CN113905822B - 使用磁传感器阵列边合成边核酸测序 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于核酸测序的装置，以及制造和使用此类装置的方法。在一些实施例中，所述装置包括磁传感器阵列，所述磁传感器阵列包括多个磁传感器，所述多个磁传感器中的每一个耦接到至少一条地址线；以及邻近所述磁传感器阵列的流体室，所述流体室具有邻近所述磁传感器阵列的近端壁。在一些实施例中，使用所述装置对核酸测序的方法包括(a)将核酸聚合酶的多个分子耦接到所述流体室的所述近端壁；(b)在一或多轮添加中，向所述流体室添加(i)包括引物结合位点和可延伸引物的核酸模板，和(ii)包括第一可切割磁标记的第一磁性标记核苷酸前体、包括第二可切割磁标记的第二磁性标记核苷酸、包括第三可切割磁标记的第三磁性标记核苷酸和包括第四可切割磁标记的第四磁性标记核苷酸；以及(c)对所述核酸模板进行测序，其中对所述核酸模板进行测序包括使用所述至少一条地址线检测所述磁传感器阵列中所述磁传感器的至少一部分的特性，其中所述特性指示所述第一、第二、第三或第四磁性标记核苷酸前体中的哪一个已经被并入所述可延伸引物中。在一些实施例中，使用所述装置对核酸测序的方法包括(a)将核酸链结合到所述近端壁；(b)在一或多轮添加中，向所述流体室中添加(i)可延伸引物，和(ii)核酸聚合酶的多个分子；(c)将包括第一可切割磁标记的第一磁性标记核苷酸前体加入到所述流体室中；以及(d)对核酸模板进行测序，其中对所述核酸模板进行测序包括使用所述至少一条地址线检测所述磁传感器阵列中所述磁传感器的至少第一部分的特性，其中所述特性指示所述第一磁性标记核苷酸前体已经结合到所述核酸聚合酶的所述多个分子中的至少一个分子上或者已经被并入所述可延伸引物中。在一些实施例中，一种制造具有至少一个被配置成容纳流体的流体室的核酸测序器件的方法包括在衬底上制造第一地址线；制造多个磁传感器，每个磁传感器具有底部部分和顶部部分，其中每个底部部分耦接到所述第一地址线；在所述磁传感器之间沉积介电材料；制造多条附加地址线，所述多条附加地址线中的每一条都耦接到所述多个磁传感器中的相应磁传感器的所述顶部部分；以及去除邻近所述多个磁传感器的所述介电材料的部分以产生所述至少一个流体室。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月12日提交的、标题为“使用磁传感器阵列边合成边核酸测序(NUCLEIC ACID SEQUENCING BY SYNTHESIS USING MAGNETIC SENSOR ARRAYS)”的美国临时申请第62/833,130号的权益，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
背景技术
边合成边测序(SBS)是一种可获得大量DNA测序数据的成功的商业可行的方法。SBS涉及引物杂交模板DNA的结合、脱氧核苷三磷酸(dNTP)的并入以及并入dNTP的检测。
目前的测序系统使用荧光信号检测。四个荧光标记的核苷酸被用来并行测序数百万个簇。在DNA合成的连续循环中，DNA聚合酶催化荧光标记的dNTP并入到DNA模板链中。在每个循环中，单个标记的dNTP被添加到核酸链中。核苷酸标记作为聚合的“可逆终止子”。并入dNTP后，通过激光激发和成像鉴定荧光染料，然后酶切进行下一轮并入。在每个循环中，从信号强度测量中直接识别碱基。
依靠荧光信号检测的最先进测序系统每次运行可提供高达200亿次读取。然而，要达到这样的性能，需要大面积的流动池、高精度的自由空间成像光学器件和昂贵的高功率激光器来产生足够的荧光信号，以实现成功的碱基检测。
两种通用策略使得SBS吞吐量逐渐增加(例如，以每次运行的碱基读取次数为特征)。第一种方法是通过增加测序仪中流动池的大小和数量向外扩展。该方法增加了试剂的成本和测序系统的价格，因为它需要额外的高功率激光器和高精度纳米定位器。
第二种方法涉及向内收缩，即减小单个DNA测试位点的大小，使得固定大小的流动池中测序的DNA链的数量更高。该第二种方法更利于降低整体测序成本，因为额外成本仅涉及更好的成像光学器件的实现，同时保持耗材成本不变。但是必须使用更高数值孔径(NA)的透镜来区分来自相邻荧光团的信号。该方法有局限性，因为瑞利判据将可分辨光源之间的距离设定为0.61λ/NA，也就是说，即使在先进的光学成像系统中，两条测序的DNA链之间的最小距离也不能减少到超过大约400nm。类似的分辨率限制也适用于直接在成像阵列顶部测序，迄今为止，成像阵列的最小像素尺寸小于1μm。瑞利判据目前代表了光学SBS系统向内收缩的基本限制。克服这些限制可能需要超分辨率成像技术，这在高度多路复用的系统中尚未实现。因此，在该阶段，提高光学SBS测序仪吞吐量的唯一可行方法是构建更大的流动池和更昂贵的光学扫描和成像系统。
因此，有必要改善SBS。
发明内容
本发明内容代表本公开的非限制性实施例。
本文公开了使用磁标记(例如磁性颗粒)和磁传感器进行核酸测序的装置。还公开了制造和使用此类装置的方法。为了简单起见，下面的一些讨论以DNA测序为例。应当理解，本文公开的内容普遍适用于核酸测序。
本发明人认识到，现有技术SBS中使用的荧光显微镜和CMOS成像器的分辨率限制不适用于电荷(例如，硅纳米线场效应晶体管(FET))或磁场传感器(例如，自旋阀、磁隧道结(MTJ)、自旋扭矩振荡器(STO)等)，其中传感元件的尺寸比最先进的SBS系统小一个数量级，并且多路复用水平显著较高。SBS中的磁场感测非常有用，因为DNA和测序试剂是非磁性的，与CMOS组件中基于电子传输调制的电荷感测方案相比，这能够显著提高信噪比(SNR)。此外，磁感测不需要并入的碱基与结直接接触。小型化的磁场传感器可用于检测纳米级磁性纳米粒子以执行SBS。
使用磁传感器阵列执行SBS可以通过提供额外的向内收缩例如大约100倍来显著提高吞吐量并降低测序成本，同时消除测序系统中对高功率激光器和高分辨率光学器件的需求。
该文献公开了结合测序器件使用磁性标记核苷酸前体的SBS方案，该测序器件包含磁性传感元件阵列(例如，MTJ、STO、自旋阀等)。该器件还包含一或多个蚀刻的纳米通道，该纳米通道使磁传感器能够检测磁性标记核苷酸前体中的磁标记，同时保护磁传感器免受损坏(例如，使用薄绝缘体层)。
在一些实施例中，用于核酸测序的装置包括磁传感器阵列，该磁传感器阵列包括多个磁传感器，该多个磁传感器中的每一个耦接到至少一条地址线；以及邻近磁传感器阵列的流体室，该流体室具有邻近磁传感器阵列的近端壁。在一些实施例中，磁传感器阵列包括线性阵列。在一些实施例中，近端壁包含被配置成将核酸或核酸聚合酶锚定到近端壁的结构(例如，腔或脊)。
在一些实施例中，该装置进一步包括经由至少一条地址线耦接到磁传感器阵列的感测电路，其中该感测电路被配置成向至少一条地址线施加电流以检测多个磁传感器中的至少一个的特性，其中该特性指示流体室中磁性标记核苷酸前体是否存在。在一些实施例中，该特性是磁场或电阻、磁场的变化或电阻的变化或噪声水平。在一些实施例中，磁传感器包括磁振荡器，并且该特性是与磁振荡器相关联或由磁振荡器产生的信号的频率。
在一些实施例中，近端壁的表面包括聚丙烯、金、玻璃或硅。
在一些实施例中，阵列的多个磁传感器以矩形网格模式排列，并且至少一条地址线包含至少第一地址线和第二地址线，其中第一地址线标识阵列的列，并且第二地址线标识阵列的行。
在一些实施例中，使用上述装置对核酸测序的第一种方法包括(a)将核酸聚合酶的多个分子耦接到流体室的近端壁；(b)在一或多轮添加中，向流体室添加(i)包括引物结合位点和可延伸引物的核酸模板，和(ii)包括第一可切割磁标记的第一磁性标记核苷酸前体、包括第二可切割磁标记的第二磁性标记核苷酸、包括第三可切割磁标记的第三磁性标记核苷酸和包括第四可切割磁标记的第四磁性标记核苷酸；以及(c)对核酸模板进行测序，其中对核酸模板进行测序包括使用至少一条地址线检测磁传感器阵列中至少一部分磁传感器的特性，其中该特性指示第一、第二、第三或第四磁性标记核苷酸前体中的哪一个已经被并入可延伸引物。
在一些实施例中，对核酸模板进行测序进一步包括响应于检测，在核酸模板的核酸序列记录中记录并入磁性标记核苷酸前体的互补碱基。
在一些实施例中，第一、第二、第三和第四磁性标记核苷酸前体各自选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或它们的等同物。
在一些实施例中，第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的两个或更多个具有相同的特定磁性，并且用于区分磁性标记核苷酸前体的特性是并入速率、并入时间、频域特性、时域特性、并入过程的特征或并入过程的概况中的一或多个。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的每一个都具有相同的特定磁性，并且用于区分磁性标记核苷酸前体的特性是并入速率、并入时间、频域特性、时域特性、并入过程的特征或并入过程的概况中的一或多个。
在一些实施例中，第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的每一个都是不同类型的，其中每种类型都具有不同的磁性。
在一些实施例中，将核酸聚合酶的多个分子耦接到流体室的近端壁包括将核酸聚合酶的多个分子中的每一个连接到多个微珠的相应微珠上，并将多个微珠连接到装置的近端壁上。
在一些实施例中，使用上述装置对核酸测序的第二种方法包括(a)将核酸链结合到装置的近端壁；(b)在一或多轮添加中，向流体室中添加(i)可延伸引物，和(ii)核酸聚合酶的多个分子；(c)将包括第一可切割磁标记的第一磁性标记核苷酸前体加入到流体室中；以及(d)对核酸模板进行测序，其中对核酸模板进行测序包括使用至少一条地址线检测磁传感器阵列中磁传感器的至少第一部分的特性，其中该特性指示第一磁性标记核苷酸前体已经结合到核酸聚合酶的多个分子中的至少一个分子上或者已经被并入到可延伸引物中。
在一些实施例中，对核酸模板进行测序进一步包括响应于检测，在核酸链的核酸序列记录中记录第一磁性标记核苷酸前体的互补碱基。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括在进行步骤(b)、(c)和(d)之前扩增核酸链。
在一些实施例中，第一磁性标记核苷酸前体不可被核酸聚合酶延伸，并且该第二种方法进一步包括，在检测特性之后，去除第一可切割磁标记，并使第一磁性标记核苷酸前体可被核酸聚合酶延伸。
在一些实施例中，第一磁性标记核苷酸前体的一部分不可被核酸聚合酶延伸。在一些此类实施例中，第一磁性标记核苷酸前体的部分通过化学切割变得可延伸。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括，在步骤(c)之后，通过酶或化学切割去除第一可切割磁标记。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括在每次重复期间用不同的磁性标记核苷酸前体重复步骤(c)和(d)。在一些此类实施例中，第一和不同的磁性标记核苷酸前体中的每一个选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或它们的等同物。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括在步骤(c)之前清洗流体室。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括，在检测磁传感器阵列中的磁传感器的至少第一部分的特性之前，向流体室添加包括第二可切割磁标记的第二磁性标记核苷酸前体，并且使用至少一条地址线，未检测到磁传感器阵列中的磁传感器的至少第一部分的特性，其中该特性指示第二磁性标记核苷酸前体已经结合到核酸聚合酶的多个分子中的至少一个分子上或者已经被并入到可延伸引物中。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括在将第二磁性标记核苷酸前体添加到流体室之后清洗流体室。
在一些实施例中，第一可切割磁标记具有第一磁性，并且该第二种方法进一步包括在一或多轮添加中，向流体室添加第二磁性标记核苷酸前体，该第二磁性标记核苷酸前体包括具有第二磁性的第二可切割磁标记，并且特性标识第一磁性。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括在一或多轮添加中，向流体室中添加包括具有第三磁性的第三可切割磁标记的第三磁性标记核苷酸前体，和包括具有第四磁性的第四可切割磁标记的第四磁性标记核苷酸前体。
在一些实施例中，将核酸链结合到近端壁包括将衔接子连接到核酸链的一端，并将寡核苷酸耦接到流体室的近端壁，其中寡核苷酸与衔接子互补。在一些实施例中，将核酸链结合到近端壁包括使用聚苯乙烯或聚丙烯酰胺凝胶将核酸链连接到近端壁。在一些实施例中，将核酸链结合到近端壁包括通过分子之间不可逆的被动吸附或亲和力固定核酸链。
在一些实施例中，装置的近端壁包括腔或脊，并且将核酸链结合到近端壁包括将水凝胶施加到腔或脊。
在一些实施例中，第二种方法进一步包括，在步骤(b)之后，向流体室中加入核酸聚合酶的额外的分子。
在第一种或第二种方法的一些实施例中，第一可切割磁标记包括磁性纳米粒子(例如，分子、超顺磁性或铁磁纳米粒子)。
在第一种或第二种方法的一些实施例中，第一磁性标记核苷酸前体包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或等同物中的一种。
在第一种或第二种方法的一些实施例中，核酸聚合酶是缺乏3'-5'核酸外切酶活性的B型聚合酶。
在第一种或第二种方法的一些实施例中，核酸聚合酶是热稳定性聚合酶。
在第一种或第二种方法的一些实施例中，使用至少一条地址线包括向至少一条地址线施加电流。
在第一种或第二种方法的一些实施例中，特性是磁场或电阻、与磁振荡器相关联或由磁振荡器产生的信号的频率、噪声水平或磁场或电阻的变化。在第一种或第二种方法的一些实施例中，特性由磁场的变化或电阻的变化引起。
在一些实施例中，一种制造具有至少一个被配置成容纳流体的流体室的核酸测序器件的方法包括制造第一地址线；制造多个磁传感器，每个磁传感器具有底部和顶部，其中每个底部耦接到第一地址线；在磁传感器之间沉积介电材料；制造多条附加地址线，多条附加地址线中的每一条都耦接到多个磁传感器中的相应磁传感器的顶部；以及去除邻近多个磁传感器的介电材料的部分以产生至少一个流体室。
在一些实施例中，制造包括沉积。在一些实施例中，去除包括研磨或蚀刻。
附图说明
从下面结合附图对某些实施例的描述中，本公开的目的、特征和优点将变得显而易见，其中：
图1A、1B和1C示出了根据一些实施例的用于核酸测序的装置。
图2A、2B、2C和2D示出了包含若干通道的示例性装置。
图3示出了根据一些实施例的磁传感器的一部分。
图4A和4B示出了图3所示的示例性传感器的电阻与其两个铁磁层的磁矩之间的角度之间的关系。
图5A示出了使用自旋扭矩振荡器(STO)传感器的概念。
图5B示出了通过延迟检测电路的示例性STO的实验响应。
图5C和5D示出了根据一些实施例如何将STO用作纳米级磁场检测器。
图6A和6B示出了根据一些实施例的两种选择器元件方法。
图7是示出根据一些实施例的制造用于核酸测序的装置的方法的流程图。
图8示出了图7所示制造方法的每个步骤的结果。
图9A示出了根据一些实施例的静态SBS。
图9B示出了根据一些实施例的动态SBS。
图10是示出根据一些实施例的静态SBS的方法的流程图。
图11A、11B、11C、11D、11E和11F图示了图10所示的方法。
图12示出了根据一些实施例的静态SBS方法的实施例。
图13示出了根据一些实施例的动态SBS。
图14示出了根据一些实施例的动态SBS的方法。
图15图示了图14所示的方法。
具体实施方式
图1A、1B和1C示出了根据一些实施例的用于核酸测序的装置100。图1A是该装置的俯视图，图1B是在图1A所示位置的剖视图。图1C是示出装置100的组件的框图。如图1A所示，装置100包括磁传感器阵列110，其包含多个磁传感器105，示出了四个磁传感器105A、105B、105C和105D。(为简单起见，本文件用附图标记105统一指代磁传感器。单个磁传感器用附图标记105后跟一个字母表示。)图1A的示例性实施例中的磁传感器阵列110是线性阵列。
在一些实施例中，多个磁传感器105中的每一个耦接到至少一条地址线120。(为简单起见，本文件用附图标记120统一指代地址线。单条地址线用附图标记120后跟一个字母表示。)在图1A所示的示例性实施例中，磁传感器阵列110的每个磁传感器105耦接到两条地址线120。具体地，磁传感器105A耦接到地址线120A和120E，磁传感器105B耦接到地址线120B和120E，磁传感器105C耦接到地址线120C和120E，并且磁传感器105D耦接到地址线120D和120E。地址线120A、120B、120C和120D分别位于磁传感器105A、105B、105C和105D之下，并且地址线120E位于磁传感器105之上。图1B示出了与地址线120D和120E相关的磁传感器105D。
装置100还包含邻近磁传感器阵列110的流体室115。顾名思义，流体室115被配置成在装置100使用时容纳流体。流体室115具有邻近磁传感器阵列110的壁117。该壁117在本文中被称为近端壁。当使用装置100时，磁传感器105能够通过壁117检测流体室115中的磁标记(例如，纳米粒子)。因此，壁117具有保护磁传感器105免受流体室115中的任何流体影响的属性和特性，同时仍然允许磁传感器105检测流体室115内的磁标记。例如，壁117的材料(并且可能还包括流体室115的其余部分的材料)可以是或包括绝缘体。例如，在一些实施例中，壁117的表面包括聚丙烯、金、玻璃或硅。此外，壁117的厚度被选择成使得磁传感器105可以检测流体室内的磁标记。在一些实施例中，近端壁117大约2至20nm厚。
在一些实施例中，近端壁117具有被配置成将核酸或核酸聚合酶锚定到近端壁117的结构(或多个结构)。例如，该结构(或多个结构)可以包含腔或脊。
为了简化说明，图1A和1B示出了示例性装置100，其具有单个流体室115，并且在磁传感器阵列110中只有四个磁传感器105A、105B、105C、105D。应当理解，装置100可以在磁传感器阵列110中具有更多的磁传感器105，并且可以具有额外的流体室115或者更复杂的单个流体室115。通常，可以使用允许磁传感器105检测流体室115中的磁标记的磁传感器105和流体室115的任何配置。
作为在磁传感器阵列110中具有更多数量的磁传感器105的装置的实例，图2A、2B、2C和2D示出了包含若干通道的示例性装置100的部分，每个通道可以是单独的流体室115，或者其集合可以是单个流体室115。在图2A、2B、2C和2D所示的装置100的实施例中，磁传感器阵列110的多个磁传感器105以矩形网格模式排列。每条地址线120标识磁传感器阵列110的一行或一列。应当理解，图2A、2B、2C和2D仅示出了装置100的一部分，以避免模糊正在讨论的装置100的部件。应当理解，各种图示的组件(例如，地址线120、磁传感器105、流体通道115等)在装置100的物理实例中可能不可见(例如，它们可能被保护材料覆盖，例如绝缘体)。
图2A是示例性装置100的透视图。装置100包含标记为120A、120B、120C、120D、120E、120F、120G、120H和120I的九条地址线120。它还包含流体室115A、115B、115C、115D和115E。如上所述，流体室115A、115B、115C、115D和115E可以被认为是独立的流体室115或单个流体室115。
图2B是来自图2A的示例性装置100的俯视图。从俯视图中看不到的地址线120G、120H和120I的位置用虚线表示。地址线120A-120F以实线示出，但是如上所述，地址线120A-120F在俯视图中也可能不可见(例如，它们可能被保护材料覆盖，例如绝缘体)。
图2C是沿着图2A中标记为“2C”的线的装置100的剖视图。如图所示，地址线120A、120B、120C、120D、120E和120F中的每一个沿着横截面与磁传感器105中的一个的顶部接触(即，地址线120A与磁传感器105A接触，地址线120B与磁传感器105B接触，地址线120C与磁传感器105C接触，地址线120D与磁传感器105D接触，地址线120E与磁传感器105E接触，并且地址线120F与磁传感器105F接触)。地址线120H与磁传感器105A、105B、105C、105D、105E和105F中的每一个的底部接触。
图2D是沿着图2A中标记为“2D”的线的装置100的剖视图。如图所示，地址线120E沿着横截面与传感器105G、105E和105H中的每一个的顶部接触。地址线120G、120H和120I中的每一个沿着横截面与磁传感器105中的一个的底部接触(即，地址线120G与磁传感器105G接触，地址线120H与磁传感器105E接触，并且地址线120I与磁传感器105H接触)。
在一些实施例中，磁传感器阵列110的每个磁传感器105是使用磁阻(MR)效应来检测流体室115中的磁标记的薄膜器件。每个磁传感器105可以作为其电阻随着感测磁场的强度和/或方向的变化而变化的电位计工作。每个磁传感器105可以具有小于30nm的尺寸，以检测几mT量级的磁场。
图3示出了根据一些实施例的磁传感器105的一部分。图3的示例性磁传感器105具有底部108和顶部109，并且包括三个层，例如由非磁性间隔层107隔开的两个铁磁层106A、106B。非磁性间隔层107可以是例如金属材料，例如铜或银，在这种情况下，所述结构被称为自旋阀(SV)；或者可以是绝缘体，例如氧化铝或氧化镁，在这种情况下，所述结构被称为磁隧道结(MTJ)。铁磁层106A、106B的合适材料包含例如Co、Ni和Fe的合金(有时与其它元素混合)。在一些实施例中，铁磁层106A、106B被设计成使其磁矩定向在膜的平面内或垂直于膜的平面。可以在图3所示的三个层106A、106B和107的下方和上方沉积额外的材料，以用于诸如界面平滑、纹理化和防止受到装置100图案化处理的损坏，但是磁传感器105的有源区位于此三层结构中。因此，与磁传感器105接触的组件可以与三个层106A、106B或107中的一层接触，或者可以与磁传感器105的另一部件接触。
如图4A和4B所示，MR传感器的电阻与1-cos(θ)成比例，其中θ是图3所示的两个铁磁层106A、106B的磁矩之间的角度。为了最大化由磁场产生的信号并提供磁传感器105对所施加磁场的线性响应，磁传感器105可以被设计成使得两个铁磁层106A、106B的磁矩在没有磁场的情况下相对于彼此取向π/2或90度。这种取向可以通过本领域已知的多种方法来实现。一种解决方案是使用反铁磁物质通过被称为交换偏置的效应来“钉住”铁磁层中的一个(106A或106B，用“FM1”表示)的磁化方向，然后用具有绝缘层和永磁体的双层膜涂覆传感器。绝缘层避免了磁传感器105的电短路，且永磁体提供垂直于FM1的钉住方向的“硬偏置”磁场，所述磁场随后将旋转第二铁磁体(106B或106A，用“FM2”表示)并产生期望的配置。平行于FM1的磁场随后使FM2围绕此90度配置旋转，且电阻的变化导致产生电压信号，所述电压信号可以被校准以测量作用在磁传感器105上的场。以这种方式，磁传感器105充当磁场-电压转换器。
注意，尽管上面刚刚讨论的实例描述了使用其磁矩在膜的平面中相对于彼此成90度取向的铁磁体，但是可替换地，可以通过将铁磁层106A、106B中的一个的磁矩定向在膜的平面之外来实现垂直配置，这可以使用所谓的垂直磁各向异性(PMA)来实现。
在一些实施例中，磁传感器105使用被称为自旋传递扭矩的量子机械效应。在此类器件中，通过SV或MTJ中的一个铁磁层106A(或106B)的电流优先允许自旋平行于该层的磁矩的电子通过，而自旋反平行的电子更有可能被反射。以这种方式，电流被自旋极化，一种自旋类型的电子比另一种自旋类型的多。该自旋极化电流然后与第二铁磁层106B(或106A)相互作用，在该层的磁矩上施加扭矩。在不同的情况下，该扭矩可以导致第二铁磁层106B(或106A)的磁矩围绕作用在铁磁体上的有效磁场进动，或者可以导致磁矩在由系统中诱发的单轴各向异性限定的两个方向之间可逆地切换。由此产生的自旋扭矩振荡器(STO)可以通过改变作用于其上的磁场进行频率调谐。因此，它们具有充当磁场-频率(或相位)转换器的能力，如图5A所示，其示出了使用STO传感器的概念。图5B示出了当在STO两端施加频率为1GHz、峰间幅值为5mT的AC磁场时，STO通过延迟检测电路的实验响应。该结果以及图5C和5D所示的短纳秒场脉冲的结果说明了这些振荡器如何用作纳米级磁场检测器。进一步的细节可以参考T.长泽(T.Nagasawa)、H.苏托(H.Suto)、K.工藤(K.Kudo)、T.杨(T.Yang)、K.水岛(K.Mizushima)和R.佐藤(R.Sato)所著“纳秒脉冲磁场下自旋扭矩振荡器的频率调制信号的延迟检测(Delay detection of frequency modulation signal from a spin-torqueoscillator under a nanosecond-pulsed magnetic field)”，应用物理学杂志(Journalof Applied Physics)，第111卷，07C908(2012)。
如图1C所示，在一些实施例中，装置100包含经由地址线120耦接到磁传感器阵列110的感测电路130。在操作中，感测电路130向地址线120施加电流以检测磁传感器阵列110中的多个磁传感器105中的至少一个的特性，其中该特性指示流体室115中磁性标记核苷酸前体是否存在。例如，在一些实施例中，特性是磁场或电阻，或者磁场的变化或电阻的变化。在一些实施例中，特性是噪声水平。在一些实施例中，磁传感器包括磁振荡器，并且特性是与磁振荡器相关联或由磁振荡器产生的信号的频率。
在一些实施例中，磁传感器阵列110包含选择器元件，该选择器元件减少了“潜在”电流通过相邻元件传输并降低磁传感器阵列110性能的机率。图6A和6B示出了根据一些实施例的两种方法。在图6A中，CMOS晶体管与磁传感器105串联耦接。关于图6A所示配置的更多细节，见B.N.恩格尔(B.N.Engel)、J.科尔曼(J.)、B.布彻(B.Butcher)、R.W.戴夫(R.W.Dave)、M.德黑尔拉(M.DeHerrera)、M.杜拉姆(M.Durlam)、G.格林克维奇(G.Grynkewich)、J.詹纳斯基(J.Janesky)、S.V.皮埃塔姆巴拉姆(S.V.Pietambaram)、N.D.里佐(N.D.Rizzo)、J.M.斯劳特(J.M.Slaughter)、K.史密斯(K.Smith)、J.J.孙(J.J.Sun)和S.特赫拉尼(S.Tehrani)所著“基于新比特和切换方法的4-Mb切换MRAM(A 4-Mb ToggleMRAM Based on a Novel Bit and Switching Method)”,电气与电子工程师协会磁学汇报(IEEE Transactions on Magnetics)，第41卷,132(2005)。
在图6B中，二极管或类似二极管的元件与磁性膜一起沉积，然后放置成“交叉点”结构，其中磁传感器阵列110外围的CMOS晶体管接通单独的地址线120(例如字线和位线)，以寻址阵列中的单独的磁传感器105。CMOS选择晶体管的使用可能更简单，这是由于制造前端(即，构建CMOS晶体管和底层电路的所有纳米制造)的代工厂的普及，但是操作所需的电流类型可能需要交叉点设计，以最终达到磁传感器阵列110所需的密度。图6B所示配置的更多细节见C.沙佩尔(C.Chappert)、A.费尔(A.Fert)和F.N.范多尔(F.N.Van Daul)所著“数据存储中自旋电子的出现(The emergence of spin electronics in data storage)”，自然材料(Nature Materials)，第6卷，813(2007)。
在核酸测序应用中，可能难以或不可能将每个磁标记(例如，纳米颗粒)的磁矩定向在同一方向，因为每个标记相对于磁传感器105的位置以及标记磁矩的轴线可以变化。此外，为了实现磁传感器阵列110中磁传感器105的高密度，磁标记可能需要在几十纳米的数量级，在这种情况下，磁标记可能是超顺磁性的，这意味着它们保持可测量的磁矩，而无需磁矩指向的定义轴线(即，作用在磁传感器105上的磁场将在其方向上随时间波动)。这些挑战会增加准确检测的难度。
检测可以通过多种方式进行。为了实现依赖于能够检测单个磁标记(例如，纳米粒子)的每个磁传感器105的高通量测序，磁标记要小，理想地与单个磁传感器105的尺寸相当。这可以通过本领域已知的各种易于合成的磁标记来实现。例如，磁标记可以是具有高磁各向异性的纳米粒子。具有高磁各向异性的纳米粒子的实例包含但不限于Fe3O4、FePt、FePd和CoPt。为了促进与核苷酸的化学结合，可以合成颗粒并用SiO2包覆。参见，例如，M.阿斯拉姆(M.Aslam)、L.Fu、S.Li和V.P.大卫(V.P.Dravid)，“FePt纳米粒子的二氧化硅包封和磁性(Silica encapsulation and magnetic properties of FePt nanoparticles)”，胶体与界面科学杂志(Journal of Colloid and Interface Science)，第290卷，第2期，2005年10月15日，第444-449页。
因为该尺寸的磁标记具有永久磁矩，其方向在非常短的时间尺度上随机波动，所以一些实施例依赖于检测由磁标记的存在引起的磁场波动的灵敏感测方案。
在一些实施例中，感测电路130检测磁传感器阵列110中的一些或所有磁传感器105的磁环境中的偏差或波动。例如，与存在磁标记的磁传感器105相比，不存在磁标记的MR类型的磁传感器105在某一频率上应该具有相对较小的噪声，因为来自磁标记的场波动会引起感测铁磁体的磁矩波动。可以使用外差检测(例如，通过测量噪声功率密度)或者通过直接测量磁传感器105的电压来测量这些波动，并且使用比较器电路来评估这些波动，以与不感测流体室115的虚拟传感器元件进行比较。在磁传感器105包含STO元件的情况下，由于频率的瞬时变化，来自磁标记的波动磁场将导致磁传感器的相位跳变，这可以使用相位检测电路来检测。另一种选择是将STO设计成仅在小磁场范围内振荡，从而磁标记的存在将关闭振荡。图2A所示的阵列设计的一个优点是，多个磁传感器105(例如，名义上位于磁标记的左侧和右侧)可以用于数据的后处理，以提高磁标记检测的精度。
在一些实施例中，使用光刻工艺和薄膜沉积来制造装置100。
图7示出了制造装置100的方法150，并且图8示出了制造过程150的每个步骤的结果。在152处，该方法开始。在154处，例如通过沉积在衬底上制造至少一条地址线120。在156处，在至少一条地址线120上制造磁传感器阵列110。磁传感器阵列110的每个磁传感器105具有底部108和顶部109。(见图3。)底部108耦接到至少一条地址线120。在一些实施例中，每个磁传感器105的底部108与至少一条地址线120接触。
在158处，在磁传感器阵列110的磁传感器105之间沉积介电材料。
在160处，制造附加地址线120。这些附加地址线中的每一条都耦接到磁传感器阵列110中的至少一个磁传感器105的顶部109。在一些实施例中，每个磁传感器105的顶部109与地址线120接触。在一些实施例中，磁传感器105的底部108与第一地址线120A接触，并且磁传感器105的顶部109与第二地址线120B接触。
在162处，去除邻近磁传感器105的介电材料的部分(例如，通过研磨、蚀刻或任何其它合适的去除工艺)以产生流体室115。
使用上述装置100的实施例的方法依赖于使用包括可切割磁标记的磁性标记核苷酸前体。这些可切割磁标记可以包括例如磁性纳米粒子，诸如，例如分子、超顺磁性纳米粒子或铁磁粒子。
存在多种方法可以连接和切割磁标记。例如，磁标记可以连接在碱基上，在这种情况下，它们可以被化学切割。作为另一个实例，磁标记可以连接到磷酸盐上，在这种情况下，它们可以被聚合酶切割，或者，如果通过连接肽连接，则通过切割连接肽来切割磁标记。
在一些实施例中，磁标记与核苷酸前体的含氮碱基(A、C、T、G或其衍生物)相连。在并入核苷酸前体并通过装置100检测(即，使用磁传感器阵列110)后，磁标记从并入核苷酸上被切割下来。
在一些实施例中，磁标记通过可切割的连接肽连接。可切割的连接肽是本领域已知的，并且已经在例如美国专利第7,057,026号、第7,414,116号及其延续和改进中描述过。在一些实施例中，磁标记通过包括烯丙基或叠氮基的连接肽连接到嘧啶的5-位或嘌呤的7-位。在其它实施例中，连接肽包括二硫化物、吲哚或Sieber基团。连接肽可以进一步含有一或多个选自烷基(C1-6)或烷氧基(C1-6)、硝基、氰基、氟基或具有类似性质的基团的取代基。简而言之，连接肽可以被水溶性膦或基于膦的含过渡金属的催化剂切割。其它连接肽和连接肽切割机制在本领域是已知的。例如，包括三苯甲基、对烷氧基苄基酯和对烷氧基苄基酰胺以及叔丁氧基羰基(Boc)基团和缩醛体系的连接肽可以在酸性条件下被释放质子的切割剂切割。硫缩醛或其它含硫连接肽可以用亲硫金属如镍、银或汞来切割。切割保护基团也可以考虑用于制备合适的连接分子。含酯和二硫化物的连接肽可以在还原条件下切割。含三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的连接肽可在F离子存在下被切割。被不影响反应混合物其它组分的波长切割的可光切割的连接肽包含包括邻硝基苄基的连接肽。包括苄氧羰基的连接肽可以被Pd基催化剂切割。
在一些实施例中，核苷酸前体包括连接到多磷酸盐部分的标记，如美国专利第7,405,281号和第8,058,031号中所述。简而言之，核苷酸前体包括核苷部分和3个或更多个磷酸基团的链，其中一或多个氧原子任选地被取代，例如被S取代。标记可以直接或通过连接肽连接到α、β、γ或更高的磷酸基团(如果存在的话)。在一些实施例中，标记通过非共价连接肽连接到磷酸基团上，如美国专利第8,252,910号所述。在一些实施例中，连接肽是选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基以及取代或未取代的杂环烷基的烃；参见例如美国专利第8,367,813号。连接肽也可以包括核酸链；参见例如美国专利第9,464,107号。
在磁标记与磷酸基团连接的实施例中，核苷酸前体通过核酸聚合酶并入新生链中，核酸聚合酶也切割并释放可检测的磁标记。在一些实施例中，通过切割连接肽来去除磁标记，例如，如美国专利第9,587,275号所述。
在一些实施例中，核苷酸前体是不可延伸的“终止子”核苷酸，即具有3'-末端的核苷酸被阻断“终止子”基团阻止添加下一个核苷酸。阻断基团是可逆的终止子，其可以去除以继续本文所述的链合成过程。将可去除的阻断基团连接到核苷酸前体是本领域已知的，参见例如美国专利申请第7,541,444号、第8,071,739号及其延续和改进。简而言之，阻断基团可以包括烯丙基基团，该烯丙基基团可以通过在磷化氢或氮膦配体存在下在水溶液中与金属-烯丙基络合物反应而被切割。边合成边测序中使用的可逆终止子核苷酸的其它实例包含2018年12月19日提交的、标题为“3'-受保护核苷酸(3'-Protected Nucleotides)”的美国临时申请序列号62/781,638中描述的修饰核苷酸，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
测序方法
使用上述装置100的实施例进行核酸测序的方法至少有两类。其中的两类在本文中是指“静态SBS”和“动态SBS”。在静态SBS中，使用固定的核酸链对核酸进行测序，该固定的核酸链在磁传感器阵列110的磁传感器105附近拴系到装置100。在动态SBS中，可以使用固定的聚合酶分子对核酸(例如，DNA)进行测序，该聚合酶分子在磁传感器阵列110的磁传感器105附近拴系到装置100。
图9是这两种方法的高级示意图。图9A示出了静态SBS，并且图9B示出了动态SBS。下面将更详细地描述这两种方法。
在静态SBS中，可以使用固定的核酸链对核酸(例如，DNA)进行测序，该固定的核酸链在磁传感器阵列110的磁传感器105附近拴系到装置100。然后加入四种类型的可逆终止子碱基(RT-碱基)，可以一起加入或一次加入一种，然后洗去未并入的核苷酸。然后，在下一个周期开始之前，将磁标记与末端3'阻断剂一起从核酸链上化学去除。
核酸链可以以任何合适的方式制备。例如，核酸链可以通过核酸样品的随机断裂和随后的5'和3'衔接子连接来制备。然后，这些核酸链可以被结合或连接到流体室115的近端壁117的寡核苷酸捕获。包含桥扩增在内的线性或指数扩增可用于在测序前扩增每条链。
为了对核酸链进行测序，磁性标记核苷酸前体可以一次一个或一次全部引入，如下所述。
在一些静态SBS实施例中，磁性标记核苷酸前体被一次一个地引入。在此类实施例中，相同的磁标记可以用于所有的核苷酸前体。应当理解，如本文所使用的，短语“相同的磁标记”不是指单个磁标记的相同物理实例(即，它不意味着物理标记的特定实例被重复使用)；相反，它指的是磁标记的多个物理实例，所有这些实例都具有相同的特性或属性，使得它们的单个实例彼此无法区分。相比之下，短语“不同的磁标记”指的是单独或作为一组具有不同特性或属性的磁标记，这些特性或属性允许它们区别于其它磁标记，无论是单独还是作为一组。
在公开的静态SBS实施例中，核酸链一次延伸一个核苷酸，并且磁传感器阵列110用于识别结合的磁性标记核苷酸前体。
图10是示出根据一些实施例的静态SBS的方法200的流程图，并且图11A、11B、11C、11D、11E和11F图示了方法200。在202处，该方法开始。在204处，如上所述，将一或多条核酸链结合到测序装置100的近端壁117。存在多种方法将一或多条核酸链结合到近端壁117上。例如，可以通过将衔接子连接到核酸链的一端并将寡核苷酸耦接到流体室115的近端壁117来将核酸链结合到近端壁117，其中寡核苷酸与衔接子互补。作为另一个实例，可以通过使用聚苯乙烯或聚丙烯酰胺凝胶将核酸链连接到近端壁117来将核酸链结合到近端壁117。作为又一个实例，通过分子间的不可逆的被动吸附或亲和力固定核酸链，核酸链可以结合到近端壁117。在一些实施例中，近端壁117包括腔或脊，如上所述，将核酸链结合到近端壁包括将水凝胶施加到腔或脊。
在任选的步骤206处，可以使用任何合适的方法扩增核酸链，诸如，例如通过利用聚合酶链式反应(PCR)或线性扩增。
在208处，向流体室115添加可延伸引物。
在210处，向流体室115添加核酸聚合酶。核酸聚合酶可以是任何合适的核酸聚合酶。用于核酸测序的核酸聚合酶(如DNA聚合酶)的期望特性包含以下一或多个：核酸模板和核苷酸前体的快速结合速率或核酸模板和核苷酸前体的慢速解离速率(结合和解离速率是核酸聚合酶在一组限定的反应条件下的动力学特性)；高保真度、低或不可检测的核酸外切酶活性，包括低或不可检测的3'-5'核酸外切酶(校对)活性或低或不可检测的5'-3'核酸外切酶活性；有效的DNA链置换、高稳定性、高加工性(包括长读取长度)、耐盐性和并入修饰的核苷酸前体(包含本文所述的前体)的能力。
合适的聚合酶的一些实例包含缺乏3'-5'核酸外切酶活性的B族(B型)聚合酶。
在一些实施例中，聚合酶是热稳定性聚合酶。热稳定性核酸聚合酶包含水生栖热菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶、泉栖热菌属细菌(Thermus sp.)Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶，如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)、海栖热袍菌(Thermatoga maritima)(Tma)和栖热球菌(Thermococcus Litoralis)(Tli或Vent)等。
在一些实施例中，聚合酶缺乏可检测的5'-3'核酸外切酶活性。基本上缺乏5'-3'核酸酶活性的DNA聚合酶的实例包含大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段；缺乏N末端235个氨基酸的水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)(“Stoffel片段”)，参见美国专利第5,616,494号。其它实例包含具有足够缺失(例如，N末端缺失)、突变或修饰的热稳定性DNA聚合酶，以消除或灭活负责5'-3'核酸酶活性的结构域。参见，例如，美国专利第5,795,762号。
在一些实施例中，聚合酶缺乏可检测的3'-5'核酸外切酶活性。基本上缺乏3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶的实例包含Taq聚合酶及其衍生物和任何天然存在或设计缺失校对结构域的B族(B型)聚合酶。
在一些实施例中，聚合酶已经被修饰或设计以实现或增强核苷酸类似物如3'-修饰核苷酸的并入；参见例如美国专利第10,150,454号、第9,677,057号和第9,273,352号。
在一些实施例中，聚合酶已经被修饰或设计以实现或增强核苷酸类似物如5'-磷酸修饰的核苷酸的并入；参见例如美国专利第10,167,455号和第8,999,676号。在一些实施例中，此类聚合酶是phi29衍生的聚合酶；参见例如美国专利第8,257,954号和第8,420,366号。在一些实施例中，此类聚合酶是phiCPV4衍生的聚合酶；参见例如美国专利公开第US20180245147号。
在一些实施例中，通过选择对聚合酶进行修饰或设计，以成功并入所需的修饰核苷酸或并入具有所需准确度和可加工性的核苷酸和核苷酸类似物。选择此类修饰的聚合酶的方法是本领域已知的；参见例如美国专利公开第US20180312904A1号，标题为“聚合酶组合物及其制备和使用方法(Polymerase Compositions and Methods of Making andUsing Same)”。
应当理解的是，步骤208和210可以组合或者它们的顺序可以颠倒。
可选地，在步骤212处，在步骤214添加磁性标记核苷酸前体之前，可以清洗流体室115。
在228处，选择磁性标记核苷酸前体用于测序循环。在一些实施例中，磁性标记核苷酸前体选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或它们的等同物。在一些实施例中，磁性标记核苷酸前体包括磁性标记dATP、dGTP、dCTP、dTTP或等同物中的一种。磁性标记核苷酸前体可以是标记的常规、天然、非常规或类似物核苷酸。当提到核苷酸前体时，术语“常规的”或“天然的”是指那些天然存在的(即，对于DNA，是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。当提及核苷酸前体时，术语“非常规”或“类似物”包含核苷酸前体中常规碱基、糖部分或核苷酸间连接的修饰或类似物。例如，dITP、7-去氮-dGTP、7-去氮-dATP、烷基嘧啶核苷酸(包括丙炔基dUTP)是具有非常规碱基的核苷酸的实例。一些非常规糖修饰包含2'位的修饰。例如，具有2'-OH的核糖核苷酸(即，ATP、GTP、CTP、UTP)是DNA聚合酶的非常规核苷酸。其它糖类似物和修饰包含D-核糖基、2'或3'D-脱氧核糖基、2',3'-D-二脱氧核糖基、2',3'-D-二氢二脱氧核糖基、2'或3'烷氧基核糖基、2'或3'氨基核糖基、2'或3'巯基核糖基、2'或3'烷氧基硫代核糖基、无环、碳环或其它修饰的糖部分。其它实例包括2'-PO4类似物，它们是终止子核苷酸。(参见例如美国专利第7,947,817号或本文所述的其它实例。)非常规连接核苷酸包含硫代磷酸dNTP([α-S]dNTP)、5'-[α-硼烷]-dNTP和[α]-甲基-膦酸dNTP。
在214处，向流体室115添加选择的磁性标记核苷酸前体。仅出于说明的目的，图11B假设所选择的磁性标记核苷酸前体是腺嘌呤(“A”)。
在216处，进行测序以确定所选择的磁性标记核苷酸前体是否已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中。如图10所示，测序步骤216可以包含多个子步骤。例如，在图10和11A、11B、11C、11D、11E和11F所示的方法200中，在子步骤218处，装置100的一或多条地址线120用于检测磁传感器阵列110的磁传感器105的特性。如上所述，所述特性可以是例如电阻、电阻的变化、磁场、磁场的变化、频率、频率的变化或噪声。
在判定点220处，确定检测结果是否指示磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中。例如，所述确定可以基于特性是否存在，即如果检测到所述特性，则认为磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中，如果没有检测到所述特性，则认为磁性标记核苷酸前体没有结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。作为另一个实例，所述确定可以基于特性的大小或值，例如，如果大小或值在特定范围内，则认为磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中，且如果大小或值不在特定范围内，则认为磁性标记核苷酸前体没有结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。
检测(子步骤218)和确定(判定点220)可以使用或依赖于磁传感器阵列110中的全部或少于全部的磁传感器105。确定特性是否存在或特性的值(判定点220)可以基于合计、平均或以其它方式处理来自磁传感器阵列110中的一些或所有磁传感器105的检测结果(子步骤218)。
如果在判定点220处确定磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中(例如，图11B、11C和11D所示的上部路径)，则在步骤222处，将磁性标记核苷酸前体的互补碱基的指示记录在核酸链的核酸序列的记录中。
在一些实施例中，磁性标记核苷酸前体不可被核酸聚合酶延伸，且因此，在检测到特性后，必须去除磁标记，以使磁性标记核苷酸前体可被核酸聚合酶延伸。在一些实施例中，第一磁性标记核苷酸前体的一部分不可被核酸聚合酶延伸，但是第一磁性标记核苷酸前体的所述部分通过化学切割变得可延伸。如图10所示，如果要执行额外的测序循环(即，判定点224的“否”路径)，则在226处使用任何合适的手段(例如，化学、酶或其它手段)去除磁标记。图11F提供了磁标记去除的图解说明。
在226处去除磁标记后，在228处选择另一个磁性标记核苷酸前体。然后在步骤214处将新选择的磁性标记核苷酸前体添加到流体室115中，所述前体可以与刚刚完成的循环中使用的前体相同或不同，并且再次执行测序步骤216，以确定新选择的磁性标记核苷酸前体是否已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中。
如果在判定点220处确定磁性标记核苷酸前体没有结合到聚合酶上，并且没有被并入到可延伸引物中(例如，图11B、11C和11D所示的下部路径)，则该方法进行到步骤228，在该步骤中选择另一个磁性标记核苷酸前体。在这种情况下，因为先前尝试的磁性标记核苷酸前体不匹配，所以所选择的磁性标记核苷酸前体应该与刚刚完成的循环中使用的不同。例如，图11C遵循图11B的下部路径，假设下一个磁性标记核苷酸前体是胞嘧啶。图11D遵循图11C的下部路径(即，先前选择的磁性标记核苷酸前体(腺嘌呤)不与聚合酶结合，并且没有被并入到可延伸引物中)，假设下一个磁性标记核苷酸前体是鸟嘌呤。最后，图11E遵循图11D的下部路径(即，先前选择的磁性标记核苷酸前体(鸟嘌呤)不与聚合酶结合，并且没有被并入到可延伸引物中)，假设下一个磁性标记核苷酸前体是胸腺嘧啶。应当理解，图11A、11B、11C、11D、11E和11F示出了装置100如何用于进行核酸测序的一个实例，并且不旨在进行限制(例如，添加不同磁性标记核苷酸前体的顺序是任意的)。
尽管图10示出了在步骤210和214之间发生的单个可选清洗步骤212，但是应当理解，该方法中可以包含额外的清洗步骤。例如，可以在步骤228和214之间或者在步骤226之后清洗流体室115(即，以基本上去除之前引入的磁性标记核苷酸前体和在步骤226中去除的任何磁标记)。
在230处，方法200结束。
应当理解，在一定数量的测序循环之后，可能需要或有必要执行步骤210，向流体室115添加核酸聚合酶的额外分子，以补充聚合酶。
上面讨论的图10说明了静态SBS实施例，其中磁性标记核苷酸前体一次一个地被引入。在其它静态SBS实施例中，一次引入多个核苷酸前体(例如，两个、三个或四个核苷酸前体)。在此类实施例中，不同的磁标记用于同时引入的不同核苷酸前体。每个引入的前体的磁标记具有不同的磁性，这使得磁传感器105能够区分用于同时引入的不同核苷酸前体的不同磁标记。
图12示出了静态SBS方法250的实施例，其中同时引入多个核苷酸前体。出于说明的目的，图12显示了同时引入的四个核苷酸前体，但是应当理解，所公开的方法可以用于测试多于或少于四个的核苷酸前体。
在252处，方法250开始。步骤254、256、258、260和262与参考图10示出和描述的步骤204、206、208、210和212相同。这里不再重复。
在步骤264处，向装置100的流体室115添加高达四个磁性标记核苷酸前体。每个添加的磁性标记核苷酸前体用不同的磁标记来标记，使得磁传感器105可以区分不同的磁性标记核苷酸前体。具体而言，每个磁标记具有不同且可区分的磁性(例如，用于第一磁性标记核苷酸前体的第一磁标记具有第一磁性，用于第二磁性标记核苷酸前体的第二磁标记具有第二磁性，等等)。
在266处，进行测序以确定添加的磁性标记核苷酸前体中的哪一个已经结合到聚合酶或者被并入到可延伸引物中。如图12所示，测序步骤266可以包含多个子步骤。例如，在图12所示的方法250中，在子步骤268处，装置100的一或多条地址线120被用于检测磁传感器阵列110的磁传感器105的特性，其中该特性标识并入磁性标记核苷酸前体的磁性。如上所述，该特性可以是例如电阻、电阻的变化、磁场、磁场的变化、频率、频率的变化或噪声。
在判定点270处，确定是否已经检测到第一磁性，其中第一磁性指示第一磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中。该确定可以基于例如第一磁性是否存在，即如果检测到第一磁性，则认为第一磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中，并且如果没有检测到第一磁性，则认为第一磁性标记核苷酸前体没有结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。作为另一个实例，该确定可以基于第一磁性的大小或值，例如，如果该大小或值在特定范围内，则认为第一磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中，并且如果该大小或值不在特定范围内，则认为第一磁性标记核苷酸前体没有结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。
如果在判定点270处确定已经检测到第一磁性，则该方法进行到步骤278，其中将第一磁性标记核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。
如果在判定点270处确定没有检测到第一磁性，则方法250进行到判定点272，以确定是否检测到第二磁性，其中第二磁性指示第二磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。可以以上述用于确定第一磁性的任何方式进行该确定。如果在判定点272处确定已经检测到第二磁性，则该方法进行到步骤278，其中将第二磁性标记核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。
如果在判定点272处确定没有检测到第二磁性，则方法250进行到判定点274，以确定是否检测到第三磁性，其中第三磁性指示第三磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。可以以上述用于确定第一磁性的任何方式进行该确定。如果在判定点274处确定已经检测到第三磁性，则该方法进行到步骤278，其中将第三磁性标记核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。
最后，如果在判定点274处确定没有检测到第三磁性，则方法250进行到判定点276，以确定是否检测到第四磁性，其中第四磁性指示第四磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。可以以上述用于确定第一磁性的任何方式进行该确定。如果在判定点276处确定已经检测到第四磁性，则该方法进行到步骤278，其中将第四磁性标记核苷酸前体的互补碱基记录在核酸链的核酸序列的记录中。如果在判定点276处确定没有检测到第四磁性，则方法250返回到步骤264。
检测(子步骤268)和确定(判定点270、272、274和276)可以使用或依赖于磁传感器阵列110中的全部或少于全部的磁传感器105。确定特定磁性是否存在或特性的值可以基于合计、平均或以其它方式处理来自磁传感器阵列110中的一些或所有磁传感器105的检测结果(子步骤268)。
在图12所示的实施例中，确定添加的磁性标记核苷酸前体中的哪一个已经结合到聚合酶上或者已经被并入到可延伸引物中是对每一个候选磁性标记核苷酸前体进行单独的“是/否”确定的结果。应当理解，可替换地，可以在单个步骤中进行确定，诸如，例如通过将检测到的特性值与密钥进行比较。例如，该密钥可以指示如果磁传感器105检测到的特性具有第一范围内的值，则第一磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中；如果磁传感器105检测到的特性具有第二范围内的值，则第二磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中；如果磁传感器105检测到的特性具有第三范围内的值，则第三磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中；如果磁传感器105检测到的特性具有第四范围内的值，则第四磁性标记核苷酸前体已经结合到聚合酶上或者被并入到可延伸引物中。特性值可以基于合计、平均或以其它方式处理来自磁传感器阵列110中的一些或所有磁传感器105的检测结果(子步骤268)。
如上所述，在一些实施例中，磁性标记核苷酸前体不可被核酸聚合酶延伸，因此，在检测到特性后，必须去除磁性标记，以使磁性标记核苷酸前体可被核酸聚合酶延伸。在一些实施例中，第一磁性标记核苷酸前体的一部分不可被核酸聚合酶延伸，但是第一磁性标记核苷酸前体的该部分通过化学切割变得可延伸。在磁性标记核苷酸前体不可被核酸聚合酶延伸的实施例中，在步骤278处，核酸链的核酸序列的记录已经增加(或开始)之后，在判定点280处，确定是否要进行额外的测序循环。如果是(判定点280的“否”分支)，则去除并入核苷酸前体的磁标记。磁标记可以通过化学、酶或本领域已知的其它方式去除，并且方法250进行到步骤264，在该步骤中，向流体室115添加高达四个磁性标记核苷酸前体(可能在执行与所示步骤262相似或相同的清洗步骤之后)。然后再次进行测序步骤266，以标识下一个与聚合酶结合的磁性标记核苷酸前体。
如果在判定点280处确定不执行额外的测序循环(判定点280的“是”分支)，则方法250在284处结束。
如上所述，在静态SBS中，每次对一个磁性标记核苷酸前体进行核酸测序。因此，测序过程缓慢但准确。相比之下，如下所述，动态SBS速度更快，允许更长的碱基读取，但更容易出错。
在动态SBS中，可以使用固定的聚合酶分子对核酸(例如，DNA)进行测序，该聚合酶分子在磁传感器阵列110的磁传感器105附近拴系到装置100，如图13所示。然后，所有磁性标记核苷酸前体可以同时添加到流体室115中，并且可以以至少与预期并入速率一样高的频率实时进行检测。在一些实施例中，检测每秒至少执行1,000次(即，检测速率至少为1kHz)。
在一些动态SBS实施例中，核苷酸前体通过具有不同的标记来区分，每个标记具有不同的磁性以便于区分。在其它动态SBS实施例中，所有引入的磁性标记核苷酸前体具有相同的标记，但并入动态不同。例如，不同的磁性标记核苷酸前体可以以不同的速率并入，从而能够基于它们的并入速率或并入时间来识别磁性标记核苷酸前体。作为另一个实例，不同的磁性标记核苷酸前体可以通过时域(例如，并入过程的作为时间函数的一个方面)或频域(例如，并入过程的作为频率函数的一个方面)中的不同并入概况来表征。因此，对于磁性标记核苷酸前体，并入过程的“特征”或概况(例如，磁性标记核苷酸前体是如何并入的，例如需要多长时间)可能不同，因此即使当相同的磁标记用于多个磁性标记核苷酸前体时，也能够区分它们。
因为检测是实时进行的，所以动态SBS不需要终止化学。
图14示出了根据一些实施例的动态SBS的方法300，并且图15图示了方法300。在302处，该方法开始。在304处，将多个聚合酶分子耦接(拴系)到磁传感器阵列110的磁传感器105的近端。例如，在一些实施例中，聚合酶分子连接或耦接到流体室115的近端壁117。聚合酶分子可以使用任何合适的技术连接到近端壁117上。作为一个实例，聚合酶分子可以通过将核酸聚合酶的多个分子中的每一个连接到微珠上，然后将微珠连接到流体室115的近端壁117上来连接。核酸聚合酶可以是任何合适的核酸聚合酶，如上文在图10的讨论中所讨论的。该讨论适用于此，不再重复。
在306处，向流体室115添加核酸模板。核酸模板包括引物结合位点和可延伸引物。
在308处，向流体室115添加磁性标记核苷酸前体。磁性标记核苷酸前体可以是常规的、天然的、非常规的或类似物，如上文参考图10描述的。在一些实施例中，磁性标记核苷酸前体是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或它们的等同物。在一些实施例中，磁性标记核苷酸前体是dATP、dGTP、dCTP、dTTP或它们的等同物。每个磁性标记核苷酸前体包含如上所述的可切割磁标记。在四个磁性标记核苷酸前体的情况下，第一磁性标记核苷酸前体包括第一可切割磁标记，第二磁性标记核苷酸包括第二可切割磁标记，第三磁性标记核苷酸包括第三可切割磁标记，并且第四磁性标记核苷酸包括第四可切割磁标记。
应当理解的是，步骤306和308可以组合或者它们的顺序可以颠倒。
在310处，进行测序以识别第一、第二、第三或第四磁性标记核苷酸前体中的哪一个已经被并入到可延伸引物。如图14所示，测序步骤310可以包含多个子步骤。例如，在图14所示的方法300中，在子步骤312处，装置100的一或多条地址线120用于检测磁传感器阵列110的磁传感器105的特性。如上所述，该特性可以是例如电阻、电阻的变化、磁场、磁场的变化、频率、频率的变化或噪声。
在314处，确定在测序循环的迭代过程中，第一、第二、第三或第四磁性标记核苷酸前体中的哪一个已经被并入到可延伸引物中。例如，该确定可以基于特性是否存在，即如果检测到特性，则认为磁性标记核苷酸前体已经被并入到可延伸引物中，如果没有检测到特性，则认为磁性标记核苷酸前体没有被并入到可延伸引物中。作为另一个实例，该确定可以基于特性的大小或值，例如，如果大小或值在指定范围内，则认为磁性标记核苷酸前体已经被并入到可延伸引物中，并且如果大小或值不在指定范围内，则认为磁性标记核苷酸前体没有被并入到可延伸引物中。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的每一个都是不同类型的，并且每一种类型都具有不同的磁性，从而使装置100能够区分第一、第二、第三和第四磁性标记核苷酸前体。
在一些实施例中，第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的两个或更多个具有相同的特定磁性，并且核酸模板的测序依赖于并入动态(例如，不同的磁性标记核苷酸前体可以以不同的速率并入或花费不同的时间量，或者以时域或频域中不同的并入概况为特征，等等)。在一些此类实施例中，第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的每一个都具有相同的特定磁性，并且核酸模板的测序依赖于并入动态。
检测(子步骤312)和确定(子步骤314)可以使用或依赖于磁传感器阵列110中的全部或少于全部的磁传感器105。确定特性是否存在或特性的值(子步骤314)可以基于合计、平均或以其它方式处理来自磁传感器阵列110中的一些或所有磁传感器105的检测结果(子步骤312)。
在316处，将并入磁性标记核苷酸前体的互补碱基的指示记录在核酸序列的记录中。
在318处，如果整个测序过程尚未完成(判定点318的“否”分支)，则方法300返回到步骤312。
当测序过程完成或终止时，该方法在320处结束。
在前面的描述和附图中，已经阐述了特定的术语，以提供对所公开的实施例的透彻理解。在一些情况下，术语或附图可能暗示实施本发明不需要的具体细节。
为了避免不必要地模糊本公开，众所周知的组件以框图形式示出和/或不详细讨论，或者在某些情况下根本不讨论。
除非本文中另有具体定义，否则所有术语都将给出其最广泛的可能解释，包含说明书和附图中暗示的含义以及本领域技术人员理解的和/或字典、论文等中定义的含义。如本文中明确阐述的，一些术语可能与它们的普通或习惯含义不一致。
如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”不排除复数指代物，除非另有说明。除非另有说明，“或”一词应解释为包含性的。因此，短语“A或B”应被解释为意指所有下列内容：“A和B”、“A但不是B”和“B但不是A”。本文中“和/或”的任何使用并不意味着“或”一词单独意味着排他性。
如在说明书和所附权利要求中所使用的，“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B或C中的一或多个”和“A、B和C中的一或多个”的表述是可互换的，并且每一个都包含以下所有含义：“仅A”、“仅B”、“仅C”、“A和B但不是C”、“A和C但不是B”、“B和C但不是A”以及“所有A、B和C”。
就具体实施方式或权利要求中使用的术语“包含”、“具有”、“带有”及其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包括”的方式具有包含性，即，意味着“包含但不限于”。术语“示例性”和“实施例”用于表示实例，而不是偏好或要求。
本文中使用的术语“上方”、“下方”、“之间”和“之上”是指一个特征相对于其它特征的相对位置。例如，设置在另一特征“上方”或“下方”的一个特征可以直接与另一特征接触，或者可以具有中间材料。此外，置于两个特征“之间”的一个特征可以直接与这两个特征接触，或者可以具有一或多个中间特征或材料。相反，在第二特征“之上”的第一特征与该第二特征接触。
附图不一定是按比例绘制的，并且特征的尺寸、形状和大小可能与它们在附图中的描绘方式有很大不同。
尽管已经公开了具体的实施例，但是很明显，在不脱离本公开的更广泛的精神和范围的前提下，可以对其进行各种修改和改变。例如，至少在可行的情况下，任何实施例的特征或方面可以与任何其它实施例结合应用，或者代替其对应的特征或方面。因此，说明书和附图被认为是说明性的，而不是限制性的。
Claims (66)
1.一种用于核酸测序的装置，所述装置包括：
磁传感器阵列，其包括：
多个磁传感器；以及
至少一个选择器元件；
耦接至所述磁传感器阵列的多个地址线，所述多个地址线包括位于所述磁传感器阵列下方并沿第一方向延伸的第一地址线，以及位于所述磁传感器阵列上方并沿第二方向延伸的第二地址线，其中所述第一方向垂直于所述第二方向；以及
流体室，其邻近所述磁传感器阵列，所述流体室包括邻近所述磁传感器阵列的近端壁。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述磁传感器阵列包括线性阵列。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述近端壁包含被配置成将核酸或核酸聚合酶锚定到所述近端壁的结构。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述结构包括腔或脊。
5.根据权利要求3所述的装置，其中所述流体室进一步包括底部表面，并且其中所述多个磁传感器位于所述近端壁后方。
6.根据权利要求1所述的装置，进一步包括经由所述第一地址线和所述第二地址线耦接到所述磁传感器阵列的感测电路，其中所述感测电路被配置成：
向所述第一地址线和所述第二地址线施加电流以检测耦接至所述第一地址线和所述第二地址线的所述多个磁传感器中的特定磁传感器的特性，其中所述特性指示所述流体室中磁性标记核苷酸前体是否存在。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述特性是磁场或电阻。
8.根据权利要求6所述的装置，其中所述特性是磁场的变化或电阻的变化。
9.根据权利要求6所述的装置，其中所述多个磁传感器中的每一个包括磁振荡器，并且其中所述特性是与所述多个磁传感器中的所述特定磁传感器的所述磁振荡器相关联或由所述多个磁传感器中的所述特定磁传感器的所述磁振荡器产生的信号的频率。
10.根据权利要求6所述的装置，其中所述特性是噪声水平。
11.根据权利要求1所述的装置，其中所述近端壁的表面包括聚丙烯、金、玻璃或硅。
12.根据权利要求1所述的装置，其中所述多个磁传感器以矩形网格模式排列，其中所述第一地址线标识所述磁传感器阵列的列，并且所述第二地址线标识所述磁传感器阵列的行。
13.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个选择器元件包括晶体管和二极管中的至少一个。
14.根据权利要求1所述的装置，进一步包括经由所述多个地址线耦接到所述磁传感器阵列的感测电路，其中所述感测电路被配置成检测所述多个磁传感器中的每一个的噪声。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述感测电路包括外差电路。
16.根据权利要求14所述的装置，其中所述感测电路包括：
比较器，以及
虚拟传感器元件，其不感测所述流体室的内容物。
17.根据权利要求1所述的装置，其中所述多个磁传感器中的第一部分以第一线性阵列排列，并且所述多个磁传感器中的第二部分以第二线性阵列排列，并且其中所述流体室包括：
第一通道，其位于所述第一线性阵列的第一侧与所述第二线性阵列的第一侧之间；以及
第二通道，其位于所述第一线性阵列的第二侧或所述第二线性阵列的第二侧上。
18.根据权利要求1所述的装置，其中所述多个磁传感器以交叉点结构排列。
19.根据权利要求1所述的装置，其中所述多个磁传感器中的每一个包括自旋扭矩振荡器(STO)，并且进一步包括检测电路，所述检测电路耦接到所述磁传感器阵列并被配置成读取所述多个磁传感器中的至少一个磁传感器，以检测振荡频率的变化。
20.根据权利要求1所述的装置，其中所述近端壁的厚度在大约2nm至大约20nm之间。
21.一种使用根据权利要求1至20中任一权利要求所述的装置对核酸测序的方法，所述方法包括：
(a)将核酸聚合酶的多个分子耦接到流体室的近端壁；
(b)在一或多轮添加中，向所述流体室添加(i)包括引物结合位点和可延伸引物的核酸模板，和(ii)包括第一可切割磁标记的第一磁性标记核苷酸前体、包括第二可切割磁标记的第二磁性标记核苷酸、包括第三可切割磁标记的第三磁性标记核苷酸和包括第四可切割磁标记的第四磁性标记核苷酸；以及
(c)对所述核酸模板进行测序，
其中对所述核酸模板进行测序包括：
使用所述多个地址线中的至少一条地址线来检测所述磁传感器阵列中所述多个磁传感器的至少一部分的特性，其中所述特性指示所述第一、第二、第三或第四磁性标记核苷酸前体中的哪一个已经被并入所述可延伸引物中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中对所述核酸模板进行测序进一步包括：
响应于所述检测，在所述核酸模板的核酸序列记录中记录所述并入磁性标记核苷酸前体的互补碱基。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四磁性标记核苷酸前体各自选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或其等同物。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的两个或更多个具有相同的特定磁性，并且其中所述特性是并入速率、并入所花的时间、频域特性、时域特性、并入过程的特征或所述并入过程的概况中的一或多个。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的每一个都具有相同的特定磁性，并且其中所述特性是并入速率、并入时间、频域特性、时域特性、并入过程的特征或所述并入过程的概况中的一或多个。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四可切割磁标记中的每一个都是不同类型的，其中每种类型都具有不同的磁性。
27.根据权利要求21所述的方法，其中将所述核酸聚合酶的所述多个分子耦接到所述流体室的所述近端壁包括：
将所述核酸聚合酶的所述多个分子中的每一个连接到多个微珠的相应微珠上；以及
将所述多个微珠连接到所述装置的所述近端壁上。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可切割磁标记、所述第二可切割磁标记、所述第三可切割磁标记或所述第四可切割磁标记中的至少一个包括磁性纳米粒子。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述磁性纳米粒子是分子、超顺磁性纳米粒子或铁磁纳米粒子。
30.根据权利要求21所述的方法，其中使用所述多个地址线中的所述至少一条地址线包括向所述多个地址线中的所述至少一条地址线施加电流。
31.根据权利要求21所述的方法，其中所述特性是磁场或电阻。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述特性是与所述多个磁传感器的所述至少一部分的磁振荡器相关联或由所述多个磁传感器的所述至少一部分的磁振荡器产生的信号的频率。
33.根据权利要求21所述的方法，其中所述特性是噪声水平。
34.根据权利要求21所述的方法，其中所述特性是磁场的变化或电阻的变化。
35.根据权利要求21所述的方法，其中所述特性是由磁场的变化或电阻的变化引起的。
36.一种使用根据权利要求1至20中任一权利要求所述的装置对核酸测序的方法，所述方法包括：
(a)将核酸链结合到近端壁；
(b)在一或多轮添加中，向流体室中添加(i)可延伸引物，和(ii)核酸聚合酶的多个分子；
(c)将包括第一可切割磁标记的第一磁性标记核苷酸前体加入到所述流体室中；以及
(d)对所述核酸链进行测序，
其中对所述核酸链进行测序包括：
使用所述多个地址线的至少一条地址线来检测所述磁传感器阵列中所述多个磁传感器的至少第一部分的特性，其中所述特性指示所述第一磁性标记核苷酸前体已经结合到所述核酸聚合酶的所述多个分子中的至少一个分子
上或者已经被并入到所述可延伸引物中。
37.根据权利要求36所述的方法，其中对所述核酸链进行测序进一步包括：
响应于所述检测，在所述核酸链的核酸序列记录中记录所述第一磁性标记核苷酸前体的互补碱基。
38.根据权利要求36所述的方法，进一步包括在进行步骤(b)、(c)和(d)之前扩增所述核酸链。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一磁性标记核苷酸前体不可被所述核酸聚合酶延伸，所述方法进一步包括：
在检测所述特性之后，去除所述第一可切割磁标记，并使所述第一磁性标记核苷酸前体可被所述核酸聚合酶延伸。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一磁性标记核苷酸前体的一部分不可被所述核酸聚合酶延伸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第一磁性标记核苷酸前体的所述部分通过化学切割变得可延伸。
42.根据权利要求36所述的方法，进一步包括，在步骤(c)之后，通过酶或化学切割去除所述第一可切割磁标记。
43.根据权利要求36所述的方法，进一步包括：
在每次重复期间用不同的磁性标记核苷酸前体重复步骤(c)和(d)。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第一和不同的磁性标记核苷酸前体中的每一个选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或其等同物。
45.根据权利要求36所述的方法，进一步包括在步骤(c)之前清洗所述流体室。
46.根据权利要求36所述的方法，进一步包括在检测所述磁传感器阵列中的所述多个磁传感器的所述至少第一部分的所述特性之前：
向所述流体室添加包括第二可切割磁标记的第二磁性标记核苷酸前体；以及
使用所述多个地址线的所述至少一条地址线，未检测到所述磁传感器阵列中的所述多个磁传感器的所述至少第一部分的所述特性，其中所述特性指示所述第二磁性标记核苷酸前体已经结合到所述核酸聚合酶的所述多个分子中的至少一个分子上或者已经被并入到所述可延伸引物中。
47.根据权利要求46所述的方法，进一步包括在将所述第二磁性标记核苷酸前体添加到所述流体室之后清洗所述流体室。
48.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一可切割磁标记具有第一磁性，并且其中所述方法进一步包括：
在所述一或多轮添加中，向所述流体室添加第二磁性标记核苷酸前体，所述第二磁性标记核苷酸前体包括具有第二磁性的第二可切割磁标记，并且其中所述特性标识所述第一磁性。
49.根据权利要求48所述的方法，进一步包括：
在所述一或多轮添加中，向所述流体室中添加包括具有第三磁性的第三可切割磁标记的第三磁性标记核苷酸前体，和包括具有第四磁性的第四可切割磁标记的第四磁性标记核苷酸前体。
50.根据权利要求36所述的方法，其中将所述核酸链结合到所述近端壁包括：
将衔接子连接到所述核酸链的一端；以及
将寡核苷酸耦接到所述流体室的所述近端壁，其中所述寡核苷酸与所述衔接子互补。
51.根据权利要求36所述的方法，其中将所述核酸链结合到所述近端壁包括使用聚苯乙烯或聚丙烯酰胺凝胶将所述核酸链连接到所述近端壁。
52.根据权利要求36所述的方法，其中将所述核酸链结合到所述近端壁包括通过分子之间不可逆的被动吸附或亲和力固定所述核酸链，或将水凝胶施加到所述近端壁的腔或脊。
53.根据权利要求36所述的方法，进一步包括：
在步骤(b)之后，向所述流体室中加入所述核酸聚合酶的额外的分子。
54.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一可切割磁标记包括磁性纳米粒子。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述磁性纳米粒子是分子、超顺磁性纳米粒子或铁磁纳米粒子。
56.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一磁性标记核苷酸前体包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或等同物中的一种。
57.根据权利要求36所述的方法，其中所述核酸聚合酶是缺乏3'-5'核酸外切酶活性的B型聚合酶。
58.根据权利要求36所述的方法，其中所述核酸聚合酶是热稳定性聚合酶。
59.根据权利要求36所述的方法，其中使用所述多个地址线的所述至少一条地址线包括向所述多个地址线的所述至少一条地址线施加电流。
60.根据权利要求36所述的方法，其中所述特性是磁场或电阻。
61.根据权利要求36所述的方法，其中所述特性是与所述多个磁传感器的所述第一部分的磁振荡器相关联或由所述多个磁传感器的所述第一部分的磁振荡器产生的信号的频率。
62.根据权利要求36所述的方法，其中所述特性是噪声水平。
63.根据权利要求36所述的方法，其中所述特性是磁场的变化或电阻的变化或者是由磁场的变化或电阻的变化引起的。
64.一种制造具有至少一个被配置成容纳流体的流体室的核酸测序器件的方法，所述方法包括：
在衬底上制造沿第一方向延伸的第一地址线；
制造多个磁传感器，所述多个磁传感器中的每一个具有底部部分和顶部部分，其中每个底部部分耦接到所述第一地址线；
在所述多个磁传感器的相邻磁传感器之间沉积介电材料；
制造多条附加地址线，所述多条附加地址线中的每一条都沿第二方向延伸并耦接到所述多个磁传感器中的相应磁传感器的所述顶部部分，其中所述第一方向垂直于所述第二方向；以及
去除邻近所述多个磁传感器的所述介电材料的部分以产生所述至少一个流体室。
65.根据权利要求64所述的方法，其中制造包括沉积。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中去除包括研磨或蚀刻。
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