CN113817807A - 基于CRISPR-Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及其应用和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于CRISPR‑Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及其应用和方法，通过采用CRISPR‑Cas、RCA、G‑四链体/hemin DNAzymes信号放大技术检测待测基因，能够实现敏感特异、低成本、无需大型实验设备、简单裸眼判读检测结果，检测灵敏度高，最低检测限低至20fmol/L；检测过程中Cas/crRNA复合物可直接识别血清中的靶标，不需核酸提取步骤；采用恒温扩增，无需精密温控设备，检测方法简单、易于操作、敏感特异、低成本、设备简单、通用性好、准确度高。

Description

基于CRISPR-Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及 其应用和方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，具体涉及基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，还涉及该系统的应用和方法。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是HER/ERBB酪氨酸激酶受体家族的一员，在细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞信号通路中发挥重要作用。研究显示，EGFR在非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、结直肠癌、头颈部癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中均高表达。在所有EGFR激酶结构域突变体中，大约47.0％为第19号外显子15bp的框内缺失(EGFR 19del)突变。已经证明，携带EGFR 19del突变的患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)表现出高度敏感性。因此，EGFR 19del基因突变已成为预测EGFR-TKIs治疗非小细胞肺癌敏感性的一个非常重要的生物标志物。

目前，用于EGFR 19del检测的主要方法有下一代测序(NGS)、液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)以及突变扩增阻滞系统-聚合酶链反应(ARMS-PCR)等方法。然而，这些方法存在操作繁琐、成本高、依赖热循环仪等缺点，限制了其在资源贫乏地区的广泛应用。最近，电化学传感技术和石英晶体微天平(QCM)等生物传感技术也被开发用于EGFR 19del检测。然而，这些方法往往涉及多次清洗步骤，依赖DNA化学修饰，需要专门的检测仪器来获取输出信号。因此，开发一种低成本、简单的基于肉眼的EGFR 19del比色生物传感器是非常必要和关键的。

CRISPR/Cas是细菌和古细菌的一种适应性免疫应答系统，保护自身免受病毒和质粒的入侵。在过去的几年中，该系统作为一种强大的基因编辑工具，广泛用于分子免疫、基因工程以及转录调控。近期研究发现，Cas12、Cas13和Cas14效应子在识别和切割特定靶标后表现出强大的反式切割活性，这揭示了CRISPR-Cas在核酸检测中的巨大潜力。现有的CRISPR-Cas生物传感平台大多需要与PCR、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等预扩增方法相结合，以实现靶标的超敏检测。但是，这些预扩增技术大多存在难以处理且不可避免的非特异性扩增。此外，尽管这些基于CRISPR的生物传感平台在分子诊断方面取得了革命性的突破，但几乎所有这些技术都需要庞大而昂贵的荧光设备、样品处理繁琐，以及不能定量分析，这些缺点限制了它们在现场快速检测中的应用。

RCA具有简单、灵敏、高效等优点，广泛应用于DNA、RNA、DNA甲基化、蛋白质和癌细胞等的检测。现有RCA检测技术大多以靶标核酸为模板，通过碱基互补配对原则将线性DNA挂锁连接为环状DNA模板，由于样本中含有与靶标核酸序列相近的核酸片段，因此容易产生不纯的环状DNA模板，从而导致非特异性RCA反应。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，采用CRISPR-Cas系统诱导环形单链DNA裂解，从而消除RCA的非特异性扩增反应，构建一种免标记和免洗的EGFR 19del可视化检测平台；本发明的目的之二在于提供所述可视化检测系统在检测待检靶标中的应用；本发明的目的之三在于提供利用所述可视化检测系统检测待测靶标的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，包括含茎环结构的单链RNA、环形的单链核酸、具有反式切割活性的Cas酶、RCA反应试剂和G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系；

所述单链RNA与待检双链DNA靶标中的一条链部分同源且能与另一条链互补结合，所述单链RNA能与Cas酶结合形成复合体，所述复合体在待检靶标存在下附属切割活性被激活；

所述环形的单链核酸能与RCA引物结合并扩增，且扩增产物能产生G-四链体的序列，还具有Cas酶附属切割位点序列；

所述G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系由hemin溶液、含K⁺的缓冲液、H₂O₂溶液和ABTS缓冲液构成，所述扩增产物在含K⁺和hemin溶液中形成G-四链体/heminDNAzyme复合物，所述G-四链体/hemin DNAzyme复合物与H₂O₂溶液和ABTS缓冲液发生颜色反应。

优选的，所述单链RNA的浓度为15～35nmol/L；所述Cas酶浓度为15～30nmol/L；所述phi29 DNA聚合酶含量为0.1～2U；所述含K⁺的缓冲液的pH为4～8。

优选的，所述G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系中hemin溶液为10μmol/Lhemin；所述含K⁺的缓冲液各组分如下：50mmol/L HEPES，400mmol/L NaCl，40mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，2％DMSO，pH 7.0；所述H₂O₂溶液为40mmol/L H₂O₂；所述ABTS缓冲液由pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解ABTS至浓度为7.5mmol/L。

优选的，所述RCA反应体系含有RCA引物、phi29 DNA聚合酶、dNTPs以及1×phi29DNA聚合酶反应缓冲液。

优选的，所述待检靶标为EGFR 19del，所述单链RNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述环形的单链核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述RCA引物为如SEQ ID NO.5所示。

2、所述可视化检测系统在检测待检靶标试剂中的应用。

3、利用所述可视化检测系统检测待测靶标的方法，包括如下步骤：

(1)将Cas酶与单链RNA加入缓冲液中进行孵育，得到Cas酶\单链RNA复合物溶液；

(2)将待测液和环形的单链核酸加入步骤(1)所得Cas酶\单链RNA复合物溶液中，进行酶切反应，然后加热灭活Cas酶；若待测液中含有待测靶标，Cas酶酶切待测靶标，同时附属切割活性被激活，切割环形的单链核酸；若待测液中不含待测靶标，Cas酶附属切割活性未激活，不能切割环形的单链核酸；

(3)向步骤(2)得到的酶切产物中加入RCA反应试剂，若环形的单链DNA未被切割，RCA扩增得到RCA产物；若环形的单链DNA被切割，RCA反应后无产物；

(4)向RCA产物中加入hemin溶液、含K⁺的缓冲液，放置1h，如果有RCA产物，RCA反应产物在K⁺的诱导下形成平行G-四链体结构，形成的G-四链体结构与hemin结合形成稳定的具有过氧化物酶活性的G-四链体/hemin DNAzyme复合物，然后加入H₂O₂和ABTS溶液，复合物催化H₂O₂介导的ABTS氧化，从而产生颜色变化，然后通过酶标仪、分光光度计或肉眼观察。

优选的，所述Cas酶为Cas12、Cas13或Cas14；

本发明中环形的单链核酸可以为环形的单链DNA，也可以为环形的单链RNA，优选为环形的单链DNA；若环形单链核酸为DNA，所述Cas酶为Cas12或Cas14；若环形单链核酸为RNA，所述Cas酶为Cas13。

优选的，具体步骤如下：(1)将Cas酶与单链RNA加入1×NEBuffer中，在37℃孵育30min，得到Cas酶\单链RNA复合物溶液；

(2)将待测液和环形的单链DNA加入步骤(1)所得Cas酶\单链RNA复合物溶液中，在37℃反应1h酶切，然后加热至65℃反应10min灭活Cas酶；若待测液中含有待测靶标，Cas酶酶切待测靶标，同时附属切割活性被激活，切割单链DNA；若待测液中不含待测靶标，Cas酶附属切割活性未激活，不能切割单链DNA；

(3)向步骤(2)得到的酶切产物中加入RCA反应体系，30℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活phi29 DNA聚合酶，若环形的单链DNA未被切割进行，RCA反应得到RCA产物；若环形的单链DNA被切割，RCA反应后无产物；

(4)向RCA产物中加入hemin溶液、含K⁺的缓冲液，放置1h，如果有RCA反应产物，RCA反应产物在K⁺的诱导下形成平行G-四链体结构，形成的G-四链体结构与hemin结合形成稳定的具有过氧化物酶活性的G-四链体/hemin DNAzyme复合物，然后加入H₂O₂和ABTS溶液，复合物催化H₂O₂介导的ABTS氧化，从而产生颜色变化，然后通过酶标仪、分光光度计或肉眼观察。

本发明中优选的待测靶标为EGFR 19del。

本发明的有益效果在于：本发明提供基于CRISPR-Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及其应用和方法，通过采用CRISPR-Cas、RCA、G-四链体/hemin DNAzymes信号放大技术检测待测基因，能够实现敏感特异、低成本、无需大型实验设备、简单裸眼判读检测结果，检测灵敏度高，最低检测限低至20fmol/L。

检测过程中Cas/crRNA复合物可直接识别血清中的靶标，不需核酸提取步骤；激活的Cas酶不但可以切割靶标，而且可将体系中环形单链核酸剪切成各种随机短线性片段，这些短线性片段不能引发RCA反应，G-四链体序列不能产生，G-四链体/hemin DNAzymes不能形成，限制了H₂O₂-ABTS系统的氧化还原反应，通过检测溶液420nm波长处吸光度即可实现EGFR19del的检测，且该检测可以通过普通分光光度计、酶标仪检测，甚至用肉眼即可读取检测结果。

本发明的检测过程采用恒温RCA技术，无需精密温控设备。

本发明的检测系统方法简单、易于操作、敏感特异、低成本、设备简单、通用性好、准确度高。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明检测系统的条件优化结果图(A为crRNA浓度优化；B为LbaCas12a浓度优化；C为phi29 DNA聚合酶量优化；D为HEPES缓冲液pH值优化)。

图2为本发明检测系统检测不同浓度EGFR 19del结果图(A为不同浓度EGFR 19del在400至500nm波长范围内的光谱图；B为EGFR 19del浓度在50fmol/L至50nmol/L时的定标曲线图，插图为对应的取对数拟合线性图)。

图3为该检测系统检测相同浓度的不同物质产生的信号变化结果图(a:无靶标EGFR 19del空白对照；b:lncRNA HULC；c：lncRNA H19-1；d：Kras G12S；e：Kras G13D；f：野生型EGFR L858R；g：突变型EGFR L858R；h：野生型EGFR 19del；i：双碱基错配EGFR 19del；j：单碱基错配EGFR 19del；k：EGFR 19del；l：b～k的混合物)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

(1)EGFR 19del crRNA

EGFR 19del crRNA为含茎环结构的单链RNA，与EGFR 19del基因组部分同源(EGFR19del-a：5’-atcgaggatttccttgttggctttcggagatgtcttgatagcgacgggaattttaactttctcaccttctgggat-3’(SQE ID NO.3)；

EGFR 19del-b：5’-atcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaagacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgat-3’(SQE ID NO.4)。crRNA能与LbaCas12a结合，引导LbaCas12a在EGFR 19del基因组PAM(TTTN)附近切割EGFR 19del基因组，并切割LbaCas12a附近的非特异性环状DNA模板序列，具体序列为：5’-uaauuucuacuaaguguagauggagaugucuugauagcgac-3’(SEQ ID NO.1)。

(2)环状DNA模板

环状DNA模板为环形的单链DNA，可与RCA引物结合，且含能复制产生G-四链体的序列(富含C)，此外，还具有LbaCas12a附属切割(反式切割)位点序列(TTATT)，具体序列为：5’-tattattatttagcacggacatttcccaacccgccctacccacttttattattat-3’(SEQ ID NO.2)。

(3)RCA反应体系

将CRISPR-Cas12a酶切反应后的产物加入含引物(5’-ataaaagtgggtaggg-3’(SEQID NO.5)、phi29 DNA聚合酶、dNTPs以及1×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液体系中，引发RCA反应，产生成千上万的重复的富G单链DNA序列。

(4)G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系：

上述RCA反应产物在K⁺的诱导下形成平行G-四链体结构，平行G-四链体结构与hemin(氯化血红素)结合后，形成稳定的具有过氧化物酶活性的G-四链体/hemin DNAzyme复合物，该复合物可催化H₂O₂介导的ABTS氧化，从而产生颜色变化。这种颜色改变可通过酶标仪或普通分光光度计进行检测，甚至可用肉眼观察。

实施例2

CRISPR-Cas12a/RCA/G-四链体/hemin检测原理：

LbaCas12a与EGFR 19del crRNA结合组装成二元复合体，待检样本中的靶标EGFR19del可将Cas12a/crRNA复合物激活并释放附属切割活性，对该体系中的环状DNA模板发生非特异性剪切，导致无法启动下一步RCA反应，G-四链体/hemin DNAzyme复合体不能形成，限制了H₂O₂介导的ABTS氧化，溶液几乎成无色。当待检样本中不含靶标EGFR 19del时，Cas12a/crRNA复合物不会被激活，该体系中的环状DNA模板也不会被Cas12a剪切，从而可以作为RCA模板启动下一步RCA反应，生成大量富含G序列的RCA产物，在K⁺及hemin的作用下，这些RCA产物进一步折叠形成具有过氧化物酶活性的G-四链体/hemin DNAzyem复合物，促进H₂O₂介导的ABTS氧化，产生肉眼可见的绿色变化。因此本发明是一种“Turn-off”检测模式。

实施例3

1、crRNA浓度优化：

(1)Cas12a/crRNA复合物准备：分别将0.4μL，0.6μL，0.8μL，1μL，1.2μL，1.4μL500nmol/L crRNA加入0.5μL 1μmol/L LbaCas12a以及2μL 10×NEBuffer 2.1混合物中，通过ddH₂O将最终体积调整为17μL，混匀后37℃孵育30min，制得Cas12a/crRNA复合物溶液。

(2)CRISPR-Cas12a酶切反应：设置实验组和对照组。实验组中的样品：向步骤(1)中继续加入2μL 1nmol/L靶标EGFR 19del以及1μL 100nmol/L环状DNA模板，涡旋混匀后将液体瞬离至管底，随后置于PCR仪中37℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活LbaCas12a蛋白酶；对照组中的样本用相同体积的水替代EGFR 19del，其他同实验组。

(3)RCA反应：向另一PCR反应管中依次加入13.6μL ddH₂O、2μL 10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、1μL1U/μL phi29 DNA聚合酶、1μL 10mmol/L dNTPs、0.4μL步骤(2)制得的实验组和对照组CRISPR-Cas12a酶切产物、2μL 10nmol/L RCA引物，涡旋混匀后将液体瞬离至管底，随后置于PCR仪中30℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活phi29 DNA聚合酶，制得RCA产物。

(4)吸光度检测：向步骤(3)制得的RCA产物中加入2μL 10μmol/L hemin(hemin用DMSO超声溶解成1mmol/L，HEPES缓冲液稀释至10μmol/L)以及55μL自配HEPES缓冲液(50mmol/L HEPES，400mmol/L NaCl，40mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，2％DMSO，pH7.0)，室温放置1h；随后向其中加入5μL，40mmol/L H₂O₂(ddH₂O稀释35％的H₂O₂至40mmol/L)以及20μL，7.5mmol/L ABTS缓冲液(pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解ABTS片剂至7.5mmol/L)；迅速充分混匀后，立即置于酶标仪中于420nm波长处检测0-30分钟内吸光度的动力学变化以及400～500nm波长范围内吸光度变化。

本实验结果以实验组(含EGFR 19del)相对于对照组(无EGFR 19del)在420nm波长处测得的吸光度降低量(ΔA)作为信号变化趋势，即ΔA＝(A₀-A)/A₀，A和A₀分别代表含EGFR19del的实验组和无EGFR 19del对照组在420nm波长处测得的吸光度值。如图1中A所示，随着crRNA浓度的增加，ΔA也逐渐增加，当crRNA终浓度为30nmol/L时，ΔA达最大值。因此，crRNA的最佳浓度为30nmol/L。

2、LbaCas12a浓度优化

LbaCas12a浓度分别为10nmol/L，15nmol/L，20nmol/L，25nmol/L和30nmol/L，其他实验步骤同实施例1，实验结果如图1中B所示。

如图1中B，随着LbaCas12a浓度的增加ΔA[ΔA＝(A₀-A)/A₀，A和A₀分别代表含EGFR19del的实验组和无EGFR 19del对照组在420nm波长处测得的吸光度值]值逐渐增加，当LbaCas12a浓度增加至25nmol/L时，ΔA逐渐趋于稳定。因此，25nmol/L为LbaCas12a的最佳浓度。

3、phi29 DNA聚合酶含量优化

phi29 DNA聚合酶含量分别为0.1U，0.3U，0.5U，1U和2U，其他实验步骤同实施例1，结果如图1中C所示。

从图1中C中可以看出，随着phi29 DNA聚合酶含量增加，信噪比S/N(S和N分别为存在和不存在环状DNA模板时，测得的420nm波长处吸光度值)逐渐增加，当phi29 DNA聚合酶含量超过1U时，S/N变化趋于稳定。因此，phi29 DNA聚合酶的最佳含量为1U。

4、HEPES缓冲液pH优化

HEPES缓冲液pH值分别为4，5，6，7和8，其他实验步骤同实施例1，结果如图1中D所示。

从图1中D中可以看出，随着HEPES缓冲液pH值增加，信噪比S/N(S和N分别为存在和不存在环状DNA模板时，测得的420nm波长处吸光度值)逐渐增加，当HEPES缓冲液pH值超过7时，S/N值急剧下降。因此，HEPES缓冲液的最佳pH值为7。

实施例4

灵敏度试验：

(1)将合成靶标EGFR 19del进行稀释，使其浓度为0mol/L、0.5×10^-13mol/L、1×10^-13mol/L、1×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L、1×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、0.5×10^-7mol/L。

(2)Cas12a/crRNA复合物准备：向PCR反应管中依次加入13.3μL ddH₂O、2μL 10×NEBuffer、1.2μL 500nmol/L crRNA、0.5μL 1μmol/L LbaCas12a，37℃孵育30min，制得Cas12a/crRNA复合物溶液。

(3)CRISPR-Cas12a酶切反应：向上述Cas12a/crRNA复合物溶液中加入2μL步骤(1)制得的不同浓度的靶标EGFR 19del以及1μL 100nmol/L环状DNA模板，涡旋混匀后将液体瞬离至管底，随后置于PCR仪中37℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活LbaCas12a蛋白酶，制得CRISPR-Cas12a酶切产物。

(4)RCA反应：向另一PCR反应管中依次加入13.6μL ddH₂O、2μL 10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、1μL 1U/μL phi29 DNA聚合酶、1μL 10mmol/L dNTPs、0.4μL步骤(3)制得的CRISPR-Cas12a酶切产物、2μL10nmol/L RCA引物，涡旋混匀后将液体瞬离至管底，随后置于PCR仪中30℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活phi29 DNA聚合酶，制得RCA产物。

(5)吸光度检测：向步骤(4)制得的RCA产物中加入2μL 10μmol/L hemin(hemin用DMSO超声溶解成1mmol/L，HEPES缓冲液稀释至10μmol/L)以及55μL自配HEPES缓冲液(50mmol/LHEPES，400mmol/L NaCl，40mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，2％DMSO，pH 7.0)，室温放置1h；随后向其中加入5μL，40mmol/L H₂O₂(ddH₂O稀释35％的H₂O₂至40mmol/L)以及20μL，7.5mmol/L ABTS缓冲液(pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解ABTS片剂至7.5mmol/L)；迅速充分混匀后，立即置于酶标仪中于420nm波长处检测0-30分钟内吸光度的动力学变化以及400～500nm波长范围内吸光度变化。

结果：本实验结果以实验组(含不同浓度EGFR 19del)相对于对照组(无EGFR19del)在420nm波长处测得的吸光度降低量(ΔA)来衡量检测体系中靶标的含量，即ΔA＝(A₀-A)/A₀，A和A₀分别代表实验组和对照组在420nm波长处测得的吸光度值。如图2中A和2中B所示，从测得的400nm至500nm可见光光谱图(图2中A)可以看出，随着EGFR 19del浓度逐渐增加，溶液吸光度逐渐降低。420nm波长处吸光度随着EGFR 19del浓度的增加而逐渐降低，这主要是因为EGFR 19del越多，导致用于RCA反应的环状DNA模板越少，从而降低了G-四链体/hemin DNAzyme的含量，不能催化H₂O₂介导的ABTS氧化产生明显颜色改变。从对应的拟合定标曲线(图2中B)的数据分析表明，本发明在50fmol/L至50nmol/L之间具有良好的线性拟合(R²＝0.99992)，拟合方程为ΔA＝0.14721lg c_{EGFR 19del}+0.25098。基于3σ/k规则，检测限计算为20fmol/L，表明本方法具有较高的灵敏度。

实施例5

特异性试验：

(1)制备不含待检靶标及其他任何干扰核酸序列的样本作为对照组，配制1nmol/LlncRNA HULC，1nmol/L lncRNA H19-1，1nmol/L Kras G12S，1nmol/L Kras G13D，1nmol/L野生型EGFR L858R，1nmol/L突变型EGFR L858R，1nmol/L野生型EGFR 19del，1nmol/L双碱基错配EGFR 19del，1nmol/L单碱基错配EGFR 19del，1nmol/L靶标EGFR 19del，以及包含EGFR 19del，lncRNA HULC，lncRNA H19-1，Kras G12S，Kras G13D，野生型EGFR L858R，突变型EGFR L858R，野生型EGFR 19del，双碱基错配EGFR 19del，单碱基错配EGFR19del各1nmol/L的混合样本作为实验组。

(2)Cas12a/crRNA复合物准备：向PCR反应管中依次加入13.3μL ddH₂O、2μL 10×NEBuffer 2.1、1.2μL 500nmol/L crRNA、0.5μL 1μmol/L LbaCas12a，37℃孵育30min，制得Cas12a/crRNA复合物溶液。

(3)CRISPR-Cas12a酶切反应：向上述Cas12a/crRNA复合物溶液中加入2μL步骤(1)制得的对照样本以及含靶标或干扰核酸的实验样本，以及1μL 100nmol/L环状DNA模板，涡旋混匀后将液体瞬离至管底，随后置于PCR仪中37℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活LbaCas12a蛋白酶，制得CRISPR-Cas12a酶切产物。

(4)RCA反应：向另一PCR反应管中依次加入13.6μL ddH₂O、2μL 10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、1μL 1U/μL phi29 DNA聚合酶、1μL 10mmol/L dNTPs、0.4μL步骤(3)制得的CRISPR-Cas12a酶切产物、2μL 10nmol/L RCA引物，涡旋混匀后将液体瞬离至管底，随后置于PCR仪中30℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活phi29 DNA聚合酶，制得RCA产物。

(5)吸光度检测：向步骤(4)制得的RCA产物中加入2μL，10μmol/L hemin(hemin用DMSO超声溶解成1mmol/L，HEPES缓冲液稀释至10μmol/L)以及55μL自配HEPES缓冲液(50mmol/L HEPES，400mmol/L NaCl，40mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，2％DMSO，pH7.0)，室温放置1h；随后向其中加入5μL，40mmol/L H₂O₂(ddH₂O稀释35％的H₂O₂至40mmol/L)以及20μL，7.5mmol/L ABTS缓冲液(pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解ABTS片剂至7.5mmol/L)；迅速充分混匀后，立即置于酶标仪中于420nm波长处检测0-30分钟内吸光度的动力学变化以及400～500nm波长范围内吸光度变化。

结果：本实验结果以实验组(含EGFR 19del或干扰核酸)相对于对照组(无EGFR19del及任何干扰核酸)在420nm波长处测得的吸光度降低量(ΔA)来衡量检测体系中靶标的含量，即ΔA＝(A₀-A)/A₀，A和A₀分别代表实验组和对照组在420nm波长处测得的吸光度值。如图3所示，本发明在检测相同浓度的靶标及干扰核酸序列时，靶标引起ΔA明显增加(k)，而干扰核酸仅引起微弱的ΔA改变(b～j)。此外，当检测样本中同时含靶标及干扰核酸时，ΔA也明显增加(l)，且与仅含靶标实验组组相比ΔA无明显差异，表明本方法能从干扰核酸中准确识别出靶标，具有较高的特异性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院

<120> 基于CRISPR-Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及其应用和方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uaauuucuac uaaguguaga uggagauguc uugauagcga c 41

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tattattatt tagcacggac atttcccaac ccgccctacc cacttttatt attat 55

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgaggatt tccttgttgg ctttcggaga tgtcttgata gcgacgggaa ttttaacttt 60

ctcaccttct gggat 75

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcccagaag gtgagaaagt taaaattccc gtcgctatca agacatctcc gaaagccaac 60

aaggaaatcc tcgat 75

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ataaaagtgg gtaggg 16

Claims (10)

1.基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：包括含茎环结构的单链RNA、环形的单链核酸、具有反式切割活性的Cas酶、RCA反应试剂和G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系；

所述单链RNA与待检双链DNA靶标中的一条链部分同源且能与另一条链互补结合，所述单链RNA能与Cas酶结合形成复合体，所述复合体在待检靶标存在下附属切割活性被激活；

所述环形的单链核酸能与RCA引物结合并扩增，且扩增产物能产生G-四链体的序列，还具有Cas酶附属切割位点序列；

所述G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系由hemin溶液、含K⁺的缓冲液、H₂O₂溶液和ABTS缓冲液构成，所述扩增产物在含K⁺和hemin溶液中形成G-四链体/hemin DNAzyme复合物，所述G-四链体/hemin DNAzyme复合物与H₂O₂溶液和ABTS缓冲液发生颜色反应。

2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述单链RNA的浓度为15～35nmol/L；所述Cas酶浓度为15～30nmol/L；所述phi29 DNA聚合酶含量为0.1～2U；所述含K⁺的缓冲液的pH为4～8。

3.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系中hemin溶液为10μmol/Lhemin；所述含K⁺的缓冲液各组分如下：50mmol/L HEPES，400mmol/L NaCl，40mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，2％DMSO，pH 7.0；所述H₂O₂溶液为40mmol/L H₂O₂；所述ABTS缓冲液由pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解ABTS至浓度为7.5mmol/L。

4.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述RCA反应体系含有RCA引物、phi29 DNA聚合酶、dNTPs以及1×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液。

5.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述待检靶标为EGFR 19del，所述单链RNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述环形的单链核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求4所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述RCA引物为如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求1～6任一项所述可视化检测系统在检测待检靶标试剂中的应用。

8.利用权利要求1～6任一项所述可视化检测系统检测待测靶标的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Cas酶与单链RNA加入缓冲液中进行孵育，得到Cas酶\单链RNA复合物溶液；

(2)将待测液和环形的单链核酸加入步骤(1)所得Cas酶\单链RNA复合物溶液中，进行酶切反应，然后加热灭活Cas酶；若待测液中含有待测靶标，Cas酶酶切待测靶标，同时附属切割活性被激活，切割环形的单链核酸；若待测液中不含待测靶标，Cas酶附属切割活性未激活，不能切割环形的单链核酸；

(3)向步骤(2)得到的酶切产物中加入RCA反应试剂，若环形的单链DNA未被切割进行，RCA扩增得到RCA产物；若环形的单链DNA被切割RCA反应后无产物；

(4)向RCA产物中加入hemin溶液、含K⁺的缓冲液，放置1h，如果有RCA产物，RCA反应产物在K⁺的诱导下形成平行G-四链体结构，形成的G-四链体结构与hemin结合形成稳定的具有过氧化物酶活性的G-四链体/hemin DNAzyme复合物，然后加入H₂O₂和ABTS溶液，复合物催化H₂O₂介导的ABTS氧化，从而产生颜色变化，然后通过酶标仪、分光光度计或肉眼观察。

9.根据权利要求6所述可视化检测系统检测待测靶标的方法，其特征在于：所述Cas酶为Cas12、Cas13或Cas14。

10.根据权利要求6所述可视化检测系统检测待测靶标的方法，其特征在于：

(1)将Cas酶与单链RNA加入1×NEBuffer中进行在37℃孵育30min，得到Cas酶\单链RNA复合物溶液；

(2)将待测液和环形的单链DNA加入步骤(1)所得Cas酶\单链RNA复合物溶液中，在37℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活Cas酶；若待测液中含有待测靶标，Cas酶酶切待测靶标，同时附属切割活性被激活，切割单链DNA；若待测液中不含待测靶标，Cas酶附属切割活性未激活，不能切割单链DNA；

(3)向步骤(2)得到的酶切产物中加入RCA反应体系，30℃反应1h，然后加热至65℃反应10min灭活phi29 DNA聚合酶，若环形的单链DNA未被切割，RCA反应得到RCA产物；若环形的单链DNA被切割，RCA反应后无产物；

(4)向RCA产物中加入hemin溶液、含K⁺的缓冲液，放置1h，如果有RCA反应产物，RCA反应产物在K⁺的诱导下形成平行G-四链体结构，形成的G-四链体结构与hemin结合形成稳定的具有过氧化物酶活性的G-四链体/hemin DNAzyme复合物，然后加入H₂O₂和ABTS溶液，复合物催化H₂O₂介导的ABTS氧化，从而产生颜色变化，然后通过酶标仪、分光光度计或肉眼观察。

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