CN120000803A - 一种刷状结构多肽药物递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种刷状结构多肽药物递送系统及其制备方法和应用，属于高分子化学和生物医药技术领域，包括，对多肽药物氨基酸残基进行点击反应或环加成反应活性官能团修饰，将修饰后的多肽药物与聚双硫主链发生点击反应或环加成反应，得到刷状多肽药物，对刷状多肽药物中的赖氨酸残基进行电荷屏蔽以及生物活性修饰，得到所述的刷状结构多肽药物递送系统。本发明的刷状结构多肽药物递送系统降低了多肽的毒性、增强了多肽的靶向性、提升多肽药代动力学，并解决了某些多肽药物水溶性差等问题，可用于肿瘤、心血管疾病、神经性疾病、致病菌或病毒侵染的治疗或疫苗的研发中。
Description
技术领域
本发明属于高分子化学和生物医药技术领域，具体涉及一种刷状结构多肽药物递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
多肽药物是由氨基酸组成的短链或长链分子，相较于传统小分子药物，多肽药物在靶标选择性、安全性等方面展现出显著优势，首先，多肽药物能够精确地与特定的生物靶点（如受体、酶等）相互结合，其高特异性使得多肽药物能够精准地发挥作用，避免传统药物在使用中存在的脱靶副作用，减少对其他非靶点组织和器官的影响；其次，多肽药物由氨基酸组成，被降解后能够通过正常的代谢途径排出体外，从而有效规避传统药物在代谢过程中产生的潜在毒性代谢产物，具有较高的安全性。此外，由于多肽药物中氨基酸序列的改变能够改变多肽的功能，因此可以根据不同的疾病靶点和治疗需求设计出各种具有特定功能的多肽药物。
但是多肽药物在使用中仍然面临着巨大挑战，包括稳定性差（蛋白酶）、体内循环时间短等，且部分多肽具有溶血毒性。为了解决上述技术问题，传统方法通常对多肽药物进行氨基酸化学修饰或改变多肽的结构。如公开号为CN109400695A的中国专利文献公开了一种多肽的修饰方法及应用，该发明方法包括：(1)向多肽的N端引入X，获得X-多肽；(2)将所述X氧化为醛基；(3)加入还原剂，将步骤(2)获得的氧化产物与PEG进行共价偶联，得到PEG修饰的多肽；其中，所述X为苏氨酸或丝氨酸。该修饰方法提高了多肽的稳定性和循环半衰期。公开号为CN119119207A的中国专利文献筛选获得了一段可以在体外相分离的短序列多肽，该短序列多肽应用于多肽药物例如GLP-1的类似物或者衍生物，可以提高多肽药物的稳定性，延长其作用时间，提高其生物活性。
但是上述方法通常不具有普适性，通过自组装类的药物递送系统能够解决上述问题，但自组装的纳米颗粒在体内循环中易解体失效。因此，需要开发一种通用的药物递送系统以解决上述技术问题，目前结合多肽化学修饰与结构设计同时实现无溶血及毒副作用、靶向性、酶稳定性及体内长循环时间的多肽药物递送系统还未见相关报道。
发明内容
针对多肽药物稳定性差、溶血和毒副作用大、缺乏靶向性及药代动力学差等问题，本发明提供了一种刷状结构多肽药物递送系统，其具有pH及还原性环境响应可降解性，适用于多种多肽药物的递送。
具体采用的技术方案如下：
本发明提供了一种刷状结构多肽药物递送系统，包括，对多肽药物氨基酸残基进行点击反应或环加成反应活性官能团修饰，将修饰后的多肽药物与聚双硫主链发生点击反应或环加成反应，得到刷状多肽药物，对刷状多肽药物中的赖氨酸残基进行电荷屏蔽以及生物活性修饰，得到所述的刷状结构多肽药物递送系统；
所述的多肽药物由5-100个氨基酸组成，赖氨酸数量≥1个；
所述的聚双硫主链的结构式为下式所示的任意一种：
；
其中，x为1-500的整数，y为1-2000的整数，z为1-1000的整数；R2为猝灭剂残基，R3为点击反应或环加成反应活性官能团，能够与多肽药物氨基酸残基上的修饰官能团发生点击反应或环加成反应，R1和R3相同、或者为甲基或甲氧基（R1进一步优选为甲基或甲氧基）；
进行电荷屏蔽以及生物活性修饰的方法为：利用至少一种3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物与刷状多肽药物中的赖氨酸残基发生反应，从而屏蔽由赖氨酸残基导致的正电荷以及进行生物活性官能团修饰；3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物的结构式如下式所示：
；
其中，R4为生物活性官能团。
优选的，对多肽药物的半胱氨酸残基进行点击反应或环加成反应活性官能团修饰。
具体的，所述的多肽药物可在常见的多肽药物（包括但不限于蜂毒肽Melittin、细胞裂解肽CALL、线粒体裂解肽KLAK或抗癌肽LTX-315等）的C-末端或N-末端连接半胱氨酸得到。
进一步的，修饰后的多肽药物中，点击反应或环加成反应活性官能团选自下式所示的任意一种：
。
进一步的，聚双硫主链中，R3选自下式所示的任意一种：
。
进一步的，修饰后的多肽药物与聚双硫主链发生点击反应或环加成反应时的摩尔比为1：0.01-1；进一步优选为1：0.01-0.5，更进一步优选为1：0.01-0.03；当发生点击反应时，反应条件为-20-100 ℃，2-48 h；当发生环加成反应时，反应条件为-20-100 ℃，1-72h。
进一步的，生物活性官能团R4选自下式所示的任意一种：
；
其中，m，n，o，p，q均各自独立地选自1-1000的整数。
进一步的，进行电荷屏蔽以及生物活性修饰时，3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物与刷状多肽药物中的赖氨酸残基的摩尔比为10-1000:1，反应条件为-20-100℃，0.01-72 h。
优选的，利用3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸聚乙二醇缀合物和3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸RGD环肽缀合物与刷状多肽药物中的赖氨酸残基发生反应；3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸聚乙二醇缀合物和3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸RGD环肽缀合物的摩尔比为1：0.01-0.5。
在上述优选的情况下，有利于提高刷状结构多肽药物递送系统的组织渗透能力、靶向性，或与其他药物进行联合治疗时，疾病治疗效果更好。
本发明对多肽药物递送系统进行结构设计，通过聚双硫主链和多肽药物之间的反应、形成的刷状结构及3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物对多肽赖氨酸残基的修饰，降低了多肽的毒性、增强了多肽的靶向性、提升多肽药代动力学，并解决了某些多肽药物水溶性差等问题，且根据搭载的多肽药物种类和数量及3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物功能的不同，可用于肿瘤、心血管疾病、神经性疾病、致病菌或病毒侵染的治疗或疫苗的研发中。
本发明还提供了所述的刷状结构多肽药物递送系统的制备方法，包括：
（1）在有机溶剂体系中，使多肽药物和带有点击反应或环加成反应活性官能团的马来酰亚胺发生反应，对多肽药物的氨基酸残基进行点击反应或环加成反应活性官能团修饰；
（2）在有机溶剂体系或有机溶剂和水的混合溶剂体系中，聚双硫主链和至少一种修饰后的多肽药物发生点击反应或环加成反应，得到刷状多肽药物；
（3）利用至少一种3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物和刷状多肽药物反应后，得到所述的刷状结构多肽药物递送系统。
具体的，可以利用3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸与N-羟基丁二酰亚胺缩合获得3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸活性脂中间体，该活性脂中间体与含有氨基和生物活性官能团R4的化合物发生反应，制备得到3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物。
本发明还提供了所述的刷状结构多肽药物递送系统在制备疾病治疗产品中的应用。
本发明还提供了所述的刷状结构多肽药物递送系统在制备疾病预防产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的刷状结构多肽药物递送系统能够解决多肽药物溶血、非特异性毒副作用的缺陷，该药物递送系统合成的工艺路线在现有技术中还未见报道。
（2）本发明提供的刷状结构多肽药物递送系统，具有普适性，适合不同的多肽药物，并且能够改善多肽药物的水溶性以及细胞摄取能力。
（3）本发明提供的刷状结构多肽药物递送系统能够改善多肽药物的药物动力学以及体内分布，延长多肽的体内循环时间并靶向到目标器官与组织。
（4）本发明提供的刷状结构多肽药物递送系统基于双重机制能够响应酸性及还原性环境，实现安全快速的多肽药物无痕释放并恢复其功能。
（5）本发明提供的刷状结构多肽药物递送系统能利用3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物实现其他生物活性分子（药物或功能分子）与多肽药物的结合，实现联合治疗与用药以进一步改善治疗效果。
附图说明
图1为化合物9、化合物19和化合物22的基质辅助激光解吸/电离质谱分析图。
图2为化合物4的渗透凝胶色谱图。
图3为化合物15、化合物23和化合物26的水合粒径及电势分析结果图。
图4为化合物15和化合物23的透射电子显微镜图。
图5为化合物18和化合物24的电势随pH的变化图。
图6为化合物15的二硫苏糖醇（DTT）降解实验结果图。
图7为游离的蜂毒肽和化合物18的胰凝乳蛋白酶降解实验效果图。
图8为化合物18、化合物27对小鼠红细胞的溶血毒性测试。
图9为化合物15、化合物16和化合物18的小鼠口腔鳞癌（MOC1）细胞的摄取实验的共聚焦显微镜和流式细胞术结果图。
图10为游离的蜂毒肽、化合物15、化合物16和化合物18对小鼠乳腺癌（4T1）、小鼠口腔鳞癌（MOC1）和人卵巢腺癌（SKOV3）细胞的细胞毒性分析结果图。
图11为化合物18与游离的蜂毒肽的药代动力学测试结果图，****表示p＜0.0001。
图12为化合物18注射24小时后在肿瘤及主要器官分布图。
图13为化合物18对小鼠肿瘤（4T1）生长抑制效果图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
（1）硫辛酸衍生物单体的合成
称取30.0 g（化合物1，0.145 mol）硫辛酸于500 ml圆底烧瓶中，加入300 ml无水二氯甲烷（DCM）充分溶解，冰水浴条件下加入25.9 g（0.160 mol）N,N’-羰基二咪唑（CDI），室温搅拌30分钟后加入13.2 g（0.131 mol）3-叠氮基丙醇（化合物2），接着加入1.8 g（14.5mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP），保持室温过夜反应，加入200 ml水洗涤有机相，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，加入200 ml乙醚溶解残余样品，抽滤除去不溶物，母液用200ml水洗涤两遍，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，油泵抽干得到34.4 g黄色油状化合物3，产率为82%。
化合物3的核磁共振氢谱数据为：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.16 (t,J= 6.0Hz, 2H), 3.62–3.52 (m, 1H), 3.39 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 3.25–3.05 (m, 2H), 2.52–2.41 (m, 1H), 2.33 (t,J= 7.2 Hz, 2H), 1.98–1.85 (m, 3H), 1.77–1.61 (m, 4H),1.56–1.39 (m, 2H)。
（2）聚双硫主链的合成
称取30.4 mg（0.02 mmol）聚乙二醇巯基（PEG2000-SH）于1.5 ml离心管中，无氧环境下，用300 μL无水四氢呋喃（THF）溶解后加入1.9 μL（0.02 mmol）四甲基胍（Me4-guanidine），涡旋1分钟，溶液变浑浊，用移液枪将浑浊液一次性吸入并快速注入到盛有800μL（3.04 mmol）化合物3的四氢呋喃（500 μL）溶液中，涡旋反应5分钟后室温搅拌反应2小时，加入39 μL（0.30 mmol）丙烯酸三氟乙酯猝灭反应，室温搅拌反应2小时后将反应液滴加到30 ml乙醚中沉淀，涡旋并离心后弃上清液，残余白色固体用少量二氯甲烷溶解后滴加到30 ml乙醚中进行沉淀，重复沉淀5次后抽干，便可得到630 mg无色浆状聚双硫高分子主链产物化合物4（Poly(LpN3)），产率为72%。
聚双硫主链4的核磁共振氢谱数据为：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.16 (t,J=6.4 Hz, 2H), 3.64 (s, 1H), 3.40 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 2.90–2.66 (m, 3H), 2.34(t,J= 7.2 Hz, 2H), 2.10–1.83 (m, 4H), 1.72–1.59 (m, 4H), 1.55–1.39 (m, 2H)。
聚双硫主链4的核磁共振氟谱数据为：19F NMR (376 MHz, CDCl3) -73.68。
（3）环辛炔修饰的多肽药物的合成
（3.1）环辛炔马来酰亚胺的合成
将双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯（化合物5，50 mg，0.172mmol）、1-(2-氨乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐（化合物6，36 mg，0.2064 mmol）以及N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，100 μL）溶解于圆底烧瓶中的无水二氯甲烷（DCM）中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，随后用盐水（3×50 mL）洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。所得残余物通过硅胶快速柱色谱法（石油醚/乙酸乙酯，20∶1）进行纯化，得到白色固体化合物7（46.38 mg，产率：85%）。
白色固体化合物7核磁共振氢谱数据为：1H NMR（400MHz,CDCl3）δ 6.72（s,2H）,4.89（s,1H）,3.95-3.93（d,2H）,3.70-3.67（m,2H）,3.40（q,J = 5.8 Hz,2H）,2.41-2.36（m,2H）,2.29（t,J = 14.3 Hz,2H）,2.15（m,J= 16.4、3.0、2.5 Hz,2H）,1.40-1.31（m,2H）,1.27（d,J= 12.4 Hz,0H）,0.74（s,1H）,0.74-0.62（m,2H）。
白色固体化合物7核磁共振碳谱数据为：13C {1H} NMR（101 MHz,CDCl3）δ 170.8,156.8,134.2,98.8,69.3,40.0,37.8,33.3,23.7,22.8,21.4。
（3.2）环辛炔修饰的Melittin-C的合成
制备环辛炔修饰的Melittin-C时，将多肽药物（Melittin-C，蜂毒肽N-末端连接半胱氨酸C，化合物8，15 mg，5 μmol，蜂毒肽氨基酸序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ）和化合物7（6.43 mg，20 μmol）溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，反应混合物在室温下搅拌4小时，然后用乙醚（3×12 mL）进行沉淀处理，所得沉淀物（即环辛炔修饰的Melittin-C，化合物9）经冷冻干燥后，储存于-20℃以供后续使用（产量为14.44 mg，产率：87%）。
（4）3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物的合成
（4.1）3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸活性脂的合成
将2-丙酸-3-甲基马来酸酐（化合物10，37 g）、N-羟基琥珀酰亚胺（化合物11，11g）以及4-二甲氨基吡啶（DMAP，6 g）溶解在圆底烧瓶内的5L无水四氢呋喃（THF）中。随后，向该混合物中加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，24 g）。让反应在室温下进行过夜。反应完成后，对混合物进行过滤，并用冷乙醚（3×5 L）进行沉淀处理，得到棕色固体化合物12（11g，产率：40%）。
化合物12的核磁共振氢谱数据为：1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ 3.02 (m, 2H),2.98-2.80 (m, 6H), 2.11 (s, 3H)。
（4.2）3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸-聚乙二醇的合成
将mPEG11-NH2（化合物13，2g）和N,N-二异丙基乙胺（100mL）溶解在圆底烧瓶中的500 mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，随后加入3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸活性脂（化合物12，20g）。反应在室温下进行4小时，并通过薄层色谱法进行监测。确认反应完成后，利用液相质谱确认产物3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸-聚乙二醇（化合物14）的合成。
（5）刷状高分子药物递送系统的构建
（5.1）刷状Melittin-C
称取聚双硫主链（化合物4，2.77 mg）和环辛炔修饰的Melittin-C（化合物9，25mg）溶解在微量离心管内的655 μL无水二甲基亚砜（DMSO）中（化合物4和化合物9的摩尔比为1：70）。将反应混合物室温搅拌过夜，随后用透析膜纯水透析8小时（截留分子量：70000Da）。透析的溶液冻干，得到刷状Melittin-C（化合物15），26mg，产率约93%，-20--80℃保存。
（5.2）聚乙二醇保护的刷状Melittin-C
称取刷状Melittin-C（化合物15，0.84 mg）和N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，5.4 μL，0.031 mmol）溶解于水中，随后加入50倍赖氨酸残基摩尔量的3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸-聚乙二醇（化合物14）的二甲基甲酰胺溶液，室温剧烈搅拌5分钟后。通过用对水溶液透析2天（截留分子量：700000Da）以去除杂质，获得3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸-聚乙二醇修饰的刷状Melittin-C，即为聚乙二醇保护的刷状Melittin-C（化合物16）冻干保存。
（5.3）刷状结构多肽药物递送系统
称取刷状Melittin-C（化合物15，0.84 mg）和N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，5.4 μL，0.031 mmol）溶解于水中，随后加入50倍赖氨酸残基摩尔量的3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸-聚乙二醇(化合物14)与3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸-RGD环肽（化合物17，直接购买得到）的二甲基甲酰胺的混合溶液（化合物14和17的摩尔比为100：1）。室温剧烈搅拌5分钟后。通过用对水溶液透析2天（截留分子量：700000Da）以去除杂质，获得基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）冻干保存，该刷状结构多肽药物递送系统制备过程中，3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸-聚乙二醇和3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸RGD环肽缀合物随机偶联多肽药物中的赖氨酸残基（氨基），整体电荷屏蔽的瓶刷状Melittin-C上RGD环肽数量为2个。
实施例2
本实施例中，刷状结构多肽药物递送系统的制备方法与实施例1的区别仅在于，多肽药物选用CALL-C（细胞裂解肽N-末端连接半胱氨酸C，细胞裂解肽氨基酸序列为KWKLFKKIFKRIVQRIKDFLR），在实施例1相同的工艺参数下制备得到环辛炔修饰的CALL-C（化合物19）、刷状CALL-C（化合物20），最终得到基于细胞裂解肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物21）。
实施例3
本实施例中，刷状结构多肽药物递送系统的制备方法与实施例1的区别仅在于，多肽药物选用KLAK-C（线粒体裂解肽N-末端连接半胱氨酸C，线粒体裂解肽氨基酸序列为KLAKLAKKLAKLAK），在实施例1相同的工艺参数下制备得到环辛炔修饰的KLAK-C（化合物22），刷状KLAK-C（化合物23），最终得到基于线粒体裂解肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物24），该刷状结构多肽药物递送系统制备过程中。
实施例4
本实施例中，刷状结构多肽药物递送系统的制备方法与实施例1的区别仅在于，多肽药物选用LTX-315-C（抗癌肽LTX-315的N-末端连接半胱氨酸C，抗癌肽LTX-315氨基酸序列为KKWWKKWDipKNH2），在实施例1相同的工艺参数下制备得到环辛炔修饰的LTX-315-C（化合物25），刷状LTX-315-C（化合物26），最终得到基于抗癌肽LTX-315的刷状结构多肽药物递送系统（化合物27）。
样品分析
（1）性能表征
图1分别为环辛炔修饰的Melittin-C（化合物9）、环辛炔修饰的CALL-C（化合物19）和环辛炔修饰的KLAK-C（化合物22）的基质辅助激光解吸/电离质谱分析图，上述结果说明利用环辛炔马来酰亚胺修饰多肽药物高效可行。
图2为聚双硫主链（化合物4）的渗透凝胶色谱图，表明通过本方法获得的聚双硫主链具有较好的分散度。
图3为刷状Melittin-C（化合物15）、刷状KLAK-C（化合物23）和刷状LTX-315-C（化合物26）的水合粒径及电势分析结果图，刷状Melittin-C的粒径为49 nm，电势为29 mV；刷状KLAK-C的粒径为43 nm，电势为27 mV；刷状LTX-315-C的粒径为24 nm，电势为39 mV。
图4为刷状Melittin-C（化合物15）、刷状KLAK-C（化合物23）的透射电子显微镜图片，纳米颗粒干态粒径约为30-40 nm，与水合粒径测试结果相符，表明刷状结构成功合成。
图5为基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）和基于KLAK多肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物24）的电势随pH的变化图。结果表明通过本方法获得靶向电荷屏蔽刷状能够响应pH，电荷屏蔽分子（含RGD部分）能够在溶酶体的pH环境下自动脱落，表面电荷复原，证明刷状结构多肽药物递送系统的酸响应设计成功。
（2）降解实验
图6为实施例1制得的刷状Melittin-C（化合物15）的二硫苏糖醇（DTT）降解实验结果图。结果表明，本发明制备的基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统，在DTT的作用下，15分钟内便能实现90%的降解，1小时内能够实现完全降解，证明了本发明制备的刷状结构多肽药物递送系统在肿瘤富还原性环境下的多肽可释放能力。
（3）酶稳定性实验
图7为游离的蜂毒肽和基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）的胰凝乳蛋白酶降解实验效果图。结果表明，该刷状结构多肽药物递送系统能够大幅增加多肽的酶稳定性，表明其在体内循环中的稳定性。
（4）克服溶血缺陷实验
图8为基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18），基于抗癌肽LTX-315的刷状结构多肽药物递送系统（化合物27）和对应游离蜂毒肽和抗癌肽LTX-315对小鼠红细胞的溶血毒性测试结果图。结果表明，刷状结构多肽药物递送系统能够完全消除多肽的溶血毒性，在体内的安全性好。
（5）细胞摄取实验
图9为刷状Melittin-C（化合物15）、聚乙二醇保护的刷状Melittin-C（化合物16）和基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）的小鼠口腔鳞癌（MOC1）细胞的摄取实验的共聚焦显微镜和流式细胞术结果图。结果表明，通过靶向分子RGD环肽的加入，刷状结构多肽药物递送系统能够有效靶向进入肿瘤细胞并且可以对其细胞摄取进行调节。
（6）细胞毒性实验
图10为游离的蜂毒肽、刷状Melittin-C（化合物15）、聚乙二醇保护的刷状Melittin-C（化合物16）和基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）对小鼠乳腺癌（4T1）、小鼠口腔鳞癌（MOC1）和人卵巢腺癌（SKOV3）细胞的细胞毒性分析。结果表明基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统的毒性与游离蜂毒肽相当，这些结果充分证明了本发明制备的刷状结构多肽药物递送系统除了能够调控其细胞摄取，还可以对其毒性进行对肿瘤细胞的针对性调控。
（7）药代动力学研究
图11为以花氰染料Cy5（1564286-24-3）作为荧光标记，基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）与游离的蜂毒肽通过尾静脉注射后不同时间的Cy5血浆浓度。结果表明该刷状结构多肽药物递送系统能够大幅延长多肽的体内循环时间。半衰期延长4倍，药时曲线下面积增加3.5倍。
（8）体内分布实验
图12为以花氰染料Cy7（1564286-24-3）作为荧光标记，基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）通过尾静脉注射后24小时后的肿瘤及主要器官分布图。结果表明该刷状结构多肽药物递送系统主要分布在肿瘤，表明RGD环肽修饰能够实现肿瘤靶向递送多肽药物。
（9）小鼠模型抑制肿瘤生长实验
图13为基于蜂毒肽的刷状结构多肽药物递送系统（化合物18）的小鼠肿瘤（4T1）生长抑制实验结果图。结果该刷状结构多肽药物递送系统通过靶向递送多肽至肿瘤，显著抑制了肿瘤的生长速率，验证了本发明的多肽递送效果。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种刷状结构多肽药物递送系统，其特征在于，包括，对多肽药物氨基酸残基进行点击反应或环加成反应活性官能团修饰，将修饰后的多肽药物与聚双硫主链发生点击反应或环加成反应，得到刷状多肽药物，对刷状多肽药物中的赖氨酸残基进行电荷屏蔽以及生物活性修饰，得到所述的刷状结构多肽药物递送系统；
多肽药物由5-100个氨基酸组成，赖氨酸数量≥1个；
聚双硫主链的结构式为下式所示的任意一种：
；
其中，x为1-500的整数，y为1-2000的整数，z为1-1000的整数；R2为猝灭剂残基，R3为点击反应或环加成反应活性官能团，能够与多肽药物氨基酸残基上的修饰官能团发生点击反应或环加成反应，R1和R3相同、或者为甲基或甲氧基；
进行电荷屏蔽以及生物活性修饰的方法为：利用至少一种3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物与刷状多肽药物中的赖氨酸残基发生反应；3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物的结构式如下式所示：
；
其中，R4为生物活性官能团。
2.根据权利要求1所述的刷状结构多肽药物递送系统，其特征在于，修饰后的多肽药物中，点击反应或环加成反应活性官能团选自下式所示的任意一种：
。
3.根据权利要求1所述的刷状结构多肽药物递送系统，其特征在于，聚双硫主链中，R3选自下式所示的任意一种：
。
4.根据权利要求1所述的刷状结构多肽药物递送系统，其特征在于，修饰后的多肽药物与聚双硫主链发生点击反应或环加成反应时的摩尔比为1：0.01-1；当发生点击反应时，反应条件为-20-100 ℃，2-48 h；当发生环加成反应时，反应条件为-20-100 ℃，1-72 h。
5.根据权利要求1所述的刷状结构多肽药物递送系统，其特征在于，生物活性官能团R4选自下式所示的任意一种：
；
其中，m，n，o，p，q均各自独立地选自1-1000的整数。
6. 根据权利要求1所述的刷状结构多肽药物递送系统，其特征在于，进行电荷屏蔽以及生物活性修饰时，3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物与刷状多肽药物中的赖氨酸残基的摩尔比为10-1000:1，反应条件为-20-100℃，0.01-72 h。
7.根据权利要求1所述的刷状结构多肽药物递送系统，其特征在于，利用3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸聚乙二醇缀合物和3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸RGD环肽缀合物与刷状多肽药物中的赖氨酸残基发生反应；3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸聚乙二醇缀合物和3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸RGD环肽缀合物的摩尔比为1：0.01-0.5。
8.根据权利要求1-7任一所述的刷状结构多肽药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括：
（1）在有机溶剂体系中，使多肽药物和带有点击反应或环加成反应活性官能团的马来酰亚胺发生反应，对多肽药物的氨基酸残基进行点击反应或环加成反应活性官能团修饰；
（2）在有机溶剂体系或有机溶剂和水的混合溶剂体系中，聚双硫主链和至少一种修饰后的多肽药物发生点击反应或环加成反应，得到刷状多肽药物；
（3）利用至少一种3-(4-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)丙酸衍生物和刷状多肽药物反应后，得到所述的刷状结构多肽药物递送系统。
9.根据权利要求1-7任一所述的刷状结构多肽药物递送系统在制备疾病治疗产品中的应用。
10.根据权利要求1-7任一所述的刷状结构多肽药物递送系统在制备疾病预防产品中的应用。
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