CN113984726B

CN113984726B - 一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰dna检测汞离子的方法

Info

Publication number: CN113984726B
Application number: CN202111220827.XA
Authority: CN
Inventors: 张娟; 于颖; 张媛
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2041-10-20
Also published as: CN113984726A

Abstract

本发明提出了一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，包括以下步骤：S1.CMB@APBA的制备；S2.DNA*的制备；S3.标准曲线的建立；S4.样品检测。本发明通过汞离子与3‑氨基苯硼酸的特异性结合，使得该分析方法具有很好的特异性，消除了其它物质的干扰，该汞离子检测方法，具有操作方便、选择性高、灵敏度高、时间短等优点。

Description

一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法

技术领域

本发明涉及汞离子技术领域，具体涉及一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法。

背景技术

汞离子(Hg²⁺)是一种广泛存在的有毒金属污染物，其在染料纺织制造业、采矿业、冶炼业、电池制造业、肥料及化肥的工业生产中都具有广泛的应用。其中土壤、空气、水中都受到不同程度的汞离子污染。农作物在吸收受污染的土壤中的养分、牲畜在饮用受污染的水情况下，均会不同程度的积累汞离子。由于其在体内的非生物降解性和生物累积性，人们若长期食用被汞离子污染的食物，即使在低浓度下也会对人类健康造成有害影响，如核酸功能紊乱、贫血和心血管疾病。因此，发展一种高灵敏高选择性的用于食品中汞离子的检测方法具有非常重要的意义。

目前，已经开发多种传统方法和新的分析手段来有效检测Hg²⁺。传统方法包括电感耦合等离子体质谱法、原子吸收/发射光谱法、冷蒸气原子荧光光谱法等，它们具有较高的灵敏度和准确性，但其固有的一些缺点包括样品前处理操作繁琐，昂贵的费用，专业的操作人员以及大型设备难以满足现场快速检测的需求。核酸适体由于其易于合成和修饰、体积小、缺乏免疫原性和成本低等优点，人们也努力开发出多种基于核酸适体检测汞离子的方法，这些方法大多与比色法、电化学法、荧光法等结合。其中比色法一般需要纳米材料或者催化剂的辅助，通过颜色变化进行定量，然后实际应用中会面临材料合成麻烦、催化体系易受pH等环境干扰稳定性较差、灵敏度低等问题。因此，建立高效、快速的适合Hg²⁺现场检测的方法势在必行。

专利号CN103884669B公开了一种利用纳米银探针检测汞离子的方法，利用合成的纳米银探针在加入汞离子前后紫外吸收光谱的变化实现汞离子的检测。该方法灵敏性高，但是合成的纳米银探针颗粒大小不均匀，且易受环境影响出现聚集沉淀等现象，影响检测结果。

发明内容

本发明的目的在于提出一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，以解决传统方法中样品处理操作繁琐，费用昂贵，操作人员的专业技术要求以及新兴分析方法中材料合成复杂、体系易受环境影响以及稳定性差等问题。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，包括以下步骤：

S1.CMB@APBA的制备：将3-氨基苯硼酸过氨基与羧基结合的方式连接到活化的羧基磁珠上，得到CMB@APBA；

S2.DNA*(乙二醛修饰的DNA)的制备：在加热的条件下，将DNA溶液与乙二醛溶液、二甲基亚砜和去离子水的混合物反应，得到乙二醛修饰的DNA，用稀盐酸调节pH至3，即DNA*；

S3.标准曲线的建立：将CMB@APBA磁分离后去除上清液，分别浸没在浓度为浓度确定的汞离子溶液中，进行第一次反应，清洗，磁分离去除上清液，加入DNA*，进行第二次反应，清洗，磁分离去除上清液，并加入磷酸盐缓冲液、CRISPR-Cas12a体系，进行第三次反应，随即进行第四次反应，终止反应，利用荧光光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并做出靶标物质汞离子和荧光强度的线性图；

S4.样品检测：在步骤S3同样的条件下，将CMB@APBA磁分离后去除上清液，浸没在待测液中，进行第一次反应，清洗，磁分离去除上清液，加入DNA*，进行第二次反应，清洗，磁分离去除上清液，并加入磷酸盐缓冲液、CRISPR-Cas12a体系，进行第三次反应，随即进行第四次反应，终止反应，利用荧光光谱分析装置，检测上清液的光谱，建立待测汞离子样品溶液的汞离子浓度和特定波长处试剂体系的荧光强度值之间的直线关系的计算模块，通过分析系统与步骤S3所得参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的汞离子的含量水平。

作为本发明的进一步改进，步骤S1的具体步骤如下：

S101.将N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中，得到活化溶液；将羧基磁珠溶液磁洗两次后去除上清，将活化溶液加入磁珠中，室温下反应10-20min；

S102.将步骤S101中得到的产物清洗，除上清液，然后加入2-10mg/mL的3-氨基苯硼酸溶液中，于35-40℃，300-700rpm的条件下反应1-5h，洗涤去除上清液，加入去离子水，得到CMB@APBA，其浓度为2-10mg/ml。

作为本发明的进一步改进，所述N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(15-20)：(2-5)。

作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述DNA溶液浓度为80-120μmol/L；所述乙二醛溶液浓度为30-50wt％；所述反应条件为40-60℃反应30-50min；所述DNA溶液、乙二醛溶液、二甲基亚砜和去离子水的体积比为(1-5)：(10-17)：(40-60)：(25-35)。

作为本发明的进一步改进，步骤S3或步骤S4中所述第一次反应条件为室温下反应20-40min；第二次反应条件为在pH＝3的体系中，35-40℃反应0.5-2h，所述第三次反应条件为35-40℃反应0.5-2h；第四次反应条件为60-70℃反应5-20min。

作为本发明的进一步改进，步骤S3或步骤S4中所述磷酸盐缓冲液和CRISPR-Cas12a体系的体积比为(3-5)：1；所述磷酸盐缓冲液pH＝7-7.7，；所述CRISPR-Cas12a体系由8μL buffer，6.4μL DEPC水，3.2μL、5μM的Cas12a，0.8μL、20μM的crRNA以及1.6μL、10μM的ssDNA混合制得。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述汞离子溶液的浓度范围为20nM-400nM。

作为本发明的进一步改进，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；所述crRNA序列如SEQ ID No.2；所述ssDNA序列如SEQ ID No.3。

作为本发明的进一步改进，所述方法的线性方程为：FL＝-2263.767C_Hg2++1203.3967(R²＝0.989)。

作为本发明的进一步改进，所述线性检测范围为：20nM-400nM，检测限为：5.46nM。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过汞离子与3-氨基苯硼酸的特异性结合，使得该分析方法具有很好的特异性，消除了其它物质的干扰；

2、本发明利用乙二醛修饰DNA后其三种碱基(A、G、C)上形成稳定的二氨基加合物能够与3-氨基苯硼酸反应生成硼酸酯的特性，开发了一种新的捕获DNA的方式，将DNA固定在界面，可以通过磁洗改变不同反应步骤中所需的反应体系；

3、本发明采用CRISPR-Cas12a反式切割ssDNA的方式做信号输出可进行信号放大，增强了传感器的灵敏度；

4、本发明基于荧光光谱分析方法，具有高灵敏度、信号稳定、检测方式简便等优点，能高效、灵敏、快速检测食品中汞离子。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子方法的原理示意图；

图2为DNA*(乙二醛修饰的DNA)与CMB@APBA连接反应的pH条件优化柱形图；

图3为本发明提供的汞离子的浓度梯度检测荧光光谱图；

图4为本发明提供的汞离子的检测方法在520nm处的荧光强度值线性关系图；

图5为本发明提供的汞离子的检测方法的选择性测试结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：基于氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法

本发明提供的基于氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，包括如下步骤：

S2.在加热的条件下，将DNA溶液与乙二醛溶液、二甲基亚砜和去离子水的混合物反应，得到乙二醛修饰的DNA，用稀盐酸调节pH至3，即DNA*；

S3标准曲线的建立：将CMB@APBA磁分离后去除上清液，分别浸没在浓度为浓度确定的汞离子溶液中，进行第一次反应，清洗，磁分离去除上清液，加入DNA*，进行第二次反应，清洗，磁分离去除上清液，并加入磷酸盐缓冲液、CRISPR-Cas12a体系，进行第三次反应，随即进行第四次反应，终止反应，利用荧光光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并做出靶标物质汞离子和荧光强度的线性图；

S4样品检测：在步骤S3同样的条件下，将CMB@APBA磁分离后去除上清液，浸没在待测液中，进行第一次反应，清洗，磁分离去除上清液，加入DNA*，进行第二次反应，清洗，磁分离去除上清液，并加入磷酸盐缓冲液、CRISPR-Cas12a体系，进行第三次反应，随即进行第四次反应，终止反应，利用荧光光谱分析装置，检测上清液的光谱，建立待测汞离子样品溶液的汞离子浓度和特定波长处试剂体系的荧光强度值之间的直线关系的计算模块，通过分析系统与步骤S3所得参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的汞离子的含量水平。

如图1，为本发明提供的基于氨基苯硼酸功能化磁珠结合乙二醛修饰DNA检测汞离子的检测原理示意图。当反应体系中无汞离子时，DNA*与3-氨基苯硼酸反应生成硼酸酯，从而使得CMB@APBA成功捕获DNA*，再加入Cas12a/crRNA复合物后，DNA*与Cas12a/crRNA复合物结合，得到具有活性的Cas12a，从而反式切割ssDNA，得到较强的荧光强度；反应体系中有汞离子存在时，汞离子与3-氨基苯硼酸特异性结合，通过磁洗过程后磁珠表面无法捕获DNA*，因此加入Cas12a/crRNA复合物后Cas12a仍无活性，无法切割ssDNA，导致较低的荧光强度。

以下通过调整DNA*与CMB@APBA反应体系的pH获得两者结合的最优实验条件，获得实施例2

实施例2：DNA*与CMB@APBA反应体系pH的优化筛选

DNA*与CMB@APBA的反应通过加入稀盐酸调整体系pH分别为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7。加入汞离子浓度为1μM；本实施例与实施例一参数基本相同，特别之处在于：

使用3'端标记Alexa 488荧光基团的DNA，经过乙二醛修饰后，调整体系至不同的pH值，测量其荧光强度；相同浓度相同处理方式的Alexa 488-DNA在不同的pH条件下与CMB@APBA反应，磁分离后测上清液的荧光。所述的Alexa 488-DNA序列为：5'-AATCCCCTCCAATGCAGGCCTAACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Alexa 488-3'。

荧光值检测：将获得的上清液放入荧光比色皿中，测量500nm～600nm波长范围内光谱。

如图2，为DNA*与CMB@APBA结合反应在不同pH条件下测得的520nm处荧光强度柱形图。由图2可以看出，当反应体系的pH为3时，对应的荧光强度相差值达到最大。因此，在此条件下CMB@APBA能够捕获更多的DNA*，检测汞离子时，检测灵敏度较高。

综上，本发明提供的汞离子的检测方法中，DNA*与CMB@APBA的反应最佳pH值为3。

实施例3：绘制标准曲线

反应体系体积为100μL，DNA*与CMB@APBA结合反应的pH值为3，待测溶液的汞离子浓度分别为0μM、0.002μM、0.004μM、0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM，其余参数参照实施例1。通过测定上清液荧光，做出汞离子和荧光强度的线性图，确定所检测的汞离子的含量水平。

如图3和图4，其中图3为不同浓度汞离子反应体系的荧光光谱图；图4为本发明提供的汞离子的检测方法的标准曲线图。结合图3和图4可以看出，反应产物溶液在520nm波长处的荧光强度值随汞离子的浓度升高而降低。由图4可以看出，本发明提供的汞离子的检测方法，线性方程为：FL＝-2263.767C_Hg2++1203.3967(R²＝0.989)，线性关系好，线性检测范围为20nM-400nM，检测限为5.46nM。由此说明，本发明提供的汞离子的检测方法，具有较低的检测限，可满足实际检测要求。

实施例4：本发明检测方法的特异性测试

为测试本发明提供的汞离子检测方法的特异性，选用几种常见的金属离子Cr³⁺、Ca²⁺、pb²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺按照实施例一的操作步骤处理来验证方法的特异性；同样地，Cr³⁺、Ca²⁺、pb²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺以及Hg²⁺一起加入检测体系中，按照实施例一的操作步骤处理来验证方法的抗干扰性；其中Cr³⁺、Ca²⁺、pb²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺的浓度为2mM，Hg²⁺浓度为10μM；并增加空白组做对比实验；

如图5，为本发明提供的汞离子的检测方法的特异性实验结果示意图。由图5可以看出，即使Cr³⁺、Ca²⁺、pb²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺的浓度比汞离子浓度高200倍，仍然不能引起荧光强度值的明显变化；并且其他金属离子对Hg²⁺的检测基本不造成干扰，主要原因在于汞离子与3-氨基苯硼酸反应的高特异性，进而说明本发明提供的汞离子的检测方法具有良好的选择性和抗干扰性。

应用实施例：实际样品检测研究

采用加样回收法，运用本实施例的荧光法测定了牛奶、茶饮料中汞离子的浓度，所有样品均测量三次取平均值，参见下表。可知，本实施例荧光传感器能够准确测定实际样品中汞离子浓度。结果见表1。

表1

由表1可知，本发明提供的汞离子的检测方法，利用汞离子与3-氨基苯硼酸的特异性结合，可以阻止乙二醛修饰的DNA与3-氨基苯硼酸的结合，使得磁珠上无法捕获DNA*，在加入Cas12a/crRNA后，无法反式切割体系中的ssDNA，最终产物借助荧光光谱仪分析并实现汞离子检测。本发明提供的汞离子检测方法，具有操作方便、选择性高、灵敏度高、时间短等优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海大学

<120> 一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 无(未知)

<400> 1

aatcccctcc aatgcaggcc taacgttttt tttttttttt tttttttttt ttttt 55

<210> 2

<211> 41

<212> RNA

<213> 无(未知)

<400> 2

uaauuucuac uaaguguaga uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 41

<210> 3

<211> 5

<212> DNA

<213> 无(未知)

<400> 3

ttatt 5

Claims

1.一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.CMB@APBA的制备：将3-氨基苯硼酸通过氨基与羧基结合的方式连接到活化的羧基磁珠上，得到CMB@APBA；

S2.DNA*的制备：在加热的条件下，将DNA溶液与乙二醛溶液、二甲基亚砜和去离子水的混合物反应，得到乙二醛修饰的DNA，用稀盐酸调节pH至3，即DNA*；

S4.样品检测：在步骤S3同样的条件下，将CMB@APBA磁分离后去除上清液，浸没在待测液中，进行第一次反应，清洗，磁分离去除上清液，加入DNA*，进行第二次反应，清洗，磁分离去除上清液，并加入磷酸盐缓冲液、CRISPR-Cas12a体系，进行第三次反应，随即进行第四次反应，终止反应，利用荧光光谱分析装置，检测上清液的光谱，建立待测汞离子样品溶液的汞离子浓度和特定波长处试剂体系的荧光强度值之间的直线关系的计算模块，通过分析系统与步骤S3所得参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的汞离子的含量水平；

步骤S3或步骤S4中所述第一次反应条件为室温下反应20-40min；第二次反应条件为在pH＝3的体系中，35-40℃反应0.5-2h，所述第三次反应条件为35-40℃反应0.5-2h；第四次反应条件为60-70℃反应5-20min。

2.根据权利要求1所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，所述N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(15-20)：(2-5)。

4.根据权利要求1所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，步骤S2中所述DNA溶液浓度为80-120μmol/L；所述乙二醛溶液浓度为30-50wt％；所述反应条件为40-60℃反应30-50min；所述DNA溶液、乙二醛溶液、二甲基亚砜和去离子水的体积比为(1-5)：(10-17)：(40-60)：(25-35)。

5.根据权利要求1所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，步骤S3或步骤S4中所述磷酸盐缓冲液和CRISPR-Cas12a体系的体积比为(3-5)：1；所述磷酸盐缓冲液pH＝7-7.7；

所述CRISPR-Cas12a体系由8μL buffer，6.4μL DEPC水，3.2μL、5μM的Cas12a，0.8μL、20μM的crRNA以及1.6μL、10μM的ssDNA混合制得。

6.根据权利要求1所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，步骤S3中所述汞离子溶液的浓度范围为20nM-400nM。

7.根据权利要求1所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；crRNA序列如SEQ ID No.2；ssDNA序列如SEQID No.3。

8.根据权利要求1所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，所述方法的线性方程为：FL＝-2263.767

C_Hg2++1203.3967(R²＝0.989)，其中FL为荧光强度，C_Hg2+为汞离子的浓度。

9.根据权利要求8所述的氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰DNA检测汞离子的方法，其特征在于，所述线性检测范围为：20nM-400nM，检测限为：5.46nM。