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CN113906135A - 使用能量转移染料对边合成边测序 - Google Patents

使用能量转移染料对边合成边测序 Download PDF

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CN113906135A
CN113906135A CN202080040393.2A CN202080040393A CN113906135A CN 113906135 A CN113906135 A CN 113906135A CN 202080040393 A CN202080040393 A CN 202080040393A CN 113906135 A CN113906135 A CN 113906135A
Authority
CN
China
Prior art keywords
anchor
dye
nucleotide
nucleotide analogs
cleavable linker
Prior art date
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Pending
Application number
CN202080040393.2A
Other languages
English (en)
Inventor
靖岳·鞠
希夫·库玛
詹姆斯·罗素
李晓旭
斯提芬·杰克什
敏晨·钱
传娟·陶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Columbia University in the City of New York
Original Assignee
Columbia University in the City of New York
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Columbia University in the City of New York filed Critical Columbia University in the City of New York
Publication of CN113906135A publication Critical patent/CN113906135A/zh
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

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Abstract

本发明提供了核苷酸类似物和其用于使用能量转移染料对边合成边测序的方法。在本发明的实施例中，荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料。

Description

使用能量转移染料对边合成边测序
本申请要求于2019年4月2日提交的美国临时申请第62/828,031号的优先权，所述美国临时申请的内容特此通过引用并入。
在此整个申请中，引用了各种出版物和专利。这些参考的完整引文可以在权利要求书之前的说明书结尾处找到。这些出版物和专利的公开内容以其全文通过引用特此并入本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的现状。
背景技术
DNA测序是生物和医学研究中的基本工具，并且对于个性化医疗范式而言尤其重要。为了最终实现1,000美元基因组的目标，已经研究了各种新的DNA测序方法；主要的方法是边合成边测序(SBS)，这是一种在聚合酶反应期间确定DNA序列的方法(Hyman,1988；Ronaghi等人,1998；Ju等人,2003；Li,2003；Braslavsky等人,2003；Ruparel等人,2005；Margulies等人,2005；Ju等人,2006；Wu等人,2007；Guo等人,2008；Bentley等人,2008；Harris等人,2008；Eid等人,2009；Rothberg等人,2011)。
本文呈现了两类新型的基于能量转移的边合成边测序方法。
发明内容
本文中公开的发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到步骤b中所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；
d)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；
e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
f)从步骤b)的任何并入的核苷酸类似物中切割所述标记和所述封闭基团；
g)其中如果未在步骤d)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到f)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；
h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，
由此确定所述核酸模板的序列。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过不可切割的或不同的可切割接头连接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述碱基的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到并入步骤b中的所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定由于并入所述荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使并入的标记的核苷酸类似物与切割所述可切割接头的切割剂接触，以从所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的一种标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述可切割标记；
g)补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤f)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失，以部分地或完全地鉴定所述并入的核苷酸；
h)使用切割所述可切割接头的切割剂迭代地重复步骤f)和g)，以从不同的标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述标记；
i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定在步骤b)中并入的所述标记的核苷酸类似物；以及
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的荧光标记，
并且迭代地执行步骤b到j以获得所述核酸模板的序列。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过所述封闭基团远侧的不可切割接头连接到所述碱基的锚定物，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有不同的锚定物和相同的可切割接头；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物不同的锚定物和相同的接头；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的四种锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；
g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于所述锚定物结合分子与并入步骤b)中的所述锚定物标记的核苷酸类似物结合而产生的任何荧光共振能量转移(FRET)信号；
h)使用对剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子一个接一个地迭代地重复步骤f)和g)，其中相同的荧光染料附接到所有四个锚定物结合分子上；
i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
j)使所述并入的与切割剂接触以从步骤b)的所述并入的核苷酸类似物中切割所述封闭基团和所述锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以由此获得所述核酸模板的序列。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基和通过相同的可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧，并且所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过相同的可切割接头附接到所述封闭基团的远侧；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头附接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同，并且其中剩余的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头是相同和不同的可切割基团；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；
g)鉴定由于步骤f)中的所述标记而产生的新生成的FRET信号，以部分地鉴定步骤b)中的并入的核苷酸类似物；
h)使用对所述第二锚定物具有特异性的第二荧光标记的锚定物结合分子重复步骤e和f；
i)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述特异性可切割剂切割所述可切割接头中的一个可切割接头但不切割任何剩余接头；
j)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤i)中执行的切割而导致的FRET信号的损失；
k)通过比较在步骤g)和j)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
l)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割剩余的锚定物和荧光标记；
以及迭代地执行步骤b)到l)以获得所述核酸模板的序列。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶、四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种标记的核苷酸类似物是：
(i)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的相同锚定物；
(ii)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第一可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头连接到所述碱基的相同锚定物；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是用于所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记的能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定由于并入任何荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所述荧光标记的核苷酸类似物上的荧光标记相同；
g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定任何新生成的FRET信号以部分地鉴定由于在步骤f)中执行的标记而并入的核苷酸；
h)使用特异性切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
i)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤g)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失；
j)通过比较在步骤g)和i)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
k)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；
以及迭代地执行步骤b)到k)以获得所述核酸模板的序列。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板和核酸聚合酶；
b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，并且同时或之后立即提供四种包括附接到所述核苷酸类似物的不同荧光染料的不可并入的核苷酸类似物，其中附接到所述不可并入的核苷酸类似物的荧光染料是用于附接到所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物的荧光染料的能量转移供体或受体染料；或者
(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，并且同时或之后立即提供四种包括附接到所述核苷酸类似物的不同荧光染料的不可并入的核苷酸类似物，其中附接到所述不可并入的核苷酸类似物的荧光染料是用于附接到所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物的荧光染料的能量转移供体或受体染料；
c)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；
d)从用所述荧光标记的核苷酸类似物延伸的任何引物中切割所述染料和所述封闭基团；
e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
f)其中如果未在步骤c)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到e)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；
g)用步骤b中描述的所述四种荧光标记的核苷酸中的第二种荧光标记的核苷酸来重复步骤b)到e)；
h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，
由此获得所述核酸模板的序列。
本发明还提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过不可切割的或不同的可切割接头连接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述碱基的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)与步骤b)同时或之后立即提供四种不同的荧光标记的不可并入的核苷酸类似物(A，C，T，G)，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的所述能量转移供体或受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)使用切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述切割剂特异性地切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
f)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤e)中执行的切割而导致的任何荧光损失，以部分地鉴定并入的核苷酸；
g)使用特异性地一个接一个切割任何剩余的接头的可切割剂迭代地重复步骤e)和f)；
h)通过比较在步骤f)和i)的多次迭代中获得的结果来确定在步骤b)中并入的特异性核苷酸类似物；
i)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸任何剩余的引物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过所述封闭基团远侧的不可切割接头连接到所述碱基的锚定物，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有不同的锚定物和相同的可切割接头；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物不同的锚定物和相同的接头；
c)与步骤b)同时或之后立即提供四种不同的锚定物标记的不可并入的核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述能量转移供体或受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)用荧光标记的锚定物结合分子标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与直接标记的核苷酸或核苷酸类似物上的荧光标记相同，并且其中所述锚定物结合分子与步骤b)的特异性核苷酸类似物的锚定物结合；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的荧光信号以部分地鉴定由于在步骤e)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用对剩余的锚定物中的每一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子一个接一个地重复步骤e)和f)，其中相同的荧光染料附接到所有四个锚定物结合分子上；
h)通过比较在步骤f)和g)的多次迭代中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
i)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余的引物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
以及迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基和通过相同的可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧，并且所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过相同的可切割接头附接到所述封闭基团的远侧；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头附接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同，并且其中剩余的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头是相同和不同的可切割基团；
c)与步骤b)同时或之后立即加入所有四种荧光标记的不可并入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体染料，所述能量转移供体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的能量转移受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所有锚定物结合分子上的荧光标记相同；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的荧光信号以部分地或完全地鉴定由于在步骤d)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用对第二锚定物具有特异性的第二荧光标记的锚定物结合分子重复步骤e)和f)；
h)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述可切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
i)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤h)中执行的切割而导致的荧光损失；
j)通过比较在步骤f)和i)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
k)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余的引物；
l)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到l)以获得所述核酸模板的序列。
一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶、四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种标记的核苷酸类似物是：
(i)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的相同锚定物；或者
(ii)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第一可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头连接到所述碱基的相同锚定物；
c)与步骤b同时或之后立即加入所有四种荧光标记的不可并入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的所述能量转移供体或受体染料；
d)在使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余引物后，鉴定由于并入任何荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
e)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所述荧光标记的核苷酸类似物上的荧光标记相同；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的FRET信号以部分地鉴定由于在步骤e)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述可切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割正交接头；
h)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤g)中执行的切割而导致的任何FRET信号损失，以完全地鉴定并入的核苷酸；
i)通过比较在步骤f)和h)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
附图说明
图1A-1D：用于本文中公开的测序方法中的一些测序方法的通用核苷酸结构。在方案P3、P4、P5、P6和U3、U4、U5、U6中，在虚拟终止子的碱基与延伸阻断剂之间(或在阻断剂的近侧)将需要可切割接头，并且对于虚拟终止子中的四个(P5，P6，U5，U6)或三个(P3，P4，U3，U4)，在阻断剂与染料或锚定物之间(或在阻断剂的远侧)将需要第二(不同的)可切割接头。应当注意，阻断剂与碱基之间或阻断剂与染料/锚定物之间不必存在直接的线性连接。因此，在通用结构中，阻断剂示出为从接头分支。必要的是，近侧而不是远侧接头的切割去除阻断剂。除了用于用本文中呈现的染料和锚定物标记的位置之外，这些染料或锚定物部分也可以附接到末端磷酸。
图2：使用核苷酸可逆终止子上的受体染料和聚合酶上的供体染料进行基于单分子或集合单色FRET的边合成边测序。携带多个FRET受体染料拷贝的标签通过可切割接头附接到NRT。模板DNA(或RNA)附接到固体支持物(例如，载玻片或芯片)上。在引物、模板、未标记的聚合酶与NRT之间形成三元复合物，并且在引物的3'端处并入与模板中的下一个碱基互补的标记的NRT。在不破坏延伸的引物与模板的附接的条件下，执行温和的洗涤步骤以去除游离的NRT和未结合的聚合酶。以足够的浓度添加用FRET供体染料标记的聚合酶以替代未标记的聚合酶，并且进行另外的温和洗涤以去除先前结合的聚合酶。通过激发供体染料并且检测来自受体染料的发射来监测FERT，指示并入。最后进行切割反应，以去除NRT上的染料和封闭基团，从而恢复3'-OH基团，以便为下一轮SBS做好准备。在每个循环中，添加四个NRT中的不同的一个NRT。FRET将仅在并入与模板链互补的核苷酸时发生。对于单分子SBS，模板DNA分子间隔足够远，使得单分子反应将在表面上的不同位点处发生。对于集合测序，需要更大的模板DNA分离以允许其克隆扩增(例如，通过桥式PCR或乳液PCR在珠粒上形成簇)。在替代性单色方案中，可以进行将染料连接到NRT的可切割接头或用于通过锚定物结合分子附接染料的不同锚定物的不同组合(方案P1-P10)，使得可以同时添加所有四个NRT。尽管在此图中展示了受体染料标记的NRT，但将虚拟终止子用于集合或单分子SBS基本上遵循相同的方法。
图3A：用于标签附接的可切割接头的实例。这些都与DTM(SS)基团兼容，也就是说，在适当条件下使用所列试剂进行切割将不会使相同或其它核苷酸类似物中的二硫键还原。在其它方案和图中，提供了用于SBS的偶氮、烯丙基和2-硝基苄基(可光切割)接头的实例。
图3B：用于标记反应的共价地相互结合的锚定物和锚定物结合部分的实例。此草图中未示出的是产生极强的离子相互作用的生物素锚定物和其结合伙伴链霉亲和素。
图4：具有DTM(SS)封闭的3'OH基团和通过DTM(SS)接头附接的能量转移受体染料Cy5的核苷酸可逆终止子。这组核苷酸可以与方案P1、P2、U1和U2一起使用。
图5：具有用于附接能量转移受体染料Cy5的四个替代性可切割接头(DTM(SS)、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基)的虚拟终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P3和U3一起使用。虚拟终止子的其它可能的封闭基团可以由附接到碱基上的长聚合物分子组成。
图6：具有分别通过链霉亲和素、四嗪、TCO和叠氮化物(N3)的四种替代性锚定物(生物素、TCO、四嗪和DBCO)的虚拟终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P4和U4一起使用。虚拟终止子的其它可能的封闭基团可以由附接到碱基上的长聚合物分子组成。
图7：具有用于附接能量转移受体染料Cy5(分别通过链霉亲和素和四嗪)的两个替代性可切割接头(DTM(SS)和偶氮)和两种替代性锚定物(生物素和TCO)的虚拟终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P5和U5一起使用。虚拟终止子的其它可能的封闭基团可以由附接到碱基上的长聚合物分子组成。
图8：具有用于通过链霉亲和素附接能量转移受体染料Cy5的两个替代性可切割接头(DTM(SS)和偶氮)的虚拟终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P6和U6一起使用。虚拟终止子的其它可能的封闭基团可以由附接到碱基上的长聚合物分子组成。
图9：具有用于附接能量转移受体染料Cy5的DTM(SS)封闭的3'-OH基团和四个替代性可切割接头(DTM(SS)、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基)的核苷酸可逆终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P7和U7一起使用。
图10：具有用于分别通过链霉亲和素、TCO、四嗪和叠氮化物(N3)附接能量转移受体染料Cy5的DTM(SS)封闭的3'-OH基团和四种替代性锚定物(生物素、TCO、四嗪和DBCO)的核苷酸可逆终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P8和U8一起使用。
图11：具有用于(分别通过链霉亲和素和四嗪)附接能量转移受体染料Cy5的DTM(SS)封闭的3'-OH基团、两个替代性接头(DTM(SS)和偶氮)以及两种替代性锚定物(生物素和TCO)的核苷酸可逆终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P9和U9一起使用。
图12：具有用于通过链霉亲和素附接Cy5的DTM(SS)封闭的3'-OH基团、两个替代性接头(DTM(SS)和偶氮)的核苷酸可逆终止子。这组核苷酸类似物可以与方案P10和U10一起使用。
图13：具有亚甲基、胺或其它替代α与β磷酸盐之间的氧原子的基团或具有α-硫代磷酸盐的Rp异构体并且具有附接到碱基或末端磷酸的能量转移供体染料Cy3的不可并入的核苷酸的实例。这些类型的核苷酸类似物中的任一种都可以用于方案U1-U10中。尽管在此图中将Cy3示出为能量转移供体染料，但Cy2或其它染料也可以与能量转移受体染料Cy5一起使用。也可以使用供体和受体染料的其它组合。
图14：用于合成具有附接到碱基的染料的不可并入的核苷酸的通用方案。在这种情况下，呈现了α,β-亚甲基三磷酸核苷酸的合成方案，但对于图13中示出的其它不可并入的核苷酸也存在类似的方案，并且可以如图15中增加磷酸的数量。
图15：用于合成具有附接到末端磷酸的染料的不可并入的核苷酸的通用方案。在这种情况下，呈现了α,β-亚甲基六磷酸核苷酸的合成方案，但对于图13中示出的其它不可并入的核苷酸也存在类似的方案，并且磷酸的数量可以减少(例如，减少到四磷酸或五磷酸)或增加(例如，增加到七磷酸或更高的多磷酸)。
图16：示出使用附接到聚合酶的供体以及在核苷酸可逆终止子上的受体的SBS的示意图(方案P1)。每个SBS循环由三个步骤组成：聚合酶反应以并入受体染料标记的核苷酸可逆终止子(3'封闭的或虚拟终止子)，用供体染料附接的聚合酶替代未标记的聚合酶以影响能量转移，随后进行成像，并且切割受体染料和封闭基团以针对下一个循环进行重置。尽管在此通用方案中展示的三个循环中的每个循环中都示出了延伸，但仅在添加了正确的核苷酸可逆终止子的情况下(即，所述延伸与模板链中的核苷酸互补的情况下)，所述延伸才会被并入到增长的引物链和观察到的FRET中。图中的箭头表示供体荧光团(Cy3)的激发、从供体到受体荧光团(Cy5)的FRET以及受体荧光团的发射。图4中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构，并且图2中呈现了FRET供体染料标记的聚合酶的实例。
图17A-17B：使用4个不同模板、聚合酶上的FRET供体染料以及NRT上的FRET受体染料的单色SBS的若干个循环的实例，其中在每个循环中添加了不同的NRT(方案P2)。示出了多个循环。此图中示出了用于添加每个核苷酸可逆终止子的小循环(例如，步骤1-3、步骤4-6等)以及指示添加所有4个核苷酸可逆终止子的大循环(步骤1-12)；合计呈现了两个完整的大循环。方案P1的图例中呈现了使用单个模板的三个小循环的详细信息。由于仅在添加适当的核苷酸的情况下(即，核苷酸与模板链中的下一个可用核苷酸互补的情况下)才会发生并入，所示出的四个不同模板延伸至不同长度，顶部和底部模板总共有4个碱基，并且中间两个模板总共有3个碱基。图4中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构。
图18A-18B：(方案3)使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-烯丙基-Cy5、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-Cy5、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-Cy5、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-2-硝基苄基-Cy5)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-烯丙基-Cy5、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-Cy5、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-Cy5、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-2-硝基苄基-Cy5)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的染料标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种染料标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的染料标记的核苷酸之后，添加用Cy3标记的DNA聚合酶，并且检测到唯一的FRET信号(在Cy3激发的情况下，Cy5发射信号)确认并入，但不指示哪种核苷酸被并入。步骤3，通过将Pd(0)添加到延长的DNA链切割烯丙基接头导致从并入的A中去除Cy5。步骤4，在洗掉切割的染料之后，再次添加Cy3-聚合酶并且执行第二轮成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示A的并入。步骤5，通过将连二亚硫酸钠(Na2S2O4)添加到延长的DNA链中切割偶氮接头导致从并入的C中去除Cy5。步骤6，在重新添加Cy3-聚合酶并且洗掉切割的染料之后，执行第三轮成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示C的并入。步骤7，通过用340nm光处理延长的DNA链切割2-硝基苄基接头导致从并入的G中去除Cy5。步骤8，在洗掉切割的染料之后，执行第四轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示G的并入。步骤9，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头导致从并入的T中去除Cy5，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉经切割的染料之后，执行任选的最后一轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy3激发后Cy5信号的损失证实T的并入。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图5中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图19A-19B：使用4种锚定物利用聚合酶上的供体染料、虚拟终止子上的受体染料的单色SBS(方案P4)。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-锚定物(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-生物素、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-TCO、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-DBCO、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-四嗪)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-生物素、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-TCO、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-DBCO、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-四嗪)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的锚定物标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的染料标记的核苷酸之后，添加用Cy3标记的DNA聚合酶并且进行成像(任选的)以揭示任何背景FRET信号(在激发Cy3的情况下，Cy5发射信号)。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加Cy3-聚合酶并且执行第二轮成像。Cy3激发后Cy5信号的出现指示A的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与T核苷酸类似物特异性地结合。步骤6，在重新添加Cy3-聚合酶并且洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，执行第三轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示T的并入。步骤7，使用TCO-Cy5进行标记，以将染料附接到含四嗪的核苷酸类似物。染料将与G核苷酸类似物特异性地结合。步骤8，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，执行第四轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示G的并入。步骤9，使用N3-Cy5进行标记，以将染料附接到含DBCO的核苷酸类似物。染料将与C核苷酸类似物特异性地结合。步骤10，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，执行第五轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示C的并入。步骤11，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤12，在洗掉THP之后，执行任选的最后一轮Cy3-聚合酶添加和成像。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图6中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图20A-20B：使用2种锚定物和2个可切割接头利用聚合酶上的供体染料、虚拟终止子上的受体染料的单色SBS(方案P5)。使用dNTP-DTM(SS)-阻断剂-锚定物(dATP-7-SS-阻断剂-生物素、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO)、dNTP-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-锚定物(dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-TCO、dCTP-5-SS-阻断剂-偶氮-生物素)和对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素和Cy5标记的四嗪)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-SS-阻断剂-生物素、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO、dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-TCO、dCTP-5-SS-阻断剂-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的阻断剂-锚定物dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种阻断剂-锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，添加Cy3标记的DNA聚合酶，并且在激发Cy3的情况下进行成像以获得背景Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A和C核苷酸类似物特异性地结合，但不与G和T类似物结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，使用Cy3标记的聚合酶替代未标记的聚合酶，并且成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示A或C的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与G和T核苷酸类似物特异性地结合，但不与A和C类似物结合。步骤6，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸并且重新添加DNA聚合酶-Cy3之后，在Cy3激发后检测到新的Cy5信号指示G或T的并入。接下来，在步骤7中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤8，在洗掉经切割的染料并且重新添加DNA聚合酶-Cy3之后，对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或C，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是C，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为G或T的信号，Cy5荧光的损失将指示T特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤9中，使用THP处理DNA产物切割SS接头，从而导致去除阻断剂和剩余的Cy3染料，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉THP之后，任选的DNA聚合酶-Cy3添加和成像步骤将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。图7中示出了此方案中使用的经修饰的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。图20B(底部)展示了使用数字解码的碱基调用模式。每个成像步骤之后的草图(矩形中的圆形)指示观察到(黑色圆形)或没有观察到(白色圆形)FRET。如果将“1”分配给正FRET信号并且将“0”分配给负FRET信号，则关键成像步骤中唯一的一系列数字将指示碱基。使用此方案中的标记的核苷酸类似物以及两次标记和第一切割步骤之后的成像结果，“111”系列将指示带有A的延伸(模板为T)；“011”将指示带有G的延伸(模板为C)；“001”将指示带有T的延伸(模板为A)；“110”将指示带有C的延伸(模板为G)。尽管这些草图不包含在方案P9、U5和U9中，但所述草图将显示与方案P5相同的序列编码模式。
图21A-21B：使用1种锚定物和2个可切割接头利用聚合酶上的供体染料、虚拟终止子上的受体染料的单色SBS(方案P6)。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料[dNTP-DTM(SS)-阻断剂-染料(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5)、dNTP-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-染料(dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-Cy5)]、dNTP-可切割接头-阻断剂-锚定物[dNTP-DTM(SS)-阻断剂-锚定物(dGTP-7-SS-阻断剂-生物素)、dNTP-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-锚定物(dCTP-5-SS-阻断剂-偶氮-生物素)]和对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5、dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-Cy5、dGTP-7-SS-阻断剂-生物素、dCTP-5-SS-阻断剂-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的阻断剂-染料或阻断剂-锚定物dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种阻断剂-染料或阻断剂-锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料或锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，添加Cy3标记的DNA聚合酶，并且在激发Cy3的情况下进行成像，以获得由于并入A或T核苷酸类似物而导致的Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与C和G核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，使用Cy3标记的聚合酶替换未标记的聚合酶，并且成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示C或G的并入。接下来，在步骤5中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤6，在洗掉经切割的染料并且重新添加DNA聚合酶-Cy3之后，对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或T，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是T，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为C或G的信号，Cy5荧光的损失将指示C特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤7中，使用THP处理DNA产物切割SS接头，从而导致去除阻断剂和剩余的Cy3染料，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤8，在洗掉THP之后，任选的DNA聚合酶-Cy3添加和成像步骤将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。图8中示出了此方案中使用的经修饰的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。在此图中，还展示了使用数字解码的碱基调用模式。每个成像步骤之后的草图(矩形中的圆形)指示观察到(黑色圆形)或没有观察到(白色圆形)FRET。如果将“1”分配给正FRET信号并且将“0”分配给负FRET信号，则关键成像步骤中唯一的一系列数字将指示碱基。使用此方案中的标记的核苷酸类似物以及延伸、标记和第一切割步骤之后的成像结果，“111”系列将指示带有A的延伸(模板为T)；“011”将指示带有G的延伸(模板为C)；“110”将指示带有T的延伸(模板为A)；“010”将指示带有C的延伸(模板为G)。尽管这些草图不包含在方案P10、U6和U10中，但所述草图将显示与方案P6相同的序列编码模式。
图22A-22B：使用4个可切割接头利用聚合酶上的供体染料、DTM(SS)-NRT上的受体染料的单色SBS(方案P7)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-染料(3'-SS-dATP-7-烯丙基-Cy5、3'-SS-dTTP-5-SS-Cy5、3'-SS-dCTP-5-偶氮-Cy5、3'-SS-dGTP-7-(2-硝基苄基)-Cy5)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-SS-dATP-7-烯丙基-Cy5、3'-SS-dTTP-5-SS-Cy5、3'-SS-dCTP-5-偶氮-Cy5、3'-SS-dGTP-7-(2-硝基苄基)-Cy5)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的染料标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种染料标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的染料标记的核苷酸之后，添加用Cy3标记的DNA聚合酶，并且检测到唯一的FRET信号(在Cy3激发的情况下，Cy5发射信号)确认并入，但不指示哪种核苷酸被并入。步骤3，通过将Pd(0)添加到延长的DNA链切割烯丙基接头导致从并入的A中去除Cy5。步骤4，在洗掉切割的染料之后，再次添加Cy3-聚合酶并且执行第二轮成像。Cy5信号的损失指示A的并入。步骤5，通过将连二亚硫酸钠(Na2S2O4)添加到延长的DNA链中切割偶氮接头导致从并入的C中去除Cy5。步骤6，在重新添加Cy3-聚合酶并且洗掉切割的染料之后，执行第三轮成像。Cy5信号的损失指示C的并入。步骤7，通过用340nm光处理延长的DNA链切割2-硝基苄基接头导致从并入的G中去除Cy5。步骤8，在洗掉切割的染料之后，执行第四轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy5信号的损失指示G的并入。步骤9，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头导致从并入的T中去除Cy5，并且还恢复了所有这些核苷酸类似物上以及在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的所有增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉经切割的染料之后，执行任选的最后一轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy5信号的损失证实T的并入。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图9中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图23A-23B：使用4种锚定物利用聚合酶上的供体染料、DTM(SS)-NRT上的受体染料的单色SBS(方案P8)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-染料(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dTTP-5-SS-四嗪、3'-SS-dCTP-5-SS-TCO、3'-SS-dGTP-7-SS-DBCO)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dTTP-5-SS-四嗪、3'-SS-dCTP-5-SS-TCO、3'-SS-dGTP-7-SS-DBCO)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的锚定物标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的染料标记的核苷酸之后，添加用Cy3标记的DNA聚合酶并且进行成像以揭示背景FRET信号(在激发Cy3的情况下，Cy5发射信号)。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加Cy3-聚合酶并且执行第二轮成像。Cy3激发后Cy5信号的出现指示A的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与C核苷酸类似物特异性地结合。步骤6，在重新添加Cy3-聚合酶并且洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，执行第三轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示C的并入。步骤7，使用TCO-Cy5进行标记，以将染料附接到含四嗪的核苷酸类似物。染料将与T核苷酸类似物特异性地结合。步骤8，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，执行第四轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示T的并入。步骤9，使用N3-Cy5进行标记，以将染料附接到含DBCO的核苷酸类似物。染料将与G核苷酸类似物特异性地结合。步骤10，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，执行第五轮Cy3-聚合酶添加和成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示G的并入。步骤11，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头恢复了在这些核苷酸类似物上以及在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤12，在洗掉经切割的染料之后，执行任选的最后一轮Cy3-聚合酶添加和成像。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图10中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图24A-24B：使用2种锚定物和2个可切割接头利用聚合酶上的供体染料、DTM(SS)-NRT上的受体染料的单色SBS(方案P9)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-DTM(SS)-锚定物(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dGTP-7-SS-TCO)、DTM(SS)-dNTP-偶氮-锚定物(3'-SS-dTTP-5-偶氮-TCO、3'-SS-dCTP-5-偶氮-生物素)和对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素和Cy5标记的四嗪)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dGTP-7-SS-TCO、3'-SS-dTTP-5-偶氮-TCO、3'-SS-dCTP-5-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的锚定物标记的NRT中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，将添加Cy3标记的DNA聚合酶，并且将在激发Cy3的情况下进行成像以获得背景Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A和C核苷酸类似物特异性地结合，但不与G和T类似物结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，使用Cy3标记的聚合酶替代未标记的聚合酶，并且成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示A或C的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与G和T核苷酸类似物特异性地结合，但不与A和C类似物结合。步骤6，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸并且重新添加DNA聚合酶-Cy3之后，在Cy3激发后检测到新的Cy5信号指示G或T的并入。接下来，在步骤7中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤8，在洗掉经切割的染料并且重新添加DNA聚合酶-Cy3之后，对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或C，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是C，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为G或T的信号，Cy5荧光的损失将指示T特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤9中，使用THP处理DNA产物切割3'封闭基团和SS接头，从而恢复3'-OH并且去除任何剩余的Cy5，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉THP之后，任选的DNA聚合酶-Cy3添加和成像步骤将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。图11中示出了此方案中使用的经修饰的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图25A-25B：使用1种锚定物和2个可切割接头利用聚合酶上的供体染料、DTM(SS)-NRT上的受体染料的单色SBS(方案P10)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-染料[3'-DTM(SS)-dNTP-SS-染料(3'-DTM(SS)-dATP-7-SS-Cy5)、3'-DTM(SS)-dNTP-偶氮-染料(3'-DTM(SS)-dTTP-5-偶氮-Cy5)]、3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-锚定物[3'-DTM(SS)-dNTP-SS-锚定物(3'-DTM(SS)-dGTP-7-SS-生物素)、3'-DTM(SS)-dNTP-偶氮-锚定物(3'-DTM(SS)-dCTP-5-偶氮-生物素)]和对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素)执行1色DNASBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-DTM(SS)-dATP-7-SS-Cy5、3'-DTM(SS)-dTTP-5-偶氮-Cy5、3'-DTM(SS)-dGTP-7-SS-生物素、3'-DTM(SS)-dCTP-5-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的阻断剂-染料或阻断剂-锚定物dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种阻断剂-染料或阻断剂-锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料或锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，添加Cy3标记的DNA聚合酶，并且在激发Cy3的情况下进行成像，以获得由于并入A或T核苷酸类似物而导致的Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与C和G核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，使用Cy3标记的聚合酶替换未标记的聚合酶，并且成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示C或G的并入。接下来，在步骤5中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤6，在洗掉经切割的染料并且重新添加DNA聚合酶-Cy3之后，对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或T，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是T，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为C或G的信号，Cy5荧光的损失将指示C特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤7中，使用THP处理DNA产物切割3'封闭基团和SS接头，从而恢复3'-OH并且去除任何剩余的Cy5，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤8，在洗掉THP之后，任选的DNA聚合酶-Cy3添加和成像步骤将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的Cy3-聚合酶。图12中示出了此方案中使用的经修饰的核苷酸的结构。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图26：针对使用NRT上的受体和附接到相邻的不可并入的核苷酸的供体的SBS的通用方案(方案U1)。每个SBS循环由两个步骤组成：聚合酶反应以并入受体染料标记的核苷酸可逆终止子(3'封闭的或虚拟终止子)，并且结合不可并入的核苷酸(示出在括号中并且未连接到先前的碱基)，随后进行成像，并且切割受体染料和封闭基团以针对下一个循环进行重置。尽管在此通用方案中展示的三个循环中的每个循环中都示出了延伸，但仅在添加了正确的核苷酸可逆终止子的情况下(即，所述延伸与模板链中的核苷酸互补的情况下)，所述延伸才会被并入到增长的引物链和观察到的FRET中。图中的箭头表示供体荧光团(Cy3)的激发、从供体到受体荧光团(Cy5)的FRET以及受体荧光团的发射。灯笼椒形闭合曲线表示结合三元复合物中的模板和引物的聚合酶分子。图4中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。
图27A-27B：使用4个不同模板、进入NRT上的FRET受体染料以及在下一个位置处的不可并入的核苷酸上的FRET供体染料的单色SBS的若干个循环的实例，其中在每个循环中添加了不同的NRT(方案U2)。示出了多个循环。此图中示出了用于添加每个核苷酸可逆终止子的小循环(例如，步骤1-3、步骤4-6等)以及指示添加所有4个核苷酸可逆终止子的大循环(步骤1-12)；合计呈现了两个完整的大循环。方案U1的图例中呈现了针对单个模板的三个小循环的详细信息。由于仅在添加适当的与模板链中的下一个可用核苷酸互补的核苷酸的情况下才会发生并入，所示出的四个不同模板延伸至不同长度，顶部和底部模板总共有4个碱基，并且中间两个模板总共有3个碱基。图4中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。
图28A-28B：使用4个可切割接头利用进入虚拟终止子上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U3)。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-烯丙基-Cy5、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-Cy5、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-Cy5、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-2-硝基苄基-Cy5)和dNPPCP-染料(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3和dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-烯丙基-Cy5、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-Cy5、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-Cy5、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-2-硝基苄基-Cy5)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的染料标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种染料标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的染料标记的核苷酸之后，添加DNA聚合酶和四种dNPPCP-Cy3不可并入的核苷酸，并且检测到唯一的FRET信号(在Cy3激发的情况下，Cy5发射信号)确认并入，但不指示哪种核苷酸被并入。步骤3，通过将Pd(0)添加到延长的DNA链切割烯丙基接头导致从并入的A中去除Cy5。步骤4，在洗掉切割的染料之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第二轮成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示A的并入。步骤5，通过将连二亚硫酸钠(Na2S2O4)添加到延长的DNA链中切割偶氮接头导致从并入的C中去除Cy5。步骤6，在重新添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且洗掉切割的染料之后，执行第三轮成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示C的并入。步骤7，通过用340nm光处理延长的DNA链切割2-硝基苄基接头导致从并入的G中去除Cy5。步骤8，在洗掉切割的染料之后，执行第四轮DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸添加和成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示G的并入。步骤9，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头导致从并入的T中去除Cy5，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉切割的染料之后，执行任选的最后一轮DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸添加和成像。Cy3激发后Cy5信号的损失证实T的并入。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除任何剩余的dNPPCP-Cy3。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图5中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图29A-29B：使用4种锚定物利用进入虚拟终止子上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U4)。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-锚定物(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-生物素、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-TCO、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-DBCO、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-四嗪)、对应的Cy5标记的锚定物结合分子(链霉亲和素-Cy5、四嗪-Cy5、N3-Cy5和TCO-Cy5)和Cy3标记的dNPPCP核苷酸类似物(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3和dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-DTM(SS)-阻断剂-生物素、dTTP-5-DTM(SS)-阻断剂-TCO、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-DBCO、dGTP-7-DTM(SS)-阻断剂-四嗪)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的锚定物标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的锚定物标记的核苷酸类似物之后，添加DNA聚合酶和四种dNPPCP-Cy3不可并入的核苷酸并且进行成像(任选的)以揭示任何背景FRET信号(在Cy3激发的情况下，Cy5发射信号)。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第二轮成像。Cy3激发后Cy5信号的出现指示A的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与T核苷酸类似物特异性地结合。步骤6，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第三轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示T的并入。步骤7，使用TCO-Cy5进行标记，以将染料附接到含四嗪的核苷酸类似物。染料将与G核苷酸类似物特异性地结合。步骤8，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第四轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示G的并入。步骤9，使用N3-Cy5进行标记，以将染料附接到含DBCO的核苷酸类似物。染料将与C核苷酸类似物特异性地结合。步骤10，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第五轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示C的并入。步骤11，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤12，在洗掉THP之后，进行任选的最后一轮聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸添加并且进行成像。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的dNPPCP-Cy3核苷酸和聚合酶。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图6中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图30A-30B：使用2种锚定物和2个可切割接头利用进入虚拟终止子上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U5)。使用dNTP-DTM(SS)-阻断剂-锚定物(dATP-7-SS-阻断剂-生物素、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO)、dNTP-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-锚定物(dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-TCO、dCTP-5-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-生物素)、对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素和Cy5标记的四嗪)和不可并入的dNPPCP-Cy3核苷酸(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3、dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-SS-阻断剂-生物素、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO、dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-TCO、dCTP-5-SS-阻断剂-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的含阻断剂-受体染料的锚定物dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种阻断剂-锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，添加Cy3标记的不可并入的核苷酸(dNPPCP-Cy3)，并且在激发Cy3的情况下进行成像以获得背景Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A和C核苷酸类似物特异性地结合，但不与G和T类似物结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，添加四种dNPPCP-Cy3核苷酸，并且成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示A或C的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与G和T核苷酸类似物特异性地结合，但不与A和C类似物结合。步骤6，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸并且添加四种dNPPCP-Cy3核苷酸之后，在Cy3激发后检测到新的Cy5信号指示G或T的并入。接下来，在步骤7中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤8，在洗掉切割的染料并且重新添加dNPPCP-Cy3核苷酸之后，对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或C，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是C，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为G或T的信号，Cy5荧光的损失将指示T特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤9中，使用THP处理DNA产物切割SS接头，从而导致去除阻断剂和剩余的Cy3染料，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉THP之后，任选的dNPPCP-Cy3添加和成像步骤将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除任何剩余的dNPPCP-Cy3。图7中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图31A-31B：使用1种锚定物和2个可切割接头利用进入虚拟终止子上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U6)。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料[dNTP-DTM(SS)-阻断剂-染料(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5)、dNTP-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-染料(dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-Cy5)]、dNTP-可切割接头-阻断剂-锚定物[dNTP-DTM(SS)-阻断剂-锚定物(dGTP-7-SS-阻断剂-生物素)、dNTP-DTM(SS)-阻断剂-偶氮-锚定物(dCTP-5-SS-阻断剂-偶氮-生物素)]、对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素)和不可并入的dNPPCP-Cy3核苷酸(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3和dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5、dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮-Cy5、dGTP-7-SS-阻断剂-生物素、dCTP-5-SS-阻断剂-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的阻断剂-染料或阻断剂-锚定物dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种阻断剂-染料或阻断剂-锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料或锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，添加DNA聚合酶和四种dNPPCP-Cy3不可并入的核苷酸，并且在激发Cy3的情况下进行成像，以获得由于并入A或T核苷酸类似物而导致的Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与C和G核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸，并且成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示C或G的并入。接下来，在步骤5中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤6，在洗掉切割的染料之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸，并且对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或T，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是T，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为C或G的信号，Cy5荧光的损失将指示C特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤7中，使用THP处理DNA产物切割SS接头，从而导致去除阻断剂和剩余的Cy3染料，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤8，在洗掉THP之后，任选地添加聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸，并且成像将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸。图8中示出了此方案中使用的经修饰的核苷酸的结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图32A-32B：使用4个可切割接头利用进入NRT上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U7)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-染料(3'-SS-dATP-7-烯丙基-Cy5、3'-SS-dTTP-5-SS-Cy5、3'-SS-dCTP-5-偶氮-Cy5、3'-SS-dGTP-7-(2-硝基苄基)-Cy5)和四种dNPPCP-Cy3不可并入的核苷酸(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3、dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-SS-dATP-7-烯丙基-Cy5、3'-SS-dTTP-5-SS-Cy5、3'-SS-dCTP-5-偶氮-Cy5、3'-SS-dGTP-7-(2-硝基苄基)-Cy5)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的染料标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种染料标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的染料标记的核苷酸之后，添加DNA聚合酶和四种dNPPCP-Cy3核苷酸，并且检测到唯一的FRET信号确认并入(在激发Cy3的情况下，Cy5发射信号)，但不指示哪种核苷酸被并入。步骤3，通过将Pd(0)添加到延长的DNA链切割烯丙基接头导致从并入的A中去除Cy5。步骤4，在洗掉切割的染料之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第二轮成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示A的并入。步骤5，通过将连二亚硫酸钠(Na2S2O4)添加到延长的DNA链中切割偶氮接头导致从并入的C中去除Cy5。步骤6，在洗掉切割的染料并且重新添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸之后，执行第三轮成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示C的并入。步骤7，通过用340nm光处理延长的DNA链切割2-硝基苄基接头导致从并入的G中去除Cy5。步骤8，在洗掉切割的染料之后，执行第四轮DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3添加和成像。Cy3激发后的Cy5信号的损失指示G的并入。步骤9，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头导致从并入的T中去除Cy5，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉切割的染料之后，执行任选的最后一轮DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3添加和成像。Cy3激发后Cy5信号的损失证实T的并入。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的dNPPCP-Cy3。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图9中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图33A-33B：使用4种锚定物利用进入NRT上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U8)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-染料(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dTTP-5-SS-四嗪、3'-SS-dCTP-5-SS-TCO、3'-SS-dGTP-7-SS-DBCO)、对应的染料标记的锚定物结合分子(链霉亲和素-Cy5、TCO-Cy5、四嗪-Cy5和N3-Cy5)和不可并入的dNPPCP-Cy3核苷酸类似物(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3和dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dTTP-5-SS-四嗪、3'-SS-dCTP-5-SS-TCO、3'-SS-dGTP-7-SS-DBCO)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤(未示出)，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的锚定物标记的dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗掉未并入的锚定物标记的核苷酸之后，添加DNA聚合酶和四种dNPPCP-Cy3不可并入的核苷酸，并且进行成像以揭示背景FRET信号(在激发Cy3的情况下，Cy5发射信号)。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第二轮成像。Cy3激发后Cy5信号的出现指示A的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与C核苷酸类似物特异性地结合。步骤6，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第三轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示C的并入。步骤7，使用TCO-Cy5进行标记，以将染料附接到含四嗪的核苷酸类似物。染料将与T核苷酸类似物特异性地结合。步骤8，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第四轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示T的并入。步骤9，使用N3-Cy5进行标记，以将染料附接到含DBCO的核苷酸类似物。染料将与G核苷酸类似物特异性地结合。步骤10，在洗掉游离标记和多余的核苷酸之后，再次添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸并且执行第五轮成像。Cy3激发后新的Cy5信号的出现指示G的并入。步骤11，通过将THP添加到延长的DNA链切割SS接头恢复了在这些核苷酸类似物上以及在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤12，在洗掉切割的染料之后，执行任选的最后一轮聚合酶和dNPPCP-Cy3添加和成像。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的聚合酶和核苷酸类似物。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图10中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图34A-34B：使用2种锚定物和2个可切割接头利用进入NRT上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U9)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-DTM(SS)-锚定物(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dGTP-7-SS-TCO)、DTM(SS)-dNTP-偶氮-锚定物(3'-SS-dTTP-5-偶氮-TCO、3'-SS-dCTP-5-偶氮-生物素)、对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素和Cy5标记的四嗪)和不可并入的核苷酸dNPPCP-Cy3(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3、dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-SS-dATP-7-SS-生物素、3'-SS-dGTP-7-SS-TCO、3'-SS-dTTP-5-偶氮-TCO、3'-SS-dCTP-5-SS-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的锚定物标记的NRT中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种锚定物标记的NRT(A，C，G，T)中的一种锚定物标记的NRT或不具有染料的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，添加Cy3标记的不可并入的核苷酸(dNPPCP-Cy3)，并且在激发Cy3的情况下进行成像以获得背景Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与A和C核苷酸类似物特异性地结合，但不与G和T类似物结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸集合，随后成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示A或C的并入。步骤5，使用四嗪-Cy5进行标记，以将染料附接到含TCO的核苷酸类似物。染料将与G和T核苷酸类似物特异性地结合，但不与A和C类似物结合。步骤6，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸并且重新添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸之后，在Cy3激发后检测到新的Cy5信号指示G或T的并入。接下来，在步骤7中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤8，在洗掉切割的染料并且重新添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸之后，对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或C，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是C，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为G或T的信号，Cy5荧光的损失将指示T特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤9中，使用THP处理DNA产物切割3'封闭基团和SS接头，从而恢复3'-OH并且去除任何剩余的Cy5，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤10，在洗掉THP之后，任选的DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3添加和成像步骤将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的dNPPCP-Cy3。图11中呈现了FRET受体染料标记的NRT的示例结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
图35A-35B：使用2种锚定物和2个可切割接头利用进入NRT上的受体染料、在下一个位置处瞬时结合的不可并入的核苷酸上的供体染料的单色SBS(方案U10)。使用3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-染料[3'-DTM(SS)-dNTP-SS-染料(3'-DTM(SS)-dATP-7-SS-Cy5)、3'-DTM(SS)-dNTP-偶氮-染料(3'-DTM(SS)-dTTP-5-偶氮-Cy5)]、3'-DTM(SS)-dNTP-可切割接头-锚定物[3'-DTM(SS)-dNTP-SS-锚定物(3'-DTM(SS)-dGTP-7-SS-生物素)、3'-DTM(SS)-dNTP-偶氮-锚定物(3'-DTM(SS)-dCTP-5-偶氮-生物素)]、对应的染料标记的结合分子(Cy5标记的链霉亲和素)和不可并入的dNPPCP-Cy3核苷酸(dAPPCP-Cy3、dCPPCP-Cy3、dGPPCP-Cy3和dTPPCP-Cy3)执行1色DNA SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种核苷酸类似物(3'-DTM(SS)-dATP-7-SS-Cy5、3'-DTM(SS)-dTTP-5-偶氮-Cy5、3'-DTM(SS)-dGTP-7-SS-生物素、3'-DTM(SS)-dCTP-5-偶氮-生物素)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的核苷酸类似物能够并入增长的DNA链中，以终止DNA合成。任选步骤，追踪：将DNA聚合酶和四个3'-O-SS(DTM)-dNTP(3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dATP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dCTP、3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dTTP和3'-O-叔丁基二硫甲基(SS)-dGTP)添加到固定的准备好的DNA模板中使得互补的3'-O-SS-核苷酸类似物能够并入未使用步骤1中的阻断剂-染料或阻断剂-锚定物dNTP中的任一种延伸的增长的DNA链的子集中。增长的DNA链用四种阻断剂-染料或阻断剂-锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的一种核苷酸类似物或不具有染料或锚定物的四种核苷酸类似物(A，C，G，T)中的相同的一种核苷酸类似物封端。步骤2，在洗涤以去除剩余的核苷酸和聚合酶之后，添加DNA聚合酶和四种dNPPCP-Cy3不可并入的核苷酸，并且在激发Cy3的情况下进行成像，以获得由于并入A或T核苷酸类似物而导致的Cy5发射。步骤3，使用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将染料附接到含生物素的核苷酸类似物。染料将与C和G核苷酸类似物特异性地结合。步骤4，在洗掉剩余的游离标记和多余的核苷酸之后，添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸，并且成像导致在Cy3激发后检测到由FRET引起的Cy5发射信号，指示C或G的并入。接下来，在步骤5中，使用连二亚硫酸钠处理DNA产物切割偶氮接头，从而导致去除T和C上的受体染料。步骤6，在洗掉切割的染料之后，添加DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸，并且对Cy3激发后Cy5荧光的存在进行成像。在此步骤中，如果已经确定并入的核苷酸可能是A或T，则Cy5荧光的损失将揭示所述并入的核苷酸是T，而剩余的荧光将揭示所述并入的核苷酸是A。类似地，对于先前确定为C或G的信号，Cy5荧光的损失将指示C特异性并入，而剩余的荧光将指示G的并入。接下来，在步骤7中，使用THP处理DNA产物切割3'封闭基团和SS接头，从而恢复3'-OH并且去除任何剩余的Cy5，并且还恢复了在任选的追踪步骤中用3'-O-SS(DTM)-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤8，在洗掉THP之后，任选的DNA聚合酶和dNPPCP-Cy3核苷酸添加和成像步骤将证实所有染料已被去除，从而为下一个测序循环做好准备。如果执行此任选步骤，则需要进行另外的洗涤以去除剩余的聚合酶和核苷酸类似物。图12中示出了此方案中使用的经修饰的核苷酸的结构，并且图13中呈现了FRET供体染料标记的不可并入的核苷酸的实例。核苷酸上的受体染料簇和/或聚合酶上的供体染料簇也可以用于放大能量转移信号。
具体实施方式
目前广泛使用的高通量SBS技术(Bentley等人,2008)使用先前开发的可切割荧光核苷酸可逆终止子(NRT)测序化学(Ju等人,2003；Ju等人,2006)。这些可切割的荧光NRT是基于以下原理设计的：通过将独特的可切割荧光团附接到碱基的特定位置并用小的可逆部分对3'-OH基团进行封端来修饰四种核苷酸(A，C，G，T)中的每种核苷酸，使得其仍然被DNA聚合酶识别为底物。因此，可切割的荧光NRT涉及两个位点修饰(Ju等人,2003；Ju等人,2006)：充当碱基上的报告基团的荧光染料和对3'-OH基团进行封端的小的化学部分，以在核苷酸并入后暂时终止聚合酶反应以进行序列测定。在并入和信号检测之后，荧光团被切割并且3'-OH封端部分被去除，以在下一个循环中恢复聚合酶反应。这些可切割的荧光NRT已被证明是重新工程化的聚合酶的良好底物，并且已广泛用于下一代DNA测序系统(Ju等人,2006；Bentley等人,2008)。此外，所述可切割的荧光NRT使得能够准确测定均聚物序列，因为在每个循环中鉴定了仅一个碱基。
先前在PCT/US2019/022326中描述的边合成边测序(SBS)设计(特此以全文引用的方式并入本文中)在若干种SBS方案中使用荧光共振能量转移(FRET)染料，其中供体荧光团在其吸收范围内被激发，将能量转移到受体荧光团，并且受体荧光团的发射被监测。同时，可以监测供体荧光团的可检测发射信号的减少。在所述SBS方案中，供体染料和受体染料以以下三种构型之一呈现在同一核苷酸上。
在第一种构型中，受体(例如，Cy5或ATTO647N)直接附接到碱基上，并且供体(例如，Cy3或Cy2)存在于结合碱基上的锚定物的标记分子上。因此，在标记反应期间，供体和受体聚集在一起。此构型可以使用3'封闭的核苷酸可逆终止子、双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)和具有附接到核苷酸碱基的封闭基团的虚拟终止子。在第二种构型中，受体直接附接到碱基，并且供体通过锚定物和标记分子附接到3'位置。再次，在标记反应期间，供体和受体在能量转移距离内。此构型可以使用3'封闭的核苷酸可逆终止子。第三种构型与前两种相同，但供体和受体的位置相反。还描述了使用量子点作为FRET供体。能量转移方法最适用于单色检测方法，但理论上使用2个FRET系统(供体1→受体1/供体2→受体2，包含特别是在受体1是供体2的情况下)和/或使用多种FRET染料之间的不同距离和比率，可以通过精心设计的供体/受体组合来检测2种或甚至更多种颜色。此外，受体染料簇和/或供体染料簇可以用于增加FRET发生的机会或增加整体信号的强度。
除了将供体染料和受体染料放置在同一核苷酸上之外，供体或受体可以放置在系统中的不同分子(例如，聚合酶或相邻核苷酸)上。先前也已经描述了将供体染料分子放置在聚合酶上，其中受体染料放置在不可并入的核苷酸、可逆终止子或天然核苷酸上(Ju等人,WO 2017/176677 A1)，并且如本文所描述的。
本文中公开的发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到步骤b中所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；
d)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；
e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
f)从步骤b)的任何并入的核苷酸类似物中切割所述标记和所述封闭基团；
g)其中如果未在步骤d)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到f)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；
h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，
由此确定所述核酸模板的序列。
本发明提供了即刻法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有附接到碱基的封闭基团。本发明提供了即刻法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有在3'-OH位置处的封闭基团。
在本发明的实施例中，所述核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且步骤c)的第二核酸聚合酶上的染料是Cy3。在本发明的实施例中，碱基上的可切割接头是DTM。
在本发明的实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物的3'封闭基团是DTM或叠氮基甲基，并且使用THP进行所述切割。
在本发明的实施例中，荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料。在本发明的实施例中，其中所述核苷酸类似物和/或第二核酸聚合酶上的染料是染料簇。
在本发明的实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物选自图4和/或图9的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。在本发明的实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物选自图5的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过不可切割的或不同的可切割接头连接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述碱基的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到并入步骤b中的所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定由于并入所述荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使并入的标记的核苷酸类似物与切割所述可切割接头的切割剂接触，以从所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的一种标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述可切割标记；
g)补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤f)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失，以部分地或完全地鉴定所述并入的核苷酸；
h)使用切割所述可切割接头的切割剂迭代地重复步骤f)和g)，以从不同的标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述标记；
i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定在步骤b)中并入的所述标记的核苷酸类似物；以及
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的荧光标记，
并且迭代地执行步骤b到j以获得所述核酸模板的序列。
在一个实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物具有附接到碱基的封闭基团。在一个实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物具有在3'-OH位置处的封闭基团。
在一个实施例中，所述核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且步骤c)的第二核酸聚合酶上的染料是Cy3。在一个实施例中，所述染料包括染料簇。
在即刻法的实施例中，步骤b)(i)的四种标记的核苷酸类似物各自包括将封闭基团连接到碱基的相同类型的可切割接头，并且所述四种标记的核苷酸类似物中的三种标记的核苷酸类似物包括将所述荧光标记连接到所述封闭基团的远侧的不同的可切割接头。在一个实施例中，所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
在即刻法的实施例中，步骤b)(ii)的所述四种标记的核苷酸类似物各自包括将所述荧光标记连接到所述碱基的不同可切割接头，并且其中所述切割所述可切割接头中的一个可切割接头的切割剂也切割在3'-OH位置处的所述封闭基团，并且其中所述切割在3'-OH处的所述封闭基团的切割剂接触在步骤f)的最终迭代中并入的标记的核苷酸类似物。在一个实施例中，所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且所述第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料。
在即刻法的实施例中，四种标记的核苷酸类似物由在图5中找到的那些标记的核苷酸类似物组成。在另一个实施例中，四种标记的核苷酸类似物由在图9中找到的那些标记的核苷酸类似物组成。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过所述封闭基团远侧的不可切割接头连接到所述碱基的锚定物，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有不同的锚定物和相同的可切割接头；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物不同的锚定物和相同的接头；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的四种锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；
g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于所述锚定物结合分子与并入步骤b)中的所述锚定物标记的核苷酸类似物结合而产生的任何荧光共振能量转移(FRET)信号；
h)使用对剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子一个接一个地迭代地重复步骤f)和g)，其中相同的荧光染料附接到所有四个锚定物结合分子上；
i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
j)使所述并入的与切割剂接触以从步骤b)的所述并入的核苷酸类似物中切割所述封闭基团和所述锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以由此获得所述核酸模板的序列。
在一个实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)i)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在另一个实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。
在一个实施例中，所述染料各自包括染料簇。
在即刻法的实施例中，步骤b)(i)的四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到碱基的封闭基团、通过不可切割接头附接到封闭基团的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物中的锚定物与不同的锚定物结合分子结合。在一个实施例中，四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO或四嗪中的一种，并且荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
在即刻法的实施例中，步骤b)(ii)的四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到碱基的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物中的锚定物与不同的锚定物结合分子结合。在一个实施例中，四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO和四嗪中的一种，并且其中荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
在一个实施例中，所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且所述第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且所述第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料。
在一个实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图6的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。在另一个实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图10的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基和通过相同的可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧，并且所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过相同的可切割接头附接到所述封闭基团的远侧；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头附接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同，并且其中剩余的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头是相同和不同的可切割基团；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；
g)鉴定由于步骤f)中的所述标记而产生的新生成的FRET信号，以部分地鉴定步骤b)中的并入的核苷酸类似物；
h)使用对所述第二锚定物具有特异性的第二荧光标记的锚定物结合分子重复步骤e和f；
i)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述特异性可切割剂切割所述可切割接头中的一个可切割接头但不切割任何剩余接头；
j)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤i)中执行的切割而导致的FRET信号的损失；
k)通过比较在步骤g)和j)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
l)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割剩余的锚定物和荧光标记；
以及迭代地执行步骤b)到l)以获得所述核酸模板的序列。
在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)i)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在另一个实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在一个实施例中，所述染料包括染料簇。
在即刻法的实施例中，所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括两个不同的可切割接头和两种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述锚定物标记的核苷酸类似物的碱基之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述封闭基团的远侧，从而将所述锚定物连接到所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物的封闭基团，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种由可切割接头1与锚定物1组成，一种由可切割接头1与锚定物2组成，一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物1组成，并且最后一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物2组成，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行。在一个实施例中，所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，其中一个可切割接头(可切割接头1)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，另一个可切割接头(可切割接头2)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物1，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物2，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物1，并且最后一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物2，由此产生一组4种核苷酸类似物，其中能够切割可切割接头1的药剂也去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割可切割接头1之前执行可切割接头2的切割和信号的确定。在一个实施例中，所述可切割接头独立地包括DTM或偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且所述第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且所述第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料。
在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图7的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图11的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶、四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种标记的核苷酸类似物是：
(i)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的相同锚定物；或者
(ii)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第一可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头连接到所述碱基的相同锚定物；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是用于所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记的能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定由于并入任何荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所述荧光标记的核苷酸类似物上的荧光标记相同；
g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定任何新生成的FRET信号以部分地鉴定由于在步骤f)中执行的标记而并入的核苷酸；
h)使用特异性切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
i)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤g)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失；
j)通过比较在步骤g)和i)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
k)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；
以及迭代地执行步骤b)到k)以获得所述核酸模板的序列。
在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)i)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，所述染料包括染料簇。
在即刻法的实施例中，所述四种标记的核苷酸类似物包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述核苷酸或核苷酸类似物之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述碱基与所述锚定物之间，但在所述核苷酸或核苷酸类似物中的两种核苷酸或核苷酸类似物的封闭基团的远侧，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种包括可切割接头1和锚定物1，一种包括可切割接头1与锚定物2，一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物1，并且最后一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物2，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行。在一个实施例中，可切割接头1包括DTM，可切割接头2包括偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素(锚定物1)和TCO(锚定物2)，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述四种标记的核苷酸类似物2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，第一类型的可切割接头位于所述核苷酸或核苷酸类似物中的一种核苷酸或核苷酸类似物与所述锚定物中的一种锚定物之间，所述第一类型的可切割接头位于第二核苷酸类似物与第二类型的锚定物之间，第二类型的可切割接头位于第三核苷酸类似物与第一锚定物之间，并且所述第二类型的可切割接头位于第四核苷酸类似物与第二锚定物之间，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，其中所述第一类型的可切割接头的切割也能够去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割所述第一类型的可切割接头之前执行所述第二类型的可切割接头的切割和信号的确定。在一个实施例中，所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的锚定物结合分子和荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子和所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料。
在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图8的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图12的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板和核酸聚合酶；
b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，并且同时或之后立即提供四种包括附接到所述核苷酸类似物的不同荧光染料的不可并入的核苷酸类似物，其中附接到所述不可并入的核苷酸类似物的荧光染料是用于附接到所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物的荧光染料的能量转移供体或受体染料；或者
(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，并且同时或之后立即提供四种包括附接到所述核苷酸类似物的不同荧光染料的不可并入的核苷酸类似物，其中附接到所述不可并入的核苷酸类似物的荧光染料是用于附接到所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物的荧光染料的能量转移供体或受体染料；
c)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；
d)从用所述荧光标记的核苷酸类似物延伸的任何引物中切割所述染料和所述封闭基团；
e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
f)其中如果未在步骤c)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到e)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；
g)用步骤b中描述的所述四种荧光标记的核苷酸中的第二种荧光标记的核苷酸来重复步骤b)到e)；
h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，
由此获得所述核酸模板的序列。
在即刻法的实施例中，步骤b)中提供的标记的核苷酸类似物是来自步骤b)(i)的那些标记的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，步骤b)中提供的标记的核苷酸类似物是来自步骤b)(ii)的那些标记的核苷酸类似物。在一个实施例中，荧光标记的核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且不可并入的核苷酸类似物上的染料是Cy3。在一个实施例中，可切割接头是DTM，并且切割是用THP进行的。在一个实施例中，所述染料是染料簇。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料。在一个实施例中，荧光标记的核苷酸类似物来自图4的那些荧光标记的核苷酸类似物，并且不可并入的核苷酸类似物是来自图13的那些不可并入的核苷酸类似物。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明还提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过不可切割的或不同的可切割接头连接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述碱基的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)与步骤b)同时或之后立即提供四种不同的荧光标记的不可并入的核苷酸类似物(A，C，T，G)，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的所述能量转移供体或受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)使用切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述切割剂特异性地切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
f)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤e)中执行的切割而导致的任何荧光损失，以部分地鉴定并入的核苷酸；
g)使用特异性地一个接一个切割任何剩余的接头的可切割剂迭代地重复步骤e)和f)；
h)通过比较在步骤f)和i)的多次迭代中获得的结果来确定在步骤b)中并入的特异性核苷酸类似物；
i)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸任何剩余的引物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
在即刻法的实施例中，步骤b)中提供的标记的核苷酸类似物是来自步骤b)(i)的那些标记的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，步骤b)中提供的标记的核苷酸类似物是来自步骤b)(ii)的那些标记的核苷酸类似物。在一个实施例中，所述染料是染料簇。
在即刻法的实施例中，所述可逆封闭的荧光标记的核苷酸类似物包括在所述碱基与所述封闭基团之间相同的可切割接头，并且所述四种类似物中的三种类似物包括在连接到所述荧光标记的封闭基团的远侧的不同的可切割接头，并且剩余的类似物具有在所述封闭基团与标记之间的不可切割的接头，并且其中在每个循环中执行的最后的切割反应对所述碱基与所述封闭基团之间的接头进行切割。在一个实施例中，所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
在即刻法的实施例中，所述四种可逆阻断的荧光标记的核苷酸类似物各自包括在所述碱基与所述荧光标记之间不同的可切割接头，并且其中所述四个可切割反应中的一个可切割反应也能够去除3'封闭基团，并且其中这是在每个循环中执行的最后的切割反应。在一个实施例中，所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料。
在即刻法的实施例中，荧光标记的核苷酸类似物来自图5的那些荧光标记的核苷酸类似物，并且不可并入的核苷酸类似物是来自图13的那些不可并入的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，荧光标记的核苷酸类似物来自图9的那些荧光标记的核苷酸类似物，并且不可并入的核苷酸类似物是来自图13的那些不可并入的核苷酸类似物。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过所述封闭基团远侧的不可切割接头连接到所述碱基的锚定物，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有不同的锚定物和相同的可切割接头；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物不同的锚定物和相同的接头；
c)与步骤b)同时或之后立即提供四种不同的锚定物标记的不可并入的核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述能量转移供体或受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)用荧光标记的锚定物结合分子标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与直接标记的核苷酸或核苷酸类似物上的荧光标记相同，并且其中所述锚定物结合分子与步骤b)的特异性核苷酸类似物的锚定物结合；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的荧光信号以部分地鉴定由于在步骤e)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用对剩余的锚定物中的每一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子一个接一个地重复步骤e)和f)，其中相同的荧光染料附接到所有四个锚定物结合分子上；
h)通过比较在步骤f)和g)的多次迭代中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
i)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余的引物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
以及迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)i)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在一个实施例中，所述染料各自包括染料簇。
在即刻法的实施例中，步骤b)(i)的四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到碱基的封闭基团、通过不可切割接头附接到封闭基团的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物中的锚定物与不同的锚定物结合分子结合。在一个实施例中，四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO或四嗪中的一种，并且荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
在即刻法的实施例中，步骤b)(ii)的四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到碱基的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物中的锚定物与不同的锚定物结合分子结合。在一个实施例中，四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO和四嗪中的一种，并且其中荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料。
在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图6的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图10的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
本发明进一步提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基和通过相同的可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧，并且所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过相同的可切割接头附接到所述封闭基团的远侧；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头附接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同，并且其中剩余的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头是相同和不同的可切割基团；
c)与步骤b)同时或之后立即加入所有四种荧光标记的不可并入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体染料，所述能量转移供体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的能量转移受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所有锚定物结合分子上的荧光标记相同；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的荧光信号以部分地或完全地鉴定由于在步骤d)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用对第二锚定物具有特异性的第二荧光标记的锚定物结合分子重复步骤e)和f)；
h)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述可切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
i)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤h)中执行的切割而导致的荧光损失；
j)通过比较在步骤f)和i)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
k)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余的引物；
l)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到l)以获得所述核酸模板的序列。
在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)i)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在一个实施例中，所述染料包括染料簇。
在即刻法的实施例中，所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括两个不同的可切割接头和两种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述锚定物标记的核苷酸类似物的碱基之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述封闭基团的远侧，从而将所述锚定物连接到所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物的封闭基团，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种由可切割接头1与锚定物1组成，一种由可切割接头1与锚定物2组成，一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物1组成，并且最后一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物2组成，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行。在一个实施例中，可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，其中一个可切割接头(可切割接头1)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，另一个可切割接头(可切割接头2)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物1，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物2，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物1，并且最后一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物2，由此产生一组4种核苷酸类似物，其中能够切割可切割接头1的药剂也去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割可切割接头1之前执行可切割接头2的切割和信号的确定。在一个实施例中，所述可切割接头独立地包括DTM或偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料。
在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图7的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图11的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶、四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种标记的核苷酸类似物是：
(i)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的相同锚定物；或者
(ii)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第一可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头连接到所述碱基的相同锚定物；
c)与步骤b同时或之后立即加入所有四种荧光标记的不可并入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的所述能量转移供体或受体染料；
d)在使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余引物后，鉴定由于并入任何荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
e)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所述荧光标记的核苷酸类似物上的荧光标记相同；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的FRET信号以部分地鉴定由于在步骤e)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述可切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割正交接头；
h)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤g)中执行的切割而导致的任何FRET信号损失，以完全地鉴定并入的核苷酸；
i)通过比较在步骤f)和h)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)i)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在即刻法的实施例中，四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物。在一个实施例中，所述染料包括染料簇。
在即刻法的实施例中，所述四种标记的核苷酸类似物包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述核苷酸或核苷酸类似物之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述碱基与所述锚定物之间，但在所述核苷酸或核苷酸类似物中的两种核苷酸或核苷酸类似物的封闭基团的远侧，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种包括可切割接头1和锚定物1，一种包括可切割接头1与锚定物2，一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物1，并且最后一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物2，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行。在一个实施例中，可切割接头1包括DTM，可切割接头2包括偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素(锚定物1)和TCO(锚定物2)，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述四种标记的核苷酸类似物2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，第一类型的可切割接头位于所述核苷酸或核苷酸类似物中的一种核苷酸或核苷酸类似物与所述锚定物中的一种锚定物之间，所述第一类型的可切割接头位于第二核苷酸类似物与第二类型的锚定物之间，第二类型的可切割接头位于第三核苷酸类似物与第一锚定物之间，并且所述第二类型的可切割接头位于第四核苷酸类似物与第二锚定物之间，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，其中所述第一类型的可切割接头的切割也能够去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割所述第一类型的可切割接头之前执行所述第二类型的可切割接头的切割和信号的确定。在一个实施例中，所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
在即刻法的实施例中，所述荧光标记的锚定物结合分子和荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子和所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料。
在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图8的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
在即刻法的实施例中，锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是图12的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
本发明进一步提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于执行即刻法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
术语
如本文所使用的并且除非另有说明，否则以下术语中的每个术语都应该具有以下所阐述的定义。
A -腺嘌呤；
C -胞嘧啶；
G -鸟嘌呤；
T -胸腺嘧啶；
U -尿嘧啶；
DNA-脱氧核糖核酸；
RNA-核糖核酸；
除非另有说明，否则“核酸”应意指任何核酸分子，包含但不限于DNA、RNA和其杂交体。在一个实施例中，形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及其衍生物。
这些碱基的“衍生物”或“类似物”是本领域熟知的，并且例示在PCR系统、试剂和消耗品(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)目录1996-1997,美国新泽西州布兰奇堡罗氏分子系统公司(Roche Molecular Systems,Inc.))中。
“核苷酸残基”是在并入到多核苷酸中并由此成为多核苷酸单体后在其存在的状态下的单个核苷酸。因此，核苷酸残基是多核苷酸的核苷酸单体，例如，DNA，所述核苷酸单体通过其糖的3'位置处的磷酸二酯键与多核苷酸的相邻核苷酸单体结合，并且通过其磷酸基团与第二相邻核苷酸单体结合，除了(i)3'端核苷酸残基仅通过来自其磷酸基团的磷酸二酯键与多核苷酸的一个相邻核苷酸单体结合，并且(ii)5'端核苷酸残基仅通过其糖的3'位置处的磷酸二酯键与多核苷酸的一个相邻核苷酸单体结合之外。
“底物”或“表面”应意指固相中存在的可以附着核酸或药剂的任何合适的介质。非限制性实例包含芯片、珠粒、纳米孔结构和柱。在一个实施例中，固体底物可以存在于溶液中，所述溶液包含水溶液、凝胶或流体。
“杂交”应意指基于众所周知的序列互补性原理将一种单链核酸粘接到另一种核酸。在一个实施例中，另一种核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向取决于其环境的温度和离子强度、核酸的长度和互补性程度。这些参数对杂交的影响是本领域中众所周知的(参见Sambrook J、Fritsch EF、Maniatis T.1989.《分子克隆：实验室手册(Molecular cloning:a laboratory manual)》.冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress),纽约)。如本文所使用的，引物序列或DNA延伸产物与另一种核酸的杂交应意指充分粘接使得所述引物或DNA延伸产物分别通过与能够形成磷酸二酯键的可用核苷酸或核苷酸类似物形成磷酸二酯键而可延伸。
如本文所使用的，除非另有说明，否则“独特的”或“不同于”另一个碱基或所列举的碱基列表的碱基应意指所述碱基具有不同于另一个或多个碱基的结构。例如，“独特的”或“不同于”腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的碱基将包含鸟嘌呤碱基或尿嘧啶碱基。
如本文所使用的，除非另有说明，否则与参考分子的标记或标签部分不同的标记或标签部分意指标记或标签部分具有与其它/参考标记或标签部分的化学结构不同的化学结构。
如本文所使用的，除非另有说明，否则“引物”意指寡核苷酸，当与多核苷酸模板形成双链体时，所述寡核苷酸能够作为聚合酶并入点并且从其3'端沿模板延伸，由此产生延伸的双链体。
如本文所使用的，“烷基”包含具有规定数量的碳原子的支链和直链饱和脂肪族烃基，并且可以是未经取代的或经取代的。因此，如“C1-Cn烷基”中的C1-Cn包含具有1个、2个、……、n-1个或n个碳的呈直链或支链布置的基团。例如，“C1-C5烷基”包含具有1个、2个、3个、4个或5个碳的呈直链或支链布置的基团，并且具体地包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和戊基。
如本文所使用的，术语“烯基”是指直链或支链的非芳香族烃基，其含有至少1个碳-碳双键，并且可以存在多达最多可能数量的非芳香族碳-碳双键，并且可以是未经取代的或经取代的。例如，“C2-C5烯基”意指分别具有2个、3个、4个或5个碳原子和至多1个、2个、3个或4个碳-碳双键的烯基。烯基包含乙烯基、丙烯基和丁烯基。
术语“炔基”是指直链或支链的烃基，其含有至少1个碳-碳三键，并且可以存在多达最多可能数量的非芳香族碳-碳三键，并且可以是未经取代的或经取代的。因此，“C2-C5炔基”意指具有2个或3个碳原子和1个碳-碳三键或具有4个或5个碳原子和多达2个碳-碳三键的炔基。炔基包含乙炔基、丙炔基和丁炔基。
术语“经取代的”是指如上所述的如烷基或烃基等官能团，其中所含有的与氢原子的至少一个键被与非氢或非碳原子的键所替代，条件是维持正常的化合价并且取代产生稳定的化合物。被取代的基团还包含其中到一个或多个碳或一个或多个氢的一个或多个键被到杂原子的一个或多个键(包括双键或三键)替代的基团。取代基的非限制性实例包含上述官能团以及例如N例如以便形成-CN。
贯穿本申请，各个方案中使用的大多数核苷酸类似物含有在3'O位置处的二硫甲基(DTM(SS))封闭基团，并且含有在碱基与染料或锚定物分子之间的接头中的可切割的DTM(SS)基团。先前的方法将SS基团放置在碱基与染料之间，但在切割后会形成游离的反应性-SH基团，在可以进行第二延伸反应之前，必须用碘乙酰胺对所述-SH基团进行封端(Mitra等人,2003,Turcatti等人,2008)。这限制了测序读段的长度。本申请中公开的碱基与荧光团之间的新的基于DTM的接头不需要在用THP切割后对所得游离SH基团进行封端，因为切割的产物会立即塌缩为稳定的OH基团。
第I节：涉及使用聚合酶上的供体荧光团和核苷酸类似物上的受体荧光团进行能量转移的新的SBS方法
Ju等人(WO 2017/176677 A1)先前描述了利用聚合酶上的供体染料以及核苷酸可逆终止子(NRT)、不可并入的核苷酸或天然核苷酸上的受体染料的SBS的能量转移方法。这将供体和受体染料置于2-4nm范围内，小于高效荧光共振能量转移(FRET)所需的10nm。其中描述了三种通用类型的SBS。第一种使用3'封闭的NRT，其中受体染料在末端磷酸位置处。在存在如Sr++等非催化金属的情况下进行聚合酶反应，以提供足够的时间来测量在由酶、模板、引物和核苷酸组成的聚合酶三元复合物中从供体到受体的能量转移。然后添加如Mg++等催化金属以允许并入，同时与受体染料一起释放焦磷酸盐或多磷酸盐。最后，3'封闭基团的切割恢复了3'-OH以供下一个循环使用。
其中公开的第二种通用类型的SBS使用了在碱基或末端磷酸位置上带有受体染料的不可并入的核苷酸。这些核苷酸结合足够长时间以测量三元复合物中的FRET，并且然后在竞争反应中被未标记的NRT替代，随后切割并入的NRT上的封闭基团。其中公开的第三种通用类型的SBS使用了在末端磷酸上带有组合FRET受体染料的天然核苷酸。描述了实时单分子方法。
本文公开的发明提供了一种新颖且替代类型的SBS(图1)，其中使用未标记的聚合酶并入带有受体染料的核苷酸类似物(可逆终止子，包含虚拟终止子或3'封闭的NRT)，之后用一种带有供体染料的核苷酸类似物替代聚合酶。使用通过在3'位置或碱基上的可切割接头附接到受体染料(例如，Cy5)的模板、引物、可逆终止子以及高效接受此类核苷酸的未标记的DNA聚合酶进行延伸。在洗掉未并入的核苷酸之后，带有附接到活性位点附近的一个或多个氨基酸的供体染料(例如，Cy3或Cy2)的聚合酶流入系统中。标记的聚合酶可以与未标记的聚合酶交换以结合模板/延伸的引物。通过激发供体染料并测量来自受体染料的发射来检测能量转移。在另外的洗涤之后，核苷酸上的染料被切割并且3'-OH再生，以允许发生SBS的下一个循环。
尽管供体染料分子附接到聚合酶并且受体染料附接到核苷酸是本文所描述的实例中示出的方法，但相反的放置也在本发明的范围内。所述方法可以用于集合或单分子测序。因为在此方法期间聚合酶需要脱离和打开，所以模板或引物应附接到表面，在单分子测序的情况下不进行扩增，或者随后在集合测序的情况下进行扩增(例如，簇形成)。
尽管未示出，本发明提供了本文呈现的方案的简化变体，荧光标记的聚合酶可以用于并入和能量转移两者，前提是荧光修饰的聚合酶保留其聚合酶活性的基本方面(高反应速度和保真度)。
所述方法可以与多种类型的核苷酸类似物和多种单色SBS方法一起使用。例如，受体染料可以附接到具有可切割的3'封闭基团和可切割接头的传统核苷酸可逆终止子(NRT)上以将染料附接在碱基上，受体染料可以附接到具有3'-OH基团和可切割接头的虚拟终止子上以将封闭基团和染料附接到碱基上，或者当后者在混合SBS/Sanger测序方法中与未标记的NRT组合使用时，受体染料甚至可以附接到双脱氧核苷酸(ddNTP)(Ju等人,US 2016/0024574 A1；Guo等人,2008)。3'封闭的NRT和虚拟终止子设计可以用于单分子测序或集合测序。在目前现有技术下，ddNTP设计仅可以用于集合测序。
本发明针对单色边合成边测序提供可以一次添加一个的NRT或虚拟终止子(例如，A、G、C、T、A、G、C、T等)，如方案P1和P2中，或者它们可以一起添加。本发明还提出，在同时添加的情况下，染料可以通过4个不同的可切割接头附接，在每个切割步骤后进行成像(方案P3和P7)，通过4种锚定物和锚定物结合分子附接，在每个标记步骤后进行成像(方案P4和P8)，或者通过2个可切割接头以及2种锚定物和锚定物结合分子的正交组合附接，在每个标记和切割步骤后进行成像(方案P5和P9)。
最后，本发明提供了实施例，其中受体染料可以直接附接到核苷酸类似物中的一种或多种核苷酸类似物，并且通过锚定物和锚定物结合分子间接附接到其它核苷酸类似物，在延伸、标记和切割步骤后进行成像(方案P6和P10)。
尽管本文示出的本发明的非限制性实例利用Cy3(或Cy2)作为供体荧光团并且利用Cy5作为受体荧光团，但多种其它供体-受体对是可用的并且可以被使用。尽管本文示出的所有非限制性实例都是单色方法以充分利用FRET技术，但在使用组合FRET受体染料作为所提供的本发明的一部分的情况下，可以考虑2色甚至4色方案。虽然本文描述的非限制性实例示出了通过受体染料的发射信号的出现来测量能量转移，本发明还提供了一种跟踪供体发射的损失和受体发射的增益的比率方法，所述方法在准确性和背景表征方面，特别是在使用组合方法的情况下提供了另外的益处。
存在许多用于将供体染料分子缀合到聚合酶的氨基酸的方法。
本领域技术人员将了解利用如赖氨酸(通过N-羟基琥珀酰亚胺)或半胱氨酸(通过马来酰亚胺)的关键氨基酸残基来衍生聚合酶的若干方法。这些连接可以涉及同双功能或异双功能试剂、双接头系统，如可从TriLink公司(Chromalink试剂)获得的系统，或TCO与四嗪之间的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应。接头分子末端上的NHS酯或异硫氰酸酯基团的存在允许其附接到聚合酶的赖氨酸的N端氨基或伯氨基。接头上的马来酰亚胺或碘乙酰胺的存在允许其附接到聚合酶的半胱氨酸上的SH基团。此类基团还可以用于连接到氨基或巯基修饰的染料分子。选择合适的染料与聚合酶的比率是基于聚合酶中可用的可修饰氨基酸的数量确定的。
文献中描述了多种其它缀合策略，其中一些涉及将非天然氨基酸放置在期望的位置以实现染料的高度特异性附接。有可能调整胶体量子点(QD)以充当能量转移供体。一种用于将QD附接到活性T7 RNA聚合酶分子的方法已经公开(Eriksen等人,2013)。
实例P1：使用在聚合酶上的供体染料与核苷酸类似物上的受体染料之间的能量转移以及一个接一个地添加四种核苷酸类似物的单色SBS(方案P1和P2)：
方案P1(图16)中呈现的通用方案展示了一次添加一种核苷酸类似物(虚拟终止子或3'封闭的NRT)的基础1色方法。图16中展示的方案P1的实例假设在每个添加循环中都已经添加正确的核苷酸类似物。
在初始步骤中，DNA聚合酶反应允许在增长的引物链的3'端并入与模板DNA上的相同位置处的碱基互补的核苷酸类似物；此核苷酸具有通过可切割接头附接的FRET受体荧光团。在第二步骤中，聚合酶与缀合到FRET供体荧光团中的一种或多种FRET供体荧光团的聚合酶交换。当供体在其最大吸收附近被激发时，供体和受体染料彼此足够接近，以进行从供体到受体的能量转移。供体染料在聚合酶上的精确放置被设计成增加可逆终止子上的受体染料最大FRET的可能性。测量所产生的受体荧光团的(如果需要的话，供体荧光团的)的发射。
这些激发、能量转移和发射事件由图16中的箭头指示。在第三步骤中，受体染料和任何阻断进一步核苷酸并入的基团被切割。在每个循环中重复这三个步骤。在步骤之间进行洗涤以去除未并入的NRT、聚合酶、化学可切割剂和其它反应组分。
方案P2(图17A-17B)是方案P1的具体实例，其中使用Cy3作为供体并且使用Cy5作为受体并且按A、G、C、T、A、G、C、T等的顺序添加NRT进行多个循环。与涉及一次添加一种核苷酸的所有此类方法一样，SBS的进展将依赖于序列。因此，在方案P2中，4个DNA模板至少在示出的短距离内以稍微不同的速率延伸。必须使用3'封闭的NRT(或虚拟终止子，如果期望的话)替代天然核苷酸，以准确地解码均聚物延伸(例如，AAA或GG)。图4中呈现了用于此方案的FRET受体染料标记的NRT的示例结构。
实例P2：使用在聚合酶上的供体染料与核苷酸类似物上的受体染料之间的能量转移以及同时添加四种核苷酸类似物的单色SBS(方案P3-P10)：
在方案P3(图18A-18B)中，所述方法示出为使用虚拟终止子(带有大量或酸性基团(阻断剂)的核苷酸类似物通过可切割接头附接到碱基)，所述虚拟终止子在很大程度上阻止了后续核苷酸的并入。除了此封闭基团之外，FRET受体荧光染料(Cy5)还通过在阻断剂远侧的第二接头附接在碱基上。在图18A-18B中描绘的示例方案中，4个不同碱基的接头具有在碱基与封闭基团之间的DTM(SS)基团以及3个不同的可切割基团(即，用于C的偶氮(N2)、用于A的烯丙基、用于G的2-硝基苄基(2-NB))或在封闭基团与用于T的染料之间没有另外的可切割基团。四个虚拟终止子一起添加。图3A中呈现了这些和其它可切割接头的结构。
在将未标记的聚合酶并入并且用含有供体染料的聚合酶(示出为Cy3，但也可以使用Cy2)替代后，测量FRET，由于并入了4种核苷酸中的任何一种，因此所述FRET呈现为非特异性信号。在接下来的步骤中，接头被一个接一个地切割，并且重新添加Cy3-聚合酶并重复成像，以查看FRET信号是否保留或损失。FRET信号的损失立即揭示了所并入的特异性核苷酸类似物。因此，用Pd(0)切割烯丙基接头后的信号损失指示A的并入，用连二亚硫酸钠切割偶氮接头后的信号损失指示C的并入，用约340nm光对2-NB接头进行光切割后的信号损失指示G的并入，并且用THP切割DTM(SS)接头后的信号损失指示T的并入。THP切割(应始终是每个循环中的最终切割反应)还会去除所有封闭基团，从而为下一个SBS循环准备延伸的引物。
尽管在图18A-18B中展示的方案中没有指示，但如果执行了集合测序，则可以在每个完整循环期间或之后使用非荧光NRT执行追踪步骤，以确保所有增长的引物链保持对齐，以便避免在检测步骤中跳过碱基。在这种情况下，在下一个循环开始之前，需要切割这些追踪核苷酸上的3'封闭基团，例如，DTM(SS)或叠氮基甲基。
在方案P4(图19A-19B)中，同样对于虚拟终止子，代替在每个循环中四个碱基上染料的顺序切割，此方法涉及四个碱基的顺序标记。虚拟终止子上的封闭基团全部通过相同的可切割接头与碱基连接，并且在阻断剂的远侧存在与四种不同锚定物中的一种锚定物的不可切割接头。在所描绘的示例方案中，4个不同碱基的接头具有在碱基与封闭基团之间的DTM(SS)基团，并且A、C、G和T的锚定物分别是生物素、DBCO、四嗪和TCO。四个虚拟终止子一起添加。图3B中呈现了这些和其它锚定物和锚定物结合分子的结构。
在将未标记的聚合酶并入并且用含有供体染料的聚合酶(示出为Cy3，但也可以使用Cy2)替代后，测量FRET，由于并入了4种核苷酸中的任何一种，因此所述FRET呈现为非特异性信号。在接下来的步骤中，一个接一个地添加附接到锚定物结合分子的染料，并且重新添加Cy3-聚合酶，并且重复成像，以查看是否出现新的FRET信号。FRET信号的增益立即揭示了所并入的特异性核苷酸类似物。因此，用链霉亲和素-Cy5进行标记后FRET信号的增益指示用A延伸，用N3-Cy5进行标记后FRET信号的增益指示用C延伸，用TCO-Cy5进行标记后FRET信号的增益指示用G延伸，并且用四嗪-Cy5标记后FRET信号的增益指示用T延伸。最后，用THP进行的处理去除所有染料和封闭基团，从而为下一个SBS循环准备延伸的引物。在使用集合测序的情况下，可以按照与方案P3中描述的相同的方式执行追踪步骤。
在方案P5(图20A-20B)中，所述方法与方案P3中的虚拟终止子一起示出，在这种情况下，碱基与阻断剂之间有DTM(SS)基团，并且锚定物分子(生物素或TCO)的DTM(SS)或偶氮接头在封闭基团远侧。每种核苷酸类似物都有不同的可切割接头(偶氮或DTM(SS))和锚定物(生物素或TCO)的组合。因此，A仅具有DTM(SS)可切割接头和生物素；T具有DTM(SS)以及偶氮接头和TCO两者；C具有DTM(SS)以及偶氮接头和生物素两者；并且G仅具有DTM(SS)可切割接头和TCO。四个虚拟终止子一起添加。
在并入后，将未标记的聚合酶选择性地替换为含有供体染料的聚合酶(示出为Cy3，但也可以使用Cy2)并且测量背景FRET。接下来，使用链霉亲和素-Cy5执行标记步骤，以将染料附接到可逆终止子上的生物素锚定物，并且在洗涤后添加Cy3-聚合酶。将观察FRET以确定A或C的并入。使用四嗪-Cy5执行第二标记步骤，以将染料附接到可逆终止子上的TCO锚定物，并且在洗涤后再次添加Cy3-聚合酶。检测到FRET将指示T或G的并入。在此之后，用连二亚硫酸钠切割偶氮接头和其附接的染料，随后重新添加Cy3-聚合酶，并且FRET测量将具体揭示哪种核苷酸类似物被并入。由于A或C并入而导致的信号损失将指示C的并入。由于G或T并入而导致的信号损失将指示T的并入。剩余的信号将分别指示A和G的并入。
最后，用THP或TCEP进行的处理将切割含有接头的DTM和所有封闭基团，从而去除所有剩余的染料，为下一个循环做好准备。
任选的Cy3-聚合酶添加将证实不存在FRET信号。尽管方案中没有指示，但如果执行了集合测序，则可以在每个完整循环期间或之后使用非荧光NRT执行追踪步骤，以确保所有增长的引物链保持对齐，以便避免在检测步骤中跳过碱基。在这种情况下，在下一个循环开始之前，需要切割这些追踪核苷酸上的3'封闭基团，例如，DTM(SS)。
方案P6(图21A-21B)与方案P5有些类似，再次使用在碱基与阻断剂之间的接头中带有DTM(SS)基团的虚拟终止子，并且在阻断剂远侧的接头中使用DTM(SS)或Azo基团以附接到Cy5或生物素。每种核苷酸类似物都有不同的可切割接头(偶氮或DTM(SS))以及染料(Cy5)或锚定物(生物素)的组合。因此，A具有DTM(SS)可切割接头和Cy5，C具有偶氮可切割接头和生物素，G具有SS可切割接头和生物素，并且T具有偶氮可切割接头和Cy5。四个虚拟终止子一起添加。
在并入后，将未标记的聚合酶选择性地替换为含有供体染料的聚合酶(示出为Cy3，但也可以使用Cy2)并且测量FRET。FRET信号将指示用A或T延伸。接下来，使用链霉亲和素-Cy5执行标记步骤，以将染料附接到剩余的可逆终止子上的生物素锚定物，并且在洗涤后添加Cy3-聚合酶。将观察FRET以确定C或G的并入。使用连二亚硫酸钠执行切割步骤，以从具有偶氮接头(C和T)的核苷酸类似物中去除染料，并且在洗涤后，再次添加Cy3-聚合酶。当延伸步骤后的成像指示A或T时，FRET信号的保留将指示A的并入；并且当标记步骤后的成像指示C或G时，指示G。信号损失将指示在前一种情况下并入T，并且在后一种情况下并入C。
最后，用THP或TCEP进行的处理将切割含有接头的DTM和所有封闭基团，从而去除所有剩余的染料，为下一个循环做好准备。任选的Cy3-聚合酶添加将证实不存在FRET信号。在集合测序的情况下，可以完全按照方案P5来执行追踪步骤。
方案P7-P10(图22-25)分别与方案P3-P6基本相同，除了使用具有3'-DTM(SS)阻断剂的核苷酸可逆终止子代替虚拟终止子之外。在方案P7(图22A-22B)中，碱基与受体染料之间的接头上的可切割基团是用于T的DTM(SS)、用于A的烯丙基、用于C的偶氮以及用于G的2-硝基苄基。在方案P8(图23A-23B)中，锚定物是用于A的生物素、用于C的TCO、用于G的DBCO以及用于T的四嗪，其中Cy5标记的锚定物结合分子分别为链霉亲和素、四嗪、N3和TCO。在方案P9(图24A-24B)中，接头中的可切割基团的正交集合以及其附接到的锚定物是用于A的DTM(SS)和生物素、用于T的偶氮和TCO、用于C的偶氮和生物素以及用于G的DTM(SS)和TCO。在方案P10(图25A-25B)中，正交集合由以下组成：碱基与Cy5之间的用于A的DTM(SS)接头、碱基与生物素之间的用于C的偶氮接头、碱基与生物素之间的用于G的DTM(SS)接头以及碱基与Cy5之间的用于T的偶氮接头。在最后的TCEP或THP处理步骤中，不仅去除了任何剩余的染料，而且3'封闭基团也被切割，从而恢复3'-OH基团，为下一个边合成边测序循环做好准备。
第II节：涉及使用可逆终止子上的受体荧光团和相邻不可并入的核苷酸上的供体荧光团的能量转移的新的SBS方法
本文描述的发明提供了一种方法，其中供体染料和受体染料位于两个相邻的核苷酸上，其中第一(更多5')可并入核苷酸是携带受体染料(例如，Cy5)的可逆终止子(虚拟终止子或可逆3'封闭的dNTP)，并且第二(更多3')核苷酸是携带供体染料(例如，Cy3)的不可并入的核苷酸。(可替代地，可以使用Cy5标记的ddNTP与未标记的3'封闭的dNTP的混合物连同Cy3标记的不可并入的核苷酸，但仅用于集合测序。)
已经描述了多种不可并入的核苷酸，包含具有α,β-亚甲基或硫代磷酸盐而不是天然三磷酸盐或多磷酸盐基团的类似物；许多其它实例是已知的，并且若干个实例在Ju等人,WO 2017/176677 A1中进行了说明，本文中图13中有4个实例。
此方法背后的构思是，不可并入的核苷酸将与NRT并入位点的3'位置结合，并且停留足够长的时间以发生FRET。虽然有许多可能的方案，其中一些在下面的实施例中示出，为了便于介绍所述方法，本文描述的方案的非限制性实例示出了一个接一个地添加含有受体染料的核苷酸(例如，A、G、C、T、A、G、C、T等)的一般情况。为了进一步简化这些通用方案以便于理解，本文描述的非限制性实例示出为使用传统核苷酸可逆终止子(NRT)，所述传统核苷酸可逆终止子具有在3'O位置处的可切割封闭基团以及通过可切割接头附接在碱基上的染料(嘧啶的5位置或嘌呤的7位置)。
在存在模板的情况下进行延伸的同时或之后，添加引物、聚合酶和受体染料标记的NRT中的一个受体染料标记的NRT(例如，A)、具有附接的供体染料的一组4种不可并入的核苷酸，并且测量能量转移(供体染料的激发和受体染料发射的检测)。如果并入了A，则将发生能量转移。进行切割以从NRT中去除受体染料和3'封闭基团；无需切割不可并入的核苷酸上的染料，这些核苷酸被简单地洗掉。然后添加下一个受体染料标记的NRT(例如，G)和具有附接的供体染料的一组4个不可并入的核苷酸，测量FRET，并且切割受体染料和封闭基团。只要需要对模板进行测序，就重复所述过程。
必须使用3'封闭的NRT(或虚拟终止子，如果期望的话)而不是携带受体染料的天然核苷酸，以准确地解码均聚物延伸(例如，AAA或GG)。(虽然所有四种不可并入的核苷酸(A、C、G和T)都可以一起添加，但可以简单地添加通用的不可并入的核苷酸类似物(例如，2'-脱氧肌苷、2'-脱氧水粉菌素等)。
上面的实例需要一个接一个地添加四个NRT(方案U1(图26)和U2(图27A-27B))。其它单色方法也可以利用含有供体染料的不可并入的核苷酸将能量转移到NRT上的受体染料，从而允许在每轮SBS中添加所有四个NRT。例如，如果使用不同的可切割接头(偶氮、烯丙基、2-硝基苄基、二硫甲基)将受体染料附接到4个NRT，则可以在特异性地切割每个接头(连二亚硫酸钠、Pd(0)、约340nm光、TCEP)后测量FRET，如在方案U3(图28A-28B)和U7(图32A-32B)中一样。
类似地，如果使用具有四种不同锚定物(生物素、TCO、四嗪、叠氮化物)之一和等效的含有受体染料的锚定物结合分子(链霉亲和素、四嗪、TCO、DBCO)的NRT，则可以在每个标记反应后测量FRET，如在方案U4(图29A-29B)和U8(图33A-33B)中一样。
最后，可以使用受体染料标记的NRT的正交集合，所述NRT具有2种锚定物中的任何一种以及2个可切割接头中的任何一个，其中在标记和切割步骤后测量FRET(方案U5(图30A-30B)和U9(图34A-34B)，或者使用具有2个可切割接头的正交集合，但其中两个直接连接到Cy5，并且另外两个直接连接到生物素，其中在延伸、标记和切割步骤后测量FRET(方案U6(图31A-31B)和U10(图35A-35B))。
本文提供的本发明的非限制性实例仅示出具有虚拟终止子或3'封闭的NRT的实例，其中任一者均可以用于集合和单分子SBS方案两者。并入低浓度的受体标记的双脱氧核苷酸与较高浓度的未标记的NRT连同含有不可并入的供体染料的核苷酸的组合的混合方法也是可能的并且在本发明的范围内，但仅用于集合测序。最后，虽然优选将供体染料放置在不可并入的核苷酸上并且将受体染料放置在NRT上，但相反的放置也是可行的并且在本发明的范围内。
实例U1：使用在增长的引物链的不可并入的核苷酸上的供体染料与不可并入的核苷酸类似物上的受体染料之间的能量转移以及一个接一个地添加4种不可并入的核苷酸类似物的单色SBS(方案U1和U2)：
方案U1中呈现的通用方案展示了一次添加一种核苷酸类似物(3'封闭的NRT或虚拟终止子)的基础1色方法。方案U1(图26)中展示的实例假设在每个添加循环中都已经添加正确的核苷酸类似物。在初始步骤中，DNA聚合酶反应允许在增长的引物链的3'端并入与模板DNA上的相同位置处的碱基互补的核苷酸类似物。此核苷酸具有通过可切割接头附接的FRET受体荧光团。同时或随后，添加一组用FRET供体荧光团标记的不可并入的核苷酸。这些将间歇性地且瞬时地结合，但不会在紧邻所并入的可逆终止子的3'的位置处并入。(虽然可以添加所有四种不可并入的核苷酸，但也可以使用具有可以与A、C、T和G结合的通用碱基的单一(或可能两种类型的)不可并入的核苷酸。)当供体在其最大吸收附近被激发时，供体和受体染料彼此足够接近，以进行从供体到受体的能量转移。
不同长度的刚性或柔性接头的使用可以用于使FRET最大化。测量所产生的受体荧光团的发射(如果需要的话，供体荧光团的发射)。这些激发、能量转移和发射事件由图26中例示的方案中的箭头指示。在下一步骤中，受体染料和任何阻断进一步核苷酸并入的基团被切割。在每个循环中重复这些步骤。在步骤之间进行洗涤以去除未并入的NRT、聚合酶、化学可切割剂和其它反应组分。
方案U2(图27A-27B)提供了方案U1的具体实例，其中使用Cy3作为供体并且使用Cy5作为受体并且按A、G、C、T、A、G、C、T等的顺序添加NRT进行多个循环。与涉及一次添加一种核苷酸的所有此类方法一样，SBS的进展将依赖于序列。因此，在方案U2中，4个DNA模板至少在示出的短距离内以稍微不同的速率延伸。尽管供体染料分子附接到不可并入的核苷酸并且受体染料附接到NRT是实例中示出的方法，但相反的放置也是可行的。必须使用3'封闭的NRT(或虚拟终止子，如果期望的话)替代天然核苷酸，以准确地解码均聚物延伸(例如，AAA或GG)。
实例U2：使用在增长的引物链的不可并入的核苷酸上的供体染料与不可并入的核苷酸类似物上的受体染料之间的能量转移以及同时添加4种不可并入的核苷酸类似物的单色SBS(方案U3-U10)：
在方案U3(图28A-28B)中，所述方法示出为使用虚拟终止子(携带大量基团(阻断剂)的核苷酸类似物通过可切割接头附接到碱基)，所述虚拟终止子在很大程度上阻止了后续核苷酸的并入。除了此封闭基团之外，FRET受体荧光染料(Cy5)还通过在阻断剂远侧的第二接头附接在碱基上。在所描绘的示例方案中，4个不同碱基的接头具有在碱基与封闭基团之间的DTM(SS)基团以及3个不同的可切割基团(即，用于C的偶氮、用于A的烯丙基、用于G的2-硝基苄基)或在封闭基团与用于T的染料之间没有另外的可切割基团。图3B中呈现了这些和其它可切割接头的结构。
四个虚拟终止子一起添加。随后(或同时)，添加含有四种供体染料(Cy3，但也可以使用Cy2)的不可并入的核苷酸。测量FRET，由于并入了4种核苷酸中的任何一种，因此所述FRET呈现为非特异性信号。在接下来的步骤中，可逆核苷酸上的接头被一个接一个地切割，并且添加不可并入的核苷酸连同聚合酶并且重复成像，以确定FRET信号是否保留或损失。FRET信号的损失立即揭示了所并入的特异性核苷酸类似物。
因此，用Pd(0)切割烯丙基接头后的信号损失指示A的并入，用连二亚硫酸钠切割偶氮接头后的信号损失指示C的并入，用约340nm光对2-NB接头进行光切割后的信号损失指示G的并入，并且用THP切割DTM(SS)接头(应始终是每个循环中的最终切割反应)后的信号损失指示T的并入。THP切割还会去除所有封闭基团，从而为下一个SBS循环准备延伸的引物。
尽管在图28A-28B中例示的方案中没有指示，但如果执行了集合测序，则可以在每个完整循环期间或之后使用非荧光NRT执行追踪步骤，以确保所有增长的引物链保持对齐，以便避免在检测步骤中跳过碱基。在这种情况下，在下一个循环开始之前，需要切割这些追踪核苷酸上的3'封闭基团，例如，DTM(SS)或叠氮基甲基。
在方案U4(图29A-29B)中，同样对于虚拟终止子，代替在每个循环中四个碱基上染料的顺序切割，此方法涉及四个碱基的顺序标记。虚拟终止子上的封闭基团全部通过相同的可切割接头与碱基连接，并且在阻断剂的远侧存在与四种不同锚定物中的一种锚定物的不可切割接头。
在图29A-29B所描绘的示例方案中，4个不同碱基的接头具有在碱基与封闭基团之间的DTM(SS)基团，并且A、C、G和T的锚定物分别是生物素、DBCO、四嗪和TCO。四个虚拟终止子一起添加。图3B中呈现了这些和其它锚定物和锚定物结合分子的结构。
在并入并添加聚合酶和含有供体染料(示出为Cy3，但也可以使用Cy2)的不可并入的核苷酸后，测量FRET，由于并入了4种核苷酸中的任何一种，因此所述FRET呈现为非特异性信号。在接下来的步骤中，一个接一个地添加附接到锚定物结合分子的染料，并且在存在聚合酶和用供体染料标记的不可并入的核苷酸的情况下重复成像，以查看是否出现新的FRET信号。FRET信号的增益立即揭示了所并入的特异性核苷酸类似物。因此，用链霉亲和素-Cy5进行标记后FRET信号的增益指示用A延伸，用N3-Cy5进行标记后FRET信号的增益指示用C延伸，用TCO-Cy5进行标记后FRET信号的增益指示用G延伸，并且用四嗪-Cy5标记后FRET信号的增益指示用T延伸。最后，用THP进行的处理去除所有封闭基团，从而为下一个SBS循环准备延伸的引物。在使用集合测序的情况下，可以按照与方案U3(图28A-28B)中描述的相同的方式执行追踪步骤。
在方案U5(图30A-30B)中，所述方法与方案U3(图28A-28B)中的虚拟终止子一起示出，在这种情况下，碱基与阻断剂之间有DTM(SS)基团，并且锚定物分子(生物素或TCO)的DTM(SS)或偶氮接头在封闭基团远侧。每种核苷酸类似物都有不同的可切割接头(偶氮或DTM(SS))和锚定物(生物素或TCO)的组合。因此，A仅具有DTM(SS)可切割接头和生物素；T具有DTM(SS)以及偶氮接头和TCO两者；C具有DTM(SS)以及偶氮接头和生物素两者；并且G仅具有DTM(SS)可切割接头和TCO。四个虚拟终止子一起添加。
随后或同时，添加一组具有附接的供体染料(示出为Cy3，但也可以使用Cy2)的不可并入的核苷酸并测量背景FRET。接下来，使用链霉亲和素-Cy5执行标记步骤，以将染料附接到可逆终止子上的生物素锚定物，并且在洗涤后，添加一组Cy3标记的不可并入的核苷酸。将观察FRET以确定A或C的并入。使用四嗪-Cy5执行第二标记步骤，以将染料附接到可逆终止子上的TCO锚定物，并且在洗涤后再次添加一组Cy3标记的不可并入的核苷酸。检测到FRET将指示T或G的并入。在此之后，用连二亚硫酸钠切割偶氮接头和其附接的染料，随后重新添加Cy3标记的不可并入的核苷酸，并且FRET测量将具体揭示哪种核苷酸类似物被并入。
由于A或C并入而导致的信号损失将指示C的并入。由于G或T并入而导致的信号损失将指示T的并入。剩余的信号将分别指示A和G的并入。最后，用THP或TCEP进行的处理将切割含有接头的DTM和所有封闭基团，从而去除所有剩余的染料，为下一个循环做好准备。
任选的Cy3-聚合酶添加将证实不存在FRET信号。尽管方案中没有指示，但如果执行了集合测序，则可以在每个完整循环期间或之后使用非荧光NRT执行追踪步骤，以确保所有增长的引物链保持对齐，以便避免在检测步骤中跳过碱基。在这种情况下，在下一个循环开始之前，需要切割这些追踪核苷酸上的3'封闭基团，例如，DTM(SS)。
方案U6(图31A-31B)与方案U5(图30A-30B)有些类似，再次使用在碱基与阻断剂之间的接头中带有DTM(SS)基团的虚拟终止子，并且在阻断剂远侧的接头中使用DTM(SS)或Azo基团以附接到Cy5或生物素。每种核苷酸类似物都有不同的可切割接头(偶氮或DTM(SS))以及染料(Cy5)或锚定物(生物素)的组合。因此，A具有DTM(SS)可切割接头和Cy5，C具有偶氮可切割接头和生物素，G具有SS可切割接头和生物素，并且T具有偶氮可切割接头和Cy5。四个虚拟终止子一起添加。在并入后，任选地添加聚合酶连同含有供体染料的不可并入的核苷酸(示出为Cy3，但也可以使用Cy2)并且测量FRET。FRET信号将指示用A或T延伸。接下来，使用链霉亲和素-Cy5执行标记步骤，以将染料附接到剩余的可逆终止子上的生物素锚定物，并且在洗涤后，添加聚合酶和含有供体染料的不可并入的核苷酸。将观察FRET以确定C或G的并入。使用连二亚硫酸钠执行切割步骤，以从具有偶氮接头(C和T)的核苷酸类似物中去除染料，并且在洗涤后，再次添加聚合酶和供体染料标记的不可并入的核苷酸。当延伸步骤后的成像指示A或T时，FRET信号的保留将指示A的并入；并且当标记步骤后的成像指示C或G时，指示G。信号损失将指示在前一种情况下并入T，并且在后一种情况下并入C。最后，用THP或TCEP进行的处理将切割含有接头的DTM和所有封闭基团，从而去除所有剩余的染料，为下一个循环做好准备。添加聚合酶和不可并入的核苷酸与供体染料后的任选成像步骤将证实不存在FRET信号。在集合测序的情况下，可以完全按照方案P5(图20A-20B)来执行追踪步骤。
例示的方案U7(图32A-33B)、U8(图33A-33B)、U9(图34A-34B)和U10(图35A-35B)基本上分别与方案U3(图28A-28B)、U4(图29A-29B)、U5(图30A-30B)和U6(图31A-31B)相同，除了使用具有3'-DTM(SS)阻断剂的核苷酸可逆终止子代替虚拟终止子之外。在方案U7(图32A-33B)中，碱基与受体染料之间的接头上的可切割基团是用于T的DTM(SS)、用于A的烯丙基、用于C的偶氮以及用于G的2-硝基苄基。在方案U8(图33A-33B)中，锚定物是用于A的生物素、用于C的TCO、用于G的DBCO以及用于T的四嗪，其中Cy5标记的锚定物结合分子分别为链霉亲和素、四嗪、N3和TCO。在方案U9(图34A-34B)中，接头中的可切割基团的正交集合以及其附接到的锚定物是用于A的DTM(SS)和生物素、用于T的偶氮和TCO、用于C的偶氮和生物素以及用于G的DTM(SS)和TCO。在方案U10(图35A-35B)中，正交集合由以下组成：碱基与Cy5之间的用于A的DTM(SS)接头、碱基与生物素之间的用于C的偶氮接头、碱基与生物素之间的用于G的DTM(SS)接头以及碱基与Cy5之间的用于T的偶氮接头。在最后的TCEP或THP处理步骤中，不仅去除了任何剩余的染料，而且3'封闭基团也被切割，从而恢复3'-OH基团，为下一个边合成边测序循环做好准备。
相同的FRET受体染料标记的核苷酸可逆终止子和虚拟终止子可以用于部分I和II中例示的方案。图4-12中呈现了这些方案的实例，在图3A-3B中展示了碱基与染料或锚定物之间的接头的潜在可切割基团。图4中例示的3'封闭的核苷酸可逆终止子可以与方案P1(图16)、P2(图17A-17B)、U1(图26)和U2(图27A-27B)一起使用。图5中例示的虚拟终止子可以与方案P3(图18A-18B)和U3(图28A-28B)一起使用。图6中例示的虚拟终止子可以与方案P4(图19A-19B)和U4(图29A-29B)一起使用。图7中例示的虚拟终止子可以用于方案P5(图20A-20B)和U5(图29A-29B)。图8中例示的虚拟终止子可以与方案P6(图21A-21B)和U6(图30A-30B)一起使用。图9中例示的3'封闭的核苷酸可逆终止子(NRT)可以与方案P7(图22A-22B)和U7(图31A-31B)一起使用。图10中例示的NRT可以与方案P8(图23A-23B)和U8(图32A-32B)一起使用。图11中例示的NRT可以与方案P9(图24A-24B)和U9(图33A-33B)一起使用。图12中例示的NRT可以与方案P10(图25A-25B)和U10(图34A-34B)一起使用。
可以使用具有不同受体染料或染料簇的许多其它核苷酸类似物集合以及接头中的锚定物和可切割基团的不同组合。Ju等人PCT/US2019/022326中已经呈现了合成类似分子的方案，所述文献特此以全文引用的方式并入本文中。
图13提供了用于与方案U1-U10(图26-35)一起使用的FRET供体-染料标记的不可并入的核苷酸的实例，并且图14和图15中呈现了两种示例不可并入的核苷酸的合成方案，其中染料分别附接到碱基或末端磷酸。各种不可并入的核苷酸的合成方案已在文献中描述(Liang等人,(2008)；Gharizadeh等人,(2002))。
从上文应当理解，虽然已经展示和描述了特定实施方案，但是可以对其进行各种修改并且在本文中设想到。本发明也并不旨在受说明书内提供的具体实例限制。尽管已经参考上述说明书描述了本发明，但本文中的优选实施例的描述和说明并不打算以限制意义理解。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的取决于各种条件和变量的特定描绘、配置或相对比例。本发明的实施例的形式和细节的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，可设想到，本发明还应覆盖任何此类修改、变化和等效物。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。
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Claims (61)

1.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到步骤b中所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；
d)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；
e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
f)从步骤b)的任何并入的核苷酸类似物中切割所述标记和所述封闭基团；
g)其中如果未在步骤d)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到f)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；
h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，
由此确定所述核酸模板的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有附接到所述碱基或在所述3'-OH位置处的封闭基团。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且步骤c)的所述第二核酸聚合酶上的染料是Cy3，和/或其中所述碱基上的所述可切割接头是DTM。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物的3'封闭基团是DTM或叠氮基甲基，并且使用THP进行所述切割。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述核苷酸类似物和/或第二核酸聚合酶上的染料是染料簇。
6.根据权利要求1到3和5中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物选自图4和/或图9的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。
7.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物选自图5的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。
8.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求1到7所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
9.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过不可切割的或不同的可切割接头连接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述碱基的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到并入步骤b中的所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定由于并入所述荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使并入的标记的核苷酸类似物与切割所述可切割接头的切割剂接触，以从所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的一种标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述可切割标记；
g)补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤f)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失，以部分地或完全地鉴定所述并入的核苷酸；
h)使用切割所述可切割接头的切割剂迭代地重复步骤f)和g)，以从不同的标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述标记；
i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定在步骤b)中并入的所述标记的核苷酸类似物；以及
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的荧光标记，并且迭代地执行步骤b到j以获得所述核酸模板的序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有附接到所述碱基或在所述3'-OH位置处的封闭基团。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且步骤c)的所述第二核酸聚合酶上的染料是Cy3，和/或其中染料包括染料簇。
12.根据权利要求9到11中任一项所述的方法，其中步骤b)(i)的所述四种标记的核苷酸类似物各自包括将所述封闭基团连接到所述碱基的相同类型的可切割接头，并且所述四种标记的核苷酸类似物中的三种标记的核苷酸类似物包括连接所述封闭基团的远侧的所述荧光标记的不同的可切割接头，和/或其中所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
13.根据权利要求9到11中任一项所述的方法，其中步骤b)(ii)的所述四种标记的核苷酸类似物各自包括将所述荧光标记连接到所述碱基的不同可切割接头，并且其中所述切割所述可切割接头中的一个可切割接头的切割剂也切割在3'-OH位置处的所述封闭基团，并且其中所述切割在3'-OH处的所述封闭基团的切割剂接触在步骤f)的最终迭代中并入的标记的核苷酸类似物，和/或其中所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
14.根据权利要求9到13中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述四种标记的核苷酸类似物由在a)图5或b)图9中找到的那些标记的核苷酸类似物组成。
15.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求9到14中任一项所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
16.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过所述封闭基团远侧的不可切割接头连接到所述碱基的锚定物，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有不同的锚定物和相同的可切割接头；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物不同的锚定物和相同的接头；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的四种锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；
g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于所述锚定物结合分子与并入步骤b)中的所述锚定物标记的核苷酸类似物结合而产生的任何荧光共振能量转移(FRET)信号；
h)使用对剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子一个接一个地迭代地重复步骤f)和g)，其中相同的荧光染料附接到所有四个锚定物结合分子上；
i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
j)使所述并入的与切割剂接触以从步骤b)的所述并入的核苷酸类似物中切割所述封闭基团和所述锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以由此获得所述核酸模板的序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料各自包括染料簇。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中步骤b)(i)的所述四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到所述碱基的封闭基团、通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物与不同的锚定物结合分子结合，和/或其中所述四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO或四嗪中的一种，并且所述荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中步骤b)ii)的所述四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到所述碱基的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物与不同的锚定物结合分子结合，和/或其中所述四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO和四嗪中的一种，并且其中所述荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
20.根据权利要求16到19中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图6或b)图10的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
21.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求16到20所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
22.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基和通过相同的可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧，并且所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过相同的可切割接头附接到所述封闭基团的远侧；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头附接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同，并且其中剩余的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头是相同和不同的可切割基团；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；
g)鉴定由于步骤f)中的所述标记而产生的新生成的FRET信号，以部分地鉴定步骤b)中的并入的核苷酸类似物；
h)使用对所述第二锚定物具有特异性的第二荧光标记的锚定物结合分子重复步骤e)和f)；
i)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述特异性可切割剂切割所述可切割接头中的一个可切割接头但不切割任何剩余接头；
j)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤i)中执行的切割而导致的FRET信号的损失；
k)通过比较在步骤g)和j)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
l)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割剩余的锚定物和荧光标记；
以及迭代地执行步骤b)到l)以获得所述核酸模板的序列。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料包括染料簇。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括两个不同的可切割接头和两种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述锚定物标记的核苷酸类似物的碱基之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述封闭基团的远侧，从而将所述锚定物连接到所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物的封闭基团，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种由可切割接头1与锚定物1组成，一种由可切割接头1与锚定物2组成，一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物1组成，并且最后一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物2组成，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行，和/或其中所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，其中一个可切割接头(可切割接头1)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，另一个可切割接头(可切割接头2)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物1，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物2，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物1，并且最后一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物2，由此产生一组4种核苷酸类似物，其中能够切割可切割接头1的药剂也去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割可切割接头1之前执行可切割接头2的切割和信号的确定，和/或其中所述可切割接头独立地包括DTM或偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
26.根据权利要求22到25中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图7或b)图11的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
27.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求22到26所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
28.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供第一核酸聚合酶、四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种标记的核苷酸类似物是：
(i)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的相同锚定物；或者
(ii)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第一可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头连接到所述碱基的相同锚定物；
c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是用于所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记的能量转移供体或受体染料；
d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
e)鉴定由于并入任何荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
f)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所述荧光标记的核苷酸类似物上的荧光标记相同；
g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定任何新生成的FRET信号以部分地鉴定由于在步骤f)中执行的标记而并入的核苷酸；
h)使用特异性切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
i)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤g)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失；
j)通过比较在步骤g)和i)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
k)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；
以及迭代地执行步骤b)到k)以获得所述核酸模板的序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料包括染料簇。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述四种标记的核苷酸类似物包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述核苷酸或核苷酸类似物之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述碱基与所述锚定物之间，但在所述核苷酸或核苷酸类似物中的两种核苷酸或核苷酸类似物的封闭基团的远侧，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种包括可切割接头1和锚定物1，一种包括可切割接头1与锚定物2，一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物1，并且最后一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物2，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行，和/或其中可切割接头1包括DTM，可切割接头2包括偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素(锚定物1)和TCO(锚定物2)，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述四种标记的核苷酸类似物2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，第一类型的可切割接头位于所述核苷酸或核苷酸类似物中的一种核苷酸或核苷酸类似物与所述锚定物中的一种锚定物之间，所述第一类型的可切割接头位于第二核苷酸类似物与第二类型的锚定物之间，第二类型的可切割接头位于第三核苷酸类似物与第一锚定物之间，并且所述第二类型的可切割接头位于第四核苷酸类似物与第二锚定物之间，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，其中所述第一类型的可切割接头的切割也能够去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割所述第一类型的可切割接头之前执行所述第二类型的可切割接头的切割和信号的确定，和/或其中所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
32.根据权利要求28到31中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子和荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子和所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图8或b)图12的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
33.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求28到32所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
34.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板和核酸聚合酶；
b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，并且同时或之后立即提供四种包括附接到所述核苷酸类似物的不同荧光染料的不可并入的核苷酸类似物，其中附接到所述不可并入的核苷酸类似物的荧光染料是用于附接到所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物的荧光染料的能量转移供体或受体染料；或者
(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，并且同时或之后立即提供四种包括附接到所述核苷酸类似物的不同荧光染料的不可并入的核苷酸类似物，其中附接到所述不可并入的核苷酸类似物的荧光染料是用于附接到所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物的荧光染料的能量转移供体或受体染料；
c)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；
d)从用所述荧光标记的核苷酸类似物延伸的任何引物中切割所述染料和所述封闭基团；
e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
f)其中如果未在步骤c)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到e)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；
g)用步骤b中描述的所述四种荧光标记的核苷酸中的第二种荧光标记的核苷酸来重复步骤b)到e)；
h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；
i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，
由此获得所述核酸模板的序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤b)中提供的标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)(i)或b)步骤b)(ii)的那些标记的核苷酸类似物。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是Cy3，和/或其中所述可切割接头是DTM并且用THP进行切割，和/或其中所述染料是染料簇，和/或其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料，和/或其中荧光标记的核苷酸类似物是来自图4的那些荧光标记的核苷酸类似物并且所述不可并入的核苷酸类似物是来自图13的那些不可并入的核苷酸类似物。
37.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求34到36所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
38.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过不可切割的或不同的可切割接头连接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者
(ii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述碱基的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；
c)与步骤b)同时或之后立即提供四种不同的荧光标记的不可并入的核苷酸类似物(A，C，T，G)，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的所述能量转移供体或受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)使用切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述切割剂特异性地切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
f)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤e)中执行的切割而导致的任何荧光损失，以部分地鉴定并入的核苷酸；
g)使用特异性地一个接一个切割任何剩余的接头的可切割剂迭代地重复步骤e)和f)；
h)通过比较在步骤f)和i)的多次迭代中获得的结果来确定在步骤b)中并入的特异性核苷酸类似物；
i)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸任何剩余的引物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
39.根据权利要求38所述的方法，其中步骤b)中提供的所述标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)(i)或b)步骤b)(ii)的那些标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料是染料簇。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述可逆封闭的荧光标记的核苷酸类似物包括在所述碱基与所述封闭基团之间相同的可切割接头，并且所述四种类似物中的三种类似物包括在连接到所述荧光标记的封闭基团的远侧的不同的可切割接头，并且剩余的类似物具有在所述封闭基团与标记之间的不可切割的接头，并且其中在每个循环中执行的最后的切割反应对所述碱基与所述封闭基团之间的接头进行切割，和/或其中所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述四种可逆封闭的荧光标记的核苷酸类似物各自包括在所述碱基与所述荧光标记之间不同的可切割接头，并且其中所述四个切割反应中的一个切割反应也能够去除3'封闭基团，并且其中这是在每个循环中执行的最后的切割反应，和/或其中所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2-硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。
42.根据权利要求38到41中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述荧光标记的核苷酸类似物是来自a)图5或b)图9的那些荧光标记的核苷酸类似物并且所述不可并入的核苷酸类似物是来自图13的那些不可并入的核苷酸类似物。
43.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求38到42中任一项所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
44.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过所述封闭基团远侧的不可切割接头连接到所述碱基的锚定物，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有不同的锚定物和相同的可切割接头；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物不同的锚定物和相同的接头；
c)与步骤b)同时或之后立即提供四种不同的锚定物标记的不可并入的核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述能量转移供体或受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)用荧光标记的锚定物结合分子标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与直接标记的核苷酸或核苷酸类似物上的荧光标记相同，并且其中所述锚定物结合分子与步骤b)的特异性核苷酸类似物的锚定物结合；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的荧光信号以部分地鉴定由于在步骤e)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用对剩余的锚定物中的每一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子一个接一个地重复步骤e)和f)，其中相同的荧光染料附接到所有四个锚定物结合分子上；
h)通过比较在步骤f)和g)的多次迭代中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
i)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余的引物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
以及迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料各自包括染料簇。
46.根据权利要求45所述的方法，其中步骤b)(i)的所述四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到所述碱基的封闭基团、通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物与不同的锚定物结合分子结合，和/或其中所述四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO或四嗪中的一种，并且所述荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
47.根据权利要求45所述的方法，其中步骤b)ii)的所述四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到所述碱基的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物与不同的锚定物结合分子结合，和/或其中所述四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO和四嗪中的一种，并且其中所述荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。
48.根据权利要求44到47中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图6或b)图10的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
49.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求44到48所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
50.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：
(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基和通过相同的可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧，并且所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过相同的可切割接头附接到所述封闭基团的远侧；或者
(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头附接到所述碱基的锚定物以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同，并且其中剩余的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同；
c)与步骤b)同时或之后立即加入所有四种荧光标记的不可并入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体染料，所述能量转移供体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的能量转移受体染料；
d)鉴定由于并入荧光标记的核苷酸或核苷酸类似物而产生的荧光信号；
e)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所有锚定物结合分子上的荧光标记相同；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的荧光信号以部分地或完全地鉴定由于在步骤d)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用对第二锚定物具有特异性的第二荧光标记的锚定物结合分子重复步骤e)和f)；
h)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述可切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；
i)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤h)中执行的切割而导致的荧光损失；
j)通过比较在步骤f)和i)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
k)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余的引物；
l)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到l)以获得所述核酸模板的序列。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料包括染料簇。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括两个不同的可切割接头和两种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述锚定物标记的核苷酸类似物的碱基之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述封闭基团的远侧，从而将所述锚定物连接到所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物的封闭基团，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种由可切割接头1与锚定物1组成，一种由可切割接头1与锚定物2组成，一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物1组成，并且最后一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物2组成，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行，和/或其中所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，其中一个可切割接头(可切割接头1)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，另一个可切割接头(可切割接头2)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物1，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物2，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物1，并且最后一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物2，由此产生一组4种核苷酸类似物，其中能够切割可切割接头1的药剂也去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割可切割接头1之前执行可切割接头2的切割和信号的确定，和/或其中所述可切割接头独立地包括DTM或偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
54.根据权利要求50到53中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图7或b)图11的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
55.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求50到54所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
56.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
b)提供核酸聚合酶、四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种标记的核苷酸类似物是：
(i)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的相同锚定物；或者
(ii)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第一可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且
其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及
两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'-OH位置处的封闭基团，
其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的锚定物，并且
其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头连接到所述碱基的相同锚定物；
c)与步骤b同时或之后立即加入所有四种荧光标记的不可并入的核苷酸或核苷酸类似物，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到步骤b)的所述荧光标记的核苷酸的所述能量转移供体或受体染料；
d)在使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸执行追踪步骤以延伸剩余引物后，鉴定由于并入任何荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；
e)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所述荧光标记的核苷酸类似物上的荧光标记相同；
f)重复步骤c)并且鉴定新生成的FRET信号以部分地鉴定由于在步骤e)中执行的标记而并入的核苷酸；
g)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述可切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割正交接头；
h)重复步骤c)并且鉴定由于在步骤g)中执行的切割而导致的任何FRET信号损失，以完全地鉴定并入的核苷酸；
i)通过比较在步骤f)和h)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及
迭代地执行步骤b)到j)以获得所述核酸模板的序列。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料包括染料簇。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述四种标记的核苷酸类似物包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述核苷酸或核苷酸类似物之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述碱基与所述锚定物之间，但在所述核苷酸或核苷酸类似物中的两种核苷酸或核苷酸类似物的封闭基团的远侧，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种包括可切割接头1和锚定物1，一种包括可切割接头1与锚定物2，一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物1，并且最后一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物2，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行，和/或其中可切割接头1包括DTM，可切割接头2包括偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素(锚定物1)和TCO(锚定物2)，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述四种标记的核苷酸类似物2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，第一类型的可切割接头位于所述核苷酸或核苷酸类似物中的一种核苷酸或核苷酸类似物与所述锚定物中的一种锚定物之间，所述第一类型的可切割接头位于第二核苷酸类似物与第二类型的锚定物之间，第二类型的可切割接头位于第三核苷酸类似物与第一锚定物之间，并且所述第二类型的可切割接头位于第四核苷酸类似物与第二锚定物之间，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，其中所述第一类型的可切割接头的切割也能够去除3'-OH封闭基团，并且其中在切割所述第一类型的可切割接头之前执行所述第二类型的可切割接头的切割和信号的确定，和/或其中所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。
60.根据权利要求57到59中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子和荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子和所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且所述不可并入的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图8或b)图12的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。
61.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求57到60中任一项所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。
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