CN113943798A

CN113943798A - 一种肝癌诊断标志物及治疗靶点的应用

Info

Publication number: CN113943798A
Application number: CN202010687138.9A
Authority: CN
Inventors: 李向东; 李鹏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN113943798B

Abstract

一种肝癌诊断标志物及治疗靶点的应用，本发明涉及分子生物学领域，具体是一种circ RNA在肝细胞癌诊断及靶向治疗中的应用。所述circ RNA标志物为hsa_circRNA_0000384，研究发现肝细胞癌组织中hsa_circRNA_0000384的表达显著高于癌旁组织及正常组织，hsa_circRNA_0000384高表达暗示肝细胞癌患者的不良预后。同时本发明还涉及一种特异降低肝癌细胞系hsa_circRNA_0000384表达的siRNA,并证实其可以抑制肝癌细胞增殖与迁移，所述siRNA可作为肝细胞癌治疗的靶点。

Description

一种肝癌诊断标志物及治疗靶点的应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物医学邻域，具体涉及hsa_circRNA_0000384作为肝细胞癌诊断的标志物和治疗靶点。

背景技术

肝癌（Liver Cancer）是全球第六大常见癌症，也是致死率第四的癌症。2018年全球新增肝癌病例84.1万例，肝癌死亡病例78.2万例。中国恶性肿瘤流行情况分析显示2015年我国新增肝癌病例37万例，位列主要癌症新发病例第四位；肝癌死亡病例32.6万例，位列主要癌症死亡病例第二位。原发性肝癌主要分为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC），占比为75%-85%；胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma），占比为10%-15%。早期肝细胞癌不易发现，多数肝细胞癌患者被确诊时已处于中晚期。肝癌的治疗主要以手术、放疗、化疗为主，但是预后较差，患者存活期普遍较短。目前尚未有特异的肝细胞癌早期诊断靶标及预后生物标志物，且肝细胞癌靶向治疗药物的研发依然没有实质突破。因此，寻找肝细胞癌早期诊断特异性标志物，同时以标记物为突破口研发肝细胞癌靶向药物意义重大。

环状RNA（circular RNA, circ RNA）与micro RNA、长链非编码RNA同属于非编码RNA家族，近年来环状RNA已经成为非编码RNA研究领域的热点，受到广泛关注。环状RNA是一类不具有游离的5'末端帽子和3'末端 poly (A)尾巴而主要依赖于反向剪接机制以共价键形式形成的闭合环状RNA分子。目前的研究结果表明，环状RNA在人体内广泛表达，且在不同组织器官中具有特异性，其主要作用是作为microRNA的内源竞争性结合分子调控下游基因的表达；作为RNA结合蛋白的诱饵调控RNA结合蛋白的功能；作为蛋白的脚手架分子调控蛋白的修饰；直接翻译多肽等。越来越多的证据表明环状RNA在肝细胞癌发生、发展中发挥着重要的作用，因此环状RNA有望成为肝细胞癌理想的诊断标志物和治疗靶点。

发明内容

为了实现肝细胞癌的早期诊断及靶向治疗，本发明提供了hsa_circRNA_0000384作为肝细胞癌早期诊断靶标及临床治疗靶点。

本发明的第一个目的是提供一种环状RNA用于肝细胞癌诊断的标志物。

本发明的第二个目的是提供一种肝细胞癌特异性诊断试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种环状RNA作为肝细胞癌的治疗靶点。

为实现第一个目的，本发明提供在肝细胞癌中显著高表达circRNA为生物标志物，所述标志物为hsa_circRNA_0000384。SEQ ID No.1所示，环化序列由420个碱基组成。

为实现第二个目的，本发明采取的技术方案是：提供了一种基于荧光定量PCR的检测试剂盒，其中包含hsa_circRNA_0000384的特异检测引物。

荧光定量PCR的检测引物序列如下

F: 5'-CCCCAGAGCACGAGTAGTAG-3'

R: 5'-TGCTGCAACTGGGTAAACAC-3'

beta-actin内参引物序列如下

F: 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'

R: 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'

为实现第三个目的，本发明采取的技术方案是：提供了一种在肝细胞癌细胞系中显著降低hsa_circRNA_0000384表达，且不影响hsa_circRNA_0000384来源基因MRPS35表达的siRNA，并利用肝癌细胞系验证了该siRNA通过降低hsa_circRNA_0000384表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移。

hsa_circRNA_0000384特异siRNA序列如下

F: 5'-GUAGUCUUAAGACGGAAAGTT-3'

R: 5'-CUUUCCGUCUUAAGACUACTT-3'

附图说明

图1为环状RNA标志物的表达分析。

图2为用于荧光定量PCR检测hsa_circRNA_0000384表达的检测引物的融解曲线。

图3为siRNA敲降效率及特异性分析。

图4为降低hsa_circRNA_0000384表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1

1.1 样本的收集

收集20例肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织石蜡组织。

1.2 石蜡组织及细胞系总RNA的提取与反转录

利用石蜡组织RNA提取试剂盒（天根公司）提取石蜡组织RNA，利用Nano Drop测定RNA浓度。利用Trizol法提取肝细胞系及肝癌细胞系的RNA，利用Nano Drop测定RNA浓度。

利用反转录试剂盒（TAKARA公司）进行反转录，体系如下：

成分	体积
		总RNA	500 ng
Random Primer (50 μM)	0.5 μL
		dNTPs Mixture (10 mM)	0.5μL
5x M-MLV Buffer	2 μL
		RNase Inhibitor（40 U/μl）	0.25 μL
RTase M-MLV（RNase H-）（200 U/μl）	0.5 μL
		RNase free H<sub>2</sub>O	up to 10 μL

反应条件

30℃，10分钟；42℃，1小时；70℃，15分钟；冰上冷却，得到的cDNA溶液。

1.4 cDNA稀释

反转录后，每孔加40 μL RNase free H₂O稀释。

1.5 荧光定量PCR

设计hsa_circRNA_0000384跨剪切点引物:设计合成了三对跨剪切点引物（由生工生物公司合成），进行PCR检测，从中优选引物扩增条带明确且单一的引物组合，如下：

F: 5'-CCCCAGAGCACGAGTAGTAG-3'

R: 5'-TGCTGCAACTGGGTAAACAC-3'

PCR产物大小为137bp。经测序确定PCR产物正确。

利用SYBR Green Mixture（GenStar公司）以beta-actin为内参检测hsa_circRNA_0000384的相对表达，计算相对表达量。

荧光定量PCR体系

成分	体积
		2×SYBR Green Mixture	5 μL
F引物 (10 μM)	0.4 μL
		R引物 (10 μM)	0.4 μL
cDNA	2 μL
		RNase free H<sub>2</sub>O	2.2 μL

PCR条件

95℃，2min；40个PCR循环(95℃，15秒；60℃，15秒(收集荧光))。扩增反应结束后，从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)，以获得PCR产物的熔解曲线。

实施例2

2.1 hsa_circRNA_0000384特异siRNA的选择

基于hsa_circRNA_0000384的序列，设计2对跨hsa_circRNA_0000384成环剪切点的siRNA（由吉玛基因公司合成）。通过检测其特异性和敲降效率优选以下siRNA，其序列如下：

F: 5'-GUAGUCUUAAGACGGAAAGTT-3'

R: 5'-CUUUCCGUCUUAAGACUACTT-3'

2.2 siRNA转染细胞

Huh-7细胞系，HCCLM3细胞系铺板于12孔板，待细胞汇合度达到60%-70%，利用lipo2000转染试剂（购自英潍捷基公司）转染细胞，每孔加入2μL siRNA（20μM），48小时后提取细胞RNA，反转录后荧光定量PCR检测hsa_circRNA_0000384及MRPS35的表达。

实施例3

3.1 CCK-8检测细胞增殖

细胞铺板于24孔板，转染siRNA或NC-siRNA，24小时后，消化细胞，计数，并以每孔约1000个铺板于96孔板，每孔的总体积为100 μL，测定5个时间点，每个时间点3次重复。待细胞贴壁后作为零点，每孔加入10 μL CCK-8试剂（购自碧云天公司），37℃ 避光培养1小时，利用酶标仪检测450 nm 吸光度。

3.2划痕实验检测细胞迁移

细胞铺板于12孔板，转染siRNA或NC-siRNA，24小时后，消化细胞，将细胞传代至6孔板中，待细胞长满后，换为无血清培养基，用10 μL枪头在孔板中笔直划线，用显微镜明场拍照记为零点，48h后在同一位置拍照，比较间隙宽度。

3.3裸鼠成瘤实验检测体内肿瘤生长速率

细胞铺板于10 cm 皿，转染siRNA或NC-siRNA，24小时后，消化细胞，计数，注射BALB/c裸鼠皮下每只200万细胞，每隔5天计量肿瘤大小，25天取出肿瘤，计算重量。

Claims

1.一种用于肝细胞癌诊断的circ RNA标志物，其特征在于，所述circ RNA标志物为hsa_circRNA_0000384。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，hsa_circRNA_0000384的核酸序列。

3.一种肝细胞癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含检测患者肝组织中hsa_circRNA_0000384表达量的试剂。

4.根据权利要求1和3所述用途，其特征在于：所述hsa_circRNA_0000384的特异性检测引物组合，包括一对针对hsa_circRNA_0000384的特异引物的核酸序列。

5.一种肝细胞癌治疗靶点，其特征在于：一种可以特异性降低hsa_circRNA_0000384表达的siRNA。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述siRNA的核酸序列。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述siRNA在肝癌细胞系的应用，是降低肝癌细胞的细胞增殖能力方面的应用。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述siRNA在肝癌细胞系的应用，是降低肝癌细胞的细胞迁移能力方面的应用。