CN1259141B - 用于疫苗或诊断测试中的鉴定prrs病毒的肽序列的prrsv抗原位点 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了PRRSV分离物的抗原位点。抗原位点是中和性的，保守的，非保守的和构象的，可以引发抗体并且在PRRSV的ORF4和ORF7编码的蛋白质GP4和N上存在。这些位点鉴定的肽序列可以掺入抗PRRS的疫苗和PRRS的诊断测试中。同时，可以开发在设计消灭猪群中PRRS的计划中在标记疫苗之后使用的区别测试。
Description
技术领域
本发明涉及神秘猪疾病(Mystery Swine Disease)的病原体PRRS病毒，涉及在PRRS病毒中鉴定的肽序列，并且涉及在疫苗和诊断测试中掺入这些序列。
背景技术
PRRS病毒(PRRSV)是一种目前称为猪生殖和呼吸综合症(PRRS)的猪疾病的病原体。该病毒是在美国大约自1987年，在欧洲大约自1990年发现的猪疾病的病原体，该病最初以各种名称如神秘猪疾病，猪不育和呼吸综合症等许多其它名称而闻名。病毒本身也有许多名称，如Lelystad病毒(LV)，SIRS病毒和许多其它名称，但现在大多数命名为猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)。它在猪中引起流产和呼吸窘迫并且首先于1991年在欧洲分离(EP专利587780，美国专利5,620,691)，随后在美国和许多其它国家分离。PRRSV是含有正链RNA基因组的小的有包膜病毒。PRRSV优选地在巨噬细胞中生长，除了巨噬细胞，PRRSV可以生长在细胞系CL2621和其它从猴肾细胞系MA-104克隆的细胞系(Benfield等人，兽医诊断研究杂志4；127-133，1992)。在1993年测序了PRRSV的基因组，约15kb的多聚腺苷酸化RNA(Meulenberg等人，病毒学192；62-74，1993)。核苷酸序列，基因组构成和复制方案表明PRRSV与一组命名为动脉炎病毒的小的有包膜正链RNA病毒相关，这组病毒包括乳酸脱氢酶升高病毒(LDV)，马动脉炎病毒(EAV)，和猴出血热病毒(SHFV)。这些病毒具有相似的基因组构成，复制方案，形态学，和病毒蛋白质的氨基酸序列。动脉炎病毒含有12.5到15kb的基因组并且在复制过程中合成六个亚基因组RNA的一个3’嵌套组合。这些亚基因组RNA含有起源于病毒基因组的5’末端的引导序列。ORF1a和1b含有约2/3 的病毒基因组，并且编码依赖RNA的RNA聚合酶。六个较小的ORF，ORF2到7位于病毒基因组的3’末端，ORF2到6似乎是编码包膜蛋白而ORF7编码核衣壳蛋白(Meulenberg等人，病毒学206；155-163，1995)。
PRRSV是第一个已被证明ORF2到7编码的所有六个蛋白质均与病毒粒子相关的动脉炎病毒。15kDa N蛋白(ORF7编码)和18kDa整合膜蛋白M(ORF6)不是N糖基化的，而29-30kDa GP2蛋白质(ORF2)，45-50kDa蛋白质GP3蛋白(ORF3)，31-35kDa GP4蛋白(ORF4)，和25kDa蛋白质GP5(ORF5)是N糖基化的。在细胞外病毒和用PRRSV的北美分离物ATCC-VR2332，和其它PRRSV的分离物感染的细胞的裂解物中也已经检测到这些蛋白质(PRRSV的其它分离物例如是CNCM I-1140，ECACC V93070108，CNCM I-1387，CNCM I-1388，ATCC-VR2402，ATCC-VR2429，ATCC-VR2430，ATCC-VR2431，ATCC-VR2475，ATCC-VR2385，但许多其它的也是已知的)。
我们先前描述了特异于GP3，GP4，M和N的一系列特异于PRRSV的MAbs的分离和定性(van Nieuwstadt等人，病毒学杂志，70，4767-4772，1996)。令人感兴趣的是，抗GP4的MAbs是中和的，表明至少部分蛋白质暴露于病毒粒子表面。另外，大多数抗N的Mabs与测试的所有PRRSV分离物反应。
在世界的大多数地区PRRS本身是养猪业的主要关心的问题。在猪群中导入PRRSV将引起严重的经济损失。许多兽医和实验室广泛实践了抗PRRS的诊断测试。大多数诊断测试如IPMA，IFT，IFA，ELISA，均含有适当的检测工具，如缀合酶，或荧光素和其它底物，这些诊断测试中利用了起源于PRRSV的抗原和抗PRRSV的抗体之间的相互作用以便测量生物样品如血液，血清，组织，组织液体，灌洗液体，尿，粪便中PRRSV抗原或抗PRRSV的抗体的存在，这些生物样品是从待测试的动物(如猪)中取样的。为了诊断PRRS，用 于这些诊断测试，或诊断试剂盒或测试中的抗原和/或抗体仅由它们的起源或它们与PRRSV的反应性确定。通常这对于筛选测试是足够的，其中并未明显需要高度特异性或敏感性。但是，PRRS的连续传播已经引起养猪业的极大关注，以至于认为需要从整个猪群，或甚至从养猪的整个地区或国家消灭PRRS。这一需要的一个明显的例子是在丹麦建议的涉及PRRS的消灭计划。如果决定完全消灭PRRS，那么需要比今天所用的测试展示更高的特异性或敏感性的诊断测试。
同时广泛实践了抗PRRS的免疫接种。已知的几个例子是所使用的修饰的活疫苗，同时灭活疫苗也是已知的。但是，通常在活疫苗因此活PRRS疫苗中存在问题，因为这些疫苗具有传播到非接种猪的趋势，从而传播而不是减少猪群中可检测的感染，因此是与完全消灭相反。如果利用了与野生型病毒血清学不同的株系标记疫苗，这一问题将大大降低。另外的缺点是活疫苗有时候在接种的猪中由于未确定的抗原成分引起过敏性反应。虽然通常报道灭活疫苗在接种的猪中诱导保护性，并具有不会从猪传播到猪的额外优点，但是灭活疫苗的一个缺点是在一个剂量的疫苗中很难达到足够的抗原量以引发可测量的和保护性的免疫应答。尤其是可以在猪中诱导可测量的中和抗体效价的灭活疫苗是有益的，因为在接种的猪群中测量这些中和抗体将有助于了解猪群中接种获得的保护水平。另外，如果成功地汇集了必要的抗原量，也意味着在疫苗中也存在更多其它未确定的抗原，也可以产生如上所述的过敏性反应。在这一意义上，知道PRRSV上的哪个特异位点参与了中和反应，从而设计掺入引发中和抗体需要的重要肽序列的更好的适当的疫苗是有益的。目前利用的起源于在美国分离的PRRSV分离物的疫苗的缺点在于这样的疫苗，尽管对PRRSV的欧洲分离物完全保护性抵抗并有免疫交叉反应，但如含有仍未确定的可以从PRRSV的欧洲分离物中区别出来的表位或抗原位点。另一方面，尽管具有抗PRRSV的美国分离物的完全保 护性和免疫性交叉反应，但起源于欧洲分离的PRRSV分离物的活疫苗含有类似的仍未确定的可以从PRRSV的美国分离物中区别出来的表位或抗原位点。
如果可以获得的血清学测试能够区别(基于PRRSV分离物之间的小的表位差异)用美国起源的疫苗接种或由PRRSV的欧洲野生型感染的猪(接种的或未接种的)，或可以区别接种欧洲起源的疫苗或感染美国野生型PRRSV的猪(接种的或未接种的)，那么可以开发标记疫苗和相应的诊断测试(掺入所述的区别表位或抗原位点)，相信可以用于PRRS的消灭计划。例如，在丹麦，可以利用美国起源的疫苗接种并且测量在丹麦猪中仅抗欧洲野生型PRRSV的独特表位并且与美国毒株没有交叉反应的抗体系列。这将能够明确地检测和随后除去丹麦猪群中野生型感染的猪。目前，由于在PRRSV分离物之间存在广谱的免疫交叉反应性，这样的区别是不可能的。毫无疑问这样的联合接种测试程序将是消灭PRRS的基础，并且如果需要，在疫苗和/或诊断测试中使用区分性的PRRSV抗原位点，它也可以用于其它国家。
发明内容
本发明提供了能改良灭活或减毒的疫苗或重组DNA技术起源的疫苗的含有PRRSV的肽序列的抗原位点，以及能改良诊断方法，测试和试剂盒的抗原位点以及新的诊断方法，测试和试剂盒的生产。保持抗原性(如由与多克隆血清或MAbs的反应性所确定)和因此保持持抗原位点的功能性的人工变化和氨基酸残基的取代可以容易地由具有肽设计和合成技术的本领域的普通技术人员从已知构成特异分离物的抗原位点的序列衍生。例如，一些氨基酸残基可以常规地通过可比较特性的其它氨基酸残基取代，例如一个碱性残基被另一个碱性残基取代，酸性残基取代酸性残基，大体积残基取代大体积残基，一个疏水或亲水残基取代另一个疏水或亲水残基等等。同时，保持或甚至改良所选择序列的抗原性的较不常规但更特异的变化也是可能的。这样的变化可以例如通过PEPSCAN基础的氨基酸取代或 替换图谱技术产生(van Amerongen等人，肽研究(1992)5,269-274)。简要地说，本发明提供的抗原位点中的氨基酸残基可以例如常规地或在替换图谱的指导下替换，而得到的肽序列在功能上相当于抗原位点。替换氨基酸可以是L—或D—氨基酸残基。另外，通过与本领域已知的佐剂(如KLH)缀合可使本发明提供的肽序列更具免疫原性。另外，利用一个重复序列(如串联肽)或更多重复序列制备肽或通过聚合或环化也可使肽更具免疫原性。
虽然以前已经证明N蛋白是免疫原性的(Meulenberg(1995)，临床诊断实验室免疫杂志，2,652-656，GB2 289 279A)并且在欧洲株(LV)和美国株(VR2332)的N蛋白之间存在保守和非保守区域(WO96/04010)，我们第一次证明哪些保守和非保守区是抗原性的，以及那些可以作为抗原单独或联合用于免疫接种或诊断测试。另外，本文鉴定了在N蛋白中的抗原区由线性的和构象依赖型的表位组成。
GP4蛋白是被证明引发可以中和病毒的抗体的第一个PRRSV结构蛋白质。鉴定和确定了大约40个氨基酸的特异区域，它们应该暴露在病毒粒子表面作为中和抗体的靶，然后可防止病毒感染细胞。这是令人激动的新发现因为通常认为GP5蛋白质，PRRSV的主要结构，是参与附着宿主细胞的最重要的候选物。
本发明提供了一个主要抗原位点，即在PRRSV的GP4上的中和位点。本发明提供了用于设计有效标记疫苗很重要的主要中和位点的位置，其含有PRRSV分离物的氨基酸核心序列和该核心序列两侧的氨基酸序列，这些序列包括PRRSV的ORF4蛋白质上的中和位点。通过在各种类型的疫苗中掺入相关的中和位点序列，可以在接种的猪中特异地诱导中和抗体。制备含有本发明提供的中和位点的灭活疫苗以便诱导可测量的中和抗体。尤其是位于相应于PRRSV分离物I-1102中发现的约氨基酸40-79的序列的ORF4编码的PRRSV的蛋白质的序列含有中和位点。另外，通过将肽与佐剂或本领域已知的其它载体混合使选择的肽序列更加免疫原性。这样得到的肽组合 物用作疫苗。但是，尽管将含有中和位点的选择的肽序列掺入疫苗载体系统，所述系统是起源于异源病毒或细菌的重组载体，但选择的肽序列也选择性被掺入PRRSV载体病毒或起源于它的疫苗。
在本发明的另一方面，位于对应约53到75位的氨基酸序列更加特异地构成广谱反应的中和位点。在已知的或待发现的各种PRRSV分离物之中可以发现本发明提供的中和位点的其它实施方案(例如本说明书的实验部分所见)。任何工作在分子生物学领域中的人很容易比较含有本发明提供的中和位点的序列与另一个PRRSV分离物的ORF4编码的蛋白质的氨基酸序列。
本发明也提供了改良诊断测试包括抗原或抗体检测测试的PRRSV的肽序列。本发明提供了在诊断测试中单独或联合使用的抗原位点的各种组合。以这一方法，本发明提供的诊断测试能满足诊断和差异诊断的领域中存在的各种需要。抗原—抗体相互作用总是需要5到15个氨基酸序列长的氨基酸序列的交叉反应性表位—互补位相互作用。所以，本发明提供了用于在诊断测试中掺入的5到15氨基酸长和与本发明的抗原位点的核心序列部分或完全重叠的氨基酸序列。这些肽序列用于选择或设计在待利用的测试中含有这些序列的抗原或抗原性物质。或者，本发明提供的是与本发明提供的抗原位点反应的合成抗体。这些位点或相关序列与从系统如噬菌体展示文库或构成抗体类分子(这些分子可以容易地在异源表达系统中表达)的(重链)抗体克隆选择中获得的合成抗体反应。
本发明提供的一个组合含有对应于如上所述中和位点的肽序列。含有这一位点和/或特异地抗这一位点的抗体的诊断测试能检测猪中的中和抗体。本发明提供的另一个组合包括在蛋白质N上的保守抗原位点。在该保守抗原位点内，本发明提供了核心序列VNQLCQLLGA或VNQLCQMLGK。含有这一位点和/或特异地抗这一位点的抗体的诊断测试能检测猪中与大多数PRRSV分离物特异反应的那些抗体。同样，提供了诊断测试，其中利用了抗保守位点的 抗体检测PRRSV抗原，因此使得该测试能检测PRRSV分离物，不管它们的来源如何。
本发明提供的另一个组合包括在蛋白质N上的非保守的分化的抗原位点。含有这一位点和/或特异地抗这一位点的抗体的诊断测试能检测猪中与不同的PRRSV分离物特异地反应的抗体，因此例如接种的猪可以与由野生型PRRSV感染的猪相区别。同样，提供了诊断测试，其利用抗非保守位点的抗体检测PRRSV抗原，因此使得测试能区别不同的PRRSV分离物。本发明提供了在这样一个非保守位点内的核心序列PRGGQAKKKK或PRGGQAKRKK或PRGGQAKKRK或GPGKKNKKKN或GPGKKNKKKT或GPGKKNRKKN或GPGKKFKKKN或GPGKKIKKKN或GPGQINKKIN。在另一个保守位点内，本发明提供了核心序列MAGKNQSQKK或MPNNNGKQTE或MPNNNGKQPK或MPNNNGKQQK或MPNNNGKQQN或MPNNNGKQQK或MPNNNGRQQK。同样，如上所述，肽设计和合成技术领域的任何技术人员采可以容易地导入能保持GP4或N蛋白中的上述核心序列的抗原性和因此的功能性的人工变化。
本发明也提供了含有构象表位(其在各种分离物中变化很大)的组合，它存在于对应于分离物I-1102的蛋白质N上的氨基酸位置51到约68(在分离物I-1102核心序列PKPHFPLAAEDDIRHHL中)或从79到约90(在分离物I-1102核心序列SIQTAFNQGAGT中)或从111到124(在分离物I-1102核心序列HTVRLIRVTSTSAS中)的位置。本发明提供的位点即N蛋白中的保守的、非保守的、分化的和构象的位点提供了明确诊断PRRSV感染的诊断测试。进行测试避免利用非保守位点因此避免假阴性结果。另外，在分化测试研制中利用各种非保守位点，这些测试可以例如将接种猪与由PRRSV的野生型分离物感染的猪区别开来。再次，对于工作在分子生物学领域的任何人员来说将含有保守或非保守或构象表位位点的序列与另一个PRRSV分离物的ORF7编码的蛋白质的氨基酸序列进行对比是容易的。本发明提供的位点可用于疫苗区分诊断测试的新的配对，以用于消灭PRRS的计划。
附图说明
图1.在pSFV1中表达的G蛋白质和它们与GP4特异MAbs的反应性的示意图。表明了含有不同ORF4基因的质粒的名称。开放的条代表起源于PRRSV的ORF4编码的G蛋白质氨基酸序列，黑条代表起源于VR2332的ORF4编码的G蛋白质的氨基酸序列。条的上面表明了氨基酸的编号。如材料和方法部分详细叙述，这些基因首先掺入在PGEM-4Z，然后转移到pSFV1。整套14GP4特异MAbs相同地与IPMA中不同构建体反应并且反应性表示为阳性(+)和阴性(-)。
图2.特异于GP4的MAbs和含有覆盖GP4的残基25-94的重叠12聚体肽的多克隆血清的肽扫描分析。显示了识别四个连续肽的MAbs130.7和MAb138.28的扫描(2A)。5个其它MAbs(122.29，122.30，122.66，122.71和138.28)展示了同样的特异性。(2A和2B)显示了来自接种前(va12-0)和va14-0)，利用表达ORF4的假狂犬病毒载体的免疫接种后和利用PRRSV(va12-s1和va14-s1)随后攻击后的两个猪的多克隆血清的扫描，显示了多价猪抗—LV血清21(va21)的扫描(2D)。盒子包括的常见残基的核心显示了反应肽的氨基酸序列。
图3.各种PRRSV毒株的GP4(A)和N(B)蛋白质的氨基酸序列的排列。显示了区别于I-1102序列的氨基酸。肽扫描分析中的MAbs和/或多克隆血清识别的核心肽序列下面划线。
图4.在N蛋白序列中抗原结合位点的定位和N蛋白序列与北美毒株VR2332和LDV的比较。阴影显示了抗原位点A，B，C和区D。在肽扫描分析中鉴定了位点A，B和C，通过嵌合N蛋白的构建鉴定了位点D。为了图谱定位D区，替代LDV的对应氨基酸序列的LV氨基酸序列下面划线。在LDV序列的下面显示了氨基酸25-30到突变位点B之间插入的EAV的N蛋白的氨基酸。相同的氨基酸与垂直条连接。
具体实施方式
实验部分
材料和方法
细胞和病毒
PRRSV的Ter Huurne毒株(CNCM I-1102)于1991年分离(Wensvoort等人，1991)。由Benfield等人(1992)分离了美国ATCC-VR2332(1992)。毒株NL1由我们实验室分离(荷兰，1991)。T.Drew惠赠毒株NY2(英格兰，1991)。A.Botner惠赠毒株DEN(丹麦，1992)。Losch惠赠毒株LUX(Luxemburg，1992)，Shokouhi和Espuna分别惠赠SPA1和SPA2(西班牙，1992)和Y.Leforban惠赠毒株FRA(法国，1992)。
如前所述，在CL2621细胞上培养PRRSV和VR2332(vanNieuwstadt等人，1996)。在猪肺泡巨噬细胞中培养7个不同的欧洲分离物。如前所述维持巨噬细胞(Wensvoort等人，1991)。在用5％胎牛血清和抗生素补充的Dulbecco基本必要培养基中培养BHK-21细胞。在转染实验中，在Glasgow基本必要培养基(GIBCO-BRL/生命技术公司)中生长BHK-21细胞。
抗血清
在先前的实验中利用了猪抗PRRSV血清21和兔抗肽血清698和700。血清700抗PRRSV的ORF4编码的氨基酸106到122(CLFYASEMSEKGFKVIF)并且是从兔中获得的。已经叙述了MAbs的生产和鉴定(van Nieuwstadt等人，1996)。杂交瘤来源于5个连续融合的实验并且抗ORF4蛋白(MAb121.4，122.1，122.12，122.20，122.29，122.30，122.59，122.66，122.68，122.70，122.71，126.1，126.7，130.7，138.28)或抗ORF7蛋白(MAb122.17，125.1，126.9，126.15，130.2，130.4，131.7，138.22，WBE1，WBE4，WBE5，WBE6，SDOW17)。MabsWBE是由Drew博士，Weybridge英国提供的。Mab SDOW17是由 Benfield博士，美国南Dakota提供的。
质粒构建体
位于ORF4上游(PRRSV13)和下游(PRRSV14)的2个寡核苷酸已早先用于在pGEM-4Z中扩增和克隆分离物I-1102的ORF4，其中利用了在引物中导入的BamHI和HindIII位点(Meulenberg等人，1995)。将得到的质粒命名为pABV209。将位于类似于VR2332的ORF4的起始密码(PRRSV4)和终止密码(PRRSV5)的位置的两个寡核苷酸通过先前研究所述的RT-PCR的方法用于扩增VR2332的ORF4。因为VR2332的ORF4含有内部HindIII位点，利用BamHI消化和利用HindIII部分消化PCR片段，克隆在pGEM-4Z中得到质粒pABV270。如Sambrook等人所述进行重组DNA技术(分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY，1989)。在自动DNA序列仪(应用生物系统)上测定的pABV270中VR2332ORF4的核苷酸序列与公开的序列(Murtaugh等人，病毒构造140；1451-1460，1995)相同。
随后，将I-1102和VR2332的ORF4转移到Semliki Forest病毒表达载体pSFV1。利用BamHI和HindIiII(部分消化pABV270)消化pABV209和pABV270，利用Klenow聚合酶(Pharmacia)处理ORF4片段以便产生平末端，并且将这些片段连接在pSFV1的Smal位点，利用小牛肠碱性磷酸酶(Pharmacia)去磷酸化。进一步测试含有正确方向的I-1102的ORF4(pABV265)和VR2332的ORF4(pABV271)的质粒的GP4蛋白的表达。另外，产生了I-1102和VR2332的四个不同的嵌合ORF4基因。用寡核苷酸PRRSV4和PRRSV6从质粒pABV270扩增编码VR2332的GP4蛋白的氨基酸1到39的ORF4的核苷酸序列。利用BamHI和SacII消化得到的片段。将这一片段连接在用BamHI和SacII消化的pABV209中以便在pABV306中产生VR2332的GP4蛋白的氨基酸1到39和I-1102的GP4的40到183之间的框内融合体。利用寡核苷酸PRRSV4和PRRSV9(参见表2)扩增编码VR2332的GP4的氨基酸1到75的ORF4的核苷酸序列。 利用KpnI和BamHI消化这一片段。利用P RRSV46和PRRSV14扩增编码I-1102GP4蛋白的氨基酸80-183的ORF4的核苷酸序列，并且利用KpnI和BamHI消化扩增的片段。将两个片段一起连接在用BamHI和HindIII消化的pGEM-4Z。得到质粒pABV308。以同样的方法，在含有由PRRSV13和PRRSV57扩增的编码I-1102GP4蛋白的氨基酸1到79的核苷酸序列的pABV314中产生互补构建体，其中的核苷酸序列已经连接到编码VR2332的氨基酸76到178的片段中，该片段是用PRRSV10和PRRSV5在pGEM-4Z中扩增的。第四个嵌合构建体含有与编码VR2332GP4蛋白的氨基酸1到39和氨基酸76到178的片段融合的编码PRRSV GP4蛋白的氨基酸40-79的片段。这是在利用BamHI和HindIII消化的pGEM-4Z中连接pABV270的BamHI/SacII ORF4片段和pABV314的SacII/HindIIIORF4片段完成的。这一质粒命名为pABV325。通过寡核苷酸测序检测质粒pABV306，pABV308，pABV314，和pABV325序列正确与否。与上面对于VR2332和PRRSV的ORF4基因所述相同，将嵌合ORF4基因从pABV306，pABV308，pABV314，和pABV325转移到PSFVI，分别得到pABV296，pABV305，pABV321，和pABV326(图3)。
在pGEM-T中用两个位于ORF7上游(LV108；5’GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC3’)和下游(LV112；5’CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA3’)的寡核苷酸扩增和克隆ORF7基因，得到pABV431。表1中列出了用于扩增ORF7的片段的这些和其它寡核苷酸的序列和位置。另外，通过PCR介导的诱变产生四个不同的嵌合构建体。编码氨基酸25-26，28-30的序列(位点B；图3)用EAV N蛋白的对应序列取代。这通过用LV108和LV134(5’TGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATGACCTGTGCCGGATGTTTGGTGCAATGATAAAGTCC3’)对ORF7进行PCR扩增实现。利用MscI和PacI位点在pABV431中导入突变的DNA片段，产生pABV455。将编码氨基酸51到67的ORF7 的区域用LDV ORF7的对应区域取代。利用EcoNI和ClaI消化pABV431，并且连接到利用同样的酶消化的用引物LV98(5’CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACATTTTCCCATGGCTGGTCCATCTGAC3’)和LV99(5’CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGAGGGAGCGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGCCGGAGGTCAGATGGACCAGCC3’)产生的PCR片段。将这一质粒命名为pABV463。将编码ORF7的氨基酸80-90的区域用LDV ORF7基因的对应区域取代。利用引物LV101(5’GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAATCAAGGCGGAGGACAGGCGTCGCTTTCATCCA3’)和LV112在PCR中突变了LV的ORF7基因。利用NarI和PacI消化得到的片段，并且连接到ClaI和PacI消化的pABV431得到pABV453。最后，将编码N蛋白的C末端部分的区域(氨基酸11-128)用编码对应于LDV的N蛋白的氨基酸的序列取代。利用引物LV108和LV102(5’ATGTCCCGGGCTAAGCGGCGGAGGAATTAGCAGAAGCGTTAATCAGGCGCTGTGTAGCAGCAACCGGCAG3’)扩增ORF7基因，克隆在pGEM-T载体中，得到pABV456。利用PacI(平末端)和HpaI消化从pABV431，pABV453，pABV455和pABV463，和利用HpaI和SwaI消化从pABV456切出野生型和突变ORF7基因。随后将这些基因掺入Seimliki Forest病毒表达载体pSFV1的去磷酸化的SmaI位点。进一步测试含有正确方向的各个ORF7基因的质粒pABV470，pABV460，pABV462，pABV518和pABV471中N蛋白的表达。如上述对于SFV-ORF4构建体所述，进行Semliki Forest病毒ORF7RNA的体外转录和转染。
为了克隆7个不同欧洲分离物的ORF4基因，如Meulenberg等(1993)所述用NL1，NY2，DEN，FRA，SPA1，SPA2和LUX感染巨噬细胞并分离RNA。通过利用寡核苷酸PRRSV13和PRRSV14的RT-PCR扩增ORF4基因，利用BamHI和HindIII克隆在pGEM-4Z中。对于每个毒株，确定了衍生于两个独立的PCR的两个克隆的 ORF4的核苷酸序列。利用PCGene的多序列对比程序CLUSTAL(Intelligenetics Tm)对比衍生于核苷酸序列的蛋白质序列。
SFV-ORF4RNA的体外转录和转染
通过利用Spel消化线性化含有不同ORF4构建体的pSFVl质粒并且在体外转录。利用脂转染将合成的RNA转染到在24孔平板的15毫米孔中的BHK-21细胞。利用冰冷的50％(v/v)甲醇/丙酮固定细胞，在免疫过氧化物酶单层测试(IPMA)中利用MAbs染色不同ORF4构建体表达的GP4蛋白。为了通过免疫沉淀分析ORF4表达产物，利用电穿孔将10微克体外转录的SFV-ORF4RNA转染107BH K-21细胞。将电穿孔细胞在三个35毫米孔的6孔平板上涂布，并且在转染18小时后标记细胞。
肽扫描方法
如前面确定的(Meulenberg等人，1993)，从起源于PRRSV的ORF4或ORF7序列的氨基酸合成一整套重叠九肽或十二肽。根据熟知的肽扫描方法进行聚乙烯棒上固相肽的合成并用酶联免疫吸附测试(ELISA)分析类型的免疫筛选(Geysen等人，PNAS，81，3998-4002，1984)。
结果
前面我们已经叙述了一组与PRRSV的31-35KDa蛋白质，命名为GP4，反应的中和MAbs，和采用Western免疫印迹分析与N蛋白反应的一组Mabs。显示GP4是ORF4编码的结构糖蛋白，N是ORF7编码的核衣壳蛋白。在利用GP4特异的Mabs的免疫沉淀实验中，来自感染PRRSV的细胞的裂解物的GP4蛋白作为明显的28KDa的谱带迁移，以及具有更高表观分子量的轻污点。MAbs免疫沉淀31KDa的扩散(糖蛋白)GP4蛋白，该蛋白质来自感染PRRSV的细胞外培养基而不是模拟感染的细胞的细胞外培养基。
在GP4中的中和区的鉴定
早先我们已经证明了特异于GP4蛋白的MAbs识别I-1102但 不识别美国分离物VR2332(van Nieuwstadt等人，1996)。为了在GP4蛋白中鉴定中和MAbs的结合区，我们制备了I-1102的GP4和VR2332的融合蛋白。在Liljestrom等人开发的Semliki Forest病毒表达系统(生物技术，9，1356-1362，1991)表达了这些蛋白质。首先，在pSFVl中克隆I-1102的ORF4得到质粒pABV265(图1)。将从pABV265转录的RNA转染BHK-21细胞，并且在24小时后转染细胞用15个中和MAbs阳性染色。MAbs与pSFV1-RNA转染的BHK-21细胞不反应。来自用pABV265RNA转染的L-[35S]-甲硫氨酸标记的BHK-21细胞的MAb126.1免疫沉淀重组GP4蛋白。它具有与真正的GP，在利用I-1102感染的CL2621细胞中合成的蛋白质，相同的大小，并且也含有PNGaseF和EndoH敏感N—葡聚糖(glycan)。在pSFVl中也克隆VR2332的GP4蛋白，但这一蛋白质不能被BHK21细胞中表达的MAbs识别(图1)。为了进一步在GP4蛋白中定位MAbs识别的区域，在pSFVl中构建了I-1102和VR2332的ORF4的四个嵌合基因(图1)。将从质粒pABV296，pABV305，pABV321和pABV326中转录的RNA转染BHK-21细胞，并且在IPMA中测试表达蛋白与GP4特异的MAbs的反应性。这15个MAbs的反应图谱是相同的，表明这些MAbs针对GP4蛋白中40个氨基酸的区域；MAbs还识别含有由来自分离物CNCM I-1102的GP4蛋白的氨基酸40到79并且环绕来自VR2332GP4蛋白的序列组成的pABV326的表达产物。为了确定在BHK21细胞中适当表达不同GP4蛋白尤其是MAbs没有识别的那些，它们从用质粒pABV265，pABV271，pABV296，pABV305，pABV321和pABV326体外转录得到的RNA转染BHK-21细胞的裂解物免疫沉淀。利用猪抗PRRSV血清21，MAb126.1，和抗肽血清698和700进行免疫沉淀。血清700是抗分离物CNCN I-1102的PRRSV GP4蛋白的氨基酸106-122的，该序列与分离物ATCC-VR2332的GP4蛋白相同的，不包括氨基酸121。所以，利用血清700免疫沉淀所有GP4蛋白。当通过SDS -PAGE分析时，除了pABV305和pABV271表达的GP4蛋白迁移稍微快些，它们在大小上是不可区分的。这最大可能是由于在与I-1102序列相关的VR2332序列中，在氨基酸62-64之间缺失了4个氨基酸(图3)。整套GP4-特异MAbs识别从pABV265，pABV296，pABV321，pABV326表达的但不是从pABV305和pABV271表达的GP4蛋白，这证明了从IPMA获得的结果(图3)。血清698具有与MAbs同样的反应曲线。血清698抗PRRSV的GP4的氨基酸62到77，这一序列位于现在鉴定的GP4蛋白的中和区。这一区域在VR2332ORF4中是高度异源的，所以这一血清没有识别在这一区域含有VR2332序列的表达产物。但是，中和多克隆猪血清识别I-1102GP4蛋白和嵌合GP4蛋白和VR2332GP4蛋白，表明在猪抗PRRSV血清中存在抗GP4蛋白的氨基酸40到79形成的中和位点的各种中和抗体。
ORF4和ORF7蛋白质的肽扫描
由于与ORF4蛋白质反应的15个MAbs都在Western印迹分析中与GP4蛋白反应，预期它们识别分离物I-1102的GP4的跨越氨基酸40到79的区域中的线性表位，为了进一步绘制MAbs的结合区的图谱，利用在这一区重叠九肽或十二肽进行PEPSCAN分析。如果在这一系列中的峰可重复性地达到背景的2倍以上，就认为肽代表抗原位点。MAbs122-29，122-30，122-66，122-71，130-7，138-28与含有氨基酸59-67(SAAQEKISF)的一个特异抗原位点阳性反应(图2)。MAb122-12只微弱地与这一抗原位点反应，而剩余的7MAbs在PEPSCAN分析中是阴性的。PEPSCAN中多克隆猪血清也识别该位点。在PRRSV感染猪21后6星期后所取的中和血清21与该位点和它的侧翼区强烈和广谱地反应。另外，在利用PRV-ORF4载体病毒接种54天和在第54天用PRRSV激发后30天屠宰所取的中和多克隆猪血清(Va12和Va14)与PEPSCAN中鉴定的中和位点强烈而更广谱地反应。
在分离物I-1102中，中和位点的核心序列含有位于氨基酸位 置59-67的氨基酸序列SAAQEKISF。在其它分离物中，核心序列可以在或围绕相应的氨基酸位置存在，这是对应于蛋白质GP4的中和位点的氨基酸序列，含有例如SAAQEEISF，或STAQENISF或STAQENIPF或SEESQSVT或SASEAIR或SASEAFR或PAPEAFR或PAPEAIR或SAFETFR或STSEAFR，但预期其它PRRSV的分离物具有相应的但稍微不同于位于或围绕相对于PRRSV的I一1102分离物的ORF4氨基酸序列氨基酸59-67的氨基酸位置的中和位点的核心序列。同样，在肽设计和合成领域中的一般专业人员可以容易地导入维持核心序列的抗原性和因此的功能性的人工变化。同样正如在中和多克隆血清的PEPSCAN更广谱的反应性清楚证明的，含有氨基酸核心序列和各种PRRSV分离物的核心序列的侧翼序列的氨基酸序列另外构成了PRRSV的ORF4蛋白质上的中和位点。尤其是位于约氨基酸40到79的位置的序列构成中和位点(图1)。再次，肽设计和合成领域的一般专业人员可以容易地导入维持上述抗原位点的抗原性和因此的功能性的人工变化。再次，考虑到多克隆中和血清va12和va14的广谱反应性(图2)，位于对应于氨基酸52到75位置的序列特异地构成广谱反应中和位点。
ORF7蛋白的Mabs抗在PEPSCAN的四个不同的组，组A(4)，B(2)，C(3)和D(1)中反应的。组1(D)(其中有Mab122.17，130.3，130.4，131.7，WBE1，WBE4，WBE6，SDOW17，并且含有保守和非保守反应位点)与PEPSCAN中不可检测的构象表位反应。组2(B)(其中有125.1，126.9，NS95和NS99并且与所有测试的PRRSV分离物反应，因此鉴定保守抗原位点)鉴定了核心序列VNQLCQLLGA(在分离物I-1102从氨基酸位置22到约32中存在)或VNQLCQMLGK。组3(C)(其中有Mab126.15并且主要与欧洲分离的PRRSV的毒株反应，因此鉴定分化的抗原位点)鉴定了核心序列PRGGQAKKKK(在分离物I-1102从氨基酸位置41到约50发现)或PRGGQAKRKK或PRGGQAKKRK或GPGKKNKKKN或GPGKKNKKKT或GPGKKNRKKN或 GPGKKFKKKN或GPGKKIKKKN或GPGQINKKIN。组4(A)(其中有Mab138.22并且主要与欧洲分离的PRRSV的毒株反应，因此鉴定了不同的抗原位点)鉴定了核心序列MAGKNQSQKK(在分离物I-11-2从氨基酸位置1到约10中存在的)或MPNNNGKQTE或MPNNNGKQPK或MPNNNGKQQK或MPNNNGKQQN或MPNNNGKQQK或MPNNNGRQQK。同样通过肽设计和合成领域的一般技术人员可以容易地导入维持N蛋白上述抗原位点的抗原性和因此的功能性的人工变化。虽然组1没有构成线性表位，PRRSV氨基酸序列与LDV序列的比较显示了构象表位(在各种分离物中变化非常大)可以在对应于分离物I-1102从氨基酸位置51到约68(在分离物I-1102氨基酸序列PKPHFPLAAEDDIRHHL)或从79到约90(在分离物I-1102氨基酸序列SIQTAFNQGAGT)或从111-124(在分离物I-1102氨基酸序列HTVRLIRVTSTSAS)的位置存在。同样通过肽设计和合成领域中的一般技术人员特别是在有了通过PRRSV分离物的序列比较和通过与其它马动脉炎病毒的N蛋白序列的比较收集的信息后，可以容易地导入维持N蛋白中的构象表位位点的抗原性和因此的功能性的人工变化，这是在SFV表达系统中表达嵌合LDV/PRRSV ORF7蛋白质(如上面ORF4)和从组1确定的与Mabs的反应性中确定的。
嵌合N蛋白
利用表达嵌合N蛋白的ORF7的构建体进一步作出D区的图谱。因为抗D区的10个MAbs中有6个识别欧洲和北美PRRSV分离物，所以在LV的N蛋白和北美原型VR2332之间最保守的区域被突变(图4)。编码LDV的对应氨基酸的序列用于取代编码氨基酸51到67，80到90，和111到128的核苷酸序列(图4)。为此，欧洲和北美分离物中保守的位点B(氨基酸25-30)被突变。因为LV的N蛋白的氨基酸序列非常相似于位点B的LDV的N蛋白，所以用编码EAV的N蛋白的对应氨基酸的区域取代LV的N蛋白的区域(图4)。当利用Smliki Forest病毒表达系统在BHK-21细胞中表达突变的和野生型N—蛋白质并且在IPMA中利用N特异MAbs测试时，D—特异Mabs相同地反应(表1)。在氨基酸51-67和89-90之间的突变，而不是氨基酸111-128或氨基酸25-30(位点B)之间的突变打断了它们的结合。正如预期的，抗位点A，B，和C的MAb染色含有氨基酸51-67和80-90的LDV序列的N蛋白。但是，染色细胞数及这一染色的亮度小于野生型N蛋白和在氨基酸25-30(位点B)或在氨基酸111-128突变的N蛋白中观察到的(表1)。这最可能是由于在氨基酸51-67或80-90之间含有突变的N蛋白的表达更低，因为当在体外翻译等同量的转录物也获得了与其它N蛋白相比更低产量的这些突变N蛋白(数据未显示)。正如预期的，针对位点B(肽扫描分析)的MAbs没有识别在位点B含有EAV序列的N蛋白，而却被针对位点A，C或区域D的MAbs识别。这些数据表明针对D区的表位是依赖构象的并且(部分)由氨基酸51-67和80-90组成。
不同PRRSV毒株的GP4蛋白的序列分析
为了分析特异于GP4的抗体识别的主要的抗原中和位点在不同的PRRSV分离物之间是否是保守的，进一步在7个不同的欧洲毒株上测试了MAbs的反应性和中和活性。结果表明这些MAbs识别和中和另一个荷兰毒株NL1和英国毒株NY，但不识别和中和丹麦分离物DEN，两个西班牙毒株SPA1和SPA2，法国分离物FRA，和卢森堡分离的LUX。所以，我们感兴趣的是在这些分离物的GP4蛋白的中和位点的区域中的氨基酸序列。利用起源于PRRSV序列的引物的RT-PCR克隆ORF4基因并且确定核苷酸序列。起源于这一核苷酸序列的不同分离物的GP4蛋白的氨基酸序列与I-1102的有86-97％的相同。这些氨基酸序列的对比显示中和位点(氨基酸40-79)比蛋白质的剩余部分更加趋异。在这一区域，特别是毒株DAN，SPA1，SPA2和FRA的氨基酸序列是不同的。这与这些毒株不被I-1102特异Mabs中和的发现是一致的，并且进一步证实该位点在欧洲分离物 中不是高度保守的，在GP4蛋白的N末端部分观察到更高的异质性的另一个区域。PRRSV GP4蛋白的氨基酸序列和VR2332和其它北美毒株的比较显示后者在蛋白质的中和位点中也是异质的。氨基酸序列的排列导致在北美分离物的中和位点中产生裂口(图3)，这与MAbs没有识别这些分离物的观察一致。总的来说，在美国分离物的序列中观察到比欧洲分离物的序列更高的多样性。这是与例如在GP4的氨基酸序列中鉴定的典型病毒包膜的特征一致的。
用于疫苗开发的中和位点的潜力是在中和位点的异质性问题上很重要的。不同欧洲毒株的GP4蛋白的氨基酸序列的比较表明中和位点比蛋白质的其它部分更加可变表明该位点对免疫选择是敏感的。欧洲和北美毒株的中和位点序列的比较展示了在与欧洲相关的北美序列中的4个氨基酸的裂口，进一步说明PRRSV的现在鉴定的中和位点的大的氨基酸可变性。
在本文叙述的GP4蛋白中的中和位点是所鉴定的Lelystad病毒的第一个位点。对于其它两个马动脉炎病毒，EAV和LDV，分离的中和MAbs均是抗ORF5编码的G1/VP3蛋白质(Deregt等人，1994；Glaser等人，1995，Balasuriya等人，1995；Harty和Plagemann，1998)。利用避免中和的突变体，EAV的中和位点被定位于G1的胞外域中的特异氨基酸。
对于PRRSV的ORF7蛋白质进行同样的序列比较(图4)进一步说明PRRSV的现在鉴定的抗原的保守位点和非保守位点的大的氨基酸可变性。在这一工作中，我们已经在PRRSV的N蛋白中鉴定了四个不同的抗原位点。其中3个位点命名为A，B和C，含有线性表位并且将这些图谱分别位于氨基酸2-12，25-30和40-46之间。相反，第四个位点命名为区域D含有部分由氨基酸51-67和80-90组成的构象依赖性表位。位点A和C含有在欧洲但不是北美PRRSV分离物中保守的表位，位点B含有欧洲和北美PRRSV分离物中保守的表位，而位点D含有在欧洲和北美PRRSV分离物中保守和非保守 的表位。本文叙述的N蛋白中的保守位点在开发目的为PRRSV感染的明确诊断的诊断测试是非常重要的，这些测试应该避免利用非保守位点，从而避免假阴性结果。另外关于各种非保守位点的知识在开发分化测试中是非常有价值的。这些测试可以例如从感染野生型PRRSV分离物的猪中区别接种猪。
表2.用于PCR中的克隆LV和VR2332的ORF4基因和质粒载体pGEM-42和pSV1中嵌合ORF-4基因的引物序列
表2
*在这些引物中的下面划线的核苷酸是针对原始序列突变的核苷酸以产生限制位点或突出序列或以便避免一个特殊的核苷酸的长跨度。引物中的限制位点以斜线表示。
Claims (4)
1.具有抗原位点的肽，它由来自猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)分离物I-1102的蛋白质GP4的氨基酸残基40到79的9到40个氨基酸残基的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列至少由氨基酸序列SAAQEKISF组成。
2.根据权利要求1的肽，其中所述抗原位点由位于PRRSV分离物I-1102的蛋白质GP4的氨基酸位置52到75的氨基酸残基组成。
3.根据权利要求2的肽，其中所述抗原位点由位于PRRSV分离物I-1102的蛋白质GP4的氨基酸位置59到67的氨基酸残基组成。
4.与权利要求1的肽反应的合成抗体。
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