CN113784970B - Erk抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

一类作为ERK抑制剂的化合物，及其在制备治疗ERK相关疾病的药物中的应用。具体涉及式(III)所示化合物、其异构体或其药学上可接受的盐。

Description

ERK抑制剂及其应用

本申请主张如下优先权：

CN201910404679.3，申请日：2019.05.15；

CN201910761813.5，申请日：2019.08.16；

CN201911248182.3，申请日：2019.12.06；

CN202010309793.0，申请日：2020.04.17。

技术领域

本发明涉及一类作为ERK抑制剂的化合物，及其在制备治疗ERK相关疾病的药物中的应用。具体涉及式(Ⅲ)所示化合物、其异构体或其药学上可接受的盐。

背景技术

Ras/Raf/MEK/ERK通路是一条经典的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)信号级联通路，参与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的信号转导，是控制细胞生长、分化和存活最重要的信号转导途径之一。

研究表明，突变或扩增引起的Ras/Raf/MEK/ERK通路异常活化是多种癌症发生的决定因素。在人类肿瘤中，RAS突变发生率约为22％，BRAF突变发生率约为7％，MEK突变发生率约为1％，因此，该通路上的关键节点蛋白已成为癌症治疗的重要靶点(CancerDiscov.2019,9,329-341)。目前，已有多个BRAF抑制剂和MEK1/2抑制剂，以及它们的联用方案，被美国FDA批准用于黑色素瘤、BRAFV600E突变型非小细胞肺癌等癌症的治疗。然而，使用这些上游节点的BRAF和MEK抑制剂后，由于突变或通路重新激活，会快速导致耐药性问题，极大地限制了它们的临床应用。

细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)，特别是ERK1和ERK2激酶，是Ras/Raf/MEK/ERK通路的主要参与者和下游关键节点，在许多人类的癌症中都可发现它们的过度激活。ERK作为该通路的末端信号激酶，目前尚未发现有耐药突变，因此，靶向ERK激酶的药物有望克服上游靶点抑制剂治疗后产生的耐药性问题，成为更具潜力的治疗策略。但迄今为止，关于ERK抑制剂的研究仍处于临床阶段，还没有ERK抑制剂作为药物批准上市。综上所述，迫切需要研发出安全、有效的ERK抑制剂药物满足肿瘤治疗的需要。

发明内容

本发明提供了式(Ⅲ)化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

n为0、1或2；

环A为

T₁、T₂和T₃分别独立地选自N和CH；

D₁和D₂分别独立地选自-CH₂-和-CH₂-CH₂-；

R₁选自H和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_a取代；

R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_b取代；

R₄选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂；

R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_c取代；

R₁₀选自H、F、Cl、Br、I和CH₃；

R_a、R_b和R_c分别独立地选自F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂。

本发明还提供了式(Ⅰ’)化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

n为0、1或2；

环A为

T₁、T₂和T₃分别独立地选自N和CH；

D₁和D₂分别独立地选自-CH₂-和-CH₂-CH₂-；

R₁选自H和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_a取代；

R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_b取代；

R₄选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂；

R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_c取代；

R_a、R_b和R_c分别独立地选自F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂。

本发明还提供了式(Ⅰ)化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

环A为

T₁、T₂和T₃分别独立地选自N和CH；

D₁和D₂分别独立地选自-CH₂-和-CH₂-CH₂-；

R₁选自H和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_a取代；

R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_b取代；

R₄选自F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂；

R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_c取代；

R_a、R_b和R_c分别独立地选自F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂。

本发明的一些方案中，上述化合物选自

其中，环A、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述化合物选自

其中，环A、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述化合物化合物具有式(Ⅱ)所示结构：

其中，环A、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述R₁选自H和CH₃，其中所述CH₃任选被1、2或3个R_a取代，其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述R₁为CH₃，其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和CH₃，其中所述CH₃任选被1、2或3个R_b取代，其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂和CH₃，其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN、NH₂、CH₃和-CH₂-CH₃，其中所述CH₃和-CH₂-CH₃任选被1、2或3个R_c取代，其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂，其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述环A为

其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述环A为

其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述环A为

其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述环A为

其他变量如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述化合物选自

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述化合物选自

其中，

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述化合物选自

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀如本发明所定义。

本发明的一些方案中，上述化合物选自

其中，

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉如本发明所定义。

本发明还有一些方案是由上述各变量任意组合而来。

本发明还提供了下述化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，

本发明的一些方案中，上述化合物、其异构体及其药学上可接受的盐，其选自

本发明还提供了上述化合物、其异构体及其药学上可接受的盐在制备治疗ERK相关疾病的药物中的应用。

本发明的一些方案中，上述ERK相关疾病药物是用于治疗结直肠癌的药物。

技术效果

本发明化合物表现出较优的对ERK2激酶的抑制活性，同时，表现出较优的对HT29细胞增殖抑制活性；另外，本发明化合物展现了优良的口服暴露量和生物利用度。本发明化合物在人结肠癌HT-29细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效研究中，具有明显的抑制肿瘤生长的作用，动物的体重未有明显下降，无发病或死亡现象，安全性优良。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。

本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。

除非另有说明，术语“对映异构体”或者“旋光异构体”是指互为镜像关系的立体异构体。

除非另有说明，术语“顺反异构体”或者“几何异构体”系由因双键或者成环碳原子单键不能自由旋转而引起。

除非另有说明，术语“非对映异构体”是指分子具有两个或多个手性中心，并且分子间为非镜像的关系的立体异构体。

除非另有说明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。

除非另有说明，用楔形实线键

和楔形虚线键

表示一个立体中心的绝对构型，用直形实线键

和直形虚线键

表示立体中心的相对构型，用波浪线

表示楔形实线键

或楔形虚线键

或用波浪线

表示直形实线键

和直形虚线键

除非另有说明，当化合物中存在双键结构，如碳碳双键、碳氮双键和氮氮双键，且双键上的各个原子均连接有两个不同的取代基时(包含氮原子的双键中，氮原子上的一对孤对电子视为其连接的一个取代基)，如果该化合物中双键上的原子与其取代基之间用波浪线

连接，则表示该化合物的(Z)型异构体、(E)型异构体或两种异构体的混合物。例如下式(A)表示该化合物以式(A-1)或式(A-2)的单一异构体形式存在或以式(A-1)和式(A-2)两种异构体的混合物形式存在；下式(B)表示该化合物以式(B-1)或式(B-2)的单一异构体形式存在或以式(B-1)和式(B-2)两种异构体的混合物形式存在。下式(C)表示该化合物以式(C-1)或式(C-2)的单一异构体形式存在或以式(C-1)和式(C-2)两种异构体的混合物形式存在。

除非另有说明，术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指在室温下，不同官能团异构体处于动态平衡，并能很快的相互转化。若互变异构体是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(proton tautomer)(也称质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键异构体(valence tautomer)包括一些成键电子的重组来进行的相互转化。其中酮-烯醇互变异构化的具体实例是戊烷-2,4-二酮与4-羟基戊-3-烯-2-酮两个互变异构体之间的互变。

除非另有说明，术语“富含一种异构体”、“异构体富集”、“富含一种对映体”或者“对映体富集”指其中一种异构体或对映体的含量小于100％，并且，该异构体或对映体的含量大于等于60％，或者大于等于70％，或者大于等于80％，或者大于等于90％，或者大于等于95％，或者大于等于96％，或者大于等于97％，或者大于等于98％，或者大于等于99％，或者大于等于99.5％，或者大于等于99.6％，或者大于等于99.7％，或者大于等于99.8％，或者大于等于99.9％。

除非另有说明，术语“异构体过量”或“对映体过量”指两种异构体或两种对映体相对百分数之间的差值。例如，其中一种异构体或对映体的含量为90％，另一种异构体或对映体的含量为10％，则异构体或对映体过量(ee值)为80％。

可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。

本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(³H)，碘-125(¹²⁵I)或C-14(¹⁴C)。又例如，可用重氢取代氢形成氘代药物，氘与碳构成的键比普通氢与碳构成的键更坚固，相比于未氘化药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。

术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。氧取代不会发生在芳香基上。术语“任选被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。

当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。

当一个连接基团的数量为0时，比如-(CRR)₀-，表示该连接基团为单键。

当其中一个变量选自单键时，表示其连接的两个基团直接相连，比如A-L-Z中L代表单键时表示该结构实际上是A-Z。

当一个取代基为空缺时，表示该取代基是不存在的，比如A-X中X为空缺时表示该结构实际上是A。当所列举的取代基中没有指明其通过哪一个原子连接到被取代的基团上时，这种取代基可以通过其任何原子相键合，例如，吡啶基作为取代基可以通过吡啶环上任意一个碳原子连接到被取代的基团上。

当所列举的连接基团没有指明其连接方向，其连接方向是任意的，例如，

中连接基团L为-M-W-，此时-M-W-既可以按与从左往右的读取顺序相同的方向连接环A和环B构成

也可以按照与从左往右的读取顺序相反的方向连接环A和环B构成

所述连接基团、取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。

除非另有规定，当某一基团具有一个或多个可连接位点时，该基团的任意一个或多个位点可以通过化学键与其他基团相连。所述位点与其他基团连接的化学键可以用直形实线键

直形虚线键

或波浪线

表示。例如-OCH₃中的直形实线键表示通过该基团中的氧原子与其他基团相连；

中的直形虚线键表示通过该基团中的氮原子的两端与其他基团相连；

中的波浪线表示通过该苯基基团中的1和2位碳原子与其他基团相连。

除非另有规定，术语“C_1-3烷基”用于表示直链或支链的由1至3个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C_1-3烷基包括C_1-2和C_2-3烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C_1-3烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(包括n-丙基和异丙基)等。

除非另有规定，术语“C_1-3烷氧基”表示通过一个氧原子连接到分子的其余部分的那些包含1至3个碳原子的烷基基团。所述C_1-3烷氧基包括C_1-2、C_2-3、C₃和C₂烷氧基等。C_1-3烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(包括正丙氧基和异丙氧基)等。

除非另有规定，术语“卤代素”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分表示氟、氯、溴或碘原子。

除非另有规定，C_n-n+m或C_n-C_n+m包括n至n+m个碳的任何一种具体情况，例如C_1-12包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、和C₁₂，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如C_1-12包括C_1-3、C_1-6、C_1-9、C_3-6、C_3-9、C_3-12、C_6-9、C_6-12、和C_9-12等；同理，n元至n+m元表示环上原子数为n至n+m个，例如3-12元环包括3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环、11元环、和12元环，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如3-12元环包括3-6元环、3-9元环、5-6元环、5-7元环、6-7元环、6-8元环、和6-10元环等。

术语“离去基团”是指可以被另一种官能团或原子通过取代反应(例如亲核取代反应)所取代的官能团或原子。例如，代表性的离去基团包括三氟甲磺酸酯；氯、溴、碘；磺酸酯基，如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯等；酰氧基，如乙酰氧基、三氟乙酰氧基等等。

术语“保护基”包括但不限于“氨基保护基”、“羟基保护基”或“巯基保护基”。术语“氨基保护基”是指适合用于阻止氨基氮位上副反应的保护基团。代表性的氨基保护基包括但不限于：甲酰基；酰基，例如链烷酰基(如乙酰基、三氯乙酰基或三氟乙酰基)；烷氧基羰基，如叔丁氧基羰基(Boc)；芳基甲氧羰基，如苄氧羰基(Cbz)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)；芳基甲基，如苄基(Bn)、三苯甲基(Tr)、1,1-二-(4'-甲氧基苯基)甲基；甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等等。术语“羟基保护基”是指适合用于阻止羟基副反应的保护基。代表性羟基保护基包括但不限于：烷基，如甲基、乙基和叔丁基；酰基，例如链烷酰基(如乙酰基)；芳基甲基，如苄基(Bn)，对甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)和二苯基甲基(二苯甲基，DPM)；甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等等。

本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明采用下述缩略词：aq代表水；psi代表磅力/平方英寸。

附图说明

图1：人结肠癌HT-29异种移植瘤模型动物在分别给予溶剂和受试化合物后的肿瘤生长曲线；

图2：人结肠癌HT-29异种移植瘤模型动物在给药过程中的体重变化率(％)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。

参考例1：片段A-1

步骤1：化合物A-1-2的合成。

在预先干燥过的单口瓶中加入乙酸钠(4.64g,56.60mmol,5eq)、单过硫酸氢钾(13.92g,22.64mmol,2eq)和水(47mL)的溶液，降温至0℃，滴加A-1-1(4.7g,11.32mmol,1eq)、溶剂四氢呋喃(47mL)和甲醇(47mL)的溶液，并在0℃搅拌1小时。29℃油浴搅拌15小时。反应结束后将该反应液倒入水(200mL)中，水相用乙酸乙酯萃取三次(50mL×3)。合并有机相，有机相依次用饱和食盐水洗涤(200mL)，无水硫酸钠干燥，过滤收集滤液，减压浓缩得到残余物。残余物通过快速柱层析分离，纯化得到A-1-2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 8.67(d,J＝4.9Hz,1H),7.64(d,J＝4.9Hz,1H),3.37(s,3H),1.63-1.53(m,6H),1.39-1.30(m,6H),1.26-1.12(m,6H),0.90(t,J＝7.3Hz,9H)。

步骤2：化合物A-1的合成。

向反应瓶中加入A-1-2(3.9g,8.72mmol,1eq)、A-1-3(1.02g,10.46mmol,1.2eq)和四氢呋喃(117mL)，抽换氮气后-35℃滴加入六甲基二硅基胺基锂(1M,18.31mL,2.1eq)，-35℃下混合液反应10分钟，反应结束后将反应液用饱和氯化铵水溶液(100mL)淬灭，乙酸乙酯(100mL×2)和二氯甲烷(100mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干得粗品。粗品用柱层析纯化得到A-1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 8.17(d,J＝4.85Hz,1H),7.46(d,J＝1.76Hz,1H),6.91(d,J＝4.63Hz,1H),6.60(s,1H),6.32(d,J＝1.98Hz,1H),3.79(s,3H),1.52-1.61(m,6H),1.28-1.40(m,6H),1.03-1.20(m,6H),0.89(t,J＝7.28Hz,9H)。

参照参考例1中步骤1～2的合成方法，合成表1中的片段A-2。

表1

参考例3：片段A-3

合成路线：

步骤1：化合物A-3的合成

在预先干燥的反应瓶中加入A-1-2(0.4g,894.41μmol,1eq)，A-3-1(261.50mg,3.58mmol,4eq)，叔丁醇(6mL)和二异丙基乙胺(722.48mg,5.59mmol,973.69μL,6.25eq)，置于70℃油浴中反应12小时。升温到80℃，补加A-3-1(392.25mg,5.37mmol,6eq)，继续反应12小时。反应完毕后反应液加水(2mL)稀释，然后加DCM(10mL×3)萃取，收集有机相，用饱和食盐水(10mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液真空泵浓缩得到产物粗品。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到A-3。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 8.01-8.10(d,1H),6.69-6.78(d,1H),5.42(br d,J＝6.13Hz,1H),5.12(m,J＝6.68Hz,1H),4.95-5.03(m,2H),4.60(m,J＝6.38Hz,2H),1.51-1.61(m,6H),1.29-1.37(m,6H),1.02-1.18(m,6H),0.90(t,J＝7.32Hz,9H)。

参考例4：片段A-4

步骤1：化合物A-4-2的合成。

向反应瓶中加入A-4-1(1g,5.73mmol,1eq)、四氢呋喃(10mL)和甲醇(10mL)，降温至0℃，加入乙酸钠(939.40mg,11.45mmol,2eq)，单过硫酸氢钾(7.04g,11.45mmol,2eq)和水(10mL)，0℃搅拌1小时，30℃下混合液反应15小时。原料消耗完毕后反应液用水(2mL)稀释，二氯甲烷(5mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(2mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品。粗品用柱层析纯化得到A-4-2。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 9.01(s,J＝0.61Hz,1H),3.41(s,3H),2.42(d,J＝0.61Hz,3H)。

步骤2：化合物A-4的合成。

向三口瓶中加入A-4-2(1g,4.84mmol,1eq)、A-1-3(563.96mg,5.81mmol,1.2eq)和四氢呋喃(30mL)，抽换氮气后降温至-30℃，随后滴加双三甲基硅基胺基锂(1M,10.16mL,2.1eq)，-30℃下反应1小时。反应完毕后反应液用水(50mL)稀释，乙酸乙酯(50mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品。粗品用柱层析纯化得到A-4。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 9.62(s,1H),8.36(s,1H),7.33(d,J＝1.83Hz,1H),6.19(d,J＝1.83Hz,1H),3.64(s,3H),2.16(s,3H)。

参照参考例4中步骤1～2的合成方法，合成表2中片段A-5。

表2

参考例6：片段B-1

合成路线：

步骤1：化合物B-1-3的合成

氮气保护20℃向单口瓶中加入B-1-1(59.46g,825.08mmol,6.15mL,2eq)、B-1-2(50g,412.54mmol,1.00eq)和四氢呋喃(1000mL)，最后加入钛酸四异丙基酯(351.74g,1.24mol,365.26mL,3.00eq)，80℃油浴混合液反应16小时。反应完毕后，反应液先旋走溶剂，残余液用二氯甲烷(1000mL)稀释，加饱和氯化铵水溶液(200mL)淬灭，会有红色固体产生，布氏漏斗垫上硅藻土过滤，收集滤液，分液要下层有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品。粗品用柱层析纯化得到B-1-3。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 5.69-5.33(m,4H),1.26-1.09(m,9H)。

步骤2：化合物B-1-5的合成

在预先干燥过的反应瓶中加入B-1-4(15g,117.05mmol,1eq)和四氢呋喃(300mL)，降温至-70℃，滴加正丁基锂(2.5M,112.37mL,2.4eq)，30分钟后滴加B-1-3(18.46g,105.35mmol,0.9eq)和四氢呋喃(100mL)的溶液，-70℃并搅拌1小时，反应完毕后，反应液用饱和氯化铵水溶液(100mL)淬灭，水相用稀盐酸水溶液调pH至3，乙酸乙酯(50mL x3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品B-1-5。

步骤3：化合物B-1-6的合成

向反应瓶中加入B-1-5(35g,115.36mmol,1eq)、二氯甲烷(1000mL)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(43.86g,115.36mmol,1eq)，抽换氮气后加入二异丙基乙胺(44.73g,346.08mmol,60.28mL,3eq)，20℃下混合液反应14小时。反应完毕后反应液用水(500mL)淬灭，加入2N氢氧化钠水溶液调pH至9，二氯甲烷(100mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(500mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品。粗品用柱层析纯化得到B-1-6。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm7.84(d,J＝5.1Hz,1H),7.25(d,J＝4.9Hz,1H),5.37(d,J＝7.1Hz,1H),5.24(d,J＝6.8Hz,1H),4.88(d,J＝7.1Hz,1H),4.77(d,J＝7.1Hz,1H),1.40(s,9H)。

步骤4：化合物B-1-7的合成

向反应瓶中加入B-1-6(2g,4.56mmol,1eq)和四氢呋喃(20mL)，然后加入四丁基氟化铵(1M,4.56mL,1eq)，20℃下混合液反应16小时。反应完毕后，45℃水泵将有机相旋干得到粗品。粗品溶于6mL乙腈，过滤得到B-1-7。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 9.13(s,1H),7.73(dd,J＝0.7,4.9Hz,1H),7.14(d,J＝4.9Hz,1H),4.96(d,J＝6.8Hz,2H),4.78(d,J＝7.1Hz,2H)。

步骤5：化合物B-1-8的合成

向反应瓶中加入B-1-7(700mg,3.86mmol,1eq)和N’N-二甲基甲酰胺(10.5mL)，抽换氮气后分批加入N-溴代丁二酰亚胺(687.53mg,3.86mmol,1eq)，60℃反应6小时。反应完毕后将反应液过滤得到B-1-8。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 9.30(s,1H),7.38(s,1H),4.91(d,J＝7.0Hz,2H),4.80(d,J＝7.0Hz,2H)。

步骤6：B-1的合成

向反应瓶中加入B-1-8(50mg,192.23μmol,1eq)和四氢呋喃(1.5mL)，抽换氮气后0℃分批加入钠氢，自然升温至15℃反应4小时，然后加入C-1和四氢呋喃(0.5mL)的溶液，缓慢升温至65℃反应16h。加甲醇(2mL)淬灭，旋干得粗品。粗品用制备薄层色谱板纯化得到B-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 7.59(s,1H),7.48-7.42(m,2H),7.40-7.33(m,2H),5.83(tdd,J＝5.2,10.5,17.3Hz,1H),5.42(dd,J＝5.4,9.2Hz,1H),5.23-5.04(m,3H),4.85(d,J＝7.1Hz,1H),4.82-4.75(m,2H),4.45(t,J＝9.5Hz,1H),4.06-3.91(m,3H)。

参考例7：片段C-1

合成路线：

步骤1：化合物C-1-3的合成

向三口瓶中加入四丁基溴化铵(4.67g,14.48mmol,0.1eq)、碳酸钾(30.03g,217.25mmol,1.5eq)、C-1-2(35.04g,289.67mmol,2eq)、乙腈(450mL)和N’N-二甲基甲酰胺(50mL)，抽换氮气后加入C-1-1(25g,144.84mmol,1eq)和二丁基二氯化锡(4.40g,14.48mmol,0.1eq)，80℃下混合液反应4小时。反应结束后，反应液用水(500mL)稀释，二氯甲烷(100mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品，粗品用柱层析纯化得到C-1-3。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm7.40(s,1H),7.29-7.37(m,3H),5.78-5.91(m,1H),5.52(d,J＝4.65Hz,1H),5.21(br dd,J＝17.24,1.71Hz,1H),5.12(br d,J＝10.39Hz,1H),4.72(q,J＝5.14Hz,1H),3.96(br d,J＝5.01Hz,2H),3.40-3.48(m,2H)。

步骤2：化合物C-1的合成

向三口瓶中加入C-1-3(4g,18.81mmol,1eq)、三乙胺(5.71g,56.42mmol,7.85mL,3eq)和二氯甲烷(40mL)，抽换氮气后在0℃下缓慢滴加甲磺酰氯(3.23g,28.21mmol,2.18mL,1.5eq)，15℃下混合液反应0.5小时。反应完毕后，反应液直接旋干。粗品用石油醚和乙酸乙酯混合溶液柱层析纯化得到C-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 7.53(s,1H),7.40-7.47(m,3H),5.76-5.92(m,2H),5.25(dd,J＝17.20,1.76Hz,1H),5.15(dd,J＝10.58,1.54Hz,1H),3.93-4.08(m,2H),3.78(dd,J＝11.36,7.61Hz,1H),3.67(dd,J＝11.36,3.64Hz,1H),3.15(s,3H)。

实施例1：WX001

合成路线

步骤1：WX001-1的合成

向投库瓶中加入B-1(180mg,395.81μmol,1eq)、乙酸钠(129.87mg,1.58mmol,4eq)、乙酸(1.35mL)和水(0.15mL)，抽换氮气后降温至5℃，加入氯化钯(154.42mg,870.78μmol,2.2eq)，27℃油浴下混合液反应5小时。反应完毕后反应液垫硅藻土过滤，滤液旋干得黑色油状物。使用制备薄层色谱纯化得到WX001-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 7.64-7.52(s,1H),7.47-7.28(m,4H),5.27-5.23(m,1H),5.23-5.12(m,2H),4.88-4.79(m,2H),4.77-4.71(m,1H),4.54-4.38(m,1H),4.02-3.82(m,1H)。

步骤2：WX001的合成

向反应瓶中加入WX001-1(80mg,192.91μmol,1eq)、A-1(107.47mg,231.49μmol,1.2eq)、四三苯基膦钯(44.58mg,38.58μmol,0.2eq)和甲苯(1mL)，抽换氮气后，125℃下混合液反应2小时，反应完毕后过滤除去催化剂，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品，粗品用制备薄层色谱纯化得到WX001。

参照实施例1中步骤1～2的合成方法，用片段A-2替代A-1合成下表3中的实施例2。

表3

实施例3：WX003

合成路线

WX003的合成

在预先干燥的反应瓶中加入WX001-1(68.51mg,165.21μmol,1eq)，A-3(80mg,181.73μmol,1.1eq)和甲苯(2mL)，然后氮气保护下升温到125℃，加入四三苯基膦钯(38.18mg,33.04μmol,0.2eq)，在该温度下反应16小时。反应完毕后，将反应体系真空浓缩，得到产物粗品。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX003。

实施例4：WX004

合成路线

步骤1：WX004-1的合成

向反应瓶中加入WX001-1(60mg,144.68μmol,1eq)、双联频哪醇硼酸酯(73.48mg,289.37μmol,2eq)、乙酸钾(42.60mg,434.05μmol,3eq)和二氧六环(1.5mL)，抽换氮气后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(10.59mg,14.47μmol,0.1eq)，70℃下混合液反应1.5小时。反应完毕得到粗品WX004-1直接用于下一步。

步骤2：WX004的合成

向反应瓶中加入WX004-1(20mg,52.68μmol,1eq)、A-4(11.78mg,52.68μmol,1eq)、乙酸钾(15.51mg,158.05μmol,3eq)、水(0.75mL)和二氧六环(1.5mL)，抽换氮气后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(3.85mg,5.27μmol,0.1eq)，70℃下混合液反应12小时。反应完毕后反应液用水(5mL)稀释，二氯甲烷(10mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(2mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩干得粗品，粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX004。

实施例5：WX005

合成路线

步骤1：WX005-1的合成

在预先干燥的反应瓶中加入B-1-8(700mg,2.69mmol,1eq)，N’N-二甲基甲酰胺(14mL)，置换氮气后，0℃加入钠氢(161.46mg,4.04mmol,60％纯度,1.5eq)，反应0.5小时，然后加入D-1(663.58mg,3.23mmol,422.66μL,1.2eq)，缓慢升温至25℃反应2小时。反应完毕，将反应液缓慢倒入饱和氯化铵溶液(5mL)淬灭，乙酸乙酯(1mL×3)萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(5mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品通过柱分离纯化得到WX005-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝ppm 7.50(s,1H),7.32-7.39(m,3H),7.25(m,1H),4.94(s,2H),4.87(d,J＝7.50Hz,2H),4.74(d,J＝7.50Hz,2H)。

步骤2：WX005的合成

向反应瓶中加入WX005-1(100mg,259.96μmol,1eq)，A-1(144.82mg,311.95μmol,1.2eq)，甲苯(3mL)，抽换氮气，加热到125℃，然后慢慢加入四三苯基膦钯(60.08mg,51.99μmol,0.2eq)。125℃反应45小时。反应完毕，将反应液浓缩得到粗品。粗品先通过薄层层析硅胶板纯化得到WX005。

实施例6：WX006

合成路线：

步骤1：WX006-1的合成

向干燥的反应瓶中加入WX005-1(150mg,389.94μmol,1eq)，四氢呋喃(2mL)，抽换氮气，降温至0℃后加入异丙基格氏试剂氯化锂复合物(1.3M,449.93μL,1.5eq)，0℃反应0.5小时。然后降温到-30℃，加入硼酸三异丙基酯(293.35mg,1.56mmol,358.61μL,4eq)，然后将温度升到0℃反应1小时，反应完毕，向反应液中加0.5mL甲醇，减压浓缩得到粗品WX006-1，直接用于下一步。

步骤2：WX006-2的合成

向干燥的反应瓶中加入WX006-1(136mg,389.02μmol,1eq)和E-1(92.77mg,311.22μmol,0.8eq)，二氧六环与水的混合物(5:1，2mL)，乙酸钾(114.54mg,1.17mmol,3eq)，抽换氮气，然后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(28.46mg,38.90μmol,0.1eq)，加热到70℃反应3小时。反应完毕，反应液直接浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX006-2。¹H NMR(400MHz,CHCl₃-d)δppm 8.65(s,1H),7.77(s,1H),7.16(d,J＝1.13Hz,3H),7.14(s,1H),4.88(s,2H),4.85(d,J＝7.50Hz,2H),4.76(d,J＝7.50Hz,2H),3.29(s,3H),2.57(s,3H)。

步骤3：WX006的合成

向干燥的反应瓶中加入WX006-2(32mg,67.23μmol,1eq)，A-1-3(7.84mg,80.68μmol,1.2eq)，四氢呋喃(1mL)，抽换氮气，-30℃加入六甲基二硅基胺基锂(1M,141.19μL,2.1eq)，-30℃反应2小时。反应完毕，向反应液中加0.5mL甲醇，减压浓缩得到固体粗品。粗产品通过薄层层析硅胶板分离纯化得到WX006。

实施例7：WX007

合成路线

步骤1：WX007-1的合成

向干燥的反应瓶中加入WX001-1(600mg,1.45mmol,1eq)，二甲基甲酰胺(6mL)和咪唑(295.49mg,4.34mmol,3eq)，抽换氮气，25℃一次性加入叔丁基二甲基氯硅烷(436.13mg,2.89mmol,354.58μL,2eq)，25℃反应0.5小时。反应完毕后，反应液用水(4mL)稀释，用乙酸乙酯(5mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(5mL)洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用水泵减压浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX007-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝7.62(s,1H),7.46(s,2H),7.41-7.33(m,2H),5.32(br dd,J＝5.7,9.1Hz,1H),5.25(br d,J＝6.9Hz,1H),4.83(br dd,J＝7.3,10.7Hz,2H),4.79-4.73(m,1H),4.61(br t,J＝9.6Hz,1H),4.14(br dd,J＝5.6,9.5Hz,1H),0.75(s,9H),0.00(s,3H),-0.08(s,3H).

步骤2：WX007-3的合成

向干燥的反应瓶中加入WX007-1(100mg,189.05μmol,1eq)，WX007-2(140.70mg,756.20μmol,154.27μL,4eq)，四甲基乙二胺(28.56mg,245.76μmol,37.09μL,1.3eq)，四氢呋喃(2mL)，抽换氮气，-78℃然后加入正丁基锂(2.5M,189.05μL,2.5eq)，-78℃反应0.5小时。反应完毕后，将反应液加0.5mL甲醇淬灭，减压浓缩得到WX007-3，直接用于下一步反应。

步骤3：WX007-4的合成

向干燥的反应瓶中加入WX007-3(93mg,188.30μmol,1eq)，A-5(45.96mg,188.30μmol,1eq)，乙酸钾(55.44mg,564.91μmol,3eq)，二氧六环(3mL)和水(0.6mL)，抽换氮气，然后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(13.78mg,18.83μmol,0.1eq)，加热到70℃反应3小时。反应完毕后，反应液浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX007-4。

步骤4：WX007的合成

向干燥的反应瓶中加入WX007-4(50mg,76.02μmol,1eq)，二氯甲烷(1mL)，三氟乙酸(54.82mg,760.24μmol,61.60μL,10eq)，25℃反应0.5小时。反应完毕后，反应液用水(2mL)稀释，用二氯甲烷(2mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(2mL)洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到粗品，通过薄层层析硅胶板纯化得到WX007。

实施例8：WX008

合成路线

步骤1：WX007-3的合成

向干燥的反应瓶中加入WX007-1(200mg,378.10μmol,1eq)，WX007-2(281.39mg,1.51mmol,308.54μL,4eq)，四甲基乙二胺(57.12mg,491.53μmol,74.18μL,1.3eq)，四氢呋喃(2mL)，抽换氮气，-78℃然后加入正丁基锂(2.5M,453.72μL,3eq)，-78℃反应0.5小时。反应完毕后，向反应液中加入甲醇淬灭，减压浓缩，得到粗品WX007-3，直接用于下一步。

步骤2：WX008-2的合成

向干燥的反应瓶中加入WX007-3(186mg,376.61μmol,1eq)，WX008-1(62.88mg,376.61μmol,1eq)，乙酸钾(110.88mg,1.13mmol,3eq)，二氧六环(1mL)，水(0.2mL)，抽换氮气，然后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(27.56mg,37.66μmol,0.1eq)，加热到70℃反应3小时。反应完毕后，将反应液直接浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化，得到WX008-2。

步骤3：WX008-3的合成

向干燥的反应瓶中加入WX008-2(80mg,137.79μmol,1eq)，A-1-3(16.06mg,165.35μmol,1.2eq)，碳酸铯(89.79mg,275.59μmol,2eq)，2-甲基四氢呋喃：水为1:1的溶剂(2mL)，2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯(10.85mg,27.56μmol,0.2eq)，抽换氮气，然后加入三二亚苄基丙酮二钯(12.62mg,13.78μmol,0.1eq)，抽换氮气，加热到72℃反应14小时。反应完毕后，反应液直接减压浓缩得到粗品，通过薄层层析硅胶板纯化，得到WX008-3。

步骤4：WX008的合成

向干燥的反应瓶中加入WX008-3(50mg,77.98μmol,1eq)，二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(88.91mg,779.75μmol,57.73μL,10eq)，25℃反应0.5小时。反应完毕后，向反应液中加入1mL饱和碳酸氢钠水溶液，分离有机相和水相，有机相干燥，过滤，滤液减压浓缩得到粗品。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX008。

实施例9：WX009

合成路线

步骤1：WX009-1的合成

向干燥的反应瓶中加入B-1-8(150mg,576.68μmol,1eq)和N’N-二甲基甲酰胺(3mL)，抽换氮气，0℃加入钠氢(34.60mg,865.03μmol,60％纯度,1.5eq)，在0℃下反应0.5小时，然后再加入D-2(143.26mg,692.02umol,88.43μL,1.2eq)，反应液慢慢升到25℃继续反应2小时。反应完毕，将反应液缓慢倒进装有40mL水的锥形瓶中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃下减压浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX009-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 7.50(s,1H),7.38(br s,2H),7.19-7.13(m,1H),4.91(s,2H),4.87(d,J＝7.3Hz,2H),4.73(d,J＝7.3Hz,2H)。

步骤2：WX009的合成

向反应瓶中加入WX009-1(40mg,103.57μmol,1eq)，A-1(57.70mg,124.28μmol,1.2eq)，甲苯(2mL)，抽换氮气，加热到125℃，然后慢慢加入四三苯基膦钯(23.94mg,20.71μmol,0.2eq)。125℃反应48小时。反应完毕，反应液在45℃下减压浓缩，粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX009。

实施例10：WX010

合成路线

步骤1：WX010-1的合成

向投库瓶中加入B-1-8(100mg,384.46μmol,1eq)和N’N-二甲基甲酰胺(2mL)，抽换，降温至0℃后向反应瓶中分多次加入钠氢(23.07mg,576.68μmol,60％纯度,1.5eq)，在0℃搅拌0.5小时后加入D-3(87.21mg,461.35umol,56.63uL,1.2eq)。逐渐升温至25℃反应0.5小时。反应完毕后，反应液用水(20mL)淬灭，乙酸乙酯(10mL×3)萃取，饱和食盐水(20mL)洗涤有机相，并用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，滤液在45℃旋干。粗品使用通过薄层层析硅胶板纯化得到WX010-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 7.51(s,1H),7.35-7.42(m,1H),7.07-7.16(m,3H),4.95(s,2H),4.87(d,J＝7.50Hz,2H),4.73(d,J＝7.50Hz,2H)。

步骤2：WX010的合成

向投库瓶中加入WX010-1(89mg,241.70μmol,1eq)、A-1(134.65mg,290.04μmol,1.2eq)和甲苯(2mL)，抽换氮气后，加入四三苯基膦钯(55.86mg,48.34μmol,0.2eq)，在125℃反应24小时。反应完毕后，反应液直接旋干。粗品使用通过薄层层析硅胶板纯化得到WX010。

实施例11：WX011

合成路线

步骤1：WX006-1的合成

向干燥的反应瓶中加入WX005-1(50mg,129.98μmol,1eq)，四氢呋喃(4mL)，硼酸三异丙基硼酯(195.56mg,1.04mmol,239.08μL,8eq)，抽换氮气，然后降温到-78℃，加入异丙基氯化镁-氯化锂络合物(1.3M,499.92μL,5eq)，反应0.5小时，然后将温度升到25℃反应1小时。反应完毕后，反应液用0.5mL甲醇淬灭，并用水泵在45℃下减压浓缩得到WX006-1，直接用于下一步。

步骤2：WX011-1的合成

向干燥的反应瓶中加入WX006-1(45mg,128.72μmol,1eq)和WX008-1(21.49mg,128.72μmol,1eq)，二氧六环:水＝5:1(6mL)，乙酸钾(75.80mg,772.32μmol,6eq)，抽换氮气，然后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(18.84mg,25.74μmol,0.2eq)，加热到70℃反应15小时。反应完毕后，将反应液减压浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX011-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 9.03(d,J＝2.8Hz,1H),8.01(d,J＝1.5Hz,1H),7.43-7.30(m,4H),5.01(s,2H),4.96-4.93(m,2H),4.85(d,J＝7.4Hz,2H).

步骤3：WX011的合成

向干燥的反应瓶中加入WX011-1(28.91mg,66.26μmol,1eq)，A-1-3(7.72mg,79.51μmol,1.2eq)，碳酸铯(43.18mg,132.52μmol,2eq)，2-甲基四氢呋喃:水＝9:1(2mL)，2-二环己膦基-2’-(N,N-二甲胺)-联苯(5.22mg,13.25μmol,0.2eq)，抽换氮气，然后加入三二亚苄基丙酮二钯(6.07mg,6.63μmol,0.1eq)，抽换氮气，加热到72℃反应14小时。反应完毕后，反应液减压浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化，再使用高效液相制备色谱法纯化得到WX011。

实施例12：WX012

合成路线

步骤1：WX012-2的合成

向干燥的反应瓶中加入WX006-1(181mg,517.74μmol,1eq)和WX012-1(142.45mg,776.61μmol,1.5eq)，二氧六环:水＝5:1(8mL)，三乙胺(209.56mg,2.07mmol,288.25μL,4eq)，抽换氮气，然后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(75.77mg,103.55μmol,0.2eq)，加热到70℃反应20小时。反应完毕后，反应液用水泵在45℃下减压浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX012-2。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 9.08(s,1H),8.41(s,1H),7.47-7.33(m,4H),5.06(s,2H),5.00(br d,J＝7.3Hz,2H),4.89(d,J＝7.3Hz,2H)。

步骤2：WX012的合成

向干燥的反应瓶中加入WX012-2(40mg,88.35μmol,1eq)，A-1-3(12.87mg,132.53μmol,1.5eq)，碳酸铯(86.36mg,265.05μmol,3eq)，叔丁醇(2mL)，抽换氮气，然后加入[(2-二-环己基膦基-3,6-二甲氧基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯基)-2-(2′-氨基-1,1′-联苯基)]甲磺酸钯(II)(8.01mg,8.84μmol,0.1eq)抽换氮气，加热到105℃，反应16小时。反应完毕后，将反应液减压浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX012。

实施例13：WX013

合成路线

步骤1：WX013-1的合成

向干燥的反应瓶中加入WX009-1(177mg,458.30μmol,1eq)，四氢呋喃(2mL)，抽换氮气，0℃然后加入异丙基氯化镁-氯化锂络合物(1.3M,528.81μL,1.5eq)，0℃反应0.5小时。然后降温到-30℃，加入硼酸三异丙基硼酯(344.77mg,1.83mmol,421.48μL,4eq)，然后将温度升到25℃反应14小时。反应完毕后，向反应液中加1mL甲醇，减压浓缩得到WX013-1。

步骤2：WX013-2的合成

向干燥的反应瓶中加入WX013-1(160mg,455.67μmol,1eq)和E-1(135.84mg,455.67μmol,1eq)，二氧六环:水＝5:1(2mL)，乙酸钾(134.16mg,1.37mmol,3eq)，抽换氮气，然后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(33.34mg,45.57μmol,0.1eq)，加热到70℃反应3小时。反应完毕后，将反应液直接浓缩，粗品通过薄层层析硅胶板纯化，得到WX013-2。

步骤3：WX013的合成

向干燥的反应瓶中加入WX013-2(70mg,146.60μmol,1eq)，A-1-3(18.51mg,190.57μmol,1.3eq)，四氢呋喃(1mL)抽换氮气，-30℃加入六甲基二硅基胺基锂(1M,307.85μL,2.1eq)，-30℃反应2小时。反应完毕后，加甲醇淬灭，将反应液减压浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX013。

实施例14：WX014

合成路线

步骤1：WX014的合成

向反应瓶中加入WX013-2(60mg,125.65μmol,1eq)、WX014-1(32.84mg,376.95μmol,3eq,HCl)、三乙胺(63.57mg,628.25μmol,87.45μL,5eq)和二甲基亚砜(0.5mL)，100℃下混合液反应20小时。反应完毕后，反应液用水(5mL)稀释，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃旋干。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX014。

参照实施例14中步骤1的合成方法，合成表4中的各实施例。

表4

实施例19：WX019

合成路线

步骤1：WX018-2的合成

向反应瓶中加入WX005-1(200mg,519.92μmol,1eq)，A-1-2(255.77mg,571.91μmol,1.1eq)，甲苯(5mL)，抽换氮气，加热到125℃，然后慢慢加入四三苯基膦钯(120.16mg,103.98μmol,0.2eq)。125℃反应48小时。反应完毕后，将反应液减压浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX019-1。

步骤2：WX019的合成

在预先干燥的反应瓶中加入WX019-1(70mg,151.53μmol,1eq)，WX018-1(30.65mg,303.07μmol,2eq)，之后用二甲基亚砜(2mL)溶解，100℃搅拌反应16小时。反应完毕后，向反应液中加入10mL水，有固体析出，过滤，收集固体，滤液用乙酸乙酯萃取，合并浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX019。

实施例20：WX020

合成路线

WX020的合成

在预先干燥的反应瓶中加入WX019-1(40mg,86.59μmol,1eq)，A-3-1(12.66mg,173.18μmol,2eq)，之后用二甲基亚砜(1mL)溶解，100℃搅拌反应2小时。反应完毕后，向反应液中加入10mL水，有固体析出，过滤，收集固体，滤液用乙酸乙酯萃取，合并浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX020。

实施例21：WX021

合成路线

WX021的合成

向干燥的反应瓶中加入WX006-2(80mg,168.08μmol,1eq),WX018-1(34.00mg,336.16μmol,2eq)，二甲基亚砜(1mL)抽换氮气，100℃反应16小时。反应完毕后，将反应液通过薄层层析硅胶板纯化得到WX021。

参照实施例21中的合成方法，合成表5中的实施例22。

表5

实施例23：WX023

合成路线

步骤1：WX023-2的合成

向反应瓶中加入WX023-1(6g,37.46mmol,1eq)和氯仿(120mL)，抽换氮气后加入三溴化铁(1.11g,3.75mmol,0.1eq)和三氯化铝(24.98g,187.31mmol,10.24mL,5eq)，随后加入液溴(8.98g,56.19mmol,2.90mL,1.5eq)的氯仿(12mL)溶液，30℃下混合液反应20小时。反应完毕后，反应液倒入冰水(100mL)稀释，加入100mL饱和亚硫酸钠水溶液淬灭，二氯甲烷(100mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩。粗品通过柱分离纯化得到WX023-2。

步骤2：WX023-3的合成

向反应瓶中加入WX023-2(5.2g,21.75mmol,1eq)、氢氧化锂(1.83g,43.50mmol,2eq)、水(17mL)和甲醇(50mL)，抽换氮气后，20℃下混合液反应16小时。反应完毕后，反应液用水(30mL)稀释，加入2摩尔每升盐酸调节pH至3-4，乙酸乙酯(50mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩得到WX023-3。¹HNMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)13.70(br s,1H),8.11(d,J＝4.3Hz,1H)。

步骤3：WX023-4的合成

向反应瓶中加入WX023-3(1g,4.44mmol,1eq)和二甲亚砜(20mL)，抽换氮气后加入乙酸(26.69mg,444.37μmol,25.41μL,0.1eq)和碳酸银(61.27mg,222.19μmol,10.08μL,0.05eq)，120℃下混合液反应2小时。反应完毕后，反应液用水(200mL)稀释，甲叔醚(50mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得WX023-4。

步骤4：WX023-5的合成

向反应瓶中加入WX023-4(0.7g,3.87mmol,1eq)、三乙胺(978.22mg,9.67mmol,1.35mL,2.5eq)、N’N-二甲基甲酰胺(30mL)和甲醇(15mL)，抽换氮气后加入二苯基膦二茂铁二氯化钯(315.78mg,386.68μmol,0.1eq)，抽换三次一氧化碳，在80℃、50psi的一氧化碳(3.87mmol,1eq)环境下混合液反应20小时。反应完毕后，反应液用水(300mL)稀释，乙酸乙酯(100mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(100mL x 2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩。粗品通过柱分离纯化得到WX023-5。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)8.33(t,J＝3.7Hz,1H),7.35(dd,J＝3.7,1.8Hz,1H),3.79(s,3H)。

步骤5：WX023-6的合成

向反应瓶中加入WX023-5(350mg,2.19mmol,1eq)、氢氧化锂(183.40mg,4.37mmol,2eq)、水(3.5mL)和甲醇(7mL)，20℃下混合液反应16小时。反应完毕后，将有机溶剂旋干，乙酸乙酯(5mL)萃取，分液，水相用2摩尔每升的盐酸调节pH至3-4，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩得到WX023-6。

步骤6：WX023-7的合成

向反应瓶中加入WX023-6(310mg,2.12mmol,1eq)和四氢呋喃(10mL)，抽换氮气后降温至-78℃，缓慢滴入正丁基锂(2.5M,2.04mL,2.4eq)，-78℃搅拌0.5小时，缓慢滴入B-1-3(557.62mg,3.18mmol,1.5eq)的四氢呋喃(2mL)溶液，-78℃下混合液反应1小时。反应完毕后，反应液用饱和氯化铵水溶液(10mL)和碳酸氢钠(5mL)稀释，分液，水相用2摩尔每升盐酸调节pH至3-4，乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩得到WX023-7。

步骤7：WX023-8的合成

向反应瓶中加入WX023-7(680mg,2.12mmol,1eq)和二氯甲烷(20mL)，抽换氮气后加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(804.50mg,2.12mmol,1eq)和二异丙基乙胺(820.35mg,6.35mmol,1.11mL,3eq)，27℃下混合液反应20小时。反应完毕后，反应液用水(50mL)稀释，二氯甲烷(30mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩。粗品通过柱分离纯化得到WX023-8。

步骤8：WX023-9的合成

向反应瓶中加入WX023-8(220mg,290.07μmol,40％纯度,1eq)、四丁基氟化铵(1M,290.07μL,1eq)和四氢呋喃(2.5mL)，抽换氮气后，20℃下混合液反应1小时。反应完毕后，反应液直接旋干，析出大量固体。粗品加入0.5mL乙腈，搅拌后过滤，得到WX023-9。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)9.27(s,1H),7.39(s,1H),4.92(d,J＝7.1Hz,2H),4.77(d,J＝7.1Hz,2H)。

步骤9：WX023-10的合成

向反应瓶中加入WX023-9(110mg,552.20μmol,1eq)和N’N-二甲基甲酰胺(10mL)，抽换氮气后加入N-溴代丁二酰亚胺(108.11mg,607.42μmol,1.1eq)，60℃下混合液反应2小时。反应完毕后，反应液用饱和亚硫酸钠水溶液(100mL)稀释，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，有机相用饱和食盐水(50mLx2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX023-10。

步骤10：WX023-11的合成

向反应瓶中加入WX023-10(80mg,287.67μmol,1eq)和N’N-二甲基甲酰胺(6mL)，抽换氮气后降温至0℃，分批加入钠氢(14.96mg,373.97μmol,60％纯度,1.3eq)，搅拌0.5小时，随后加入D-1(70.93mg,345.20μmol,45.18μL,1.2eq)的N’N-二甲基甲酰胺(1mL)溶液，0℃下混合液反应1小时。反应完毕后，反应液用饱和氯化铵水溶液(50mL)稀释，乙酸乙酯(20mL x3)萃取，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃用水泵减压浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板纯化。得到WX023-11。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)7.42(s,1H),7.32-7.40(m,2H),7.26-7.30(m,1H),4.94(s,2H),4.85(d,J＝7.2Hz,2H),4.73(d,J＝7.5Hz,2H)。

步骤11：WX023的合成

向反应瓶中加入WX023-11(75mg,186.26μmol,1eq)、A-1(86.47mg,186.26μmol,1eq)和甲苯(2mL)，抽换氮气后加入四三苯基膦钯(43.05mg,37.25μmol,0.2eq)，125℃下混合液反应24小时。反应完毕后，反应液直接旋干。粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX023。

实施例24：WX024

合成路线：

步骤1：WX024-2的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-1(500mg,2.82mmol,46.17μL,1eq)、甲醇(6mL)、N’N-二甲基甲酰胺(12.5mL)、二苯基膦二茂铁(187.86mg,338.86μmol,0.12eq)、乙酸钯(63.40mg,282.39μmol,0.1eq)和三乙胺(714.36mg,7.06mmol,982.62μL,2.5eq)。通入一氧化碳(79.07mg,2.82mmol,63.25μL,1eq)气体50psi，80℃反应16小时。反应完毕后，反应液用乙酸乙酯(20mL)稀释，过滤，滤液分别用10％的柠檬酸(20mL)、饱和碳酸氢钠20mL，水20mL，饱和食盐水(20mL)洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用水泵减压浓缩。粗品通过柱分离纯化得到WX024-2。¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ(ppm)8.09(d,J＝3.4Hz,1H),6.88-7.00(m,1H),3.86(s,3H),2.47(s,3H)。

步骤2：WX024-3的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-2(390mg,2.50mmol,1eq)，甲醇(6mL)，水(3mL)，氢氧化钠(299.59mg,7.49mmol,3eq)，25℃反应16小时。反应完毕后，将反应液直接减压浓缩，将甲醇旋出，水相用3摩尔每升的盐酸调节pH＝3，有固体析出，过滤，收集固体得到WX024-3。

步骤3：WX024-4的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-3(80mg,562.68μmol,1eq)，四氢呋喃(2mL)，氮气保护，-78℃加入正丁基锂(2.5M,540.18μL,2.4eq)，搅拌0.5小时，然后加入B-1-3(147.91mg,844.02μmol,1.5eq)的四氢呋喃(1mL)，-78℃反应1小时。反应液倒入饱和氯化铵水溶液(2mL)中，先用乙酸乙酯1mL，然后再用2摩尔每升的盐酸溶液调节pH＝3～4，用乙酸乙酯(2mL)萃取3次，合并有机相，有机相用饱和食盐水(4mL)洗涤有，用硫酸钠干燥，过滤，滤液用水泵减压浓缩得到WX024-4。

步骤4：WX024-5的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-4(178mg,560.77μmol,1eq)，二氯甲烷(3mL)，抽换氮气，0℃加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(319.83mg,841.15μmol,1.5eq)，二异丙基乙胺(217.42mg,1.68mmol,293.03μL,3eq)，25℃反应16小时。反应完毕后，反应液用水(2mL)稀释，用二氯甲烷(2mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(10mL)洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用水泵减压浓缩，粗品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX024-5。

步骤5：WX024-6的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-5(100mg,333.99μmol,1eq)，四丁基氟化铵(1M,333.99μL,1eq)，四氢呋喃(2mL)抽换氮气，25℃反应16小时。反应完毕后，将反应液直接减压浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX024-6。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)9.03(s,1H),7.28(s,1H),4.94(d,J＝6.6Hz,2H),4.74(d,J＝6.6Hz,2H),2.25(s,3H).

步骤6：WX024-7的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-6(40mg,204.88μmol,1eq)，N’N-二甲基甲酰胺(1mL)，N-溴代丁二酰亚胺(43.76mg,245.85μmol,1.2eq)，抽换氮气，加热到60℃，反应16小时。反应完毕后，反应液用水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(10mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(10mL)洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用水泵减压浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX024-7。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)9.27(s,1H),4.91(d,J＝6.6Hz,2H),4.76(d,J＝7.0Hz,2H),2.24(s,3H).

步骤7：WX024-8的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-7(80mg,291.83μmol,1eq)，N’N-二甲基甲酰胺(10mL)，抽换氮气，0℃加入钠氢(17.51mg,437.74μmol,60％纯度,1.5eq)，在0℃下反应0.5小时，然后再加入D-1(71.96mg,350.19μmol,45.83μL,1.2eq)，反应液慢慢升到25℃，继续反应1小时。反应完毕后，反应液用水(5mL)稀释，用乙酸乙酯(5mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(5mL)洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用水泵减压浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX024-8。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ(ppm)7.39(d,J＝7.5Hz,1H),7.32-7.39(m,2H),7.24-7.29(m,1H),4.93(s,2H),4.87(d,J＝7.5Hz,2H),4.70(d,J＝7.5Hz,2H),2.27(s,3H)。

步骤8：WX024的合成

向反应瓶中加入WX024-8(92mg,230.75μmol,1eq)，A-1(107.12mg,230.75μmol,1eq)，甲苯(2mL)，抽换氮气，加热到125℃，然后慢慢加入四三苯基膦钯(53.33mg,46.15μmol,0.2eq)。125℃反应48小时。反应完毕后，将反应液浓缩。粗产品通过薄层层析硅胶板纯化得到WX024。

实施例25：WX025

合成路线

步骤1：WX025-1的合成

向干燥的反应瓶中加入WX024-7(150mg,547.18μmol,1eq)，N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，无色清夜，抽换氮气，0℃加入钠氢(32.83mg,820.77umol,60％纯度,1.5eq)，在0℃下反应0.5小时，然后再加入D-3(124.12mg,656.61μmol,80.60μL,1.2eq)，反应液慢慢升到20℃，继续反应1小时。反应完毕后，反应液用水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(30mL×3)洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液用水泵减压浓缩。粗品通过薄层层析硅胶板分离纯化WX025-1。¹H NMR(CDCl₃400MHz):δ(ppm)7.28-7.35(m,1H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),7.08(d,J＝9.6Hz,1H),6.95-7.02(m,1H),4.96(s,2H),4.91(d,J＝7.3Hz,2H),4.78(d,J＝7.3Hz,2H),2.38(s,3H).

步骤2：WX025的合成

在预先干燥的单口烧瓶中加入WX025-1(80mg,209.29μmol,1eq)和A-1(97.16mg,209.29μmol,1eq)，再加甲苯(4mL)，置换氮气，升温至125℃，然后缓慢加入四三苯基膦钯(48.37mg,41.86μmol,0.2eq)，再置换氮气，125℃反应48小时。反应完毕后，减压浓缩干得粗品。粗品通过制备薄层层析硅胶板分离纯化得到WX025。

各实施例的氢谱和质谱数据如表6所示。

表6

实验例一、体外酶活性测试：

1.实验目的：

测量化合物抑制ERK2激酶活性的能力。

2.实验缓冲液：

20mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH 7.5)，10mM MgCl₂，1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.02％Brij35(十二烷基聚乙二醇醚)，0.02mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，0.1mM Na₃VO₄，2mM二硫苏糖醇(DTT)，1％DMSO。

3.化合物处理：

将测试化合物溶于100％DMSO中，配制成特定浓度的母液。利用Integra ViafloAssist智能移液器将化合物连续稀释在DMSO溶液中。

4.实验方法

1)在新制备的反应缓冲液中配置底物MBP；

2)将ERK2激酶加入到上述MBP溶液中并轻轻混合；

3)运用超声技术(Echo550；纳升范围)将溶于100％DMSO中的化合物加入到激酶反应体系中，在室温下孵育20分钟；

4)将³³P-ATP(特定浓度10μCi/μL)加入到反应体系中，此时开始发生反应；

5)在室温下孵育2小时；

6)通过过滤--结合方法检测放射性的量；

7)ERK2激酶活性计算方式为测试样品中剩余激酶活性占对照组(二甲基亚砜处理)激酶活性的比值。使用Prism(GraphPad软件)进行曲线拟合并计算IC₅₀值。

5.实验结果见表7：

表7体外酶活性测试结果

结论：本发明化合物表现出较优的对ERK2酶抑制活性。

实验例二、体外细胞增殖抑制实验：

1.实验目的：

测量化合物抑制HT29肿瘤细胞增值的能力。

2.化合物处理：

将测试化合物溶于100％DMSO中，配制成10mM的母液。

3.实验步骤与方法：

1)开启生物安全柜紫外灯，倒计时30分钟；

2)37度水浴锅中，预热RPMI1640培养基和胰酶；

3)紫外照射完毕，开启生物安全柜，将预热培养基，胰酶，磷酸缓冲盐溶液(PBS)等用酒精擦拭并放入生物安全柜中；

4)将HT29细胞从培养箱中取出，在生物安全柜中去除旧培养基，加入10毫升PBS，轻轻摇晃，并去除PBS；

5)加入预热0.25％胰酶1.5毫升，水平晃动培养瓶，使其均匀覆盖到底部的细胞，置培养箱中2分钟；

6)用完全培养基终止细胞消化，并吹打至均匀的细胞悬液计数；

7)根据细胞计数结果，调整细胞悬液密度为1500细胞每孔，50微升每孔进行种板；

8)将化合物母液连续稀释在DMSO溶液中，并使用Tecan将化合物加入细胞板中；

9)将加过化合物的细胞板和CellTiterGlo放到室温平衡，后加CellTiterGlo 25微升至每孔，震荡1-2分钟，静置10分钟后检测信号值，并用XL-Fit分析数据，计算各化合物的IC₅₀。

4.实验结果见表8：

表8体外细胞活性测试结果

结论：本发明化合物表现出较优的对HT29细胞增殖抑制活性。

实验例三、体内DMPK研究：

小鼠体内DMPK研究

1.实验目的：

以雌性BALB/c小鼠为受试动物，单次给药后测定化合物血药浓度并评估药代动力学行为。

2.实验操作：

选择健康成年雌性BALB/c小鼠8只，4只为静注组，4只为口服组。待测化合物与适量静注组溶媒(5％DMSO+20％HP-β-CD)混合，涡旋并超声，制备得到0.5mg/mL澄清溶液，微孔滤膜过滤后备用；口服组溶媒为5％DMSO+20％HP-β-CD，待测化合物与溶媒混合后，涡旋并超声，制备得到0.3mg/mL溶液。小鼠1mg/kg静脉给药或3mg/kg口服给药后，收集一定时间的全血，制备得到血浆，以LC-MS/MS方法分析药物浓度，并用Phoenix WinNonlin软件(美国Pharsight公司)计算药代参数。

注HP-β-CD:羟丙基-β-环糊精。

3.实验结果见表9：

表9化合物PK测试结果

备注:C_max为最大浓度；F％为口服生物利用度；DNAUC＝AUC_PO/Dose，AUC_PO为口服暴露量，Dose为药物剂量；Vd_ss为分布容积；Cl为清除率；T_1/2为半衰期；ND指未检测。

结论：本发明化合物展现了优良的口服暴露量和生物利用度。

实验例四、人结肠癌HT-29细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究

1.实验目的：

使用人结肠癌HT-29细胞皮下异种移植肿瘤裸小鼠模型，评价WX006的抗肿瘤作用。

2.实验动物：

种属：小鼠

品系：BALB/c裸小鼠

周龄：6-8周龄

性别：雌性

体重：18-22克

供应商：上海灵畅生物科技有限公司

动物合格证号：20180003007379

3.饲养环境：

动物在SPF级动物房以IVC(独立送风系统，恒温恒湿)笼具饲养(每笼3只)，温度：20-26℃，湿度：40-70％；

笼具：以聚碳酸酯制成，体积300mm×180mm×150mm，垫料为玉米芯，每周更换两次；

食物：实验动物在整个实验阶段中可自由进食(照射灭菌，干颗粒状食物)；

饮水：实验动物可自由饮用灭菌水；

笼具标识：每笼动物信息卡应注明笼内动物数目，性别，品系，接收日期，给药方案，实验编号，组别以及实验开始日期；

动物标识：实验动物以耳标进行标识。

4.实验内容：

1)实验细胞及培养：人结肠癌HT-29细胞(ATCC，货号：HTB-38)体外单层培养，培养条件为McCoy's 5a培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃5％CO2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种；

2)肿瘤组织接种及分组：0.1mL(5×10⁶个)HT-29细胞皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到129mm³时，将动物随机分为两组，开始给药。实验分组和给药方案见表10；

表10实验动物分组及给药方案

3)实验动物日常观察：本实验方案的拟定及任何修改均通过了实验动物管理与使用委员会(IACUC)的评估核准。实验动物的使用及福利遵照国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)的规定执行。每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察肿瘤生长和药物治疗对动物日常行为表现的影响如行为活动，摄食摄水量(仅目测)，体重变化(每周测量两次体重)，外观体征或其它不正常情况。基于各组动物数量记录了组内动物死亡数和副作用。

4)肿瘤测量和实验指标：

a)每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径；

b)化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。

c)相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV；CRTV：溶剂对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝V_t/V₀，其中V₀是分组给药时测量所得平均肿瘤体积，V_t为某一次测量时的平均肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。

5)统计分析：统计分析基于试验结束时RTV的数据运用SPSS软件进行分析。两组间比较用T test进行分析，三组或多组间比较用one-way ANOVA进行分析，如果方差齐(F值无显著性差异)，应用Tukey‘s法进行分析，如果方差不齐(F值有显著性差异)，应用Games-Howell法进行检验。p<0.05认为有显著性差异。

5.实验结果：

a)如图1所示，给药至第26天时，WX006具有明显的抑制肿瘤生长作用，它的T/C为45.2％，TGI为61.9％，与溶剂对照组相比p值<0.001；

b)实验动物的体重作为间接测定药物毒性的参考指标。如图2所示，给药至第26天时，溶剂对照组和WX006组所有动物的体重均未有明显下降，无发病或死亡现象。

Claims (17)

1.式(Ⅲ)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

n为0、1或2；

环A为

T₁、T₂和T₃分别独立地选自N和CH；

D₁和D₂分别独立地选自-CH₂-和-CH₂-CH₂-；

R₁选自H和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_a取代；

R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_b取代；

R₄选自H、F、Cl、Br、I、OH和NH₂；

R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br、I和C_1-3烷基，其中所述C_1-3烷基任选被1、2或3个R_c取代；

R₁₀选自H、F、Cl、Br、I和CH₃；

R_a、R_b和R_c分别独立地选自F、Cl、Br、I、OH、CN和NH₂。

2.根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其选自

其中，环A、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀如权利要求1所定义。

3.根据权利要求1所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其选自

其中，环A、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀如权利要求1所定义。

4.根据权利要求1、2或3所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，R₁选自H和CH₃，其中所述CH₃任选被1、2或3个R_a取代。

5.根据权利要求4所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，R₁为CH₃。

6.根据权利要求1、2或3所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I和CH₃，其中所述CH₃任选被1、2或3个R_b取代。

7.根据权利要求6所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，R₂和R₃分别独立地选自H、F、Cl、Br、I和CH₃。

8.根据权利要求1、2或3所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br、I、CH₃和-CH₂-CH₃，其中所述CH₃和-CH₂-CH₃任选被1、2或3个R_c取代。

9.根据权利要求8所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别独立地选自H、F、Cl、Br和I。

10.根据权利要求1、2或3所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，环A为

11.根据权利要求10所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其中，环A为

12.根据权利要求1～9任意一项所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其选自

其中，

R₁如权利要求1、4或5所定义；

R₂和R₃如权利要求1、6或7所定义；

R₄如权利要求1所定义；

R₅、R₆、R₇、R₈和R₉如权利要求1、8或9所定义；

R₁₀如权利要求1所定义。

13.根据权利要求12所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其选自

其中，

R₁如权利要求1、4或5所定义；

R₂和R₃如权利要求1、6或7所定义；

R₄如权利要求1所定义；

R₅、R₆、R₇、R₈和R₉如权利要求1、8或9所定义；

R₁₀如权利要求1所定义。

14.下述化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，

15.根据权利要求14所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，其选自

16.根据权利要求1～15任意一项所述化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备治疗ERK相关疾病的药物中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述ERK相关疾病药物是用于治疗结直肠癌的药物。

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