(Enhancer)；浓缩用试剂包括PEG8000。本发明提供的组合物能够包装得到高滴度的慢病毒，适用于体外细胞基因改造，尤其可高效感染HSPC。

Description

一种提高慢病毒包装滴度的组合物及慢病毒包装方法及其应用

技术领域

本发明属于慢病毒包装技术领域，具体涉及一种提高慢病毒包装滴度的组合物及慢病毒包装方法及其应用。

背景技术

造血干细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)能够自我更新并分化成所有的血细胞谱系，在体外经某些因素调节可产生多种血液/免疫细胞，包括骨髓细胞和NK、B和T细胞等免疫细胞，是诱导iPSC分化到NK细胞/T细胞的重要阶段。对HSPC的基因操作有助于深入理解造血系统的生物学机制，以及开发针对血液系统疾病的治疗策略。

慢病毒因其能够高效整合到宿主基因组、可感染分裂和非分裂细胞等特性，成为HSPC基因传递的重要工具。目前用于HSPC基因传递的慢病毒包装系统多为三质粒系统，分别为编码包膜蛋白基因的质粒、编码gag、pol、rev等蛋白基因的质粒及含目的基因的穿梭质粒共同转染293T细胞，得到重组慢病毒。然而，目前的慢病毒包装体系及感染方法面临病毒滴度偏低和感染效率不佳等问题，制约了后续实验的顺利推进。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高慢病毒包装滴度的组合物，通过优化适合慢病毒的转染试剂种类和增强转染效率的试剂组合，能极大提高包装的慢病毒的滴度。

本发明提供了一种提高慢病毒包装滴度的组合物，包括三质粒系统、转染试剂、宿主细胞、转染辅助试剂和浓缩用试剂；

所述三质粒系统包括编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒；所述编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒的质量比为(1.8～10.2)：(1.8～10.2)：(0.8～1.2)；

所述转染试剂包括PEI和/或PEI MAX；

所述宿主细胞包括悬浮培养细胞和/或贴壁培养细胞；

所述转染辅助试剂包括补充剂和增强剂；

所述浓缩用试剂包括PEG8000和/或50KDa超滤管。

优选的，所述编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒的质量比为(1.8～2.2)：(1.8～2.2)：(0.8～1.2)。

优选的，所述悬浮培养细胞包括LV293F细胞；所述贴壁培养细胞包括HEK293T细胞。

本发明提供了一种基于所述组合物提高慢病毒滴度的包装方法，包括以下步骤：

将所述组合物中三质粒系统混合，得到质粒体系；

将转染试剂稀释后孵育1～5min后，与所述质粒体系混合静置后加入到宿主细胞中进行转染，同时添加补充剂，待培养6～12h时添加增强剂继续培养，浓缩收集慢病毒。

优选的，所述转染时，转染试剂的工作浓度为0.2～1％；

所述补充剂的工作浓度为3％～8％；

所述增强剂的工作浓度为3％～6％。

优选的，当浓缩用试剂为PEG8000时，所述PEG8000的质量百分比为8％～12％。

优选的，当所述宿主细胞为LV293F细胞时，所述培养和继续培养均为震荡培养；所述震荡培养的转速为120～150rpm。

本发明提供了所述组合物或所述包装方法在制备慢病毒感染的造血干细胞中的应用。

本发明提供了一种体外条件下慢病毒感染造血干细胞的方法，包括以下步骤：

将造血干细胞接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板，加入终浓度0.1～1mg/mL的慢病毒感染增强剂Lentiboost后培养，得到待感染细胞；

将所述包装方法包装得到的慢病毒感染所述待感染细胞，感染体系中含经离心或不离心处理后培养，得到慢病毒感染的造血干细胞。

优选的，所述人纤维连接蛋白的包被浓度包括10～100μg/mL。

本发明提供了一种提高慢病毒包装滴度的组合物，包括三质粒系统、转染试剂、宿主细胞、转染辅助试剂和浓缩用试剂；所述三质粒系统包括编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒；所述编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒的质量比为(1.8～10.2)：(1.8～10.2)：(0.8～1.2)；所述转染试剂包括PEI和/或PEI MAX；所述宿主细胞包括悬浮培养细胞和/或贴壁培养细胞；所述转染辅助试剂包括补充剂和增强剂；所述浓缩用试剂包括PEG8000和/或50KDa超滤管。本发明提供的组合物能够制备得到高滴度的慢病毒，慢病毒滴度达到1.66E+09TU/mL。本提供的组合物为造血干细胞(HSPC)的慢病毒高效感染提供了基础。

本发明提供的组合物，具体优化了三质粒系统的转染比例，同时优化了转染试剂种类、浓缩用试剂种类以及宿主细胞的培养类。实验表明PEI MAX比PEI更能有效提高转染效率，进而提高慢病毒包装滴度；同时三质粒的转染比例优化实验结果表明，三质粒系统按照2:2:1的转染比例转染宿主细胞，比2:1:1和10:10:1处理组更能提高转染效率；同时病毒浓缩用试剂优化结果表明，PEG8000浓缩比50KDa超滤管浓缩具有更明显的优势，浓缩效果提高了4倍多。此外，本发明还分别以悬浮培养的LV293F和贴壁培养的HEK293T为宿主细胞进行慢病毒包装，结果表明，悬浮培养的LV293F不仅提高了慢病毒包装滴度，大大提高了包装效率，还能提高包装得到的病毒的感染活性，悬浮体系培养得到慢病毒的GFP阳性率是贴壁体系的近4倍。可见，本发明提供的组合物能够提高慢病毒对造血干细胞的效率，为HSPC的基因改造提供了基础。

附图说明

图1为穿梭质粒pCDH-MSCV-MCS-EF1α-CopGFP-T2A-Puro图谱；

图2为包膜质粒PMD2.G图谱；

图3为包装质粒psPAX2图谱；

图4为不同穿梭质粒与包装质粒比例转染细胞后，获得的慢病毒重新感染HEK293T细胞的GFP荧光图

图5为悬浮体系与贴壁体系获得的慢病毒滴度对比

图6为悬浮体系和贴壁体系包装获得的慢病毒感染HEK293T细胞后的GFP荧光图(a)和GFP阳性比的检测流式图(b)；

图7为慢病毒不同滴度感染HSPC后，检测GFP阳性比的流式图，其中a为5MOI；b为10MOI处理组；c为20MOI处理组；d为40MOI处理组。

具体实施方式

本发明提供了一种提高慢病毒包装滴度的组合物，包括三质粒系统、转染试剂、宿主细胞、转染辅助试剂和浓缩用试剂。

在本发明中，所述组合物中三质粒系统包括编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒。在本发明实施例中，所述含目的基因的穿梭质粒为pCDH-MSCV-MCS-EF1α-CopGFP-T2A-Puro。以GFP为目标基因代表说明慢病毒包装效果。pCDH-MSCV-MCS-EF1α-CopGFP-T2A-Puro，谱图见图1，是一种基于HIV的双启动子载体，可高效转染细胞和构建稳定细胞系。该载体使用MSCV和EF1α启动子驱动目的基因或报告基因的高水平和中等水平表达。EF1α启动子在造血细胞系中，表现优于CMV启动子的表达。MSCV启动子结合HIV LTR的U3区段，可显著提高CD34+造血细胞的转基因表达水平，并在胚胎干细胞中减少转录沉默。通过在MSCV LTR的CpG缺陷版本中融合HIV LTR，载体可在基因组整合后实现靶基因和报告基因的高效表达。2A肽元件则确保两种蛋白质在单个启动子驱动下均获得充分表达，避免了启动子干扰和表达不平衡的问题。所述包膜质粒PMD2.G的序列如图2所示。gag-pol包装质粒psPAX2的谱图如图3所示。本发明对所述三质粒系统的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的三质粒系统的构建方法即可。

在本发明中，所述编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒的质量比为(1.8～10.2)：(1.8～10.2)：(0.8～1.2)。为了优化转染效率，本发明一个实施例中，编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒分别以2:1:1、2:2:1和10:10:1的比例进行转染，结果表明2:2:1处理组细胞GFP阳性比例最高，其次为10:10:1，2:1:1处理组转染效果最差。

在本发明中，所述组合物中所述转染试剂包括PEI和/或PEI MAX，优选为PEI MAX。在本发明一个实施例中，分别以PEI和PEI MAX为转染试剂进行慢病毒包装，结果表明，PEIMAX转染的组别病毒滴度更高，说明转染试剂PEI MAX比PEI在生产慢病毒方面更具有优势。

在本发明中，所述组合物中宿主细胞包括悬浮培养细胞和/或贴壁培养细胞，优选为悬浮培养细胞。所述悬浮培养细胞优选包括LV293F细胞；所述贴壁培养细胞优选包括HEK293T细胞。在本发明实施例中，分别以LV293F细胞悬浮培养体系和HEK293T细胞贴壁培养体系将进行慢病毒包装，结果表明，悬浮培养比贴壁培养获得的慢病毒滴度提高了21.6倍。这说明与贴壁体系相比，悬浮体系显著提高了慢病毒滴度。

在本发明中，所述组合物中浓缩用试剂包括PEG8000和/或50KDa超滤管，优选为PEG8000。在本发明实施例中，为了进一步优化病毒浓缩方法，分别采用PEG8000和50KDa超滤管进行病毒浓缩，结果表明PEG8000浓缩后，慢病毒滴度能够达到1.62E+09TU/mL，病毒浓缩约54倍。使用50KDa超滤管浓缩，慢病毒滴度能够达到3.83E+08TU/mL，病毒浓缩约13.5倍。所以，悬浮体系中获得的慢病毒，PEG8000的浓缩效果明显优于50KD超滤管。

在本发明中，所述组合物中转染辅助试剂包括补充剂和增强剂，均具有增强转染效率的作用。

将所述组合物中三质粒系统混合，得到质粒体系；

在本发明中，三质粒系统混合时的溶剂为OPTI-MEM。所述三质粒系统的总质量与转染试剂的体积比优选为1：(2.4～4)。所述混合静置的时间优选为12～17min，可以为15min。所述转染时，转染试剂的工作浓度为0.2～1％，优选为0.6％。本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染步骤即可。所述补充剂的工作质量浓度为3％～8％，优选为5％。所述增强剂的工作质量浓度为3～6％，优选为4％。当浓缩用试剂为PEG8000时，所述PEG8000的质量百分比优选为8％～12％。当所述宿主细胞为LV293F细胞时，所述培养和继续培养均为震荡培养；所述震荡培养的转速优选为120～150rpm，可以为130～140rpm。

在本发明中，所述造血干细胞优选包括脐带血、骨髓、外周血或PSC(多潜能干细胞)分化而来的CD34+细胞。

将造血干细胞接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板，培养后加入终浓度0.1～1mg/mL的慢病毒感染增强剂，得到待感染细胞；

本发明将造血干细胞接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板，加入终浓度0.1～1mg/mL的慢病毒感染增强剂后培养，得到待感染细胞。

在本发明中，包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板的制备方法，优选包括以下步骤：

用灭菌PBS稀释人纤维连接蛋白至包被浓度，得到人纤维连接蛋白包被液；

将所述人纤维连接蛋白包被液加入细胞培养板中各孔中，封口膜封板，静置，得到包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板。所述人纤维连接蛋白的包被浓度优选包括10～100μg/mL，可以为20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL。所述静置的条件优选为置于4℃下过夜或37℃下孵育2h。所述造血干细胞的接种浓度为1E+05cells/孔。所述人纤维连接蛋白的作用是促进慢病毒感染。

得到待感染细胞后，本发明将所述包装方法包装得到的慢病毒感染所述待感染细胞，感染体系中含经离心或不离心处理后培养，得到慢病毒感染的造血干细胞

在本发明中，所述慢病毒的感染复数为5～30MOI，优选为10～20MOI。接种慢病毒后感染体系离心或不离心处理对于感染效率影响不大。

本发明实验表明，采用本发明包装方法制备的慢病毒不仅能提高对造血干细胞的感染效率，还不对造血干细胞的细胞活率影响较低。

下面结合实施例对本发明提供的一种提高慢病毒包装滴度的组合物及慢病毒包装方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例中的实验方法，除非另有说明，均采用常规技术。实施例中所用的试验材料，除非另有说明，均购自常规生化试剂公司。

LV-MAX^TM慢病毒生产系统(Gibico，2822826/2853684)；Thermo Nalgene^TMPETG一次性无菌平底锥形瓶：无菌-250mL(ThermoFisher，1376037)；Thermo Nalgene^TMPETG一次性无菌平底锥形瓶：无菌-125mL(ThermoFisher，1353699)；聚乙二醇8000(PEG8000)(Sigma，P2139)；(TAKARA，T100AC)；PEI MAX(Polysciences，24765-1)；PEI(MCE，HY-K2014)；Lentiboost(Revvity，LentiBOOST-P)。

实施例1

转染试剂的优化实验

1)细胞复苏：从液氮中取出冻存的HEK293T细胞，37℃水浴下快速解冻。

2)细胞培养

a.取20μL复苏后细胞悬液进行细胞计数。解冻的细胞总数在5E+06左右。

b.在10cm培养皿中加入10mL新鲜10％DMEM培养基，将细胞悬液全部接种到培养皿中。

c.将培养皿放入培养箱中，走米字方式将其混匀后培养。

d.贴壁培养2天后，使用胰酶消化HEK293T细胞，以0.2-0.4E+06cells/mL的细胞密度接种到3个10cm培养皿(10mL 10％DMEM培养基)，置于培养箱中稳定培养2代后可铺板进行病毒包装。

e.贴壁培养2天后，使用胰酶消化HEK293T细胞，以0.6-0.8E+06cells/mL的细胞密度接种到4个10cm培养皿(10mL 6％DMEM培养基)，置于培养箱中培养24h后即可进行转染。

3)转染

将HEK293T细胞铺于10cm培养皿中，待其密度达到约80％时进行转染操作。采用两种转染试剂PEI和PEI MAX进行转染，两种转染试剂的工作浓度为1mg/mL，并严格按照制造商说明书执行转染流程。所使用的三种质粒包括穿梭质粒pCDH-MSCV-MCS-EF1α-CopGFP-T2A-Puro、辅助质粒psPAX2和pMD2.G，其转染质量比设定为2:2:1。在每个10cm培养皿中，质粒的总转染量为25μg。转染48h后，收集慢病毒上清，0.45μm滤膜过滤后，使用PEG8000浓缩。将析出的慢病毒沉淀离心后，使用200μLPBS重悬，得到浓缩的慢病毒。

慢病毒滴度检测方法

1)细胞培养与计数：将HEK293T细胞以1E+05cells/孔铺于24孔板中，培养12-24h后，进行慢病毒感染。感染前，消化其中一个孔中的细胞，进行细胞计数，即为初始细胞数。

2)病毒稀释与感染：将浓缩后的病毒液用PBS进行10倍稀释，再在此基础上进行3倍梯度稀释，得到10倍、30倍、90倍、270倍、810倍稀释的病毒液。分别向每个细胞孔中加入10μL的不同稀释倍数的病毒液。并加入终浓度为1mg/mL的Lentiboost促进感染。

3)病毒感染与GFP检测：慢病毒感染2天后，收集所有孔板细胞。通过流式细胞仪检测GFP表达，记录GFP阳性率为15-35％的细胞孔数据。

4)滴度计算：根据收集到的GFP阳性率数据，按照如下公式I计算慢病毒滴度：

滴度(TU/mL)＝(初始细胞数量×GFP阳性率％×稀释倍数)×10³/10公式I。

观察滴度检测结果如表1所示，以PEI MAX转染的组别病毒滴度更高，这一结果提示该转染试剂在生产慢病毒方面更具有优势。

表1不同转染试剂获得的慢病毒滴度比较

转染试剂	PEI	PEIMAX
			EF1α-GFP病毒滴度TU/mL	5.29E+07	8.74E+07

实施例2

三质粒转染比例优化：

将用于转染HEK293T细胞的三质粒穿梭质粒(pCDH-MSCV-MCS-EF1α-CopGFP-T2A-Puro，以下简称：EF1α-GFP)、psPAX2和pMD2.G的转染质量比分别设置为2:1:1、2:2:1和10:10:1，质粒转染总量固定为2μg。将HEK293T细胞铺于6孔板，待其密度达到约80％时进行转染操作。在转染时，使用PEI MAX严格按照制造商说明书执行转染流程。转染48h后，收集慢病毒上清，经0.45μm滤膜过滤后，取200μL的病毒液用于感染预铺于12孔板的HEK293T细胞，同时加入终浓度为10μg/mL的聚凝胺以促进感染。感染48h后，荧光显微镜观察各孔中GFP荧光表达情况。

观察结果表明，如图4所示，以2:2:1比例转染的组别GFP阳性比最高，这一结果提示，该质粒转染比例在生产高效活性慢病毒方面具有明显的优势。基于此结果，可将这一具有优势的三质粒转染比例应用于悬浮体系的慢病毒包装过程中。

实施例3

稀释后转染试剂孵育时间优化

为了进一步优化转染条件，探讨与质粒混合前稀释后转染试剂孵育时间对病毒产率的影响，按照实施例2的方法进行转染，对比不同转染试剂孵育时间(1-5min,5-10min)下获得的慢病毒滴度。

结果如下表2所示：

表2不同稀释后转染试剂孵育时间获得的慢病毒滴度比较

由此可知，当稀释后转染试剂的孵育时间小于5min时，慢病毒的平均滴度可达1.154E+09TU/mL。然而，如果孵育时间超过5min，病毒滴度则显著降低至约6.935E+07TU/mL。前者的病毒滴度约为后者的16.6倍。这种现象可能是稀释后转染试剂的稳定性不佳导致的。因此，在转染过程中，必须严格控制稀释后转染试剂的孵育时间，确保其不超过5min，以维持高病毒滴度。

实施例4

病毒浓缩方法优化

对比两种常用的病毒浓缩方法：PEG8000浓缩和超滤管浓缩，具体操作方法如下：

1)超滤管浓缩

a.用无菌ddH₂O润洗超滤管，将15mL病毒液转移到超滤管上层，3000g离心30min。

b.离心过程中，取出超滤管观察，当下层病毒液体积约为7.5mL时，丢弃下层液体，向上层加入7.5mL 250mM高盐缓冲液(慢病毒储液)，继续离心30min。

c.待上层液体滤过一半时，丢弃下层液体，向上层转移未浓缩的慢病毒液，再次离心。重复此步骤，直至所有慢病毒液超滤完成。

d.浓缩后慢病毒体积约500μL，分装到1.5mL灭菌EP管中，每管100μL，置于-80℃储存。

2)PEG8000浓缩

a.向滤过后的慢病毒液中以1:4比例加入5×PEG8000慢病毒浓缩液(10％PEG8000)，颠倒混匀8～10次，置于4℃放置过夜，期间不时颠倒混匀。

b.取出慢病毒浓缩液，4℃，3000g离心30min，弃上清，使用300μLPBS重悬病毒沉淀，分装到1.5mL灭菌EP管中，每管50μL，置于-80℃储存。

在超滤过程中，由于培养基蛋白和高滴度慢病毒等因素，会导致大量蛋白质团块的产生，且使用高盐溶液也无法将其溶解。为此，通过瞬离去除团块，并取病毒上清用于后续的滴度测定和染毒测试。实验结果显示，PEG8000浓缩在滴度和病毒液均质性方面显著优于超滤浓缩。

表3不同浓缩方法得到的慢病毒滴度比较

PEG8000浓缩后，慢病毒滴度能够达到1.62E+09TU/mL，病毒浓缩约54倍。而使用50KDa超滤管浓缩，慢病毒滴度仅3.83E+08TU/mL，病毒浓缩约13.5倍。所以，悬浮体系中获得的慢病毒，PEG8000的浓缩效果明显优于50KDa超滤管。

实施例5

一种基于悬浮LV293F细胞进行包装慢病毒时转染效率的优化

1)细胞复苏：从液氮中取出冻存的LV293F细胞，37℃水浴快速解冻。

2)细胞培养

a.取20μL解冻后细胞悬液进行细胞计数。细胞总数在1E+07左右，细胞活率在95％以上。

b.在125mL培养瓶中加入30mL新鲜LV-MAX培养基，将细胞悬液全部接种到培养瓶中。

c.将培养瓶置于37℃，8％CO₂培养箱中，以125rpm(每分钟转数)的速率震荡培养。

d.3-4天后，悬浮细胞以0.3-0.5E+06cells/mL的细胞密度接种到125mL培养瓶(30mL LV-MAX培养基)，置于培养箱中震荡培养。

e.3-4天后，悬浮细胞以0.3-0.5E+06cells/mL的细胞密度接种到250mL培养瓶(60mL LV-MAX培养基)，置于培养箱中震荡培养。

f.在培养后第3-4天，细胞密度达到3.5-5.5E+06cells/mL时，以3.5E+06cells/mL的细胞密度传代，置于培养箱中震荡培养24h。

g.第二天，将细胞密度调整到4.7E+06cells/mL，分装到125mL培养瓶中(30mL/瓶)，每瓶添加补充剂1.5mL(占总体积的5％)。

3)转染

a.A液的制备：在1.5mL OPTI-MEM培养基中，将慢病毒包装穿梭质粒(EF1α-GFP)、psPAX2、pMD2.G按照比例2:2:1混合，质粒总量75μg。

b.B液的制备：另取1.5mL OPTI-MEM培养基，加入180μL补充剂溶液，轻轻颠倒混匀。B液的孵育时间不超过5min。

c.将B液缓慢加入A液，颠倒混匀后室温静置10min。随后，将转染复合物轻轻加入2)g.中的细胞悬液，置于37℃、8％CO₂培养箱中，以125rpm的速率震荡培养。

d.6-12h后，每瓶加入1.2mL增强剂(占总体积的4％)，继续震荡培养。

4)收获病毒

转染后48h，将细胞悬液转移到50mL离心管中，400g离心5min。收获病毒上清，使用0.45μm的滤器去除细胞碎片。随后，对滤过液采用PEG8000进行浓缩。

实施例6

一种慢病毒感染HSPC的方法

1)慢病毒感染检测板的包被：

a.制备Retronectin包被液：使用灭菌PBS稀释人纤维连接蛋白Retronectin，使其最终浓度达到20μg/mL。

b.将20μg/mL的Retronectin包被液以300μL/孔的量加入24孔板中。使用封口膜密封板子，将板子置于4℃过夜，或置于37℃条件下孵育2h。

c.在使用前，将板子从4℃取出，置于室温下平衡30min。

2)慢病毒感染HSPC染毒条件：

为进一步优化慢病毒感染条件，利用实施例5方法获得的慢病毒以相同的感染复数(40MOI)感染HSPC，对感染后的细胞板进行在300g下离心1h或不离心处理。24h后，通过流式细胞术检测GFP蛋白的阳性率。

结果详见下表4。

表4离心与不离心操作对慢病毒感染HSPC效率的影响

是否离心	离心	不离心
			GFP％	84.68	80.54

结果显示，经过离心处理后，GFP阳性细胞的百分比为84.68％，而不进行离心处理时，GFP阳性细胞的百分比为80.54％，二者差异不明显。因此，可以考虑在不离心状态下感染HSPC，这不仅可以简化操作流程，还有利于扩大病毒感染规模。

慢病毒感染HSPC的具体操作如下：

a.将不同来源的造血干细胞(HSPC)按1E+05cells/孔的密度铺于已经包被有Retronectin的24孔板内，随后进行染毒操作。

b.在每孔中加入终浓度为1mg/mL的Lentiboost(慢病毒感染增强剂)，轻轻摇晃混匀。

c.以目标的MOI(感染复数)加入相应体积的慢病毒液，轻轻摇晃混匀。

d.将板子置于37℃温箱中，继续培养24h，可进行感染效率检测或进行后续实验。

实施例7

悬浮包装体系和贴壁包装体系对慢病毒滴度的影响

悬浮LV293F慢病毒包装体系：复苏上述实施例中的悬浮LV293F细胞，使用LV-MAX培养基进行悬浮振荡培养。将状态良好的细胞按0.5E+06cells/mL的密度进行稀释，继续振荡培养3-4天。之后，将细胞进一步稀释至3.5E+06cells/mL，继续悬浮振荡培养1天，然后进行病毒包装。病毒包装的条件为：细胞密度为4.7E+06cells/mL，质粒用量为75μg，质粒比例为穿梭质粒(EF1α-GFP)：Pol/gag：psPAX2:PMD2.G＝2:2:1，转染试剂与质粒DNA的比例为2.4:1(V/W)。转染6h后添加终浓度为4％的增强剂，48h后收集细胞培养上清液，使用PEG8000进行慢病毒浓缩，并测定慢病毒滴度。

贴壁HEK293T慢病毒包装体系：复苏贴壁HEK293T细胞，并将其接种在含有DMEM培养基(添加10％胎牛血清和1％双抗)的培养皿中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。细胞复苏后传2代，使细胞生长至状态良好。使用胰蛋白酶将细胞消化下来，制备细胞悬液，并按6E+06cells/mL的密度接种到三份新的10cm培养皿中，继续在37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h，细胞密度应当达到80％左右，确保细胞处于最佳状态后进行病毒包装。使用Polysciences PEI MAX进行转染，具体操作步骤如下：首先，准备所需的质粒，包括穿梭质粒(EF1α-GFP)、psPAX2和PMD2.G，按照2:2:1的比例混合，每10cm培养皿的质粒总用量为25μg。然后，向质粒混合液中加入PEI MAX试剂，PEI MAX与质粒总量的比例为4:1(V/W)共孵育15min。最后，将转染复合物加入到细胞培养液中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。转染6h后，添加含终浓度为4％的增强剂的新鲜培养基继续培养。48h后，收集细胞培养上清液，使用0.45μm滤器过滤上清液，去除细胞碎片和其他杂质，然后使用PEG8000对过滤后的上清液进行慢病毒浓缩。最后，进行慢病毒滴度测定，以评估病毒包装的效果。

为了对比悬浮和贴壁体系的慢病毒包装效果，进行了四次慢病毒包装并检测了慢病毒滴度，慢病毒滴度检测结果见表5。

表5悬浮体系与贴壁体系获得的慢病毒滴度比较

结果显示，悬浮体系获得的慢病毒滴度平均值为1.66E+09TU/mL，而贴壁体系获得的慢病毒滴度平均值为7.68E+07TU/mL。如图5所示，悬浮体系与贴壁体系获得的慢病毒滴度差异极显著。悬浮体系获得的病毒滴度约为贴壁体系的21.6倍，说明与贴壁体系相比，悬浮体系显著提高了慢病毒滴度。这些实验数据进一步证实了悬浮体系在提高慢病毒包装效率方面的显著优势，为慢病毒的生产提供了更高效的方法。

实施例8

将实施例7公开的悬浮包装体系和贴壁包装体系获得的慢病毒液各取1μL用于感染HEK293T细胞，具体方法参见实施例6。感染24h后，通过荧光显微镜观察GFP蛋白的表达以判断感染效率。随后，对HEK293T细胞进行消化处理，并使用流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例。

如图6中a、b所示，与贴壁体系相比，悬浮体系获得的慢病毒感染HEK293T细胞后，细胞内的GFP蛋白表达明显增强。流式实验结果进一步表明，悬浮体系的GFP阳性率达到97.89％，而贴壁体系的GFP阳性率仅为24.75％。这说明，与贴壁体系相比，悬浮体系获得的慢病毒滴度显著提高。

实施例9

将上述实施例8中悬浮LV293F细胞复苏，使用LV-MAX培养基进行悬浮振荡培养。待细胞状态良好后，按0.5E+06cells/mL的密度进行稀释，继续振荡培养3-4天。随后，将细胞密度稀释至3.5E+06cells/mL，悬浮振荡培养1天后进行病毒包装。病毒包装条件为：慢病毒包装细胞密度4.7E+06cells/mL，向细胞悬液中加入5％的补充剂。质粒用量为75μg，穿梭质粒(EF1α-GFP):psPAX2:PMD2.G＝2:2:1，转染试剂与质粒DNA的比例为2.4:1(V/W)。转染6h后添加终浓度为4％的增强剂，转染48h后收集细胞培养基上清液，使用PEG8000进行慢病毒浓缩，并测定慢病毒滴度。滴度检测结果显示慢病毒滴度为1.24E+09TU/mL。如图7中a、b、c、d所示，使用纯化的慢病毒感染HSPC，感染复数MOI分别为5、10、20、40时，对应的GFP阳性率分别为8.44％、18.01％、38.97％和79.81％。检测慢病毒感染前后的细胞活率，结果如表6所示。

表6慢病毒感染前后HSPC细胞活率

随着MOI的增加，细胞活率总体变化不大。这表明，本发明的悬浮慢病毒包装及浓缩系统对HSPC的活率影响较小。

由上述实施例结果可以看出，采用本发明的悬浮慢病毒包装及浓缩系统，得到的慢病毒滴度较高，达到1.24E+09TU/mL。该病毒感染HSPC时，GFP阳性率较高，且病毒感染后HSPC的活率未受显著影响。这些结果进一步证实了本发明优化的慢病毒包装及浓缩系统与HSPC染毒系统的高效性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种提高慢病毒包装滴度的组合物，其特征在于，包括三质粒系统、转染试剂、宿主细胞、转染辅助试剂和浓缩用试剂；

所述转染试剂包括PEI和/或PEI MAX；

所述宿主细胞包括悬浮培养细胞和/或贴壁培养细胞；

所述转染辅助试剂包括补充剂和增强剂；

所述浓缩用试剂包括PEG8000和/或50KD超滤管。

2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述编码包膜蛋白的质粒、编码gag和pol的质粒和含目的基因的穿梭质粒的质量比为(1.8～2.2)：(1.8～2.2)：(0.8～1.2)。

3.根据权利要求1或2所述组合物，其特征在于，所述悬浮培养细胞包括LV293F细胞；所述贴壁培养细胞包括HEK293T细胞。

4.一种基于权利要求1～3中任意一项所述组合物提高慢病毒滴度的包装方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述组合物中三质粒系统混合，得到质粒体系；

5.根据权利要求4所述包装方法，其特征在于，所述转染时，转染试剂的工作浓度为0.2～1％；

所述补充剂的工作浓度为3％～8％；

所述增强剂的工作浓度为3％～6％。

6.根据权利要求4所述包装方法，其特征在于，当浓缩用试剂为PEG8000时，所述PEG8000的质量百分比为8％～12％。

7.根据权利要求4所述包装方法，其特征在于，当所述宿主细胞为LV293F细胞时，所述培养和继续培养均为震荡培养；所述震荡培养的转速为120～150rpm。

8.权利要求1～3中任意一项所述组合物或权利要求4～7中任意一项所述包装方法在制备慢病毒感染的造血干细胞中的应用。

9.一种体外条件下慢病毒感染造血干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求4～7中任意一项所述包装方法包装得到的慢病毒感染所述待感染细胞，感染体系中含经离心或不离心处理后培养，得到慢病毒感染的造血干细胞。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述人纤维连接蛋白的包被浓度包括10～100μg/mL。