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CN113980899A - 一种高通量筛选抗原特异性tcr的方法 - Google Patents

一种高通量筛选抗原特异性tcr的方法 Download PDF

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CN113980899A
CN113980899A CN202111434054.5A CN202111434054A CN113980899A CN 113980899 A CN113980899 A CN 113980899A CN 202111434054 A CN202111434054 A CN 202111434054A CN 113980899 A CN113980899 A CN 113980899A
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tcr
antigen
cells
specific
cell
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孙涛
余莹莹
李娜
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Original Assignee
Hangzhou Immuquad Biotechnologies LLC
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Abstract

本发明提供一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，包括T细胞扩增，还包括多肽体外刺激、获得CD137+T细胞和获得抗原特异性配对TCR。通过单细胞TCR配对高通量测序获得相应抗原肽刺激TCR alpha/beta受体序列，经生物信息学算法分析逻辑进行分析处理，获得抗原特异性配对TCR。本发明合成成本低，速度快，经生物信息学算法分析逻辑进行分析处理区分背景TCR以及特异性TCR，同时可处理16种以上抗原多肽和获得其对应的TCR序列。通过高通量刺激扩增抗原特异性T细胞的方案并结合高通量测序获得几十甚至几百种抗原特异性TCR序列；通过优化扩增方案和算法分析配合单细胞测序后双链配对可高通量的获得每个抗原特异性的TCRalpha链和beta链序列。

Description

一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法
技术领域
本发明涉及一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，属于生物医疗技术领域，主要作用在免疫领域中提供抗原特异性TCR受体序列。
背景技术
T淋巴细胞能够识别无限范围内的自体抗原和外来抗原，得益于其细胞表面表达了可识别这些抗原的抗原受体(T cell receptor，TCR)。TCR是T淋巴细胞的一种分子标记，在淋巴恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤免疫学等各种研究背景下发挥重要作用。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分。TCR是一个异源二聚体，95％以上是α/βTCR，其余5％的TCR是γ/δTCR。α/βT细胞是适应性免疫的关键，通过与主要组织相容性复合物MHC I型和II型相互作用来识别抗原，而γ/δT细胞则不是。
TCR为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR作为抗原识别的主力军主要是由于其高度多样性的特性，而这一特性主要是因为TCR基因存在序列重排现象。TCR是由不同的V(D)J基因片段随机组合而成。互补决定区域CDR3序列在α链和β链中都具有最高的可变性，决定了T淋巴细胞识别MHC分子所呈现的抗原肽的能力。随后α链和β链进行配对时，进一步增加了组合变异性，可产生大约1019的多样性，每一种都针对一种独特的多肽抗原。TCR免疫组库是动态的，直接反映了免疫反应的多样性。当naive T淋巴细胞识别了被提呈的抗原，在共刺激信号激活的条件下，迅速克隆性扩增产生一批效应细胞并进行杀伤作用。但是每种抗原多肽只在循环T细胞的一小部分中被发现，这使得抗原特异性反应的研究变得困难。
抗原特异性T细胞是研究免疫系统的独特工具。一旦外来病原体或肿瘤侵入活化免疫系统，抗原特异性T细胞通过自身TCR识别肿瘤抗原，具有选择性识别肿瘤抗原、分裂增殖和持续提供长期免疫保护的能力，在治疗病毒感染疾病和恶性肿瘤方面具有很大的研究价值，并且在肿瘤免疫治疗与疫苗开发上也是重要的细胞研究方向。
现有技术中多采用以下方法进行特异性T细胞的扩增：1.荷载抗原的DC细胞刺激产生抗原特异性淋巴细胞的活化，增殖和分化；2.使用人工提呈系统刺激抗原特异性TCR；3.使用肿瘤相关抗原多肽刺激抗原特异性TCR；4.使用肿瘤裂解产物刺激抗原特异性TCR；5.使用现成的产品扩增的T细胞保持抗原特异性；6.使用四聚体产品进行扩增抗原特异性T细胞。上述方法有的应用在临床端，有的应用在科研端，使用DC系统来提呈抗原的方法中DC细胞的制备过程比较繁琐，时间较久。使用肿瘤相关抗原多肽刺激抗原特异性TCR在目前的应用中仍然处于一次筛选一种疾病相关的抗原特异性TCR，获得大量的抗原特异性TCR比较耗时，过程也比较繁琐。使用肿瘤相关抗原和裂解产物的方法中容易出现非特异性背景。使用现成产品最大的问题是需要定制，价格比较贵。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法。
为了实现第一目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，包括T细胞扩增，还包括体外刺激、获得CD137+T细胞和获得抗原特异性配对TCR。
优选的，所述体外刺激具体为：添加多肽进行体外刺激24h。
优选的，所述多肽的浓度为0.1-0.3ng/ml。
优选的，所述获得CD137+T细胞具体为：收集细胞，用biotin-anti-CD137抗体进行染色25-30min，用完全培养基清洗，2000-2500rpm离心3-5min，取沉淀，然后用PE-anti-Biotin抗体染色25-35min，用完全培养基清洗，2000-2500rpm离心3-5min，取沉淀；使用anti-PE beads进行阳性筛选，获得CD137+T细胞。
优选的，所述获得抗原特异性配对TCR具体为：通过单细胞TCR配对高通量测序获得相应抗原肽刺激TCR alpha/beta受体序列，经生物信息学算法分析逻辑进行分析处理，获得抗原特异性配对TCR。
优选的，所述生物信息学算法分析逻辑进行分析处理具体为：
步骤1：对未刺激且阳性筛选的样本进行分析获得所有TCR表达图谱A；
步骤2：对各种多肽刺激后的阳性筛选的样本进行分析获得所有TCR表达图谱B；
步骤3：将所有TCR表达图谱A与所有TCR表达图谱B进行比对，再次筛选出多肽刺激后TCR频率升高的TCR序列信息，得到TCR序列信息A；
步骤4：将TCR序列信息A与其已知MHC I型信息、抗原多肽序列信息进行亲和力分析，将亲和力分为亲和力1级、亲和力2级和亲和力3级，其中，亲和力1级为0-0.3，亲和力2级为0.3-0.6，亲和力3级为0.6-1；
步骤5：将TCR序列信息A与亲和力等级进行相关性分析，将TCR频率变化大于5倍、且亲和力为2级以上的作为潜在的特异性TCR，TCR频率变化低于5倍及亲和力1级及以下的作为背景TCR。
优选的，所述T细胞扩增包括如下步骤：
S1：配置完全培养基和含有CD3抗体的PBS溶液；
S2：在96孔板中，每孔加入90-100ul浓度为0.1-0.15ug/ml的含CD3抗体的PBS溶液，并将96孔板置于37℃下培养1-2h，得到包被CD3抗体的96孔板；
S3：获取PBMC；
S4：将获得的PBMC重新悬浮于10ml完全培养基中，计数；将细胞悬液按照104-1.5×104cells/ml的细胞密度配置，得到配置好的PBMC细胞悬液；
S5：T细胞的扩增。
优选的，步骤S1中的完全培养基为：RPMI-1640培养基，8-10wt.％胎牛血清，0.8-10wt.％GlutaMAX添加剂，0.8-10wt.％青链霉素混合液，8-12ng/ml白细胞介素-2，0.5-1.5ng/ml白细胞介素-15，3-5ng/ml白细胞介素-7。
优选的，步骤S3具体为：提取健康人外周血8-10ml，密度梯度离心获得PBMC，清洗，2000-2500rpm离心3-5min，取沉淀；将细胞沉淀用PBS重悬，然后2000-2500rpm离心3-5min，得到PBMC。
优选的，步骤S5包括如下步骤：
S5.1：将包被CD3抗体的96孔板取出，弃上清，用100-120ul PBS溶液清洗一遍，然后用100-120ul完全培养基清洗一遍；
S5.2：在每孔中加入180-200ul步骤S4得到的细胞悬液，放置37℃培养箱中培养5-7天；
S5.3：收集96孔板中的细胞，2000-2500rpm离心3-5min，取沉淀，依次用PBS和完全培养基清洗；
S5.4：将步骤S5.3得到的细胞沉淀重悬于10ml完全培养基中，计数；
S5.5：用完全培养基将其配置成5×104-5.5×104cells/ml的细胞悬液并培养2周，期间补充完全培养基；
S5.6：收集扩增的T细胞，用0.1ug/ml的CD137抗体标记并分选。
S5.7：分选后的T细胞进行单细胞TCR beta和TCR alpha高通量测序。
本发明的有益效果：
(1)本发明在相同成本下，一次性可以获得大量不同疾病类型相关多肽对应的抗原特异性TCR的信息。
(2)本发明可以直接获得抗原特异性TCR的重链轻链的配对信息，应用于TCR-T，CAR-T等细胞治疗方案中构建基因工程化T细胞。
(3)本方案中采用肿瘤或疾病相关多肽，合成成本低，速度快，可以区分背景TCR以及特异性TCR。
附图说明
图1为对比例1得到的产品进行流式分析示意图；
图2为实施例1得到的产品进行流式分析示意图；
图3为捐赠者1的外周血分离的T细胞进行高通量多肽抗原刺激，其产生不同抗原特异性TCR的表达分布图；
图4为捐赠者2的外周血分离的T细胞进行高通量多肽抗原刺激，其产生不同抗原特异性TCR的表达分布图；
图5为捐赠者3的外周血分离的T细胞进行高通量多肽抗原刺激，其产生不同抗原特异性TCR的表达分布图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
步骤一：T细胞扩增
S1、配置完全培养基和含有CD3抗体的PBS溶液；
S2、在96孔板中，每孔加入100ul浓度为0.1ug/ml的含CD3抗体的PBS溶液，并将96孔板置于37℃下培养2h，得到包被CD3抗体的96孔板；
S3、获取PBMC；
提取健康人外周血8ml，密度梯度离心获得PBMC，清洗，2000rpm离心5min，取沉淀；将细胞沉淀用PBS重悬，然后2000rpm离心5min，得到PBMC；
S4、将得到的PBMC重新悬浮于10ml完全培养基中，计数；将细胞悬液按照105cells/ml的细胞密度配置，得到配置好的PBMC细胞悬液；
S5、T细胞的扩增；
S5.1、将包被CD3抗体的96孔板取出，弃上清，用120ul PBS溶液清洗一遍，然后用120ul完全培养基清洗一遍；
S5.2、在每孔中加入180ul配置好的PBMC细胞悬液，放置37℃培养箱中培养7天；
S5.3、收集96孔板中的细胞，2000rpm离心5min，取沉淀，依次用PBS和完全培养基清洗；
S5.4、将得到的细胞沉淀重悬于10ml完全培养基中，计数；
S5.5、用完全培养基将其配置成5×104/ml的细胞悬液并培养2周，期间补充完全培养基；
S5.6、收集扩增的T细胞，用0.1ug/ml的CD137抗体标记。
步骤二：体外刺激
向CD137抗体标记的T细胞中添加多种多肽进行体外刺激24h，多肽的浓度为0.1ng/ml。
步骤三：获得CD137+T细胞
收集体外刺激后的细胞，用biotin-anti-CD137抗体进行染色30min，用完全培养基清洗，2000rpm离心5min，取沉淀，然后用PE-anti-Biotin抗体染色25min，用完全培养基清洗，2000rpm离心5min，取沉淀；使用anti-PE beads进行阳性筛选，获得CD137+T细胞。
步骤四：获得抗原特异性配对TCR
将CD137+T细胞通过单细胞TCR配对高通量测序获得相应抗原肽刺激TCR alpha/beta受体序列，经生物信息学算法分析逻辑进行分析处理，获得每个抗原特异性配对TCR。
所述生物信息学算法分析逻辑进行分析处理具体为：
步骤1：对未刺激且阳性筛选的样本进行分析获得所有TCR表达图谱A；
步骤2：对各种多肽刺激后的阳性筛选的样本进行分析获得所有TCR表达图谱B；
步骤3：多种多肽刺激后的阳筛TCR序列与未刺激的阳筛TCR序列进行比对，再次筛选出多肽刺激后TCR频率升高的TCR序列信息，得到TCR序列信息A；
步骤4：将TCR序列信息A与其已知MHC I型信息、抗原多肽序列信息进行亲和力分析，将亲和力分为亲和力1级、亲和力2级和亲和力3级，其中，亲和力1级为0-0.3，亲和力2级为0.3-0.6，亲和力3级为0.6-1；
步骤5：将TCR序列信息A与亲和力等级进行相关性分析，将TCR频率变化明显(TCR频率变化大于5倍)且亲和力为2级以上的作为潜在的特异性TCR，TCR频率变化低于5倍及亲和力1级及以下的作为背景TCR。
本实施例中，完全培养基为：RPMI-1640培养基，10wt.％胎牛血清，0.8wt.％GlutaMAX添加剂，1wt.％青链霉素混合液，8ng/ml白细胞介素-2，1.5ng/ml白细胞介素-15，3ng/ml白细胞介素-7。
实施例2
步骤一：T细胞扩增
S1、配置完全培养基和含有CD3抗体的PBS溶液；
S2、在96孔板中，每孔加入90ul浓度为0.15ug/ml的含CD3抗体的PBS溶液，并将96孔板置于37℃下培养2h，得到包被CD3抗体的96孔板；
S3、获取PBMC；
提取健康人外周血10ml，密度梯度离心获得PBMC，清洗，2500rpm离心5min，取沉淀；将细胞沉淀用PBS重悬，然后2500rpm离心5min，得到PBMC；
S4、同实施例1；
S5、T细胞的扩增；
S5.1、将包被CD3抗体的96孔板取出，弃上清，用100ul PBS溶液清洗一遍，然后用100ul完全培养基清洗一遍；
S5.2、在每孔中加入200ul细胞悬液，放置37℃培养箱中培养7天；
S5.3、收集96孔板中的细胞，2500rpm离心5min，取沉淀，依次用PBS和完全培养基清洗；
S5.4、同实施例1；
S5.5、用完全培养基将其配置成5×104cells/ml的细胞悬液并培养2周，期间补充完全培养基；
S5.6、同实施例1。
步骤二：体外刺激
向CD137抗体标记的T细胞中添加多种多肽进行体外刺激24h，多肽的浓度为0.2ng/ml。
步骤三：获得CD137+T细胞
收集体外刺激后的细胞，用biotin-anti-CD137抗体进行染色25min，用完全培养基清洗，2000rpm离心3min，取沉淀，然后用PE-anti-Biotin抗体染色35min，用完全培养基清洗，2000rpm离心3min，取沉淀；使用anti-PE beads进行阳性筛选，获得CD137+T细胞。
步骤四：同实施例1。
本实施例中，完全培养基为：RPMI-1640培养基，8wt.％胎牛血清，1wt.％GlutaMAX添加剂，1wt.％青链霉素混合液，10ng/ml白细胞介素-2，1ng/ml白细胞介素-15，5ng/ml白细胞介素-7。
实施例3
步骤一：T细胞扩增
S1、配置完全培养基和含有CD3抗体的PBS溶液；
S2、在96孔板中，每孔加入90ul浓度为0.12ug/ml的含CD3抗体的PBS溶液，并将96孔板置于37℃下培养1h；
S3、获取PBMC；
提取健康人外周血9ml，密度梯度离心获得PBMC，清洗，2500rpm离心3min，取沉淀；将细胞沉淀用PBS重悬，然后2500rpm离心3min，得到PBMC；
S4、将得到的PBMC重新悬浮于10ml完全培养基中，计数；将细胞悬液按照1.5×105cells/ml的细胞密度配置，得到配置好的PBMC细胞悬液；
S5、T细胞的扩增；
S5.1、将包被CD3抗体的96孔板取出，弃上清，用110ul PBS溶液清洗一遍，然后用110ul完全培养基清洗一遍；
S5.2、在每孔中加入190ul细胞悬液，放置37℃培养箱中培养7天；
S5.3、收集96孔板中的细胞，2500rpm离心3min，取沉淀，依次用PBS和完全培养基清洗；
S5.4、同实施例1；
S5.5、用完全培养基将其配置成5.5×104cells/ml的细胞悬液并培养2周，期间补充完全培养基；
S5.6、同实施例1。
步骤二：体外刺激
向CD137抗体标记的T细胞中添加多种多肽进行体外刺激24h，多肽的浓度为0.3ng/ml。
步骤三：同实施例1。
步骤四：同实施例1。
本实施例中，完全培养基为：RPMI-1640培养基，9wt.％胎牛血清，1wt.％GlutaMAX添加剂，0.8wt.％青链霉素混合液，8ng/ml白细胞介素-2，1.5ng/ml白细胞介素-15，3ng/ml白细胞介素-7。
实施例4
步骤一：T细胞扩增
S1、配置完全培养基和含有CD3抗体的PBS溶液；
S2、在96孔板中，每孔加入100ul浓度为0.12ug/ml的含CD3抗体的PBS溶液，并将96孔板置于37℃下培养1.5h；
S3、获取PBMC；
提取健康人外周血10ml，密度梯度离心获得PBMC，清洗，2000rpm离心3min，取沉淀；将细胞沉淀用PBS重悬，然后2000rpm离心3min，得到PBMC；
S4、同实施例1；
S5、T细胞的扩增；
S5.1、将包被CD3抗体的96孔板取出，弃上清，用100ul PBS溶液清洗一遍，然后用100ul完全培养基清洗一遍；
S5.2、在每孔中加入180ul细胞悬液，放置37℃培养箱中培养7天；
S5.3、收集96孔板中的细胞，2000rpm离心3min，取沉淀，依次用PBS和完全培养基清洗；
S5.4、同实施例1；
S5.5、同实施例1；
S5.6、同实施例1。
步骤二：同实施例1。
步骤三：同实施例1。
步骤四：同实施例1。
本实施例中，完全培养基为：RPMI-1640培养基，9wt.％胎牛血清，1wt.％GlutaMAX添加剂，1wt.％青链霉素混合液，10ng/ml白细胞介素-2，1.5ng/ml白细胞介素-15，3ng/ml白细胞介素-7。
试验例1
试验方法：将表1中的抗原肽组合对T细胞进行体外刺激，其他步骤同实施例1。
试验结果：详见表1和表2。
表1抗原肽组合
Figure BDA0003381237110000101
Figure BDA0003381237110000111
表2抗原特异性TCRalpha和beta配对数据表
Figure BDA0003381237110000112
Figure BDA0003381237110000121
Figure BDA0003381237110000131
Figure BDA0003381237110000141
Figure BDA0003381237110000151
参考表1、表2，通过高通量刺激扩增抗原特异性T细胞的方案并结合高通量测序获得几十甚至几百种抗原特异性TCR序列；通过优化扩增方案和算法分析配合单细胞测序后双链配对可高通量的获得每个抗原特异性的TCRalpha链和beta链序列。
试验例2
试验组别：实施例1和对比例1，与实施例1不同的是对比例1不经过多肽刺激。
试验结果：详见图1和图2。
参考图1和图2可知，将实施例1和对比例1的产品进行流式分析，可以看出，经过多肽刺激后具有CD137+的T细胞大量增殖，可作为刺激成功后的T细胞分选，并进行抗原特异性TCR测序分析。
试验例3
选用不同捐赠者的外周血分离的T细胞进行高通量多肽抗原刺激，观察其产生不同抗原特异性TCR的表达分布，详见图3-图5。
图中横坐标为不同多肽，纵坐标为样本抗原多肽刺激后产生的相关TCR总频率和克隆种类数。
参考图3-图5，不同来源的外周血分离的T细胞在进行高通量多肽抗原刺激侯，产生不同抗原特异性TCR具有差异性，其相关TCR总频数与克隆种类数均不相同。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，包括T细胞扩增，其特征在于，还包括体外刺激、获得CD137+T细胞和获得抗原特异性配对TCR。
2.如权利要求1所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述体外刺激具体为：添加多肽进行体外刺激。
3.如权利要求2所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述多肽的浓度为0.1-0.3ng/ml。
4.如权利要求1所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述获得CD137+T细胞具体为：收集细胞，用biotin-anti-CD137抗体进行染色，用完全培养基清洗，离心，取沉淀，然后用PE-anti-Biotin抗体染色，用完全培养基清洗，离心，取沉淀；使用anti-PE beads进行阳性筛选，获得CD137+T细胞。
5.如权利要求1所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述获得抗原特异性配对TCR具体为：通过单细胞TCR配对高通量测序获得相应抗原肽刺激TCRalpha/beta受体序列，经生物信息学算法分析逻辑进行分析处理，获得抗原特异性配对TCR。
6.如权利要求5所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述生物信息学算法分析逻辑进行分析处理具体为：
步骤1：对未刺激且阳性筛选的样本进行分析获得所有TCR表达图谱A；
步骤2：对各种多肽刺激后的阳性筛选的样本进行分析获得所有TCR表达图谱B；
步骤3：将所有TCR表达图谱A与所有TCR表达图谱B进行比对，再次筛选出多肽刺激后TCR频率升高的TCR序列信息，得到TCR序列信息A；
步骤4：将TCR序列信息A与其已知MHC I型信息、抗原多肽序列信息进行亲和力分析，将亲和力分为亲和力1级、亲和力2级和亲和力3级；
步骤5：将TCR序列信息A与亲和力等级进行相关性分析，将TCR频率变化大于5倍、且亲和力为2级以上的作为潜在的特异性TCR，TCR频率变化低于5倍及亲和力1级及以下的作为背景TCR。
7.如权利要求1所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述T细胞扩增包括如下步骤：
S1：配置完全培养基和含有CD3抗体的PBS溶液；
S2：在96孔板中，每孔加入含CD3抗体的PBS溶液，培养，得到包被CD3抗体的96孔板；
S3：获取PBMC；
S4：将获得的PBMC重新悬浮于完全培养基中，计数；将细胞悬液按照104-1.5×104cells/ml的细胞密度配置，得到配置好的PBMC细胞悬液；
S5：T细胞的扩增。
8.如权利要求7所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，步骤S1中的完全培养基为：RPMI-1640培养基，8-10wt.％胎牛血清，0.8-1wt.％GlutaMAX添加剂，0.8-1wt.％青链霉素混合液，8-12ng/ml白细胞介素-2，0.5-1.5ng/ml白细胞介素-15，3-5ng/ml白细胞介素-7。
9.如权利要求7所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，步骤S3具体为：提取健康人外周血，密度梯度离心获得PBMC，清洗，离心，取沉淀；将细胞沉淀用PBS重悬，然后离心，得到PBMC。
10.如权利要求7所述的一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法，其特征在于，步骤S5包括如下步骤：
S5.1：将包被CD3抗体的96孔板取出，弃上清，用PBS溶液清洗，然后用完全培养基清洗；
S5.2：在每孔中加入步骤S4得到的配置好的PBMC细胞悬液，放置培养箱中培养；
S5.3：收集96孔板中的细胞，离心，取沉淀，依次用PBS和完全培养基清洗；
S5.4：将步骤S5.3得到的细胞沉淀重悬于完全培养基中，计数；
S5.5：用完全培养基将其配置成104-1.5×104cells/ml的细胞悬液并培养，期间补充完全培养基；
S5.6：收集扩增的T细胞，用CD137抗体标记分选。
S5.7：分选后的T细胞进行单细胞TCR beta和TCR alpha高通量测序。
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