CN113817678A - 对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途 - Google Patents

Abstract

本申请属于医疗检测技术领域，具体提供一种对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途，其用于制备检测，和/或治疗疾病的用品。本申请基于统计学的要求，得出了健康正常人的中性粒细胞趋化功能正常值，通过检测对象的样本中的中性粒细胞来提供检测和/或治疗疾病的建议和用品，所涉及的检测方法具有较强的精确度，用到的仪器方便、安全无任何风险。

Description

对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途

技术领域

本发明涉及一种对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途，属于医疗检测技术领域。

背景技术

中性粒细胞是人体重要的抵御病原体入侵的先天性免疫细胞，由骨髓造血干细胞产生，在骨髓中分化发育，进入血液或组织，是机体外周血中数量最多的白细胞，正常生理状态下占白细胞总数的40％～75％。中性粒细胞在瑞氏染色血涂片中，胞质呈无色或极浅的淡红色，细胞核呈杆状或2～5分叶状，叶与叶间有细丝相连，所以也常被称为多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)，具有趋化、吞噬、杀菌的功能。当人体受到致病菌的侵袭时，中性粒细胞能趋化至感染部位，将细菌吞入胞内，并通过多种途径杀灭细菌，是人体抵抗细菌感染的第一道防线，在人体非特异性免疫系统中发挥着非常重要的作用。

目前，中性粒细胞趋化功能的检测分析，国内外尚未存在具体的检测指标，缺乏相关的检测标准和指导值。因此，对中性粒细胞趋化功能的检测与分析对病人的免疫状况的精准诊断和治疗提供了新的方向，具有非常重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途，能通过检测对象的样本中的中性粒细胞来检测和/或治疗疾病。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途，用于制备检测，和/或治疗疾病的用品。

进一步地，所述产品检测所述对象的样本中的中性粒细胞的趋化功能，其中，当所述对象的样本中的中性粒细胞的趋化功能弱于健康的或没有感染的样本的中性粒细胞的趋化功能，则建议使用所述用品。

进一步地，所述产品检测所述中性粒细胞的趋化功能指标，所述趋化功能指标选自包括趋化距离、趋化细胞百分比、趋化指数或最大趋化速度中的至少一种。

进一步地，所述趋化功能指标选自趋化距离，所述趋化距离的正常值范围为大于等于1755.85μm。

进一步地，所述疾病选自包括烧伤、脓毒症、糖尿病或肿瘤中的至少一种。

进一步地，所述样本为全血或血液分样。

进一步地，所述血液分样包括血清或血浆。

进一步地，所述产品采用以下检测方法：

提供所述样本，进行离心处理和底部细胞团块重悬；

将重悬后的底部细胞团块均匀吹散，并进行密度梯度离心处理；

密度梯度离心后的溶液分三层，将上层的清液及中间层的PBMC层吸去，以得到底层的细胞团；

对所述细胞团中的红细胞进行裂解处理，并进行离心处理，得到中性粒细胞；

对所述中性粒细胞进行计数，并调整中性粒细胞的浓度，吸取中性粒细胞悬液至趋化模型中进行趋化。

进一步地，所述提供所述样本，进行离心处理具体为：

采集所述样本至EDTA抗凝管中，加入等体积的葡萄糖混匀后在室温下静置20分钟，然后取上清液至离心管中，采用400g的离心力，并在20℃的条件下离心10分钟；

和/或，

所述密度梯度离心处理具体为：

采用400g的离心力，在20℃的条件下离心35分钟。

进一步地，所述细胞团中的红细胞需要裂解两次

与现有技术相比，本申请的有益效果在于：本申请基于统计学的要求，得出了健康正常人的中性粒细胞趋化功能正常值，通过检测对象的样本中的中性粒细胞来提供检测和/或治疗疾病的建议和用品，所涉及的检测方法具有较强的精确度，用到的仪器方便、安全无任何风险。

并且，通过对样本离心、裂解等处理，以快速得到中性粒细胞，提高提取速度，缩短检测时间。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本申请所示范的一种实施例的中性粒细胞趋化检测方法的流程图；

图2为本申请所示范的一种实施例的所提取的中性粒细胞的趋化示意图；

图3为本申请所示范的一种实施例的142例健康人中性粒细胞2h趋化距离数据体；

图4为本申请所示范的一种实施例的142例健康人中性粒细胞的趋化距离的正态分布图；

图5为本申请所示范的一种实施例的142例健康人中性粒细胞中男女中性粒细胞的趋化距离统计图；

图6为本申请所示范的一种实施例的所提取的中性粒细胞的趋化示意图；

图7为本申请所示范的一种实施例的所提取的中性粒细胞的趋化示意图；

图8为本申请所示范的一种实施例的所提取的中性粒细胞的趋化示意图；

图9为本申请所示范的一种实施例的所提取的中性粒细胞的趋化示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

需要说明的是：本申请中，“精确度”是指测量或计算的数量(测试报告值)与其实际(或真实)值的符合程度。临床精确度是指真实输出(真阳性(TP)或真阴性(TN)与误分类输出(假阳性(FP)或假阴性(FN))的比例，并且除了别的测量以外，可以表述为灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)或阴性预测值(NPV)、Matheus相关系数(MCC)，或似然度、让步比、接受者操作特性(ROC)曲线、曲线下面积(AUC)。

“公式”、“算法”或“模型”为任何数学公式、算法、分析或程式化过程、或统计技术，其采用一种或多种连续或类别输入(本文称为“参数”)并且计算输出值(有时称为“指数”或“指数值”)。“公式”的非限制性实例包括总和、比率和回归算子(例如系数或幂(exponent))、生物标记值转化和归一化(包括但不限于基于临床-决定因素如性别、年龄、或种族的那些归一化方案)、规则和准则、统计分类模型和在历史群体上训练的神经网。在组合决定因素中特别使用线性和非线性公式和统计分类分析以确定对象样品中检测的决定因素的水平与具有感染或某类型感染的对象的概率之间关系。在组和组合构建中，特别要关注的是结构和句法统计分类算法，和指数构建、利用模式识别特征的方法，包括已确认技术，如互相关法，主组分分析法(PCA)，因子旋转法，逻辑回归法(LogReg)，线性判别分析法(LDA)，Eigengene线性判别分析法(ELDA)，支持向量机法(SVM)，随机森林法(RF)，递归分割树法(RPART)以及其他有关决定树分类技术，缩小重心法(SC)，StepAIC，Kth-NearestNeighbor，Boosting，决策树，Neural Networks，贝叶斯网络法，和隐马尔可夫模型等等。其他技术可以在事件危害分析的存活和时间中使用，包括本领域的技术人员熟知的Cox、Weibull、Kaplan-Meier和Greenwood模型。许多这些技术可与决定因素选择技术组合使用，例如前向选择，向后选择，或逐步选择，给定大小的所有潜在组的全面调查，基因算法，或它们可以自身包括在其自身技术内的生物标记选择方法。这些可以与信息标准例如Akaike信息标准(AIC)或Bayes信息标准(BIC)结合，以便定量其他生物标记和模型改进之间的折衷，并且有助于最小化过度拟合。使用诸如Bootstrap、Leave-One-Out(LOO)和10-Fold交叉验证验证(10-Fold CV)之类技术，所得预测模型可以在其他研究中验证，或在最初训练的研究中交叉验证。在各种步骤中，错误发现率可以根据本领域已知技术通过值置换来估算。

对于本发明的诊断性(或预后性)干预，由于各输出(其在疾病分类诊断测试中可能为TP、FP、TN、或FN)承担不同成本，健康经济效用函数可能基于临床情况和个体输出成本和值，优选倾向灵敏度超过特异性，或PPV超过NPV，因此提供健康经济性能和值的另一个测量，该测量可能不同于更直接临床或分析性能测量。这些不同测量和相对折衷一般将仅在具有零误差率的完美测试(也称零预测对象输出误分类或FP和FN)的情况下会聚，所有性能测量将倾向不完美，但程度不同。

“测量”、“测定”、“检测”或“检查”是指评价临床中给定物质或者对象衍生样品(包含这种物质的定性或定量浓度水平的衍生)的存在、不存在、数量或量(其能是有效量)，或另外评估对象的非分析物临床参数或临床-决定因素的值或分类。

本发明上下文中的“样本”是从对象中分离的生物样品，并且能包括，例如但不限于，全血、血清、血浆、口水、黏液、呼吸的空气、尿液、CSF、唾液、汗、粪便、毛发、精液、活检物、鼻液溢、组织活检物、细胞学样品、血小板、网状细胞、白细胞、上皮细胞、或全血细胞。

所谓“统计学显著”指改变大于单独偶然发生可预期(可以是“假阳性”)。统计学显著能用本领域已知的任何方法测定。常用的显著性量度包括p值，其表示至少极限值在给定数据点获得结果的概率，假定该数据点是单独偶然结果。p值是0.05或更小时，通常认为结果显著性高。

在本发明上下文中“对象”优选人类。对象可为男性或女性。对象是原先诊断或鉴定有感染，并且任选地已经经受或正在经受感染治疗干预的人。或者，对象也可以是先前未诊断有感染的对象。例如，对象可显示一种或多种有感染的风险因子。

本申请提供一种对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途，用于制备检测，和/或治疗疾病的用品。为发展和验证本发明的各种方面，发明人发现当前各类疾病的困扰与中性粒细胞息息相关：1)感染的患者中性粒细胞趋化异常，使得中性粒细胞不能到达感染部位清除病原微生物，同时过多的中性粒细胞募集到非炎症部位而引起器官损伤；2)肿瘤患者的中性粒细胞释放功能异常，中性粒细胞释放的碱性磷酸酶具有抗肿瘤作用，而当它过量释放时，会引起组织损伤，破坏癌周组织，为肿瘤的扩散提供有利条件；3)糖尿病患者的中性粒细胞死亡方式异常，糖尿病患者创面存在中性粒细胞胞外诱捕网过度形成，这种促炎的细胞死亡方式，导致了糖尿病患者慢性创面的难以愈合等等。

基于上述情况，发明人检测了142例健康正常人的中性粒细胞趋化功能，按照统计学要求，得出了健康正常人的中性粒细胞趋化功能正常值。

具体的，本申请中的所述产品检测所述对象的样本中的中性粒细胞的趋化功能，其中，当所述对象的样本中的中性粒细胞的趋化功能弱于健康的或没有感染的样本的中性粒细胞的趋化功能，则建议使用所述用品。

可选的，所述产品检测所述中性粒细胞的趋化功能指标，所述趋化功能指标选自包括趋化距离、趋化细胞百分比、趋化指数或最大趋化速度中的至少一种。

可选的，所述趋化功能指标选自趋化距离，所述趋化距离的正常值范围为大于等于1755.85μm。

可选的，所述疾病选自包括脓毒症患者、糖尿病或肿瘤中的至少一种。

可选的，所述产品采用以下检测方法：

提供所述样本，进行离心处理和底部细胞团块重悬；

将重悬后的底部细胞团块均匀吹散，并进行密度梯度离心处理；

密度梯度离心后的溶液分三层，将上层的清液及中间层的PBMC层吸去，以得到底层的细胞团；

对所述细胞团中的红细胞进行裂解处理，并进行离心处理，得到中性粒细胞；

对所述中性粒细胞进行计数，并调整中性粒细胞的浓度，吸取中性粒细胞悬液至趋化模型中进行趋化。

可选的，所述提供所述样本，进行离心处理具体为：

采集所述样本至EDTA抗凝管中，加入等体积的葡萄糖混匀后在室温下静置20分钟，然后取上清液至离心管中，采用400g的离心力，并在20℃的条件下离心10分钟；

和/或，

所述密度梯度离心处理具体为：

采用400g的离心力，在20℃的条件下离心35分钟。

可选的，所述细胞团中的红细胞需要裂解两次。

具体的，请参见图1，方法包括：

采集样本至EDTA抗凝管中，加入等体积的葡萄糖混匀后并静置。在本实施例中，EDTA抗凝管的颜色为紫色，且样本与葡萄糖的体积为2ml，葡萄糖的浓度为3％。诚然，在其他实施例中，样本与葡萄糖的体积也可为其他，葡萄糖的浓度也可为其他，在此不做具体限定，根据实际情况而定。

取静置后样本的上清液至离心管中，进行离心处理。具体的，样本在室温下需静置20分钟以沉淀，然后取上清液至离心管中，采用400g的离心力，并在20℃的条件下离心10分钟。诚然，在其他实施例中，离心处理的条件也可为其他，在此不做具体限定，根据实际情况而定。

在离心处理后的样本中加入1×无钙镁离子Hanks平衡盐溶液以重悬底部细胞团块。其中，1×无钙镁离子Hanks平衡盐溶液为预先配置好的原液，此时无需对该原液做任何稀释，直接在离心处理后的样本中加入该原液即可。呈上述，1×无钙镁离子Hanks平衡盐溶液的体积为3ml。

将重悬后的底部细胞团块均匀吹散，并从离心管的底部缓慢加入聚蔗糖溶液，进行密度梯度离心处理。所述“密度梯度离心处理”具体为：采用400g的离心力，在20℃的条件下离心35分钟。

密度梯度离心后的溶液分三层，将上层的清液及中间层的PBMC层吸去，以得到底层的细胞团。其中，PBMC层为(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单核细胞)层，其包含大量单核细胞和淋巴细胞等，底部的则为红细胞及成熟的中性粒细胞。

采用灭菌用水对细胞团中的红细胞进行裂解处理，在本实施例中，所述细胞团中的红细胞需要裂解两次，且灭菌用水的体积为3ml。轻柔吹吸后依次加入2×无钙镁离子Hanks平衡盐溶液、1×无钙镁离子Hanks平衡盐溶液混匀，并再次进行离心处理，得到中性粒细胞；所述“并再次进行离心处理”具体为：采用400g的离心力，在20℃的条件下离心7分钟。

请结合图2，对中性粒细胞进行计数，并调整中性粒细胞的浓度，吸取中性粒细胞悬液至趋化模型中进行趋化。所述趋化模型为培养皿，所述培养皿为透明培养皿以直观的观察中性粒细胞的迁移运动。具体的，该培养皿为中国专利CN105062865B所公开的细胞透膜迁移试验用装置及制作用型模，在此不做赘述。

常规提取中性粒细胞所需时间大概要2h，按照上述方法提取中性粒细胞所需的时间提高了快一倍时间，且简化了步骤，达到提高提取速度，缩短检测时间的效果。

请结合图2，并且，经最后趋化试验结果所示，利用本方法所采取的中性粒细胞在趋化模型中的趋化结果首次建立了精准分析的指标，各项指标如下：

1、趋化距离(Chemotaxis Distance，CD)：中性粒细胞于琼脂糖趋化模型中趋化两小时所能达到的最远距离，该最远距离大于等于1755.85μm。

2、趋化细胞百分比(Chemo Cell Ratio，CCR)：全部趋化细胞数量占趋化细胞总数(10⁵个)的百分比，该百分比大于等于3.34％。该百分比的计算公式如下：

CCR＝(全部趋化细胞数/趋化细胞总数)×100％。

3、趋化指数(Chemo Index，CI)：Ⅰ区与Ⅱ区的趋化细胞数量，占全部趋化细胞数量的比值，该比值大于等于39.63，且该比值的公式如下：

CI＝【(Ⅰ区细胞数+Ⅱ区细胞数)/全部趋化细胞数】×100。

4、最大趋化速度(Maximum Speed of Chemotaxis，Vmax)：中性粒细胞趋化两小时所能达到的最远距离与趋化时间(120min)的比值，该比值大于等于14.63um/min，计算公式如下：

Vmax＝趋化距离/趋化时间＝CD/120。

下面将结合具体实施例来对本申请进行详细说明。

实施例一

本实施例中对142例健康正常人对象的血液样本的中性粒细胞进行检测，本实施例中，以趋化距离来对中性粒细胞的趋化功能进行判断。

请参见图3，本实施例采用Shapiro-Wilk法，P值＝0.0526，对142例健康人(男性63例，女性89例)中性粒细胞2h趋化距离进行分析，结果显示符合正态分布，如图4所示。由图4可知，正态分布中，过低值为异常，故取单侧、下限，常用95％参考值范围，下限为1755.85μm，即趋化正常值范围为：≥1755.85μm。具体的，均值Mean:2102.71941，标准差STD:210.862622；最大值：2587.2μm，最小值：1586.2μm，中位数：2086.250μm。图5显示了男性和女性的中性粒细胞趋化距离差异情况，由图可知，男性中性粒细胞的趋化距离均值为2056μm，女性中性粒细胞的趋化距离均值为2028μm，其中，P＝0.3019(P>0.05，男女中性粒细胞2h趋化距离无统计学差异)。

实施例二

本实施例采用实施例一所示的方法对烧伤患者对象样本的中性粒细胞进行趋化功能判断，请结合图6，由图可知，2小时内，烧伤患者对象样本的中性粒细胞的趋化距离明显低于实施例一所示的健康正常人对象的样本。

实施例三

本实施例采用实施例一所示的方法对肿瘤对象样本的中性粒细胞进行趋化功能判断，请结合图7，由图可知，2小时内，肿瘤对象样本的中性粒细胞的趋化距离明显低于实施例一所示的健康正常人对象的样本。

实施例四

本实施例采用实施例一所示的方法对糖尿病患者对象样本的中性粒细胞进行趋化功能判断，请结合图8，由图可知，2小时内，糖尿病患者对象样本的中性粒细胞的趋化距离明显低于实施例一所示的健康正常人对象的样本。

实施例五

本实施例采用实施例一所示的方法对重症感染患者(脓毒症)对象样本的中性粒细胞进行趋化功能判断，请结合图9，由图可知，2小时内，重症感染患者对象样本的中性粒细胞的趋化距离明显低于实施例一所示的健康正常人对象的样本。

以上实施例仅是通过对烧伤、脓毒症、糖尿病或肿瘤进行距离分析，并不代表仅限于次，本领域技术员人有理由的在其他疾病中应用本申请的技术方案。

综上所述：本申请基于统计学的要求，得出了健康正常人的中性粒细胞趋化功能正常值，通过检测对象的样本中的中性粒细胞来提供检测和/或治疗疾病的建议和用品，所涉及的检测方法精确，用到的仪器方便、安全无任何风险。

并且，通过对样本离心、裂解等处理，以快速得到中性粒细胞，提高提取速度，缩短检测时间。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种对象的样本中检测中性粒细胞的产品的用途，其特征在于，用于制备检测，和/或治疗疾病的用品。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品检测所述对象的样本中的中性粒细胞的趋化功能，其中，当所述对象的样本中的中性粒细胞的趋化功能弱于健康的或没有感染的样本的中性粒细胞的趋化功能，则建议使用所述用品。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品检测所述中性粒细胞的趋化功能指标，所述趋化功能指标选自包括趋化距离、趋化细胞百分比、趋化指数或最大趋化速度中的至少一种。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述趋化功能指标选自趋化距离，所述趋化距离的正常值范围为大于等于1755.85μm。

5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述疾病选自包括烧伤、脓毒症、糖尿病或肿瘤中的至少一种。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述样本为全血或血液分样。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述血液分样包括血清或血浆。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述产品采用以下检测方法：

提供所述样本，进行离心处理和底部细胞团块重悬；

将重悬后的底部细胞团块均匀吹散，并进行密度梯度离心处理；

密度梯度离心后的溶液分三层，将上层的清液及中间层的PBMC层吸去，以得到底层的细胞团；

对所述细胞团中的红细胞进行裂解处理，并进行离心处理，得到中性粒细胞；

对所述中性粒细胞进行计数，并调整中性粒细胞的浓度，吸取中性粒细胞悬液至趋化模型中进行趋化。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述提供所述样本，进行离心处理具体为：

采集所述样本至EDTA抗凝管中，加入等体积的葡萄糖混匀后在室温下静置20分钟，然后取上清液至离心管中，采用400g的离心力，并在20℃的条件下离心10分钟；

和/或，

所述密度梯度离心处理具体为：

采用400g的离心力，在20℃的条件下离心35分钟。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述细胞团中的红细胞需要裂解两次。

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