CN1289259A

CN1289259A - 缔合有生长因子的假体

Info

Publication number: CN1289259A
Application number: CN99802428A
Authority: CN
Inventors: 文达·C·卡莱尔; 希拉·J·凯利; 马修·F·奥格莱
Original assignee: St Jude Medical LLC
Current assignee: St Jude Medical LLC
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-21
Publication date: 2001-03-28
Also published as: EP1051204A2; WO1999037337A3; AU2465899A; JP2002500929A; EP1051204B1; CA2319000A1; US7722671B1; DE69934298D1; WO1999037337A2; BR9907273A; ES2278435T3; DE69934298T2

Abstract

多肽生长因子与基底缔合以促进内皮细胞在基底上的繁殖。生长因子交联到基底上形成假体。优选的多肽生长因子包括VEGF。在体外和/或体内,在VEGF处理组织上可繁殖内皮细胞。在一个可选择的方法中,通过直接与VEGF溶液接触,VEGF可以与基底缔合,VEGF与粘合剂作为基底的涂层应用,或者VEGF与具有或不具有插入连接分子的基底化学结合。在一个优选方法中,生长因子与基底在适当温和的条件下通过交联进行缔合,这样生长因子在交联后仍保持活性。

Description

缔合有生长因子的假体

技术领域

本发明涉及具有被多肽生长因子修饰成分的假体。本发明进一步涉及制备这些假体的方法。

背景技术

假体，即假体装置，用于修复或代替人和动物的损害或患病器官、组织或其它结构。因为假体通常植入体内很长一段时间，所以它们通常是生物相容性的。例如，假体可以包括人造心脏，人造心脏瓣膜，韧带修复材料，血管修复物，由哺乳动物组织及类似物构成的外科手术补片。

假体可以由天然材料如组织，合成材料或他们的组合物构成。例如，合成假体如机械心脏瓣膜假体，从生物相容性金属和其它材料如石墨和聚酯制备。尽管机械心脏瓣膜经长期使用被证明具有耐久性的优点，但其伴有在假体瓣膜部位或其周围出现血液凝固高的发生率。血液凝固可以导致急性或亚急性瓣膜或相关血管的闭合。因此，植入机械心脏瓣膜的患者只要植入瓣膜后，就一直维持给药抗凝血剂。抗凝血剂造成3-5％每年出现明显出血的风险，并且某些患者不能安全服用抗凝血剂。

除了机械心脏瓣膜，心脏瓣膜假体可以由组织小叶或聚合物小叶构成。血栓症和并发的钙化与聚合物心脏瓣膜有关。瓣膜的钙化可以导致移植的失败。

例如，假体组织心脏瓣膜可以来源于猪心脏瓣膜，或从其它生物材料制备，如牛心包膜。假体心脏瓣膜的生物材料通常具有剖面和表面，其特征在于通常提供分层的、非紊流的血液流动。因此，与机械心脏瓣膜相比，更不容易发生血管内血凝固。遗憾地，假体组织心脏瓣膜在植入后大约7年后倾向于开始失效，因此有一定限制。在年轻患者中和怀孕期间瓣膜退化特别快。

钙化，即钙盐，特别是磷酸钙(羟磷灰石)的沉积，是引起退化的主要原因。解决钙化问题的努力包括用化合物处理戊二醛固定的瓣膜假体，以减少钙晶核形成。其它的方法包括使用另外的组织固定技术，因为有证据表明戊二醛固定可能造成钙化和机械退化。另外，由于不能活的细胞可以成为钙沉积点，已研制了很多方法除去不能活的细胞，而留下细胞外完整的基质。具有活细胞的完整组织对钙化具有天然的保护作用。

基于组织的假体另一个主要的缺点是该装置不能自我维持。长期的持久性由活细胞在植入组织上生长和活细胞进行维持功能的能力所影响。已经在同种移植物的范围内研究了活细胞的重要性。即，从一个种的一个个体移植到同种的另一个个体。适当保存同种移植物，可以使组织中剩余的活细胞数(由基质蛋白质合成测定)达到最大。不利于促进细胞生存的保存技术，如长期在4℃下储存，与体内的持久性降低和再次手术的几率增加有关。

发明概述

多肽生长因子可以和组织基底或合成基底连接，以促进活细胞在基底的繁殖。优选的多肽生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)。与组织交联在一起，被结合的VEGF至少减轻一些由戊二醛交联造成的细胞毒性。VEGF可以通过在溶液中直接接触和基底连接。或者，VEGF或是通过和粘合剂一起应用到基底，或是通过VEGF和具有或不具有插入连接分子的基底化学结合来与基底相连。

用VEGF修饰的基底使活内皮细胞和基底亲和，以改善基底作为假体的性能。例如，由于减少了钙化，应该部分地改善了假体的长期耐久性，并且由于适合于微生物附着的位置的减少，与假体相关的感染的发生率也应该减少。应用细胞培养系统，VEGF处理的基底可以促进内皮细胞在基底的体外繁殖。另外，在基底作为假体的一部分植入体内后，VEGF可以促进内皮细胞在基底的体内繁殖。

一方面，本发明特征在于用于病人的假体，包括同种异体移植物、异种移植物或合成组织，其具有多肽生长因子与其连接，多肽生长因子可有效刺激活细胞和组织的亲和。多肽生长因子和组织的结合可以涉及特异性结合相互作用和/或共价结合。多肽生长因子和组织的结合可以涉及连接分子。

组织可以包括交联组织和/或非交联组织。组织可以来源于猪心脏瓣膜，牛心包组织或任何其它合成或生物材料。多肽生长因子可以包括血管内皮生长因子。适合的血管内皮生长因子包括，例如，选自下组的蛋白质，包括bVEGF164,bVEGF120,hVEGF165,hVEGF121,VEGFⅡ,hVEGF80,VEGF-B,VEGF2，它们的修饰活性型，和它们的组合。

另一方面，本发明特征在于包括具有连接的VEGF的交联组织的产品。交联可以包括戊二醛半分子。

另外，本发明特征在于包括连接VEGF的假体心脏瓣膜。假体心脏瓣膜可以包括猪心脏瓣膜。

在另一方面，本发明特征在于制备用于病人假体的方法，该假体包括同种异体移植物或异种移植物组织，该方法包括将多肽生长因子结合到组织上。该方法进一步可以包括将具有结合多肽生长因子的组织和活细胞在体外培养，以将细胞结合到组织上。细胞可以包括人细胞。细胞可以包括从假体预期的受体获得的细胞。

在另一方面，本发明特征在于修饰基底的方法，该方法包括将活细胞在体外和组织培养，以将细胞结合到基底上，该基底包括结合的多肽生长因子。

在另一方面，本发明涉及一种假体，其包括基底和交联到所述基底的多肽生长因子，该多肽生长因子可有效刺激活细胞和基底的结合。

此外，本发明涉及制备生物相容性材料的方法，该方法包括：

将多肽生长因子在该多肽生长因子可有效刺激活细胞和基底的结合的条件下交联到基底上。

从下列本发明的详细描述及形成的权利要求中，可以明显地发现本发明其它的特征和优点。

附图简要说明

图1为交联组织样品的显微照片，在5天培养期前用VEGF处理，在此期间组织与在组织培养孔内插入物生长的活内皮细胞接触。通过荧光标记观察存在于固定组织上的内皮细胞。

图2为交联组织样品的显微照片，其中在与内皮细胞在5天培养期组织培养孔内培养前，用VEGF处理交联组织样品。在该实施例中，用VEGF处理的组织在培养期的开始不与内皮细胞直接接触。通过荧光标记观察存在于固定组织上的内皮细胞。

图3为组织样品在与细胞培养系统中的内皮细胞培养后的一组显微照片，其中组织只是用乙醇处理(图3A)，或其中交联乙醇处理的组织用VEGF/戊二醛溶液处理15分钟(图3B)，或用VEGF/戊二醛溶液处理30分钟(图3C)。通过荧光标记观察细胞。

图4为一组显微照片，人主动脉内皮细胞生长于戊二醛交联猪主动脉瓣膜小叶组织(图4A)，用乙醇处理的戊二醛交联组织(图4B)，或用乙醇、然后用100ng/ml VEGF+0.01％戊二醛处理的戊二醛交联组织。通过荧光标记观察细胞。

图5为一组显微照片，人主动脉内皮细胞生长于戊二醛交联猪主动脉瓣膜小叶组织(图5A)，用乙醇处理的戊二醛交联组织(图5B)，或用乙醇、然后用100ng/ml VEGF+0.01％戊二醛处理的戊二醛交联组织。通过扫描电子显微镜观察细胞。

图6为一组显微照片，人主动脉内皮细胞生长于未交联猪主动脉瓣膜小叶组织，预先在HEPES缓冲盐溶液中培养(图6A)，在HEPES缓冲盐/0.01％戊二醛溶液培养(图6B)，或在HEPES缓冲盐/0.01％戊二醛100ng/ml/100ng/ml VEGF溶液(图6C)。通过荧光标记观察细胞。

图7为在皮下植入幼年雄性大鼠21或63天前，戊二醛交联小叶中钙含量的示图，其中未接受进一步处理(对照)，乙醇处理(乙醇)，或乙醇和VEGF处理(VEGF)。

图8为在皮下植入幼年雄性大鼠21或63天前，戊二醛交联小叶组织的一组显微照片，其中未接受任何进一步处理(图8A)，或乙醇处理(图8B)，或乙醇和VEGF处理(图8C)。应用染色系统，磷酸钙染成棕色，在照片中描绘为小的暗斑。

优选实施方案的详细描述

多肽生长因子或其片断可以在体外与组织基底或合成的基底缔合。通常，基底形成，或将形成假体的全部或部分。优选的多肽生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)以及相关化合物。基底用VEGF修饰后，VEGF可以刺激内皮细胞趋化和增殖。在优选的实施方案中，基底是固定的。活的上皮细胞与假体组织的缔合应该有利于假体长期的生存能力。VEGF修饰特别适合于在天然状态下具有上皮细胞或上皮细胞衬里的假体的制备，如血管成分，心血管结构，淋巴系统的部分，子宫组织或视网膜组织。

VEGF可以以多种方式与基底缔合。例如，基底可以与VEGF溶液结合，这样VEGF通过直接附着与假体组织连接在一起。或者，VEGF应用粘合与假体组织缔合。另外，VEGF可以通过化学键合与假体组织连接在一起。

如下面的实施例1所述，通过将VEGF加入到交联组织中，可以发生直接附着或缔合。然而还不知道VEGF与交联组织直接附着的机理，VEGF可能与交联组织中的游离戊二醛官能团结合。

对于VEGF与组织的化学键合，VEGF可以交联到具有戊二醛的组织上。将VEGF交联到组织上的条件必须严格控制，以在交联后维持VEGF活性所需的水平，并防止残余的戊二醛介导细胞毒性。VEGF通过戊二醛有控制地交联到组织上可以有效地将VEGF附着于交联或未交联的组织上。因此，该方法特别适合于VEGF与未交联的自体移植物或同种移植物组织的缔合。

VEGF可有效诱导基底上的内皮细胞在体外或体内的生长，这样在组织上活细胞增殖。对于体内生长，与VEGF缔合的基底可以植入患者体内。一旦植入患者体内，由于VEGF的存在，内皮细胞被吸引到假体上。或者，如下面所描述，内皮细胞可以与假体在细胞培养系统中缔合。A．假体

假体可以包括组织基底或合成基底，至少其作为一种成份，使基底适合作为用于细胞附着的位置。通常，这些假体被设计为植入患者体内很长一段时间。假体包括，例如，人工心脏，人工心脏瓣膜，瓣环成形术环，血管和结构扩张，人造血管，小拭子，缝合线，引线，永久性留置的经皮装置，血管或心血管支路，用于伤口愈合的真皮移植，和外科手术补片。设计在患者体内保留很长一段时间的生物医学装置还适于包括具有缔合生长因子的基底。例如，该装置包括Hickman导管。

用于作为基底的天然组织来源于动物类，特别是哺乳动物，如人、牛、猪、犬、海豹或袋鼠。例如，这些组织可以从心脏瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织如心包补片、结缔组织如硬脑脊膜、旁路移植、筋、韧带、皮肤补片、血管、人脐带组织、骨、筋膜、粘膜下层及类似物获得。这些天然组织通常包括含有胶原蛋白的材料。天然组织通常为，但不是必须为，软组织。基于组织的假体可以通过其天然型维持结构要素，和/或结构要素可以通过组织明显的片断组装结合到假体。例如，可以从猪心脏瓣膜、从牛心包膜或从它们的组合组装心脏瓣膜假体。

合成基底可以从合成聚合物和/或生物聚合物形成，如那些发现的天然组织基质，形成合成组织基质。特别地，通过多种技术的任何一种如编织和成型，胶原蛋白和弹性蛋白可以形成相当于组织成分的基质。从这些生物聚合物形成的合成基底模拟天然组织基质。或者，合成基底可以以合成组织的形式，其具有包括合成和/或生物聚合物以及活和/或非活细胞的基质。聚合物可以为，但不是必须为，生物再吸收的。适合的合成和生物聚合物如下所描述。

组织可以通过交联固定。它提供了机械稳定性，例如，通过防止组织的酶降解。交联还除去了可能导致患者对假体排斥的抗原性位点。通常使用戊二醛或甲醛用于固定，但也可以使用其它固定剂，如环氧化物和其它双官能团醛。异种移植物，即与患者不同种属的假体结合组织，通常在使用前被固定。同种移植物，即使用与患者相同种属的不同个体的假体组织，在使用前可以被固定，也可以不被固定。同样，自体移植物，即使用同一个体的假体组织，在使用前可以被固定，也可以不被固定。

假体可以包括其它非组织成分，如聚合材料，陶瓷和金属。适合的陶瓷包括，但不限于羟磷灰石，氧化铝和热解碳。聚合材料可以从合成聚合物以及纯化生物聚合物制成。适合的合成材料可以包括水凝胶和经受不住严重脱水的其它合成材料。

适合的合成包括，但不限于聚酰胺(例如尼龙)，聚酯，聚苯乙烯，聚丙烯酸酯，乙烯基聚合物(例如，聚乙烯，聚四氟乙烯，聚丙烯，和聚氯乙烯)，聚碳酸酯，聚氨基甲酸酯，聚二甲基硅氧烷，醋酸纤维素，聚甲基丙烯酸甲酯，乙烯醋酸乙烯酯，聚砜，硝化纤维，以及类似共聚物。还可以使用生物可再吸收聚合物，如右旋糖苷，羟乙基淀粉，凝胶，凝胶衍生物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]，多羟基酸，聚(ε-己内酯)，聚乳酸，聚乙醇酸，聚二甲基乙醇酸，聚羟基buterate，以及类似共聚物。这些合成聚合材料可以被编织成网眼，以形成基质或基底。或者，该合成聚合材料可以被成型或浇铸成适当的形状。

生物聚合物可以天然形成或在体外制备，例如通过发酵等。应用技术如编织、编结、浇铸、成型、挤出、细胞排列和磁性排列，可以将纯化生物聚合物适当地形成基底。对于磁性排列的描述参见，例如，R.Tranquillo等，生物材料(Biomaterials)17:349-357(1996)，在这里引用作为参考。适当的生物聚合物材料包括，但不限于胶原蛋白，弹性蛋白，蚕丝，角蛋白，聚氨基酸，猫肠道缝合，多糖(例如，纤维素和淀粉)，和它们的共聚物。B.血管内皮生长因子(VEGF)

VEGF指一族多肽，已发现其刺激血管内皮细胞的生长超过其它细胞，如平滑肌细胞。已经鉴别几种类型的VEGF。VEGF多肽通常为具有血小板衍生生长因子的一系列同系物，其可以改变多种类型细胞的迁移和增殖。VEGF有时也指血管渗透性因子。

VEGF的最初鉴别型的分子量大约为45-46千道尔顿(kDa)。该型明显地为均二聚体，各亚基分子量大约为23kDa。已经测定编码人多肽的c-DNA序列(165个氨基酸，hVEGF₁₆₅)和相应的牛多肽(164个氨基酸，bVEGF₁₆₄)。另外，还鉴别了多肽的变异体具有121个氨基酸的人的类型(hVEGF₁₂₁)和具有120个氨基酸的牛的类型(bVEGF₁₂₀)。对于相关的氨基酸序列，参见Tischer等的美国专利5,194,596，在这里引用作为参考。已鉴别其它不溶性的变异体分别为189和206个氨基酸。参见，例如，Tischer等“血管内皮生长因子的人基因。通过可选的外显子剪接编码多蛋白型”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)266:11947-119549(1991)，和K.A.Houck等“血管内皮生长因子家族，第四个分子的鉴别和RNA可选剪接的特征”，分子内分泌学(Molec.Endocrinology),5:1806-1814(1991)，两篇文章在这里引用作为参考。

VEGF的另一种类型，命名为VEGFⅡ，为杂二聚物。从大鼠神经胶质瘤细胞分离，第一个亚基有190个氨基酸，而第二个亚基有135个氨基酸型和115个氨基酸型。VEGFⅡ在欧洲专利EP0476983A中描述，在这里引用作为参考。

还鉴别了未命名的单一多肽人VEGF。该多肽的分子量大约为80kDa。分离了相应cDNA，从cDNA序列中检测到728个氨基序列。蛋白质的详细内容参见欧洲专利EP0550296A，在这里引用作为参考。

另一个人生长因子，VEGF2，已经从早期人胚胎破骨细胞瘤、成年人心脏和几种乳腺癌系中鉴别。VEGF2由350个氨基酸，其中大约24个氨基酸代表一个引导序列。VEGF2的序列在WO95/24473中公开，在这里引用作为参考。

最近，鉴别了VEGF-B,VEGF的另一个变型。VEGF-B似乎与心脏和骨骼肌有关。小鼠和人VEGF-B的全部序列在Eriksson等的美国专利5,607,918中公开，在这里引用作为参考。

除了在正常生理条件下在哺乳动物细胞表达的VEGF变型，从人免疫缺陷病毒(HIV)-1的病毒蛋白如Tat蛋白，与VEGF具有序列的同源性，并与自身的VEGF受体结合。这些性质描述在Albini等“通过血管内皮细胞上的Flk-1/KDR受体调控经HIV-1Tat蛋白诱导的血管紧张素”，天然药物(Nature Medicine),2(12):1371-1375(1996)，和Mitola等“通过激活血管内皮生长因子受体-1,Tat人免疫缺陷病毒-1诱导人单核细胞趋化性”，血液(Blood),90(4):1365-1372(1997)，两篇文章在这里引用作为参考。通过与这些VEGF受体的相互作用，Tat蛋白刺激内皮细胞趋化和增殖。因此，为了该应用的目的，Tat蛋白和结合到VEGF受体上的其它类似病毒蛋白被认为是VEGF生长因子。

如上所描述，已鉴别出多种VEGF多肽。它们中的许多与特殊的组织有关。至少部分多肽具有基于可选的信息剪接的变异体，如hVEGF165和hVEGF₁₂₁。如本申请其它部分所使用，“VEGF”指，但不限于所有以前鉴别的VEGF多肽，如这一部分中所描述的那些，以及选择性促进内皮细胞趋化或增殖的任何将来鉴定的VEGF多肽。“VEGF”还指能维持选择性促进内皮细胞趋化或增殖能力的片断。如上所述，人VEGF₁₂₁是天然形成的人VEGF₁₆₅的片断。重组体VEGF₁₆₅、VEGF₁₂₁和小鼠VEGF从Minneapolis,MN的R&D系统获得。同样，在这里提到的“VEGF”包括通过共价或非共价结合经化学加入到蛋白质分子修饰的VEGF蛋白。

应用标准分子生物技术(参见，例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis“分子克隆：实验室手册”第二版，Cold Spring Harbor出版社，(1989))，有可能制备出天然VEGF多肽的再结合修饰型。直接的修饰包括在N-末端、C-末端或两个上面加入氨基酸。修饰还可以通过取代沿着多肽链上的氨基酸进行。一些修饰可能破坏蛋白质的的活性。通过测试细胞培养系统中的活性，直接消除非活性的修饰。这些修饰多肽的活性型在我们通常定义的“VEGF”范围内。C．VEGF与基底的连接

VEGF与基底的连接可以包括直接附着、包括粘合剂的涂层的应用、或化学结合。VEGF可以只与基底的一部分连接，或与基底整个连接。如果VEGF与基底的一部分结合，细胞还可以和基底未结合的其它部分缔合，这样VEGF结合到基底的一部分上。

直接附着要求基底(如组织基底)与VEGF溶液进行组合。特别地，已发现VEGF可以与戊二醛交联的生物组织缔合，从而使VEGF不易被洗掉。当组织在与VEGF温浴前已经在0.5％的戊二醛中温浴不到1个月时，该直接附着特别有效。随后的VEGF与戊二醛交联组织的结合似乎持续一段适当的时间，直到一个月或更长，此时组织与缓冲溶液接触。已得到证据，如下面的实施例1所提出，在与VEGF接触前用乙醇处理，可减少VEGF与固定组织的缔合。由于组织和乙醇温浴导致的VEGF缔合的减少，可能是由于除去VEGF结合位点、使VEGF结合位点失活、或乙醇在VEGF结合位点结合。

对于VEGF与基底的直接附着，如戊二醛交联组织，基底或基底的一部分与VEGF溶液结合时，VEGF溶液的浓度通常在从大约1ng/ml至大约1μg/ml，优选在从大约25ng/ml至大约250ng/ml。在与VEGF培养中，优选将溶液冷却，例如，至大约4℃。基底优选在大约4℃下在VEGF-溶液中保持24小时和直到14天或更多。VEGF溶液pH值优选在大约6至大约8.5范围内缓冲，更优选范围在大约6.3至大约7.4之间。例如，适合的缓冲液可以基于下列化合物：磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、甲次砷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机缓冲液如三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、和吗啉丙烷磺酸(MOPS)。

或者，VEGF可以与基底通过应用结合剂或粘合剂进行缔合。VEGF和粘合剂在基底上形成涂层。例如，优选的粘合剂包括生物粘合剂，如血纤蛋白粘合剂等。血纤蛋白可以从纤维蛋白原和凝血酶聚合形成。例如，适合的血纤蛋白粘合剂可以从Immuno AG,Austria和Zymogenetics，Seattle,WA获得。

对于VEGF与血纤蛋白粘合剂应用时，少量的凝血酶可以被吸收到基底中。VEGF可以与含有纤维蛋白原的溶液混合，产生的溶液VEGF浓度优选范围在大约1ng/ml-10μg/ml。然后，纤维蛋白原/VEGF混合物可以冲刷具有吸收凝血酶的基底的表面，或者可以将具有吸收凝血酶的组织浸入到纤维蛋白原/VEGF溶液中。VEGF粘合剂涂层可以应用到基底的所有部分或只是一部分。对于合成基底，VEGF还可以在基底形成时结合到基底材料中。

应用后，血纤蛋白粘合剂及类似粘合剂被患者缓慢再吸收。VEGF可以和其它可再吸收的聚合物混合，形成基底的涂层。例如，适合的可再吸收的聚合物包括右旋糖苷、氢乙基(hydroethyl)淀粉、凝胶、凝胶衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、聚乙二醇、聚酯、聚原酸酯、聚酰胺酯、聚酐。例如，可再吸收的聚酯包括多羟基酸和它们的共聚物，聚(ε-己内酯)，聚二甲基乙醇酸，聚羟基buterate。例如，优选的可再吸收的聚合物包括D,L-聚乳酸，L-聚乳酸，聚乙醇酸，和L-乳酸、D-乳酸和乙醇酸的共聚物。并且，VEGF可以贮存在聚合物基质的间隙中。聚合物基质可以被再吸收释放VEGF材料，或者基质具有适当的孔隙，这样VEGF可以逐渐从基底中扩散出来。

基于天然或合成生物可再吸收的聚合物的不同方法具有建立VEGF浓度梯度的优点，这样VEGF可以作为指示细胞向高浓度的VEGF移动的趋化剂。并且，可以在一段限制的时间内传送更精确的剂量。

在其它的实施方案中，VEGF与基底的缔合涉及化学结合。化学结合包括，例如，共价结合、多种非共价化学相互作用、或共价和非共价两方面的相互作用。非共价化学相互作用包括，例如，氢键结合、vanderWaals相互作用、离子相互作用和分子重排，其特征在于，例如，抗体-抗原，特异性蛋白质受体结合和酶-基底缔合。换句话说，反应物或结合剂用于在VEGF与基底间形成直接的化学相互作用，可能涉及连接分子。VEGF的化学结合优选在生理pH值处或附近进行，优选范围在大约6至大约8.5，更优选范围在大约6.3至大约7.4之间。

VEGF的化学结合可以涉及与基底表面的共价结合，其具有反应试剂如戊二醛和其它常用交联剂。VEGF与组织的表面化学结合的典型过程利用了戊二醛，其为具有两个醛基的交联蛋白。由于戊二醛通常用于一些生物相容性材料的固定，VEGF与生物相容性材料的结合的非特异性交联，可以与组织的固定同时进行。或者，VEGF共价结合的非特异性交联可以作为分离步骤，在固定步骤完成前或之后进行(假定进行固定步骤)。用于VEGF与基底共价结合的其它化学试剂包括，例如，环氧树脂类。

VEGF与具有交联剂的基底的结合优选在严格控制的条件下进行，以避免VEGF的失活。特别地，交联优选与稀的交联剂(如戊二醛)溶液进行。进行交联的交联剂浓度优选小于大约0.1％的交联剂，更优选小于大约0.05％的交联剂，更加优选小于大约0.005％至大约0.02％的交联剂。按照本领域的常规应用，百分值基于浓缩的体积百分比储备液的V/V稀释液，储备液通常为体积比50％的储备液。

可以进行交联至少大约5分钟，通常进行大约15分钟至大约24小时或更长。特别地，VEGF与基底的交联可以优选在大约1小时之内进行，更优选在大约15分钟-30分钟之间进行。如VEGF在体外刺激内皮细胞增殖的能力所证明，已观察到VEGF的结合程度，相对于交联时间达到稳定相对快。根据本文公开，可以凭经验评价优选的交联时间。

在本文描述的优选温和条件下，组织通常不能明显被固定。如果需要，在VEGF和戊二醛培养的同时，可以使用大小排斥膜，如渗析管。例如，分子量截止到10,000的渗析管可以用于相对小体积的含有基底和VEGF的溶液。含有基底和VEGF的管浸入到戊二醛的稀溶液中。戊二醛可以渗透进入渗析管，但是VEGF溶液由于其分子量较大而保留在管中。该过程允许使用小体积的VEGF和相对大体积的交联溶液。

另一方面，VEGF与基底的化学结合可以涉及特异性结合相互作用。如果因此选择，特异性结合相互作用可以用于基底内的特异性靶部位。特异性部位的靶向性很有用，例如，如果特异性部位对抗内皮细胞的生长，或者如果在特异性部位内皮细胞的生长特别有用。可能的靶部位的例子是心脏瓣膜假体的小叶。

特殊部位的靶向方法涉及使用对天然组织内特异性细胞或细胞外结合位点具有靶向性的连接剂。在某个实施方案中，连接剂与VEGF分子共价结合，连接剂与组织通过多种非共价相互作用缔合。或者，连接剂可以与组织共价结合，VEGF可以与连接剂通过多种非共价相互作用缔合。多种商业可获得的抗体和其它特异性结合试剂可以用作连接剂。或者，抗体可以通过常规技术制备。

VEGF多肽具有一个附着的抗体或任何其它相对靶向分子或一个VEGF多肽的改造嵌合体，靶向分子被认为是为了本申请目的的VEGF分子。很好地建立了化合物与抗体的化学结合以及嵌合体的扩展，特别是其中化合物为蛋白质时。可以进行经验性调整，以保证VEGF分子的活性不被明显削弱。

在一个选择实施方案中，光化学偶合可以用于共价偶合。光化学偶合基于使用高能量的光，例如紫外光，形成某种官能团的反应中间体。这些反应中间体可以在两种组分间形成碳-碳键。芳基酮官能团在这方面特别有用。

光化学偶合可以用于VEGF与组织的附着。参见，例如Dunkirk等，生物材料应用杂志(J.Biomaterials Applications),6:131-156(1991)，在本文引用作为参考。由于光化学偶合还通常交联组织，即光固定，组织可以分别交联，也可以不分别交联。或者，光化学偶合可以用于在连接剂与VEGF多肽结合前或结合后或结合中，将连接剂附着于组织上。

不管相互作用的特性，结合的VEGF通常和未结合的VEGF保持平衡状态。因此，如果补充溶液，VEGF可能逐渐流失到周围溶液中。对于一些应用，如果在相应的时间内足够的内皮细胞在组织上增殖，VEGF可能足可以在相对短的时间内结合，如几小时或几天。在其它的条件下，可能需要VEGF与组织更长期的结合，如几个月或几年。因此可以选择VEGF与组织的缔合性质。D．其它修饰

除了VEGF，可能需要其它分子与基底缔合，以改善假体中基底的性能。由于VEGF与基底连接导致的内皮化生长可以减少钙化和感染的发生率。无论如何，由于钙化是导致生物假体组织失败的主要方式，VEGF可以与生物相容性抗钙化处理剂结合使用。因此，可能需要包括用于进一步减少钙化和/或微生物感染的试剂。

乙醇是一个被证明的抗钙化处理剂，如Vyavahare等在循环(Circulation)95:479-488(1997)中所描述，在本文引用作为参考，和Levy等的美国专利5,746,775，在本文引用作为参考。由于乙醇阻碍早期钙化的发生并且VEGF刺激活内皮层，乙醇和VEGF联合应用可以有利于长期活组织的形成。实施例4表明了乙醇处理剂抑制幼年大鼠皮下植入型的戊二醛交联猪主动脉瓣膜小叶的钙化的能力。该实施例还表明，除乙醇外，用VEGF处理这些小叶，可以进一步减少钙化。另外，已发现铝、铁和镁离子可以减少钙化。如Levy等的美国专利5,094,661所描述，这些多价离子可以直接和组织缔合，在本文引用作为参考。

在某个优选的实施方案中，多价阳离子只与基底的一部分缔合。特别地，对于组织心脏瓣膜，可能只需要离子和瓣膜壁缔合，如主动脉瓣膜的主动脉壁，而留下未用离子处理的小叶。整个组织瓣膜优选用VEGF处理。只将假体的一部分用溶液处理如含有多价阳离子的溶液，在共同申请中进一步描述，一般性参见美国专利申请序列号08/850.812,Williams等，题目为“假体装置的差异处理”，在本文引用作为参考。

或者，多价阳离子可以与外源的贮存结构缔合，其依次与基底缔合。用于抗钙化金属离子贮存的外源贮存结构的应用，在共同申请中描述，一般性参见美国专利申请序列号08/595,402和08/690,661，两篇都在本文引用作为参考。同样，某些金属如银具有抗菌活性。外源贮存结构可以用于贮存与基底缔合的适当的抗菌金属离子，如共同申请中所描述，一般性参见美国专利申请序列号08/787,139，在本文引用作为参考。优选的外源贮存结构包括，例如，铁蛋白和其它金属贮存蛋白。外源贮存蛋白可以与基底以类似于那些用于VEGF的方法缔合。活性不应互相干扰。E．体外内皮细胞的附着

在植入患者体内前，可以在体外通过VEGF与基底的连接促进假体上的活内皮细胞的生长。为了减少移植排斥的可能性，用于体外内皮化生长的内皮细胞优选为同源细胞，即来源于最终接收者的细胞。例如，适合的细胞可以从患者的脂肪细胞收获。收获过程可以涉及微血管内皮细胞通过胶原酶消化和纯化后的脂肪抽吸。适合的过程在S.K.Williams的“内皮细胞移植”，细胞移植(Cell Transplantation),4:401-410(1995)中进一步描述，在本文引用作为参考，三篇美国专利4,883,755、5,372,945和5,628,781，也都在本文引用作为参考。纯化的内皮细胞可以混悬在适当的生长介质中，如加入自体血清的M199E(例如，Sigma细胞培养物，St.Louis,MO)。

具有结合VEGF的假体组织可以在搅拌的细胞混悬液中培养几小时至几天，以使内皮细胞接种。细胞接种使内皮细胞随机附着，该内皮细胞可以在植入患者体内之前或之后增殖以涂布假体基底的表面。或者，假体基底可以在一压力梯度下培养几分钟，以促进细胞平铺(sodding)。适当的细胞平铺(sodding)方法可以按照S.K.Williams在上篇文章对血管移植描述的方法。细胞平铺(sodding)可以在假体组织的表面制备一单层细胞。

另外，假体组织可以置于培养系统中，其中让患者的内皮细胞从相邻的可塑性组织培养表面转移到假体基底的表面。如果内皮细胞的附着或转移在涉及生理切应力的条件下进行，那么生长在基底表面的内皮细胞可能表达为适当的粘着蛋白，其可以使细胞在植入体内后更牢固地附着。F．储存、包装、分配和使用

在VEGF结合到基底后，需要储存可能形成假体的基底。如果想要长时间储存基底，基底优选在活细胞不能向内生长的环境中储存。优选的储存技术可以减少微生物污染的风险。例如，修饰基底可以在具有无菌缓冲液和/或盐溶液的密封容器中储存。

在密封的容器中，不向修饰基底连续提供流体。无论如何，应该考虑在基底储存期间可能的VEGF或VEGF活性可能的损失。如果可能过多损失，应该适当限制储存时间，以保证损失可接受的量。

对于分配，假体通常置于密封和无菌的容器中。容器可以注明日期，这样该日期反映了考虑VEGF活性可能的损失或降解后建议的最大储存时间。该容器分配到医疗工作者，用于假体的外科移植手术。体外细胞和VEGF修饰假体的缔合优选在医院中进行，在这里可以取出患者的细胞用于细胞培养系统。

如果需要，作为上述储存和分配方法可供选择的方法，VEGF修饰可以在医院或其它与制备场所分开的地点进行。在这种条件下，分配制备用于VEGF修饰的假体，VEGF的缔合在以后进行。一旦假体用VEGF修饰，可以植入，或储存一段合理的时间(直到1个月或更多)，或引入细胞培养系统，以使细胞(优选自体细胞)结合到VEGF修饰假体中。

在某个具体的优选实施方案中，制备好的假体、VEGF溶液和交联溶液(如果需要)，分别装入容器中，或者作为试剂盒一起应用，或者作为单独的产品，在需要时结合使用。特别地，VEGF溶液可以按照用VEGF修饰基底的用法说明装入运输。假体和溶液在即将使用前合并。在将假体在溶液中保温一段特定的时间后，从溶液中取出假体，用无菌盐溶液漂洗，植入患者体内。

将VEGF结合到假体中以促进基底的内皮化生长，这应该可以在植入后改善基底的生物相容性。特别地，静止的内皮细胞单层可以用作障碍感染、炎症和钙化的屏障。假体的内皮化生长还可以促进具有能够修复和改型组织的细胞的假体的进一步细胞再次分裂(Cellularization)。因此，可以明显地改善假体的耐久性和使用寿命。最后，细胞再次分裂(Cellularization)可以提供更接近天然、生物成分组织的假体。

实施例实施例1：直接VEGF缔合

该实施例证明了VEGF与交联组织缔合的能力，以及相关VEGF刺激活内皮细胞与组织附着的的有效性。

制备以下几种溶液。5升的戊二醛溶液，通过加入19.3g NaCl、70.0g柠檬酸钠、2.5g柠檬酸、50ml 50％体积比的戊二醛(电子光谱科学，Fort Washington,PA)，和足量的反相渗透纯水(RO warer)制备。VEGF溶液的制备，通过用5ml 30mM的HEPES缓冲盐溶液(HBSS,fromClonetics,San Diego,CA)将50μg/ml的VEGF储备溶液(人重组体VEGF₁₆₅,R&D系统，Minneapolis,MN)稀释至最终100ng/ml的浓度。HEPES缓冲盐溶液通过将17.4g NaCl和35.7g HEPES游离酸加入到3升RO水中制备。80％的乙醇溶液的制备，通过将1.8g NaCl、3.8g HEPES游离酸、1684ml 95％的乙醇(Worum Chemical,Saint Paul,MN，目录编号200115)和316ml RO水合并制成2升溶液。所有的溶液在使用前进行无菌过滤。

为了制备样品，从收获的猪心脏瓣膜取出75个猪心脏瓣膜小叶。小叶在0.9％无菌盐溶液中4℃下保存过夜。然后，小叶在柠檬酸盐缓冲戊二醛溶液中进行戊二醛交联最少6天。戊二醛溶液在交联过程中，24小时后和3天后更换两次。交联小叶在HEPES缓冲戊二醛溶液中室温下保存，或者用乙醇处理后保存5天(35个小叶)，或者保存46天(40个小叶)。

如上所述，从戊二醛溶液中取出35个小叶，用乙醇处理。从戊二醛溶液中取出后，将这些小叶在500ml HEPES缓冲盐溶液中培养10分钟。倒掉该盐溶液，小叶在500ml新鲜的HEPES缓冲盐溶液中再培养15分钟。从第二次盐溶液中取出后，小叶用80％7醇漂洗一次，然后用500ml 80％7醇溶液浸泡15分钟。然后，将第一次的乙醇溶液用相同的500ml 80％7醇溶液替换，然后将小叶在第二次的乙醇溶液中室温下培养大约-24小时。

在乙醇中24小时后，小叶用HEPES缓冲盐溶液漂洗，然后在HEPES缓冲盐溶液中浸泡15分钟。改变溶液后，小叶在HEPES缓冲盐溶液中浸泡24小时。然后将小叶转移至含有HEPES缓冲盐溶液的储存容器中。储存容器中的小叶通过SteriGenics(Charlotte,SC)进行ε射线灭菌。ε照射使HEPES缓冲盐溶液中的小叶变成棕色。灭菌后，小叶在该容器中4℃下保存直到将来使用。

用乙醇处理的和未用乙醇处理的戊二醛交联小叶从储存液中取出，切成两半。将切割后的小叶用100ml 0.9％的无菌盐溶液漂洗三次。漂洗后，6个乙醇处理的和6个未用乙醇处理的二等分小叶在含有100ng/mlVEGF的HBSS中培养。小叶在VEGF溶液中4℃下培养过夜。

四个六孔平板用2％凝胶(Sigma Chemical,St.Louis,MO)和EGM介质(Clonetics,San Diego,CA)制备，以支持细胞生长。将从Clonetics得到的人脐静脉内皮细胞(批号#2803)在24个孔中每一个都生长至铺满。获得铺满24小时后，使用无菌橡胶刮棒从每个孔的中心刮掉细胞。除去含有细胞碎屑的介质，替换为新鲜的EGM介质。用光学显微镜检查每个孔，保证细胞已经从每个孔的中心除去。

二等分小叶放置于每个平板刮削的清洁的中心处，按照下列规定加入正常的EGM介质或含有10ng/ml VEGF的EGM介质：

1)没有小叶，没有VEGF的介质(3孔)；

2)没有小叶，具有VEGF的介质(3孔)；

3)乙醇处理的小叶，没有VEGF的介质(4孔)；

4)乙醇处理的小叶，具有VEGF的介质(4孔)；

5)乙醇和VEGF处理的小叶，没有VEGF的介质(4孔)；

6)非乙醇处理的小叶，没有VEGF的介质(2孔)；和

7)VEGF处理、未用乙醇处理的小叶，没有VEGF的介质(4孔)。未用VEGF预处理等分小叶用无菌盐溶液漂洗三次，如上所描述。VEGF预处理的小叶在用VEGF处理前漂洗过，在放置于小孔前不进行任何另外的漂洗。

使用6孔平板的第五个，其中HUVECs在置于每个孔内的组织培养插入物的膜顶部培养。一旦该膜上的细胞已获得铺满，用解剖刀在每个插入膜的中心切一个小孔。小叶置于每个培养孔的底部，插入物置于小叶上，这样插入物膜的小孔的边缘靠在小叶上。每个培养孔中加入2mlEGM介质。在该平板上，两个小叶用乙醇处理，而未用VEGF处理，两个小叶用VEGF处理后用乙醇处理，两个小叶用VEGF处理，而未用乙醇处理。

大约5小时后，替换5个平板中所有培养孔中的介质。然后细胞总共生长大约5天，每隔日加入新鲜的介质。4日后，用光学显微镜检查所有的培养孔。由于小叶是不透明的，该技术不能观察到细胞附着到小叶上。由于这些膜也是不透明的，因此也不可能观察到细胞在插入物的顶部生长。给定这些限制，进行下列观察：

1)生长于不含有小叶的培养孔中的细胞再继续生长，覆盖刮干净

的区域，并且几乎再次铺满。

2)含有戊二醛小叶的培养孔中的大多数细胞未经过进一步处理死

去；和

3)乙醇处理的小叶不出现细胞毒性。

5天后，一半的组织样品用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐溶液漂洗两次(Gibco BRL,Grand Island,NY)。漂洗的样品用3％的戊二醛溶液固定至少5分钟。固定的样品用RO水漂洗三次，用0.25M的蔗糖溶液漂洗一次。

5mM的荧光、亲脂性探针，二十八烷基四甲基靛羰花青高氯酸盐(DiI)(从分子探针公司，Eugene,OR(产品编号D-282)获得)储备溶液，通过将0.00467g的DiI粉末加入到在1.5ml的微离心管中的1ml二甲基硫酸盐中。涡旋离心管使粉末溶解。离心管在室温下保存，用铝箔包裹避光。50μM的DiI溶液通过将150μl的5mM储备液加入到离心管中的15ml的0.25M蔗糖溶液进行制备。涡旋离心管使溶液混合。稀的DiI溶液在使用当天现制备。

通过将培养孔中的每个漂洗小叶用足量的50μM DiI溶液涂布，对组织样品进行荧光染色。用铝箔覆盖平板避光。将小叶染色至少大约15分钟，但不超过大约25分钟。然后，样品用RO水漂洗四次。漂洗后，向每个样品中加入0.9％的盐溶液，以防止其干燥，然后在检查前用铝箔覆盖样品，以避免漂白。应用四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)过滤和照相，对染色的组织样品进行描绘。

在乙醇处理的小叶上没有细胞生长，在未处理的小叶上也没有细胞生长，除了少量细胞在与膜插入物接触的一个样品上生长。同样，溶液中10ng/ml的VEGF也不能刺激细胞与组织的结合。当通过TRITC过滤检查，缺少细胞的小叶只能观察到背景荧光。VEGF吸附到表面的小叶具有发光荧光细胞附着到小叶的菌落，这表明其对内皮细胞向小叶迁移和附着到小叶的刺激。这可以从图1和图2中可以发现，在图1中有代表性的小叶直接和膜插入物上的内皮细胞接触，在图2中有代表性的小叶位于培养孔中内皮细胞最初清晰的部位。插入物的应用没有定性改变结果。

在其它实验(戊二醛交联小叶在100ng/ml的VEGF中培养)中可以发现类似的结果。具体地，在培养5-30天内VEGF可以提高HUVEC和人主动脉内皮细胞在小叶的生长。其它实验还表明，在与VEGF培养前小叶在HEPES缓冲戊二醛溶液中储存少于一个月，这时VEGF附着到该小叶上最有效。实施例2:VEGF戊二醛交联到乙醇处理交联组织上

该实施例表明低浓度的戊二醛溶液可以有效将VEGF交联到乙醇处理的戊二醛交联组织上，而不降低VEGF刺激内皮细胞增殖和趋化的能力。

所有的溶液在使用当天现制备，通过0.25μm过滤器过滤。HEPES缓冲盐溶液由溶解在反向渗透纯水(RO水)中的0.1M NaCl和50mMHEPES组成。将HEPES缓冲盐溶液的pH值调节至7.4。通过将20μl体积比50％的戊二醛储备液(电子显微科学，Fort Washington,PA)加入到100ml HEPES缓冲盐溶液中，制备0.01％戊二醛溶液。VEGF/戊二醛溶液的制备，通过将2μg/ml的VEGF(人重组体VEGF₁₆₅,R&D系统，Minneapolis,MN)加入到20ml 0.01％的戊二醛溶液中，得到100ng/ml的VEGF和0.01％的戊二醛溶液。

8个戊二醛交联和乙醇处理的小叶如实施例1所描述的方法制备，用无菌盐溶液漂洗。3个小叶在VEGF/戊二醛溶液中培养15分钟，3个小叶在VEGF/戊二醛溶液中培养30分钟。其余两个小叶在HEPES缓冲盐溶液储存作为对照。培养期结束后，小叶用无菌0.9％盐溶液漂洗3次，每次漂洗2分钟。

在处理小叶培养前几天，涂布有2％凝胶的6孔组织培养平板用人主动脉内皮细胞接种(Clonetics,San Diego,CA)。内皮细胞生长至铺满，每隔日加入新鲜的内皮生长介质(EGM)(Clonetics,San Diego,CA)。在将组织样品加入到组织培养平板前，将每个组织培养孔的中心部分的内皮细胞刮干净。每个培养孔用EGM漂洗两次，除去细胞碎屑。

在EGM培养和漂洗小叶后，将小叶放置于培养孔的澄清部位，每个培养孔一个小叶。无菌组织培养插入物(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)置于小叶上面，以防止小叶悬浮。每隔日向培养孔中加入新鲜的EGM。5天后，将小叶置于3％的戊二醛中，固定附着于小叶表面的任何细胞。然后如实施例1所描述，用荧光、亲脂性探针，二十八烷基四甲基靛羰花青高氯酸盐(分子探针公司，Eugene,OR)染色小叶。

应用四甲基若丹明异硫氰酸盐过滤和照相，对染色的组织样品进行描绘。在VEGF/戊二醛溶液中培养15分钟(图3B)和30分钟(图3C)的小叶，与对照小叶相比(图3A)，在小叶的表面有大量的内皮细胞生长。因此，应用0.01％的戊二醛将VEGF交联到乙醇处理的小叶表面，对生长于小叶的内皮细胞不显示细胞毒性。另外，VEGF可有效促进处理组织的内皮细胞生长。由于戊二醛交联组织的乙醇处理已预先显示出在植入后改善生物相容性和抑制组织的钙化，所以可以明显地得出小叶的乙醇处理在该条件下不抑制VEGF的结合。

从其它实验中可发现相似的结果，其中应用体外检测对比人主动脉内皮细胞在未处理的或处理的戊二醛交联组织上生长的能力。如图4A和图5A所示，未用乙醇或VEGF处理的戊二醛交联组织是不适合于人内皮细胞生长的基底。图4所示的显微照片通过将附着于组织的细胞用3％甲醛固定，荧光染色后获得。图5所示的显微照片通过将附着于组织的细胞用磷酸盐缓冲液、2％戊二醛溶液固定至少24小时后获得。然后组织连续用乙醇脱水，最后用六甲基二硅烷脱水。样品附着到SEM短管上，用金钯涂布。应用Hitachi^TM450扫描电子显微镜对样品进行照相。

如实施例1所描述，80％乙醇中的戊二醛交联组织的培养可改善生物相容性，如乙醇处理的组织具有内皮细胞较大的菌落，如图4B和图5B所示。然而，附着于乙醇处理组织的内皮细胞具有松散附着或死亡细胞的圆形形态特性(图5B)。如果乙醇处理的小叶在100ng/ml VEGF/0.01％戊二醛再进行30分钟培养，如上所述，VEGF处理组织可以更快进行，并完成内皮化生长，如图4C和图5C所示。与其它处理组观察到的细胞相比，扫描电子显微照片显示附着于VEGF处理组织的内皮细胞被认为是更散布的(图5C)。该散布的形态表明更健康的内皮细胞系。实施例3:VEGF戊二醛交联到新鲜组织上

该实施例表明低浓度(0.01％)的戊二醛溶液可以用于将VEGF附着到新鲜的猪主动脉小叶组织上，而不降低VEGF刺激内皮细胞增殖和趋化的能力。

HEPES缓冲盐溶液、0.01％戊二醛溶液和VEGF/戊二醛溶液的制备如实施例2所描述。6个猪主动脉小叶应用无菌外科手术收获，并用无菌0.9％盐溶液漂洗。2个小叶在10ml HEPES缓冲盐溶液中培养。另2个小叶在10ml 0.01％戊二醛溶液中培养。其余2个小叶在10ml VEGF/戊二醛溶液中培养。所有的小叶在各自溶液中培养30分钟。在30分钟培养期结束后，小叶用100ml 0.9％无菌盐溶液漂洗3次，每次漂洗2分钟。

在处理小叶前几天，涂布有2％凝胶的6孔组织培养平板用人主动脉内皮细胞接种(Clonetics,San Diego,CA)。内皮细胞生长至铺满，每隔日加入新鲜的EGM(Clonetics,San Diego,CA)。在小叶的30分钟培养期，将每个组织培养孔的中心部分的内皮细胞刮干净。然后每个培养孔用新鲜的EGM漂洗，除去细胞碎屑。在30分钟的培养培养期和漂洗小叶后，立即将小叶放置于每个培养孔的澄清部位。无菌组织培养插入物(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)置于小叶上面，以防止小叶悬浮。加入新鲜的EGM，然后将组织培养平板放回组织培养箱中。

每隔日向培养孔中加入新鲜的EGM。培养持续5天。5天培养期结束时，附着于小叶表面的细胞用3％甲醛固定。然后如实施例1所描述，用荧光、亲脂性探针，二十八烷基四甲基靛羰花青高氯酸盐(分子探针公司，Eugene,OR)染色小叶。

应用四甲基若丹明异硫氰酸盐过滤和照相，对染色的组织样品进行描绘。照片如图6A-6C所示。观察或在HEPES缓冲盐溶液或在0.01％的戊二醛中已培养的组织中的一些内皮细胞菌落。通过将图6C与图6A和图6B对比后观察到，在VEGF/戊二醛溶液中培养的小叶，在组织中生长有更多的内皮细胞。因此，含有100ng/ml VEGF的0.01％戊二醛缓冲溶液中的培养，对人主动脉内皮细胞的生长不产生任何负面的影响，可以加速内皮细胞在猪主动脉组织上的覆盖。实施例4:VEGF诱导的小叶钙化抑制

该实施例表明戊二醛交联猪主动脉瓣膜小叶与VEGF和乙醇合用，可以抑制该小叶的钙化，如幼年大鼠皮下植入型所评价。

已知幼年大鼠皮下植入型是有关心脏瓣膜钙化最接近的临床模型(Levy等，Am.J.Pathol.113:143-155(1983))。因此，该模型用于评价小叶进行不同的加工或表面修饰的潜在钙化。

所有溶液的制备和小叶用这些溶液的处理按照实施例1和2中所描述的方法进行。简要地，从猪主动脉瓣膜收获45个小叶，用0.5％的柠檬酸盐缓冲戊二醛溶液交联。这些小叶中的15个(对照组)，直到植入前储存在HEPES缓冲盐溶液中。其余的30个小叶在80％的乙醇溶液中培养24小时，然后通过ε射线进行灭菌。在ε射线灭菌中和之后，小叶储存在HEPES缓冲盐溶液中。15个乙醇处理的小叶(乙醇和VEGF组)，在植入的当天在0.01％戊二醛/100ng/ml VEGF溶液中培养30分钟。

在植入前，，小叶用无菌0.9％盐溶液漂洗3次，每次漂洗大约2分钟。应用无菌技术，然后用无菌有色缝合线给小叶编码，以区分三组小叶(白色=对照组，绿色=乙醇组，黑色=乙醇和VEGF组)。编码小叶储存在无菌盐溶液中，运送到Saint Paul,MN的Regions医院的Ramsey动物实验室，在这里进行皮下植入。

手术过程在无菌条件下进行。3周的Sprague-Dawley大鼠通过腹膜内注射氯胺酮盐酸盐，进行麻醉，在每个大鼠的中腹部壁上剖开直径至少2cm的皮下一个小袋。四个小叶分别植入每个大鼠的小袋中，每个小袋中放入一个小叶。每个处理组的大鼠植入至少一个，但不超过两个小叶。通过外科手术缝合伤口，是大鼠痊愈。小叶植入21天(每个处理组的10个小叶)，或63天(每个处理组的5个小叶)。在植如期结束后，从大鼠中取出样品。取出的样品储存在无菌盐溶液中，运送进行分析。

每个组织样品沿径向轴分成两半。一半组织洗净在植入和脱水期间包覆反应产生的宿主组织。脱水样品进行诱导偶联血浆原子发射光谱(ICP-AES)，测定钙含量。每个组织样品的第二半置于10％甲醛溶液中，运送至美国Histo Labs(Gaithersburg,MD)，利用von Kossa染色特异性染色磷酸钙结晶，进行组织学样品制备。

图7为ICP-AES检测钙含量的平均结果。乙醇处理在21天和63天明显抑制钙化。乙醇处理中加入VEGF进一步减少钙化。图8为应用vonKossa染色对组织样品对磷酸钙进行组织学分析的有代表性照片。图8的照片证实了乙醇对钙化的抑制，和乙醇/VEGF合用对钙化的协同抑制。

上面描述的实施方案是为了说明，而不是为了限制。在权利要求范围内还有其它实施方案。尽管本发明作为参考描述了优选实施方案，但是本领域技术人员在不背离本发明的精神和范围内，可以在形式和细节上进行改变。

Claims

1．一种用于病人的假体，包括同种异体移植物或异种移植物组织，其中具有多肽生长因子与其缔合，所述的多肽生长因子可有效刺激活细胞与所述组织的结合。

2．按照权利要求1的假体，其中所述多肽生长因子与所述组织的所述结合涉及特异性结合相互作用。

3．按照权利要求1的假体，其中所述多肽生长因子与所述组织的所述结合涉及共价结合。

4．按照权利要求1的假体，其中所述多肽生长因子与所述组织的所述结合涉及一种连接分子。

5．按照权利要求1的假体，其中所述的组织包括交联组织。

6．按照权利要求1的假体，其中所述的组织包括未交联组织。

7．按照权利要求1的假体，其中所述的组织包括猪心脏瓣膜。

8．按照权利要求1的假体，其中所述的组织包括牛心包组织。

9．按照权利要求1的假体，其中所述的多肽生长因子包括血管内皮生长因子。

10．按照权利要求9的假体，其中所述的血管内皮生长因子包括选自下组的蛋白质：bVEGF164,bVEGF120,hVEGF165,hVEGF121,VEGFⅡ,hVEGF80,VEGF-B,VEGF2，它们的修饰活性型，以及它们的组合。

11．按照权利要求1的假体，其中所述的组织包括合成组织。

12．一种产品，包括具有缔合的VEGF的交联的组织。

13．按照权利要求12的产品，其中所述的交联涉及戊二醛半分子。

14．一种包括缔合VEGF的假体心脏瓣膜。

15．按照权利要求14的假体心脏瓣膜，其中假体心脏瓣膜包括猪心脏瓣膜。

16．一种制备用于病人的假体的方法，所述的假体包括同种异体移植物或异种移植物组织，所述的方法包括多肽生长因子与所述组织的结合。

17．权利要求16的方法，进一步包括将具有结合多肽生长因子的所述组织与活细胞在体外温浴，以将所述的细胞结合到所述的组织上。

18．按照权利要求16的方法，其中所述的细胞包括人细胞。

19．按照权利要求16的方法，其中所述的细胞包括从假体预期的接受者上获得的细胞。

20．一种修饰基底的方法，该方法包括将活细胞在体外与组织温浴，以将所述的细胞结合到所述的基底上，所述的基底包括缔合的多肽生长因子。

21．一种假体，包括基底和与基底缔合的多肽生长因子，其中多肽生长因子可有效刺激活细胞与基底的缔合。

22．按照权利要求21的假体，其中多肽生长因子通过交联剂结合到基底上。

23．按照权利要求22的假体，其中交联剂包括双官能团的醛。

24．按照权利要求23的假体，其中双官能团的醛包括戊二醛。

25．按照权利要求21的假体，进一步包括一种粘合剂，该粘合剂与多肽生长因子和基底缔合。

26．按照权利要求25的假体，其中粘合剂包括可再吸收的材料。

27．按照权利要求25的假体，其中可再吸收的材料包括一种纤维蛋白粘合剂。

28．按照权利要求21的假体，其中基底包括组织。

29．按照权利要求21的假体，其中基底包括人组织。

30．按照权利要求21的假体，其中基底选自猪组织、牛组织、袋鼠组织、犬组织，以及它们的组合。

31．按照权利要求21的假体，其中基底包括合成基底。

32．按照权利要求21的假体，其中基底包括生物可再吸收的材料。

33．按照权利要求21的假体，其中多肽生长因子包括血管内皮生长因子。

34．按照权利要求21的假体，其中多肽生长因子包括Tat蛋白。

35．按照权利要求21的假体，其中假体包括人工器官，心脏瓣膜假体，瓣环成形术环，扩张结构，小拭子，缝合线，电引线，永久性留置的经皮装置，AV支路，人造血管，真皮移植物，或外科手术补片。

36．一种用于内皮细胞与基底缔合的方法，该方法包括将权利要求21的假体与含有内皮细胞的培养物接触。

37．一种用于分发医疗工作者使用的医疗产品的方法，包括在无菌条件下将权利要求21的假体进行包装，并分发医疗工作者使用的包装物。

38．一种用于制备生物相容性材料的方法，该方法包括：将多肽生长因子在该多肽生长因子可有效刺激活细胞与基底的结合的条件下附着在基底上。

39．按照权利要求38的方法，其中多肽生长因子到基底的附着包括交联。

40．按照权利要求39的方法，其中VEGF的交联通过戊二醛进行。

41．按照权利要求39的方法，其中VEGF的交联进行时间小于大约1小时。

42．按照权利要求39的方法，其中VEGF的交联进行时间大于大约24小时。

43．按照权利要求38的方法，其中基底包括组织。

44．按照权利要求43的方法，其中组织为交联组织。

45．按照权利要求43的方法，其中组织为未交联组织。

46．按照权利要求38的方法，其中基底包括人组织。

47．按照权利要求38的方法，其中基底包括猪组织、牛组织、袋鼠组织、犬组织，以及它们的组合。