CN113925995B - 一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架及其制备方法，该方法是先进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜，再进行灭菌和交联处理得到所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架。其中，静电纺丝采用接收装置包括一块印制电路板和一个环形电极；印制电路板包括一绝缘基板和若干焊盘，焊盘的分布方式为：绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成若干个呈圆形分布的环形阵列焊盘组；环形电极的底部固定在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，环形电极的内壁构成的圆形与各个环形阵列焊盘组构成的圆形均为同心圆。所述同心圆的圆心为所述绝缘基板的正中心。本发明的支架具有连续阵列梯度纤维结构，可使药物在创面边缘与中心处药物不同浓度的释放。
Description
技术领域
本发明属于仿生支架技术领域，涉及一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架及其制备方法。
背景技术
静电纺丝纳米纤维的高比表面积能够改善敷料与伤口微环境的相互作用，同时，其可模拟细胞外基质的特性使它们在伤口护理、药物递送和生物技术应用方面具有广阔的前景。纳米纤维垫已被证明是现代有效伤口治疗和伤口护理的理想选择，它们在静电纺丝过程中被有效且廉价地生产出来，为现代伤口治疗提供了多种极具前景的策略。
研究表明，通过将药物、生长因子等掺入敷料中，可以更快、更好地修复伤口，而梯度分布的生物活性物质在皮肤创伤的愈合中起着至关重要的作用，梯度分布的生长因子可募集干细胞向创面中心部位迁移，进而分化，促进创面修复。
专利CN107510862B利用静电纺丝结合点电极-环形电极复合接收装置，制备了一种担载梯度浓度生物活性分子的有序纤维支架，但搭接的纤维少，趋化因子负载量少；同时纤维之间的相互作用较弱，支架力学性能差，促伤口愈合性能不佳。
因此，开发一种力学性能优异且可募集干细胞的数量更多的仿生支架是新型皮肤敷料的关键需求。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的方案如下：
一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，由多个纤维集落组成，且多个纤维集落中心处的平均厚度为30～65μm(平均厚度是指，每个纤维集落中心处的厚度相加求平均值得到)；在每个纤维集落中，以纤维集落的中心为圆心，纤维的长度方向是向四周呈放射状分布，且纤维的密度是沿所述放射状方向逐步降低；
所述多个纤维集落的分布方式为：将纤维集落的中心视为该纤维集落，以其中一个纤维集落为中心，其余纤维集落呈若干个环形阵列纤维集落组，每个环形阵列纤维集落组呈圆形分布，各个环形阵列纤维集落组构成的圆形呈同心圆排列，且该同心圆中位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等；所述同心圆的圆心为所述中心；构成每个环形阵列纤维集落组的纤维集落数相等，且每个环形阵列纤维集落组上各个纤维集落沿圆周等角度分布。
任意两个纤维集落中心连线部位的纤维密度高于所述两个纤维集落之间的其他部位，所述连线部位是指两个纤维集落中心之间连成的一条线。
连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的环形阵列纤维集落组有益于力学性能的提升，当支架受到顶破应力时，顶破应力从支架正中心的纤维集落向四周的环形阵列纤维集落组传递，纤维集落的环形阵列分布使顶破应力的传递和分布保持均匀性，不易产生应力集中。
作为优选的技术方案：
如上所述的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，所述多个纤维集落的分布方式中，所述半径差为3～20mm，所述构成每个环形阵列纤维集落组的纤维集落数为3～8个。
如上所述的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，所述多个纤维集落的分布方式中，若干个环形阵列纤维集落组为1～3个环形阵列纤维集落组。
如上所述的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，相邻环形阵列纤维集落组中各个纤维集落的分布角度相同(该角度是指在同一个环形阵列纤维集落组中的相邻2个纤维集落的夹角为α时，而与之相邻的环形阵列纤维集落组中的相邻2个纤维集落的夹角也为α)，且相邻环形阵列纤维集落组中距离最近的纤维集落的中心与所述同心圆的圆心位于一条直线上。这样的排列，纤维是从四周向中心呈现类似线性的取向排列，细胞沿着此方向运动，路径短，能加快细胞的迁移速率，更有利于细胞往中心处募集。
如上所述的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的顶破强力为4～5N(是单梯度纳米纤维支架的2～4倍，单梯度纳米纤维支架的顶破强力为1～2N)，拉伸强力为0.8～1.5N(是单梯度纳米纤维支架的2～4倍，单梯度纳米纤维支架的拉伸强力为0.2～0.5N)。
制备如上所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，先进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜，再进行灭菌和交联处理得到所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架；
所述静电纺丝采用接收装置包括一块印制电路板和一个环形电极(参考专利CN112981556A的术语)；
印制电路板包括一绝缘基板、若干焊盘、两连接器、若干导线和若干针尖电极；
所述焊盘的分布方式为：将焊盘视为一个点，绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成若干个环形阵列焊盘组，每个环形阵列焊盘组呈圆形分布，各个环形阵列焊盘组构成的圆形呈同心圆排列；该同心圆的圆心为所述绝缘基板的正中心；构成每个环形阵列焊盘组的焊盘数相等，且每个环形阵列焊盘组上各个焊盘沿圆周等角度分布；环形电极的底部固定(用双面胶粘到)在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，所述环形电极的内壁构成的圆形与所述各个环形阵列焊盘组构成的圆形均为同心圆且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等；且环形电极(材质为不锈钢)的厚度为2mm，高度为27mm；
针尖电极为导电材料制成的针状结构(长度29mm，直径1mm，一端尖锐)，且每个针尖电极的非针尖所在一端都独立地焊接到1个焊盘上(针尖电极和焊盘是一对一连接的)，且与焊盘电连接；针尖电极的数量和连续阵列梯度纳米纤维仿生支架中纤维集落的数量相同；
连接器位于印制电路板的边缘处，且在印制电路板的对角上分布，且焊盘通过导线与连接器电连接，连接器用于接地。
所述绝缘基板可以位于一般的滚筒接收器(滚筒接收器参考CN113130807A中的记载)上，且绝缘基板上背对环形电极的一侧面与滚筒接收器中滚筒的表面相切，针尖电极的针尖朝向静电纺丝的纺丝针头。印制电路板和滚筒接收器之间还设置绝缘层(绝缘层如无纺布和/或泡沫，目的是为了绝缘)。这样放置是为了方便纳米材料的制备，因为静电纺丝设备本身就包含一个滚筒接收器，印制电路板位于滚筒接收器上方是为了能将其更好的固定住(二者可以用双面胶固定)
作为优选的技术方案：
如上所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，所述焊盘的分布方式中，相邻圆形之间的半径差为3～20mm；每个环形阵列焊盘组的焊盘数为3～8个；所述环形阵列焊盘组的数量为1～3个。
如上所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，所述焊盘的分布方式中，若干个环形阵列焊盘组的数量为1～3个。
如上所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，相邻环形阵列焊盘组中各个焊盘的分布角度相同，且相邻环形阵列焊盘组中距离最近的焊盘与所述同心圆的圆心位于一条直线上。
如上所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)纺丝液的配置：将物质A溶于溶剂中，搅拌24～96h至完全溶解，获得纺丝液；
物质A为聚己内酯、胶原和明胶中的一种以上；纺丝液的质量分数为6～20％；超出改范围无法纺出纤维；
溶剂为六氟异丙醇；
胶原是明胶进一步水解的产物，没有生物活性，分子量较小，能够被蛋白酶分解利用；而明胶是胶原在酸、碱、酶或高温条件下的变性产物，无生物活性，物质A为其他物质如聚乳酸、壳聚糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(参考CN112843220A)也可以。
(2)以步骤(1)配置的纺丝液为原料进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜；
(3)将步骤(2)得到的阵列状梯度纳米纤维膜进行灭菌处理；灭菌是为了在后续细胞实验过程中，细胞不会染菌死亡，确保细胞实验顺利进行；
(4)将步骤(3)处理后的阵列状梯度纳米纤维膜进行交联处理得到交联纳米纤维膜，即所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架。
步骤(3)和步骤(4)对纤维膜中纤维之间形成的排布/结构不会产生影响，是因为在更微观的角度，纤维之间是有相互作用的，比如相互粘结/粘并在一起，导致纤维膜具有良好的结构稳定性，同时，步骤(3)和(4)的处理也相对比较温和，不会对原有结构造成破环。
如上所述的方法，步骤(2)中的静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压为10～20kV，接收距离为10～20cm，灌注速度为0.1～1mL/h，温度为20～30℃，相对湿度为40～60％。
如上所述的方法，步骤(3)中的灭菌处理是将阵列状梯度纳米纤维膜进行紫外照射5～20min。
如上所述的方法，步骤(4)的具体过程为：先将步骤(3)处理后的阵列状梯度纳米纤维膜置于溶液C中，在温度为37℃的条件下进行交联处理；再将阵列状梯度纳米纤维膜取出，加入到浓度为500ng/mL的趋化因子溶液中，并在温度为37℃的条件下进行接枝反应(说明：实现了趋化因子的梯度负载)(反应时间为3h)；趋化因子都可以进行接枝，因为所有趋化因子都含有氨基酸，接枝就是通过氨基酸上的氨基进行反应从而接枝的。
溶液C为是用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液为溶剂、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为溶质配置的交联剂溶液，其中，
趋化因子溶液是将趋化因子溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中得到。所述趋化因子为SDF-1α(中文名为基质细胞衍生因子1α)。
步骤(4)后还用PBS缓冲液冲洗2～3次，以洗去多余的交联剂和未交联的趋化因子。
溶液C中，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的浓度为2.0～2.5mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1.0～1.5mg/mL；
2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的pH为5.0～6.5。
发明原理：
在静电纺丝纤维的接收过程中，针尖电极两两之间以及针尖电极与环形电极之间会形成水平方向上的电场强度分量，使得纤维可以搭接在针与针之间、针与环形电极之间，形成取向结构。同时，由于针尖处的电场强度最大，使得每个针尖都会形成一个纤维集落中心，所得纤维集落与针尖电极一样呈阵列状分布。每个纤维集落从中心向四周纤维密度逐渐降低，形成连续变化的梯度。
因为本发明制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架在受力时应力会从整个支架中心处的纤维集落中心向四周的纤维集落中心传递扩散，把应力分担掉，然后所分担的应力又可以沿着该纤维集落中心向整个支架的边缘传递，分担应力。同时，两两纤维集落中心之间形成的纤维束也能起到承担应力的作用；因此本发明的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架力学性能相较于现有技术有所提高。
本发明制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架从点中心纤维集落中心向四周纤维是放射状取向分布的，所以纤维的密度也是从点中心向四周梯度分布的，当纤维担载上药物以后，因为点中心的纤维密度高，所以担载的药物就多，如果放到创面上，就会出现中心处药物释放浓度高于边缘，而干细胞会从向药物浓度高的地方迁移，因此，本发明的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架可诱导更多的干细胞到创面中心。
有益效果
(1)本发明的仿生支架具有连续阵列梯度纤维结构，可实现药物在创面边缘与中心处药物不同浓度的释放，可有效响应创面MMP-9用于抑制炎症与镇痛，同时可促进干细胞募集，促进成纤维细胞生长与粘附，增加血管生成，提高创面损伤修复效果；
(2)本发明的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的制备方法，使得所制备的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的大小在一定范围内可控，可以通过针尖电极的圆形排布直径和环形电极的直径来控制，连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的直径范围由环形电极的外径大小控制；
(3)本发明的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的制备方法，能加快连续阵列梯度纳米纤维中残余正电荷的导出速度，从而在一定程度上延长连续阵列梯度纳米纤维的接收时间，获得更厚的仿生支架；
(4)本发明的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的制备方法，提供的静电纺丝纤维接收装置使用的零部件简单，易组装。
附图说明
图1为本发明实施例5A的接收装置的结构示意图(正视图)；
其中，1-印制电路板，2-连接器，3-环形电极，4-针尖电极，5-导线，6-焊盘。
图2为本发明实施例5A的接收装置的结构示意图(顶视图)；
图3为本发明实施例5A的接收装置的结构示意图(底视图)；
图4为本发明的实施例5B中连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的纤维集落及纤维的分布图；
图5为本发明的支架在干细胞培养7天后的细胞迁移的部分荧光图像；其中，GF-9为实施例5B制得的支架，GF-1为对比例2制得的支架，RF为对比例1制得的纤维膜；
图6为本发明的支架在1天、4天和7天的培养下，细胞迁移数量的定量统计图；其中，GF-9为实施例5B制得的支架，GF-1为对比例2制得的支架，RF为对比例1制得的纤维膜；
图7为本发明的支架的顶破强力对比图，其中，GF-9为实施例5B制得的支架，GF-1为对比例2制得的支架，RF为对比例1制得的纤维膜。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中的可募集干细胞的数量的测试方法为：四周担载干细胞的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架在CO2培养箱中培养7天后，利用倒置荧光显微镜拍摄成像，随后采用ImageJ软件统计干细胞的募集数量。
实施例1A
一种静电纺丝用接收装置，包括一块印制电路板和一个材质为不锈钢的环形电极；
印制电路板由一绝缘基板、若干焊盘、两个连接器、若干导线和若干针尖电极组成；
所述若干焊盘在绝缘基板上的分布方式为：将焊盘视为一个点，绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成2个环形阵列焊盘组，每个环形阵列焊盘组呈圆形分布，各个环形阵列焊盘组构成的圆形呈同心圆排列；所述同心圆的圆心为所述绝缘基板的正中心；构成每个环形阵列焊盘组的焊盘数相等，为3个，且每个环形阵列焊盘组上各个焊盘沿圆周等角度分布；且相邻环形阵列焊盘组中各个焊盘的分布角度相同，相邻环形阵列焊盘组中距离最近的焊盘与所述同心圆的圆心位于一条直线上；环形电极的底部固定在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，所述环形电极的内壁构成的圆形与所述各个环形阵列焊盘组构成的圆形均为同心圆且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，均为3mm。
针尖电极为导电材料制成的针状结构(长度29mm，直径1mm，一端尖锐)，且每个针尖电极的非针尖所在一端都独立地焊接到1个焊盘上，且与焊盘电连接；
连接器位于印制电路板的边缘处，且在印制电路板的对角上分布，且焊盘通过导线与连接器电连接，用于接地；
上述绝缘基板位于滚筒接收器(滚筒接收器参考CN113130807A中的记载)上，且绝缘基板上背对环形电极的一侧面与滚筒接收器中滚筒的表面相切，针尖电极的针尖朝向静电纺丝的纺丝针头。印制电路板和滚筒接收器之间还设置无纺布作为绝缘层。
实施例2A
一种静电纺丝用接收装置，包括一块印制电路板和一个材质为不锈钢的环形电极；
印制电路板由一绝缘基板、若干焊盘、两个连接器、若干导线和若干针尖电极组成；
所述若干焊盘在绝缘基板上的分布方式为：将焊盘视为一个点，绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成2个环形阵列焊盘组，每个环形阵列焊盘组呈圆形分布，各个环形阵列焊盘组构成的圆形呈同心圆排列；所述同心圆的圆心为所述绝缘基板的正中心；构成每个环形阵列焊盘组的焊盘数相等，为6个，且每个环形阵列焊盘组上各个焊盘沿圆周等角度分布；且相邻环形阵列焊盘组中各个焊盘的分布角度相同，相邻环形阵列焊盘组中距离最近的焊盘与所述同心圆的圆心位于一条直线上；环形电极的底部固定在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，所述环形电极的内壁构成的圆形与所述各个环形阵列焊盘组构成的圆形均为同心圆且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，均为3mm。
针尖电极为导电材料制成的针状结构(长度29mm，直径1mm，一端尖锐)，且每个针尖电极的非针尖所在一端都独立地焊接到1个焊盘上，且与焊盘电连接；
连接器位于印制电路板的边缘处，且在印制电路板的对角上分布，且焊盘通过导线与连接器电连接，用于接地；
上述绝缘基板位于滚筒接收器(滚筒接收器参考CN113130807A中的记载)上，且绝缘基板上背对环形电极的一侧面与滚筒接收器中滚筒的表面相切，针尖电极的针尖朝向静电纺丝的纺丝针头。印制电路板和滚筒接收器之间还设置无纺布作为绝缘层。
实施例3A
一种静电纺丝用接收装置，包括一块印制电路板和一个材质为不锈钢的环形电极；
印制电路板由一绝缘基板、若干焊盘、两个连接器、若干导线和若干针尖电极组成；
所述若干焊盘在绝缘基板上的分布方式为：将焊盘视为一个点，绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成1个环形阵列焊盘组；所述圆形的圆心为所述绝缘基板的正中心；构成该环形阵列焊盘组的焊盘数为8个，且该环形阵列焊盘组上各个焊盘沿圆周等角度分布；环形电极的底部固定在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，所述环形电极的内壁构成的圆形与该环形阵列焊盘组构成的圆形形成同心圆且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，均为11mm。
针尖电极为导电材料制成的针状结构(长度29mm，直径1mm，一端尖锐)，且每个针尖电极的非针尖所在一端都独立地焊接到1个焊盘上，且与焊盘电连接；
连接器位于印制电路板的边缘处，且在印制电路板的对角上分布，且焊盘通过导线与连接器电连接，用于接地；
上述绝缘基板位于滚筒接收器(滚筒接收器参考CN113130807A中的记载)上，且绝缘基板上背对环形电极的一侧面与滚筒接收器中滚筒的表面相切，针尖电极的针尖朝向静电纺丝的纺丝针头。印制电路板和滚筒接收器之间还设置泡沫作为绝缘层。
实施例4A
一种静电纺丝用接收装置，包括一块印制电路板和一个材质为不锈钢的环形电极；
印制电路板由一绝缘基板、若干焊盘、两个连接器、若干导线和若干针尖电极组成；
所述若干焊盘在绝缘基板上的分布方式为：将焊盘视为一个点，绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成3个环形阵列焊盘组，每个环形阵列焊盘组呈圆形分布，各个环形阵列焊盘组构成的圆形呈同心圆排列；所述同心圆的圆心为所述绝缘基板的正中心；构成每个环形阵列焊盘组的焊盘数相等，为4个，且每个环形阵列焊盘组上各个焊盘沿圆周等角度分布；且相邻环形阵列焊盘组中各个焊盘的分布角度相同，相邻环形阵列焊盘组中距离最近的焊盘与所述同心圆的圆心位于一条直线上；环形电极的底部固定在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，所述环形电极的内壁构成的圆形与所述各个环形阵列焊盘组构成的圆形均为同心圆且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，均为20mm。
针尖电极为导电材料制成的针状结构(长度29mm，直径1mm，一端尖锐)，且每个针尖电极的非针尖所在一端都独立地焊接到1个焊盘上，且与焊盘电连接；
连接器位于印制电路板的边缘处，且在印制电路板的对角上分布，且焊盘通过导线与连接器电连接，用于接地；
上述绝缘基板位于滚筒接收器(滚筒接收器参考CN113130807A中的记载)上，且绝缘基板上背对环形电极的一侧面与滚筒接收器中滚筒的表面相切，针尖电极的针尖朝向静电纺丝的纺丝针头。印制电路板和滚筒接收器之间还设置泡沫作为绝缘层。
实施例5A
一种静电纺丝用接收装置，如图1～3所示，包括一块印制电路板1和一个材质为不锈钢的环形电极3；
印制电路板由一绝缘基板、若干焊盘6、两个连接器2、若干导线5和若干针尖电极4组成；
所述若干焊盘在绝缘基板上的分布方式为：将焊盘视为一个点，绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成1个环形阵列焊盘组，该环形阵列焊盘组呈圆形分布，该环形阵列焊盘组构成的圆形的半径为6mm；该圆形的圆心为所述绝缘基板的正中心；构成该环形阵列焊盘组的焊盘数为8个，且每个环形阵列焊盘组上各个焊盘沿圆周等角度分布；环形电极的底部固定在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，所述环形电极的内壁构成的圆形与该环形阵列焊盘组构成的圆形形成同心圆且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，均为6mm。
针尖电极为导电材料制成的针状结构(长度29mm，直径1mm，一端尖锐)，且每个针尖电极的非针尖所在一端都独立地焊接到1个焊盘上，且与焊盘电连接；
连接器位于印制电路板的边缘处，且在印制电路板的对角上分布，且焊盘通过导线与连接器电连接，用于接地；
上述绝缘基板位于滚筒接收器(滚筒接收器参考CN113130807A中的记载)上，且绝缘基板上背对环形电极的一侧面与滚筒接收器中滚筒的表面相切，针尖电极的针尖朝向静电纺丝的纺丝针头。印制电路板和滚筒接收器之间还设置无纺布作为绝缘层。
实施例1B
一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的制备方法，步骤如下：
(1)纺丝液的配置：将聚己内酯溶于六氟异丙醇中，搅拌72h至完全溶解，获得质量分数为13％的纺丝液；
(2)以步骤(1)配置的纺丝液为原料进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜；其中，静电纺丝采用的接收装置为实施例1A中所设计的装置；且静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压为17kV，接收距离(是指喷丝口和针尖电极的针尖处的距离)为16cm，灌注速度为0.5mL/h，温度为30℃，相对湿度为50％。
(3)将步骤(2)得到的阵列状梯度纳米纤维膜进行紫外照射20min，目的是灭菌处理；
(4)将步骤(3)处理后的阵列状梯度纳米纤维膜置于溶液C中，在温度为37℃的条件下进行交联处理；其中，溶液C为是用MES缓冲液(pH为6)为溶剂、EDC和NHS为溶质配置的交联剂溶液，溶液C中，EDC的浓度为2.2mg/mL，NHS的浓度为1.2mg/mL；
(5)将步骤(4)中的阵列状梯度纳米纤维膜取出，加入到浓度为500ng/mL的趋化因子溶液中，并在温度为37℃的条件下进行接枝反应(反应时间为3h)；
其中，趋化因子溶液是将SDF-1α溶于MES缓冲液(pH为6)中得到；
(6)用PBS缓冲液冲洗步骤(5)中的纤维膜2次，以洗去多余的交联剂和未交联的趋化因子，得到交联纳米纤维膜，即所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架。
制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架由多个纤维集落组成，且多个纤维集落中心处的平均厚度为35μm；在每个纤维集落中，以纤维集落的中心为圆心，纤维的长度方向是向四周呈放射状分布，且纤维的密度是沿所述放射状方向逐步降低；
多个纤维集落的分布是连续的，此时将纤维集落的中心视为该纤维集落，可以看出，多个纤维集落的分布方式为：以其中一个纤维集落为中心，其余纤维集落呈2个环形阵列纤维集落组，每个环形阵列纤维集落组呈圆形分布，各个环形阵列纤维集落组构成的圆形呈同心圆排列，且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，为3cm；所述同心圆的圆心为所述中心；构成每个环形阵列纤维集落组的纤维集落数相等，为3个，且每个环形阵列纤维集落组上各个纤维集落沿圆周等角度分布；相邻环形阵列纤维集落组中各个纤维集落的分布角度相同，且相邻环形阵列纤维集落组中距离最近的纤维集落的中心与所述同心圆的圆心位于一条直线上。
该连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的性能指标见表1。
实施例2B
与实施例1B的制备步骤基本相同，不同之处仅在于采用的是实施例2A设计的接收装置，制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架由多个纤维集落组成，且多个纤维集落中心处的平均厚度为63μm；在每个纤维集落中，以纤维集落的中心为圆心，纤维的长度方向是向四周呈放射状分布，且纤维的密度是沿所述放射状方向逐步降低；
多个纤维集落的分布是连续的，此时将纤维集落的中心视为该纤维集落，可以看出：以其中一个纤维集落为中心，其余纤维集落呈2个环形阵列纤维集落组，每个环形阵列纤维集落组呈圆形分布，各个环形阵列纤维集落组构成的圆形呈同心圆排列，且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，为3cm；所述同心圆的圆心为所述中心；构成每个环形阵列纤维集落组的纤维集落数相等，为6个，且每个环形阵列纤维集落组上各个纤维集落沿圆周等角度分布；相邻环形阵列纤维集落组中各个纤维集落的分布角度相同，且相邻环形阵列纤维集落组中距离最近的纤维集落的中心与所述同心圆的圆心位于一条直线上。
该连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的性能指标见表1。
这是因为针电极多了，就会加快电荷的导出，就不会让纤维间的排斥力很大，纤维就能更多的沉积到接收装置上。
实施例3B
一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的制备方法，步骤如下：
(1)纺丝液的配置：将胶原溶于六氟异丙醇中，搅拌48h至完全溶解，获得质量分数为9％的纺丝液；
(2)以步骤(1)配置的纺丝液为原料进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜；其中，静电纺丝采用的接收装置为实施例3A中所设计的装置；且静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压为20kV，接收距离为20cm，灌注速度为0.1mL/h，温度为25℃，相对湿度为60％。
(3)将步骤(2)得到的阵列状梯度纳米纤维膜进行紫外照射15min，目的是灭菌处理；
(4)将步骤(3)处理后的阵列状梯度纳米纤维膜置于溶液C中，在温度为37℃的条件下进行交联处理；其中，溶液C为是用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(pH为6)为溶剂、EDC和NHS为溶质配置的交联剂溶液，溶液C中，EDC的浓度为2.2mg/mL，NHS的浓度为1.2mg/mL；
(5)将步骤(4)中的阵列状梯度纳米纤维膜取出，加入到浓度为500ng/mL的趋化因子溶液中，并在温度为37℃的条件下进行接枝反应(反应时间为3h)；
其中，趋化因子溶液是将SDF-1α溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH为6)中得到。
(6)用PBS缓冲液冲洗步骤(5)中的纤维膜2次，以洗去多余的交联剂和未交联的趋化因子，得到交联纳米纤维膜，即所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架。
制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架由多个纤维集落组成，且多个纤维集落中心处的平均厚度为28μm；在每个纤维集落中，以纤维集落的中心为圆心，纤维的长度方向是向四周呈放射状分布，且纤维的密度是沿所述放射状方向逐步降低；
多个纤维集落的分布是连续的，此时将纤维集落的中心视为该纤维集落，可以看出：以其中一个纤维集落为中心，其余纤维集落呈1个环形阵列纤维集落组，该环形阵列纤维集落组呈圆形分布，该圆形的半径为11cm，该圆心为所述中心；构成该环形阵列纤维集落组的纤维集落数为8个，且该环形阵列纤维集落组上各个纤维集落沿圆周等角度分布。
该连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的性能指标见表1。
实施例4B
一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的制备方法，步骤如下：
(1)纺丝液的配置：将明胶溶于六氟异丙醇中，搅拌24h至完全溶解，获得质量分数为5％的纺丝液；
(2)以步骤(1)配置的纺丝液为原料进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜；其中，静电纺丝采用的接收装置为实施例4A中所设计的装置；且静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压为10kV，接收距离为10cm，灌注速度为1mL/h，温度为20℃，相对湿度为45％。
(3)将步骤(2)得到的阵列状梯度纳米纤维膜进行紫外照射5min，目的是灭菌处理；
(4)将步骤(3)处理后的阵列状梯度纳米纤维膜置于溶液C中，在温度为37℃的条件下进行交联处理；其中，溶液C为是用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(pH为6)为溶剂、EDC和NHS为溶质配置的交联剂溶液，溶液C中，EDC的浓度为2.2mg/mL，NHS的浓度为1.2mg/mL；
(5)将步骤(4)中的阵列状梯度纳米纤维膜取出，加入到浓度为500ng/mL的趋化因子溶液中，并在温度为37℃的条件下进行接枝反应(反应时间为3h)；
其中，趋化因子溶液是将SDF-1α溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH为6)中得到。
(6)用PBS缓冲液冲洗步骤(5)中的纤维膜2次，以洗去多余的交联剂和未交联的趋化因子，得到交联纳米纤维膜，即所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架。
制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架由多个纤维集落组成，且多个纤维集落中心处的平均厚度为34μm；在每个纤维集落中，以纤维集落的中心为圆心，纤维的长度方向是向四周呈放射状分布，且纤维的密度是沿所述放射状方向逐步降低；
多个纤维集落的分布是连续的，此时将纤维集落的中心视为该纤维集落，可以看出：以其中一个纤维集落为中心，其余纤维集落呈3个环形阵列纤维集落组，每个环形阵列纤维集落组呈圆形分布，各个环形阵列纤维集落组构成的圆形呈同心圆排列，且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等，为20cm；所述同心圆的圆心为所述中心；构成每个环形阵列纤维集落组的纤维集落数相等，为6个，且每个环形阵列纤维集落组上各个纤维集落沿圆周等角度分布；相邻环形阵列纤维集落组中各个纤维集落的分布角度相同，且相邻环形阵列纤维集落组中距离最近的纤维集落的中心与所述同心圆的圆心位于一条直线上。
该连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的性能指标见表1。
实施例5B
一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的制备方法，步骤如下：
(1)纺丝液的配置：将聚己内酯/胶原(聚己内酯与胶原的质量比为7：3)溶于六氟异丙醇中，搅拌96h至完全溶解，获得质量分数为18％的纺丝液；
(2)以步骤(1)配置的纺丝液为原料进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜；其中，静电纺丝采用的接收装置为实施例1A中所设计的装置；且静电纺丝的工艺参数为：纺丝电压为15kV，接收距离为15cm，灌注速度为0.2mL/h，温度为25℃，相对湿度为40％。
(3)将步骤(2)得到的阵列状梯度纳米纤维膜进行紫外照射10min，目的是灭菌处理；
(4)将步骤(3)处理后的阵列状梯度纳米纤维膜置于溶液C中，在温度为37℃的条件下进行交联处理；其中，溶液C为是用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(pH为6)为溶剂、EDC和NHS为溶质配置的交联剂溶液，溶液C中，EDC的浓度为2.2mg/mL，NHS的浓度为1.2mg/mL；
(5)将步骤(4)中的阵列状梯度纳米纤维膜取出，加入到浓度为500ng/mL的趋化因子溶液中，并在温度为37℃的条件下进行接枝反应(反应时间为3h)；
其中，趋化因子溶液是将SDF-1α溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(pH为6)中得到。
(6)用PBS缓冲液冲洗步骤(5)中的纤维膜2次，以洗去多余的交联剂和未交联的趋化因子，得到交联纳米纤维膜，即所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架。
制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架由9纤维集落组成，且多个纤维集落中心处的平均厚度为30μm；在每个纤维集落中，以纤维集落的中心为圆心，纤维的长度方向是向四周呈放射状分布，且纤维的密度是沿所述放射状方向逐步降低；
如图4所示，制得的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架中的9个纤维集落的分布是连续的，此时将纤维集落的中心视为该纤维集落，可以看出：以其中一个纤维集落为中心，其余纤维集落呈1个环形阵列纤维集落组，该环形阵列纤维集落组呈圆形分布，该圆形的半径为6cm；该圆心为所述中心；构成该环形阵列纤维集落组的纤维集落数为8个，且各个纤维集落沿圆周等角度分布。
该连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的性能指标见表1。
表1
对比例1
一种纳米纤维仿生支架的制备方法，其制备步骤基本同实施例5B，不同之处在于步骤(2)中静电纺丝采用的接收装置仅为CN113130807A中的记载滚筒接收器，此时得到的纤维膜仅仅是一种无序堆叠的纤维膜，保持相同的纺丝条件，控制得到的纤维膜的平均厚度与实施例5B保持基本相同的结构。
对比例2
一种纳米纤维仿生支架的制备方法，其制备步骤基本同实施例5B，不同之处在于步骤(2)中静电纺丝采用的接收装置为参考专利CN107510862B所制备的接收装置，此时得到的纤维膜仅有一个纤维集落构成(可以称为“单梯度纳米纤维仿生支架”)，且纤维膜的平均厚度与实施例5B保持基本相同，该单梯度纳米纤维仿生支架的顶破强力为1.8N，拉伸强力为0.4N，可募集干细胞的数量为440个。
将实施例5B、对比例1和对比例2中的制得的支架或者纤维膜进行性能比对：
为了模拟人体创伤处的修复过程，而正常修复就是创缘部位的干细胞向创面中心迁移促修复，本发明的目的是让募集到中心的干细胞更多，从而加速修复。所以边缘区域是一开始种植干细胞的地方，而考察干细胞从边缘向中心迁移的效果。将三者的边缘均担载干细胞(干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，实验中所用干细胞从人脐带间充质干细胞自提获得)，然后在CO2培养箱中培养1天、4天和7天后，对7天后的样品采用倒置荧光显微镜拍摄成像；其中，7天后的部分细胞迁移图像如图5所示；统计在7天的培养下，细胞迁移数量，如图6所示，从图5～图6中可以看出：实施例5B中的支架能够更加高效地迁移干细胞到中心位置，而且募集干细胞的数量也明显优于对比例1和对比例2，这是因为连续阵列梯度纳米纤维仿生支架相对于对比例1来说，纤维呈现取向排列结构且趋化因子浓度梯度分布，可以促进干细胞迁移；连续阵列梯度纳米纤维仿生支架相对于对比例2来说，在纤维取向排列的基础上，纤维集落的增加使支架取向排列的纤维增多，可担载更多的趋化因子，进一步更快地诱导干细胞迁移到支架中心处。
将实施例5B、对比例1和对比例2中的制得的支架或者纤维膜进行顶破强力测试，如图7所示，可以看出：实施例5B中的支架的顶破强力明显高于对比例1和对比例2，这是因为连续阵列梯度纳米纤维仿生支架在受力时应力会从整个支架中心处的纤维集落中心向四周的纤维集落中心传递扩散，把应力分担掉，然后所分担的应力又可以沿着该纤维集落中心向整个支架的边缘传递，分担应力。同时，两两纤维集落中心之间形成的纤维束也能起到承担应力的作用。
Claims (10)
1.一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，其特征是：由多个纤维集落组成，且多个纤维集落中心处的平均厚度为30~65μm；在每个纤维集落中，以纤维集落的中心为圆心，纤维的长度方向是向四周呈放射状分布，且纤维的密度是沿所述放射状方向逐步降低；
所述多个纤维集落的分布方式为：以其中一个纤维集落为中心，其余纤维集落呈若干个环形阵列纤维集落组，每个环形阵列纤维集落组呈圆形分布，各个环形阵列纤维集落组构成的圆形呈同心圆排列，且该同心圆中位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等；所述同心圆的圆心为所述中心；构成每个环形阵列纤维集落组的纤维集落数相等，且每个环形阵列纤维集落组上各个纤维集落沿圆周等角度分布；
连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的顶破强力为4~5N，是单梯度纳米纤维支架的2~4倍；连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的拉伸强力为0.8~1.5N，是单梯度纳米纤维支架的2~4倍。
2.根据权利要求1所述的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，其特征在于，所述多个纤维集落的分布方式中，所述半径差为3~20mm，所述构成每个环形阵列纤维集落组的纤维集落数为3~8个。
3.根据权利要求1所述的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，其特征在于，所述多个纤维集落的分布方式中，若干个环形阵列纤维集落组为1~3个环形阵列纤维集落组。
4.根据权利要求1所述的连续阵列梯度纳米纤维仿生支架，其特征在于，相邻环形阵列纤维集落组中各个纤维集落的分布角度相同，且相邻环形阵列纤维集落组中距离最近的纤维集落的中心与所述同心圆的圆心位于一条直线上。
5.制备如权利要求1~4中任一项所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，其特征是：先进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜，再进行灭菌和交联处理得到所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架；
所述静电纺丝采用接收装置包括一块印制电路板和一个环形电极；
印制电路板包括一绝缘基板、若干焊盘、两连接器、若干导线和若干针尖电极；
所述焊盘的分布方式为：将焊盘视为一个点，绝缘基板的正中心分布一个焊盘，其余焊盘构成若干个环形阵列焊盘组，每个环形阵列焊盘组呈圆形分布，各个环形阵列焊盘组构成的圆形呈同心圆排列；该同心圆的圆心为所述绝缘基板的正中心；构成每个环形阵列焊盘组的焊盘数相等，且每个环形阵列焊盘组上各个焊盘沿圆周等角度分布；环形电极的底部固定在绝缘基板上，且从环形电极的顶部视角看，所述环形电极的内壁构成的圆形与所述各个环形阵列焊盘组构成的圆形均为同心圆且位于最内圈的圆形的半径和相邻圆形之间的半径差相等；
针尖电极为导电材料制成的针状结构，且每个针尖电极的非针尖所在一端都独立地焊接到1个焊盘上，且与焊盘电连接；针尖电极的数量和连续阵列梯度纳米纤维仿生支架中纤维集落的数量相同；
连接器位于印制电路板的边缘处，且焊盘通过导线与连接器电连接，用于接地。
6.根据权利要求5所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，其特征在于，所述焊盘的分布方式中，相邻圆形之间的半径差为3~20mm；每个环形阵列焊盘组的焊盘数为3~8个。
7.根据权利要求5所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，其特征在于，所述焊盘的分布方式中，若干个环形阵列焊盘组的数量为1~3个。
8.根据权利要求5所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，其特征在于，相邻环形阵列焊盘组中各个焊盘的分布角度相同，且相邻环形阵列焊盘组中距离最近的焊盘与所述同心圆的圆心位于一条直线上。
9.根据权利要求5所述的一种连续阵列梯度纳米纤维仿生支架的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
（1）纺丝液的配置：将物质A溶于溶剂中，搅拌24~96h至完全溶解，获得纺丝液；
物质A为聚己内酯、胶原和明胶中的一种以上；纺丝液的质量分数为6~20%；
（2）以步骤（1）配置的纺丝液为原料进行静电纺丝得到阵列状梯度纳米纤维膜；
（3）将步骤（2）得到的阵列状梯度纳米纤维膜进行灭菌处理；
（4）将步骤（3）处理后的阵列状梯度纳米纤维膜进行交联处理得到交联纳米纤维膜，即所述连续阵列梯度纳米纤维仿生支架。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（4）的具体过程为：先将步骤（3）处理后的阵列状梯度纳米纤维膜置于溶液C中，进行交联处理；再将阵列状梯度纳米纤维膜取出，加入到趋化因子溶液中，并进行接枝反应；
溶液C为是用2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液为溶剂、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为溶质配置的交联剂溶液，其中，
趋化因子溶液是将趋化因子溶于2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中得到；
溶液C中，1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺的浓度为2.0~2.5mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1.0~1.5mg/mL；
2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液的pH为5.0~6.5。
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