CN1275999C

CN1275999C - 一种智能型可降解高分子微凝胶的分步制备方法

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Publication number: CN1275999C
Application number: CN 200410017390
Authority: CN
Inventors: 丁建东; 张颖; 王标兵
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2004-04-01
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2024-04-01
Also published as: CN1563140A

Abstract

本发明涉及一种具有反向温度敏感性的智能型可降解高分子微凝胶的分步制备方法。微凝胶通过可降解的大分子单体微粒聚合而成，由两个步骤组成：在大分子单体溶液的相转变温度以下将大分子单体溶液分散成微滴；然后再升高温度引起聚合。该方法适用范围广，尤其适用于高浓度大分子单体溶液的聚合。由该法制备的微凝胶主要用于药物的控制释放或其它的生物医学应用如组织工程、尤其是生物活性物质如蛋白质的缓释。

Description

一种智能型可降解高分子微凝胶的分步制备方法

技术领域

本发明涉及一种微凝胶的制备方法，具体是一种温敏性可降解微凝胶的分步骤的反相悬浮聚合的方法。

背景技术

随着生物技术和遗传工程的发展，许多具有药理活性的多肽和蛋白质如生长激素、胰岛素、肝素、干扰素和白细胞介素等在侏儒症、糖尿病、肝硬化以及许多癌症等难以治愈疾病的治疗过程中表现出了很强的药理作用。但这种药物其生物半衰期短，稳定性差，且由于这类药物具有较好的水溶性，很难通过生物体内脂质结构屏障，同时分子量大难于吸收，无法用普通剂型给药(平其能，1998)。

在人体器官修复的组织工程中也需要各类生长因子的介入，才能使细胞生长成为新的组织，它们共同的特点是为多肽、蛋白质类物质，半衰期是数秒至数分钟，易失去生物活性，因此如何应用药物控制释放技术保持生长因子的活性和实现长期有效是其能否真正在临床发挥作用的关键所在(Yasuhiko，2000)。

近年来，微粒作为一种理想的药物缓释载体已经取得了很大的进展。目前微粒技术已经应用于30多种药物，包括退热止痛药、抗生素、纤维蛋白和抗癌药等。对于敏感的生物大分子，如蛋白质、酶、多肽和激素等，最有前景的方法之一就是将其包封在微粒中。

由于对微粒所采用的材料具有一定的要求，如适宜的释药速度、一定的稳定性、无毒、不影响药物的药理作用、一定的强度和可塑性以及亲水性、渗透性、和溶解性等，所以目前以生物降解性类材料研究较多，尤其是聚酯类等合成高分子，主要是因为由这种材料制备的微粒在给药后具有不需取出等优点，所以目前被广泛应用(Blanco et al.，(1998)Zhu etal.，(1999))。

微粒制备的新方法、新技术一直是众多研究者的方向之一。目前，研究者多以溶剂蒸发法、相分离法、复乳法等物理化学法，界面缩聚法、乳化聚合法等化学和喷雾干燥、空气悬浮法等物理机械法制备微粒。制备方法对微球的性质有影响，对于可降解聚合物微球的形成，选择合适的包埋药物的过程从而实现理想的药物控制释放是很必要的。微球药物载体希望能有以下要求：合适的蛋白质载药量，微球的高产量，包埋蛋白质药物的稳定性，批间重现性，可调节的释放行为，较低的突释效应，微球的自由流动性而不聚集等。对于蛋白质药物的缓释微球，制备方法通常有喷雾干燥，双乳液法和相分离法。如(Cho et al2001)以聚乳酸/聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)为材料，运用水/油/水的复乳法制备了PLLA-PEG共聚物微粒，并包埋了牛血清白蛋白(BSA)等模型药物。但实际上，上述的这些方法在包裹药物时通常都是原位包裹，而且都需要高温条件，或者使用破坏性有机溶剂[Chen L，1997]，而这对蛋白质的活性是非常不利的。

近年来，由于多肽、基因药物的出现，人们对具有良好生物相容性的水凝胶的制备及其应用的研究越来越感兴趣。水凝胶作为大分子药物的控释材料更为适宜。因为水凝胶聚合物具有良好的生物相容性，并且它所含有的大量水性环境适合极性蛋白质分子的扩散。而且水凝胶在包裹药物时，可以采用后包裹的方法，即在吸附药物之前可以将造成生物不相容和大分子类药物失活的聚合过程中残余的单体，引发剂和副产物等充分去除。水凝胶有很多物理形式，无疑微凝胶即微粒的一种是蛋白质药物载体的最佳方案之一。除了因为它包封率高，稳定性好以外，最重要的就是与大块凝胶相比，具有可注射性。目前用于蛋白质药物载体的微凝胶及其制备方法并不多见。本发明提出了一种温敏性可降解微凝胶的分步骤的反相悬浮聚合的方法。

参考文献

1.Blanco D.，Alonso M J.，“Protein Encapsulation and Release fromPoly(lactide-co-glycolide)Microspheres：Effect of the Protein and PolymerProperties and of the Co-encapsulation of Surfactants，”Eur.J.Pharm.Biopharm.45：285-294(1998)

2.Chen L，Apte R N，Cohen S，Characterization of PLGA microspheres for thecontrolled delivery of IL-1α for tumor immunotherapy，J.Control.Release.，43：261-272，(1997)

3.Cho K Y.，Choi S H.，Kim C H.，Nam Y S.，Park T G..，Park J K.，“Protein ReleaseMicroparticles Based on the Blend of Poly(d，l-lactic-co-glycolic acid)andOligo-ethylene glycol Grafted Poly(l-lactide)，”J.Control.Release 76：275-284，(2001)

4.平其能主编，现代药剂学，中国医药科技出版社，1998

5.Yasuhiko T.，“The Importance of Drug Delivery Systems in Tissue Engineering，”Pharmaceutical Science & Technology Today 3：80-89，(2000)

6.Zhu Z X.，Xiong C D.，Zhang L L.，Yuan M L.，Deng X M.，“Preparation ofBiodegradable Polylactide-co-poly(ethylene glycol)Copolymer by LactideReacted Poly(ethylene glycol)”，Eur.Polym.J.35：1821-1828，(1999)

发明内容

本发明的目的在于提出了一种温敏性可降解微凝胶制备的反相悬浮聚合的方法，该方法得到的微凝胶粒径更均一，且适用范围广，尤其适用于高浓度大分子单体溶液的聚合。

微凝胶可以采用反相悬浮聚合方法，即将水溶性的大单体溶液反向悬浮在有机溶剂中形成微粒，然后聚合可交联的大单体，使得微粒的形状固定下来的方法。本发明的制备方法针对于具有如下结构的温敏性可降解的大分子单体：F(DC^*)₂，其中，F代表反向温敏性大分子或寡聚物，D为可降解部分，C^*为可聚合部分；所得到的微凝胶结构则为

式中，表示任意形式的化学交联，F(DC)₂表示交联点之间的嵌段共聚物链段，其中C为聚合交联部分。)。该类大单体以及所得到的水凝胶不仅可以降解，还具有反向的温度敏感性，即，至少具有一个这样的相转变温度，当体系的温度低于相转变温度时，大单体的溶液处于流动状态或微凝胶处于舒张状态；当温度高于该相转变温度时，大单体浓溶液处于物理凝胶状态或者所得到的微凝胶处于收缩状态。

但是，往往在适宜的聚合反应温度下，大单体水溶液已经处于凝胶的状态。这样，大单体溶液(分散相)无法滴到有机溶剂(连续相)之中，或者虽然滴到了有机溶剂之中，但是马上由于温度的变化形成了物理凝胶而难以在连续相中分散。

为此，本发明提出在大单体溶液的的相转变温度以下(较低的相转变温度，即从sol-gel的转变温度)或所形成微凝胶的相转变温度以下，将温敏性可降解的大分子单体溶液分散在连续相即有机溶剂中，当大分子单体溶液被分散成微滴之后，再升高到可引发聚合的温度，在引发剂的存在下，聚合成温敏性可降解的微凝胶。

由本发明所提出的反相悬浮聚合的方法所制备的温敏性可降解的微凝胶，其粒径大小随温度变化而改变，一般为5nm-5mm，较好的为1μm-200μm。

上述方法中，反相悬浮聚合时，大单体溶液的重量用量为1％-49％。大分子单体溶液重量浓度为3～98％，其溶剂以水、水溶液或亲水性溶剂、亲水性溶液为主体介质。

上述方法中，引发剂可以为氧化还原引发体系，氧化剂为如过硫酸钾，过硫酸胺等；还原剂为亚硫酸氢钠，抗坏血酸或四甲基乙二胺等。引发剂为也可以为热引发体系，如偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰等。引发剂的用量占大分子单体重量的0.001％以上，一般为0.01～8％。

上述方法中，引发剂可以在大分子单体溶液的相转变温度(较低的相转变温度，即从sol-gel的转变温度)或生成温敏性可降解的微凝胶的相转变温度以下加入到大分子单体溶液中，当微滴分散好以后，再升高到可引发聚合的温度。

上述方法中，可以将部分引发剂加入到大分子单体或者大分子单体溶液中，而剩下的引发剂在微滴分散好以后再加入到连续相中。

上述方法中，可以将大分子单体在连续相中分散好以后，再将引发剂直接加入到连续相中。

上述方法中，聚合温度高于大分子单体的相转变温度。该转变温度一般为从sol到gel的转变温度。有些体系不仅具有sol-gel转变温度，还具有一个更高的gel-sol转变温度或其它更高的转变温度。聚合温度高于sol-gel转变温度，也包括高于gel-sol转变温度甚至其它更高的转变温度。聚合温度可以高于所生成的温敏性可降解微凝胶的相转变温度或者虽然低于微凝胶的相转变温度但高于大分子单体的分散温度。本发明的关键之一在于聚合温度高于分散温度。变温的过程可以包含两种温度，也可以包含更多的温度。

上述方法中，反相悬浮聚合时的连续相为不溶于水的有机溶剂，可以是正庚烷、正辛烷、环己烷、甲苯以及二甲苯等，也可以是它们的混合溶剂；而分散相则为疏油的溶剂，一般为水或水溶液，也可以是其它亲水性溶剂或亲水性溶液。

上述方法中，反相悬浮聚合时在有机溶剂中加入有非离子型乳化剂，如Span(司班)，Tween(吐温)系列，也可以为它们的混合物，两者重量用量比为100～50∶0～50，较佳比为100～80∶0～20，或其它能形成油包水的液体非离子型乳化剂。

上述方法中，乳化剂重量用量为1％～40％，较佳重量用量为5％～15％；大单体溶液重量用量为1％～49％，较佳重量用量为7％～35％；反应温度为30～100℃，一般为45～80℃，搅拌速度为60转/分钟～2000转/分钟；反应时间为3分钟以上，一般为0.5～5小时。反应完毕后过滤，用丙酮、水冲洗，可以直接低温保存。或者真空干燥或冷冻干燥后得到干的凝胶微粒物质后再保存。所得粒子的粒径为5nm～5mm。

本发明的“微凝胶”可以处于本体聚合物状态或与溶剂混合的状态。溶剂可以为水以及有机溶剂；一般采用水或水溶液作为溶胀微粒本体材料的物质，微粒呈水凝胶状态。这里的所谓“凝胶微粒”也包括处于其它溶剂当中的凝胶或无溶剂时单纯的微粒。当微粒呈水凝胶状态时，这里的“溶剂”可以包括纯水、缓冲液、体液、细胞培养液、组织培养液以及其它水溶液和不以有机溶剂为主体的溶剂介质。

本发明的优点是适用范围更广，尤其适用于酰氯化程度较高，大分子单体浓度较高的单体溶液的聚合，而且该方法制备的微凝胶粒径分布较窄，粒径均一，微凝胶的温敏性显著，凝胶网络孔径较大，有利于我们后续的将该温敏性可降解的微凝胶进行后包裹生物活性物质工作的进行。

附图说明

图1a为微凝胶在4℃在倒置显微镜下观察的照片。

图1b为微凝胶在37℃在倒置显微镜下观察的照片。

图2微凝胶的体积随温度的变化。

图3微凝胶的粒径分布。

图4微凝胶的降解行为。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但不限于这些实施例。

实施例1

20g的PEO₁₀₀-PPO₆₅-PEO₁₀₀，1.84g丙交酯和1.3ml的10mg/ml的异辛酸亚锡的苯溶液装在50ml预先真空干燥的安瓿管内，将安瓿管于60℃油浴中抽真空6hr，以除去易挥发物，期间用氩气置换数次，之后在真空下热封安瓿管，再在150℃油浴中反应24hr，冷却后用二氯甲烷溶解，然后用过量的无水乙醚沉淀并去除多余的辛酸亚锡，抽滤得到F127/寡聚酯共聚物，室温下真空干燥2-3天。共聚产物的二氯甲烷溶液与丙烯酰氯(摩尔比为1∶10)反应，反应后过滤，滤液在无水乙醚(-10～0℃)中沉淀，收集沉淀，真空干燥，得大分子单体(PEO₁₀₀-PPO₆₅-PEO₁₀₀)-LA₈-DA。

在有氮气保护的四口烧瓶中先后加入司班80和正庚烷(司班80与正庚烷重量比为8％)，在冰浴中搅拌，搅拌速度为450转/分钟，滴加16.7％浓度的大单体水溶液(含有15μl的四甲基乙二胺和大单体重量3％的过硫酸胺)，每秒1-2滴，正庚烷与大单体水溶液的重量比为12∶1。在冰浴中稳定30分钟后，将水浴加热至60℃，恒温30分钟后，逐滴补加入含有20μl的四甲基乙二胺和大单体重量3％的过硫酸胺的水溶液，1小时后停止搅拌，趁热用筛网过滤，去离子水洗涤后，放入冰箱内保存。

图1是用该方法制备的微凝胶的倒置显微镜照片图，可以看到，随温度的增加，微凝胶体积减小。图2给出了微凝胶的体积随温度变化的情况(V其中为任意温度下凝胶的体积，V0为凝胶在4℃下的体积)。而图3为微凝胶的粒径分布(激光粒度仪，LS230，美国，同济大学，测试温度20℃)，粒径分布为68.14±59.45μm。

实施例2

与实施例1操作相同，反应物投料摩尔比为PEO₁₂₉-PPO₅₆-PEO₁₂₉∶ε-己内酯∶异辛酸亚锡＝1∶8∶0.02，混合均匀后在60℃抽真空6小时，以除去易挥发物，然后用惰性气体(氮气或氩气)置换数次，最后在真空(0.1mmHg)下热封安瓿管。在150℃条件下共聚反应24小时。共聚产物的二氯甲烷溶液与甲基丙烯酰氯(摩尔比为1∶20)反应，反应后过滤，滤液在无水乙醚(-10～0℃)中沉淀，收集沉淀，真空干燥，得到大分子单体(PEO₁₂₉-PPO₅₆-PEO₁₂₉)-CL₄-DMA。

在有氮气保护的四口烧瓶中先后加入司班80和吐温80(重量比为84∶16)和环己烷，(乳化剂与环己烷重量比为10％)，在冰浴中搅拌，搅拌速度为350转/分钟，滴加25％浓度的大单体水溶液，每秒1-2滴，环己烷与大单体水溶液的重量比为12∶1。在冰浴中稳定30分钟后，将水浴加热至70℃，然后逐滴加入含有500μl的四甲基乙二胺和大单体重量5％的过硫酸胺的水溶液，1小时后停止搅拌，趁热用筛网过滤，去离子水洗涤后，放入冰箱内保存，得微凝胶粒径范围为20-300μm。

实施例3

与实施例1操作相同，有氮气保护的四口烧瓶中先后加入司班80和二甲苯，(乳化剂与二甲苯重量比为12％)，在冰浴中搅拌，搅拌速度为250转/分钟，滴加20％浓度的(PEO₁₀₃-PPO₃₉-PEO₁₀₃)-(CL₄-LA₄)-DA大单体水溶液(含有大单体重量3％的过硫酸胺和2.5％的抗坏血酸)，每秒1-2滴，二甲苯与大单体水溶液的重量比为10∶1。在冰浴中稳定20分钟后，将水浴加热至50℃，2小时后停止搅拌，趁热用筛网过滤，去离子水洗涤后，放入冰箱内保存，得微凝胶粒径范围为30-400μm。

实施例4

与实施例1操作相同，有氮气保护的四口烧瓶中先后加入司班80和吐温80(重量比为84∶16)和正庚烷，(乳化剂与二甲苯重量比为8％)，在冰浴中搅拌，搅拌速度为350转/分钟，滴加10wt％(PEO₁₀₀-PPO₆₅-PEO₁₀₀)-LA₈-DA and 13wt％(PEO₁₂₉-PPO₅₆-PEO₁₂₉)-CL₄-DA大单体水溶液(含有大单体重量6％的过硫酸钾和4.6％的亚硫酸氢钠)，每秒1-2滴，正庚烷与大单体水溶液的重量比为9∶1。在冰浴中稳定15分钟后，将水浴加热至70℃，2小时后停止搅拌，趁热用筛网过滤，去离子水洗涤后，放入冰箱内保存，得微凝胶粒径范围为20-350μm。

实施例5

与实施例1操作相同，有氮气保护的四口烧瓶中先后加入司班80和吐温80(重量比为75∶25)和甲苯，(乳化剂与甲苯重量比为6％)，在冰浴中搅拌，搅拌速度为1500转/分钟，滴加25wt％％(PEO₁₂₉-PPO₅₆-PEO₁₂₉)-CL₄-DA大单体水溶液，每秒1-2滴，甲苯与大单体水溶液的重量比为10∶1。在冰浴中稳定30分钟后，将水浴加热至70℃，然后将搅拌速度降为500转/分钟，加入含有大单体重量10％的偶氮二异丁腈，1.5小时后停止搅拌，趁热用筛网过滤，去离子水洗涤后，放入冰箱内保存，得微凝胶粒径范围为20-200μm。

实施例6

与实施例1操作相同，反应物投料摩尔比为PEO₁₂₉-PPO₅₆-PEO₁₂₉∶丙交酯∶异辛酸亚锡＝1∶2∶0.02，得到的共聚产物的二氯甲烷溶液与丙烯酰氯(摩尔比为1∶30)反应，反应后过滤，滤液在无水乙醚(-10～0℃)中沉淀，收集沉淀，真空干燥，得到大分子单体PEO₁₂₉-PPO₅₆-PEO₁₂₉-LA₂-DA。有氮气保护的四口烧瓶中先后加入司班80和吐温80(重量比为84∶16)和正庚烷，(乳化剂与正庚烷重量比为8％)，在冰浴中搅拌，搅拌速度为350转/分钟，滴加20％浓度的大单体水溶液(含有25μl的四甲基乙二胺和大单体重量3％的过硫酸胺，每秒1-2滴，正庚烷与大单体水溶液的重量比为12∶1。在冰浴中稳定20分钟后，将水浴加热至70℃，1小时后停止搅拌，趁热用筛网过滤，去离子水洗涤后，放入冰箱内保存，得微凝胶粒径范围为40-400μm。

本发明的微凝胶是可降解的，所以微凝胶的降解行为是很重要的，本发明所制得的微凝胶的降解主要是通过酯键的水解，图4给出了两种微凝胶的降解行为曲线。

本发明所制备的微凝胶的毒性由动物实验进行了评价。将由本发明制得的微凝胶(由大单体(PE0₁₀₀-PPO₆₅-PEO₁₀₀)-LA₈-DA制得)通过肌肉注射到S.D大鼠中，大鼠由复旦大学医学院提供。15只平均重量为250g的大鼠被分成5组，每组3只。被检测的微凝胶在细胞培养室中经乙醇水溶液灭菌后，配成PBS的悬浮液，0.5ml的微凝胶/PBS悬浮液被注射到大鼠的骨骼肌中，每只大鼠注射两针。在第1，3，5，7，9天时，将大鼠处死，将微凝胶及周围组织取下，样品用石蜡包埋进行H&E染色。注射一天后，微凝胶组织周围有炎症细胞的出现，但并没有观察到急性的严症反映，3天后，炎症细胞消失，7天后微凝胶完全降解消失。

Claims

1、一种温敏性可降解微凝胶的制备方法，该微凝胶具有如下化学结构式：

式中，

表示任意形式的化学交联，F(DC)₂表示交联点之间的嵌段共聚物链段，其中F代表温敏性大分子或寡聚物，D为可降解部分，C为交联部分；相应的大分子单体具有F(DC^*)₂结构，其中，C^*为可聚合交联部分，其特征在于采用反向悬浮聚合方法，且制备过程分为具有不同温度的两个步骤：(1)在大分子单体溶液的相转变温度或所形成的温敏性可降解微凝胶的相转变温度以下，将大分子单体的溶液在有机溶剂中分散成微滴，实现反相悬浮；(2)再升高温度至可聚合温度，在引发剂的存在下，完成聚合反应，以得到化学交联的微凝胶，其中：

反相悬浮聚合中的大分子单体溶液重量用量为反映体系总量的1％～49％；

大分子单体溶液重量浓度为3～98wt％，其溶液以水、水溶液、亲水性溶剂、亲水性溶液为主体介质；

反相悬浮聚合的反应温度为30～100℃；反应时间为0.5～5小时；搅拌速度为60转/分钟～2000转/分钟。

2、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于聚合温度高于大分子单体的相转变温度，该相转变温度是从sol-gel的转变温度，或者是从gel到sol的转变温度。

3、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于聚合温度高于所生成的温敏性可降解微凝胶的相转变温度，或者聚合温度低于微凝胶的相转变温度但高于大分子单体的分散温度。

4、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于反相悬浮聚合中的连续相为不溶于水的有机溶剂，而分散相则为疏油的溶剂。

5、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为正庚烷、正辛烷、环己烷、甲苯、二甲苯，以及它们的混合溶剂；所述的疏油的溶剂为水或水溶液。

6、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于反相悬浮聚合中加入非离子型乳化剂，乳化剂重量用量为反应体系总量的1％～40％。

7、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于所述乳化剂为Span、Tween系列，或两者的混合物，两者重量用量比为100～50∶0～50，或其它能形成油包水的液体非离子型乳化剂。

8、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于引发剂在大分子单体的相转变温度或所导致的温敏性可降解微凝胶的相转变温度以下加入到大分子单体溶液中，当微滴分散好以后，再升高温度到可引发聚合的温度。

9、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于部分引发剂加入到大分子单体或者大分子单体溶液中，而剩下的引发剂在微滴分散好以后再加入到连续相中。

10、根据权利要求1所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于所用引发剂为氧化还原引发体系，或热发剂。

11、根据权利要求10所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于所述氧化还原体系中，氧化剂为过硫酸钾或过硫酸胺，还原剂为亚硫酸氢钠、抗坏血酸或四甲基乙二胺；所述热引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰。

12、根据权利要求10所述的温敏性可降解微凝胶的制备方法，其特征在于所述的引发剂直接加入到大分子单体的溶液中，引发剂用量为大分子单体的0.01-8wt％。