CN113736717B - 一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌及其应用。该甲烷氧化菌能在不同环境条件下高效降解硝酸盐同时进行甲烷氧化过程，对缺氧环境具有抗逆性，培养简单，成本低，菌株的适应性强，稳定性好，在污水处理领域有广泛的应用前景。该菌株利用甲烷和硝酸盐作为碳源和氮源形成菌体蛋白，可作为饲料等，实现将污染物转化为更高附加值产品，具有综合治理污染的优点。

Description

一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌及其应用。

背景技术

由于气候变暖导致大气环流受影响，使得局部地区天气不稳定，高温热浪、大雨洪涝、寒潮雪灾频发。2020年，科学家检测到北冰洋海冰加速融化，南极冰川出现大裂缝。从工业革命开始，甲烷在大气中的浓度增加迅猛，每年以1.0%～1.2%的速度增加，甲烷对全球气候变化的影响与日俱增。虽然大气中甲烷含量远远低于二氧化碳含量，但其温室效应是二氧化碳的26.5倍，拥有更高的全球变暖潜势。因此，加强对甲烷排放的管控，对于减缓全球变暖具有重要意义。除此之外，矿井瓦斯中甲烷最高含量达90%，瓦斯爆炸是主要的煤矿事故之一。厌氧污泥等反应器也能产生沼气甲烷。这些甲烷废气急需进一步转化利用，降低安全和环境风险。

硝酸盐是造成水体富营养化的重要排放氮源，其在高温或者生物作用下能够转化为有害物质亚硝酸盐，使人缺氧中毒，并具有致癌、致畸、致突变风险。目前，污水处理厂利用微生物处理硝酸盐时，需要大量碳源，比如乙酸钠等，增加投入成本。此外，所用微生物菌剂多为菌群，硝酸盐去除活性易受环境影响，性能不稳定。且污水处理过程包括有氧条件和无氧条件。因此，培育碳源经济、活性强、性能稳定且具备有氧和缺氧活性的硝酸盐去除菌剂在污水生物处理过程中尤为重要。

甲烷氧化菌以甲烷作为唯一碳源和能源，能够减少温室气体排放。根据是否需要氧气，甲烷氧化菌分为好氧甲烷氧化菌和厌氧甲烷氧化菌。其中，厌氧甲烷氧化菌生长速度慢，且难以实现纯培养，而好氧甲烷氧化菌生长速度快，容易分离获得。CN201010536169.0公开了一株利用甲醇进行废水脱氮的甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)。CN201910598263.X公开了一种甲烷氧化菌（Methylobacterium sp）在生产单细胞蛋白中的应用。但是，这些好氧甲烷氧化菌不能在缺氧条件下长期存活。因此，分离获得既能利用温室气体甲烷又能去除污水中硝酸盐且性能稳定的甲烷氧化菌具有重要应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌。

本发明的另一目的在于提供上述具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌，名称为甲基杆菌（Methylobactersp.）YRD-M2，于2021年9月24日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 61952。

上述具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌，能在不同环境（甲烷、氧气）条件下高效降解硝酸盐，同时进行甲烷氧化过程，菌株对缺氧环境具有抗逆性，且培养基成分容易获得，使用量少，培养简单，成本低，菌株的适应性强，稳定性好，菌体利用甲烷和硝酸盐形成菌体蛋白，可作为饲料等，在污水处理领域有广泛的应用前景。

上述具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌在环境修复中的应用；优选包括如下步骤：将上述具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌置于含有甲烷和硝酸盐的环境中培养，实现脱氮和甲烷减排。

所述的环境优选为水体。

一种具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂，含有培养基和上述甲烷氧化菌。

所述的培养基组成如下：0.1～0.3 g/L七水合硫酸镁、0.10～0.18 g/L六水合氯化钙、0.5～1.5 g/L硝酸钾、45～55 mL/L 磷酸盐缓冲液、1.5～2.5 mL/L微量元素液，余量为水；更优选如下：0.2 g/L七水合硫酸镁、0.14 g/L六水合氯化钙、1 g/L硝酸钾、50 mL/L磷酸盐缓冲液、2 mL/L微量元素液，余量为水。

所述的微量元素液的组成如下： 0.5～1.5 g/L EDTA二钠、1.5～2.5 g/L七水合硫酸亚铁、0.7～0.9 g/L七水合硫酸锌、0.02～0.04 g/L四水合氯化锰、0.02～0.04 g/L硼酸、0.15～0.25g/L六水合氯化钴、0.5～0.7 g/L二水合氯化铜、0.01～0.03 g/L六水合氯化镍、0.04～0.06 g/L二水合钼酸钠，余量为水；更优选如下：1 g/L EDTA二钠、2 g/L七水合硫酸亚铁、0.8 g/L七水合硫酸锌、0.03 g/L四水合氯化锰、0.03 g/L硼酸、0.2 g/L六水合氯化钴、0.6 g/L二水合氯化铜、0.02 g/L六水合氯化镍、0.05 g/L二水合钼酸钠，余量为水。

所述的磷酸盐缓冲液的组成如下：5.44 g/L KH₂PO₄、5.68 g/L Na₂HPO₄，余量为水。

所述的水优选为蒸馏水、去离子水。

所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：在培养基中接种上述具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌，在甲烷气体环境下避光培养，得到具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂。

所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌的接种体积优选为相当于所述的培养基的体积的2～5%；更优选为相当于所述的培养基的体积的4%。

所述的培养的温度优选为28～32℃；更优选为30℃。

所述的培养的时间优选为3～5天。

所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂在环境修复中的应用；优选包括如下步骤：将所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂置于待修复的环境中培养即可。

所述的环境优选为水体。

所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂的接种量按其与所述的水体按体积比1～100：1000进行计算。

与现有技术相比，本发明的有益效果表现为：

1、本申请提供的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌，能在不同环境条件下高效降解硝酸盐同时进行甲烷氧化过程，菌株对缺氧环境具有抗逆性，且培养基成分容易获得，使用量少，培养简单，成本低，菌株的适应性强，稳定性好，在污水处理领域有广泛的应用前景。

2、本发明提供的微生物制剂以瓦斯或废气中的甲烷为底物，能够降低污水处理成本，同时能够降低温室气体排放，通过甲烷氧化菌降低易燃易爆气体甲烷浓度，从而减少因甲烷误燃引起的事故发生。

3、本发明提供的微生物制剂通过甲烷氧化菌利用温室气体甲烷和污水中硝酸盐，将其作为碳源和氮源形成菌体蛋白，可作为饲料等，实现将污染物转化为更高附加值产品，具有综合治理污染的优点。

4、本发明提供的微生物制剂中的菌株适应性强，活性高且性能稳定，对缺氧环境具有抗逆性，能够长期发挥作用，有助于污水处理的可持续发展。

附图说明

图1为甲烷氧化菌YRD-M2的菌落形态图。

图2为甲烷氧化菌YRD-M2在光学显微镜（10×100）下的菌体形态图。

图3为甲烷氧化菌YRD-M2菌株的甲烷利用和硝酸盐去除效果图；其中，初始条件为25%CH₄、75%空气和2 mM NO₃ ^-；Methylobacter sp. YRD-M2指培养基接种Methylobactersp.YRD-M2菌株；无菌体对照指培养基中不接种YRD-M2菌株。

图4为甲烷氧化菌YRD-M2菌株的甲烷利用和硝酸盐去除效果图；其中，初始条件为10%CH₄、75%空气和2 mM NO₃ ^-；Methylobacter sp. YRD-M2指培养基接种Methylobactersp.YRD-M2菌株。

图5为甲烷氧化菌YRD-M2菌株的甲烷利用和硝酸盐去除效果图；其中，初始条件为25%CH₄、30%空气和2 mM NO₃ ^-；Methylobacter sp. YRD-M2指培养基接种Methylobactersp.YRD-M2菌株。

图6为甲烷氧化菌YRD-M2菌株的甲烷利用和硝酸盐去除效果图；其中，初始条件为25%CH₄、75%空气和1 mM NO₃ ^-；Methylobacter sp. YRD-M2指培养基接种Methylobactersp.YRD-M2菌株。

图7为甲烷氧化菌YRD-M2菌株利用甲烷和硝酸盐产生的菌体生物量的检测结果图；其中，菌体生物量通过细菌培养液在600 nm处的吸光值来表示； 2 mM N为2 mM NO₃ ^-，1mM N为1 mM NO₃ ^-；无菌体对照指培养基中不接种YRD-M2菌株。

图8为甲烷氧化菌YRD-M2菌株在扫描电镜下的菌体形态图；图8中（A）是YRD-M2菌株在缺氧条件下（DO＜22.3 μM）培养278天后的菌体形态图，其中DO（Dissolved Oxygen）为溶解氧；图8中（B）指缺氧条件下培养278天后的YRD-M2菌株重新转接到有氧条件下（DO约220 μM）培养后的菌体形态图。

图9为缺氧培养278天后的YRD-M2菌株重新转接到有氧条件下（DO约220 μM）培养后的甲烷和硝酸盐利用情况图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明使用的好氧甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2能够以甲烷和硝酸盐分别作为碳源和氮源，合成具有潜在应用价值的菌体蛋白。且该菌株的适用能力强，其在不同甲烷浓度、空气量和硝酸盐浓度下，都具有较强的甲烷氧化和硝酸盐利用功能，且对缺氧环境具有抗逆性。因此，将该菌株应用到污水处理中，能够同步实现污水脱氮和甲烷减排。

实施例1

甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2的分离鉴定。

1、甲烷氧化菌的富集培养：

对黄河三角洲湿地土壤进行预孵育培养。取10 g新鲜土壤于125 mL西林瓶中，再用丁基橡胶和铝盖密封。添加约5%的甲烷（6 mL）作为底物，在30 ℃暗室静态培养。期间用气体进样针取0.2 mL瓶内气体，利用高效气相色谱（Agilent 7820A, USA）检测甲烷浓度，待甲烷耗尽后补加甲烷继续培养，重复2次。以预孵育的土壤为接种物进行甲烷氧化富集培养。取2.5 g预孵育土壤接种到25 mL硝酸盐无机盐（NMS）培养基。NMS培养基制备过程如下：用电子天平分别称量0.2 g MgSO₄·7H₂O、0.14 g CaCl₂·6H₂O和1.0 g KNO₃，并用注射器取50 mL磷酸缓冲液（5.44 g/L KH₂PO₄、5.68 g/L Na₂HPO₄）和2 mL微量元素液（每升含 1.0 gNa₂-EDTA、2.0 g FeSO₄·7H₂O、0.8 g ZnSO₄·7H₂O、0.03 g MnCl₂·4H₂O、0.03 g H₃BO₃、0.2g CoCl₂·6H₂O、0.6 g CuCl₂·2H₂O、0.02 g NiCl₂·6H₂O和0.05 g Na₂MoO₄·2H₂O），添加到去离子水中，混匀后定容到1 L，加氢氧化钠调节pH值至7.0，取25 ml培养基分装到125 mL西林瓶，丁基胶塞密封，再用铝盖封口，于121℃灭菌20 min，得到培养基。添加约5%甲烷（6mL）作为底物，在30 ℃暗室条件下静止培养5天后，获得甲烷氧化菌的富集物。

2、甲烷氧化菌的分离鉴定：

使用Hungate滚管技术分离甲烷氧化菌，在25 mL厌氧管中，取上述0.5 mL甲烷氧化菌富集物转接到5 mL 2%琼脂NMS培养基中，添加约25%甲烷（5 mL），在30 ℃暗室条件下静止培养5天。挑取单菌落到5 mL液体培养基，重复滚管、挑单菌落的步骤3次，获得纯化后的菌株，命名为YRD-M2。期间用气体进样针取0.2 mL管内气体，利用高效气相色谱（Agilent7820A, USA）检测甲烷浓度来确定甲烷去除效果。

取菌液作为DNA模板进行PCR扩增。PCR 反应体系组成（50 µL）：10×ExTaq buffer（含 Mg²⁺） 5.0 µL，dNTPs（2.5 mM） 4.0 µL，引物27F/1492R（10 µM）各2.0 µL，Ex Taq（5 U/µL） 0.25 µL，DNA模板 2.0 µL，无菌超纯水 34.75 µL。PCR反应条件为：94 ℃预变性 2min；94 ℃变性 30 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，30个循环后在72 ℃终延伸10min。引物为27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGYTACCTTGTTACGACTT）

测序得到的16S rDNA序列为：

CTGCCCGATCAAGTGGTGAGCGCCCTCCCGAAGGTTAGACTACCCACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTAGGACCGGCTTTTTGGGATTTGCTTACTTTCGCAAGTTCGCTGCCCTCTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACCCATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCCTAGAGTTCCCACCATGATGTGCTGGCAACTAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACTCCGCTATCTCTAACAGATTCTCTGGATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGCCTGTAAAAAGGCCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGTACCTCAGCGTCAGTTTTAATCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCCACTCTCCTCTATTAAACTCTAGTTGCCCAGTATCAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGCTTTCACATCTGACTTAAGCAACCGCCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTAAAGGTAATGTCAAGCTGCCGGGTATTGACCGGCAGGTTTTCCTCCCAATTGAAAGTGCTTTACAACCCTCAGGCCTTCTTCACACACGCGGTATTGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCTAACGCAGGCTCATCTCAGAGCGCGAGGCCCGAAGGTCCCCCGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCTTGAGTTTCCCCAAGTTGTCCCCCACTCTGAGGCAGATTCCTACGCGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTCAGCGCCCGAAGG。

3、革兰氏染色：

取0.05 mL菌液滴加到载玻片上，涂匀，晾干后在酒精灯火焰上固定；滴加1滴草酸铵结晶紫液，染色1 min后水洗；再滴加1滴碘液，1 min后水洗；用95%乙醇脱色20 s，再水洗；滴加1滴蕃红染色1 min后水洗；干燥后，在光学显微镜下观察菌体颜色及形态。

菌株Methylobacter sp. YRD-M2在厌氧管管壁上的菌落形态如图1所示，为边缘整齐的圆形，且菌落表面较光滑，呈黄色不透明状。该菌株在光学显微镜下为短杆状（如图2），革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌。

4、菌株鉴定

将筛选出的菌株16S rRNA测序结果在NCBI数据库进行Nucleotide BLAST序列比对，结果显示该菌与Methylobacter luteus A45有98.56%的序列相似性，结合理化特性和菌体形态特征，初步判断为甲烷氧化菌Methylobacter，命名为甲基杆菌（Methylobactersp.）YRD-M2，于2021年9月24日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 61952。

实施例2

甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2在不同甲烷浓度、空气量和硝酸盐浓度下利用甲烷和硝酸盐的效果。

1）NMS培养基的制备：

用电子天平分别称量0.2 g MgSO₄·7H₂O、 0.14 g CaCl₂·6H₂O和1.0 g KNO₃，并用注射器取50 mL磷酸缓冲液（5.44 g/L KH₂PO₄、5.68 g/L Na₂HPO₄）和2 mL微量元素液（每升含 1.0 g Na₂-EDTA、2.0 g FeSO₄·7H₂O、0.8 g ZnSO₄·7H₂O、0.03 g MnCl₂·4H₂O、0.03g H₃BO₃、0.2 g CoCl₂·6H₂O、0.6 g CuCl₂·2H₂O、0.02 g NiCl₂·6H₂O和0.05 g Na₂MoO₄·2H₂O），添加到去离子水中，混匀后定容到1 L，加氢氧化钠调节pH值至7.0，取25 ml培养基分装到125 mL西林瓶，丁基胶塞密封，再用铝盖封口，于121℃灭菌20 min，得到培养基。

2）甲烷氧化菌菌剂制备：

在超净工作台中，取1 mL甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2菌液接种到上述25 mL培养基中，按25%（甲烷体积/顶空体积）添加量加入25 mL甲烷，此前需要提前用注射器取出同体积的25 mL瓶内气体，在30 ℃暗室条件下静止培养5天，利用高效气相色谱仪(Agilent 7820A, USA)检测甲烷浓度，利用分光光度计（普析 TU1810，中国）检测菌体密度OD₆₀₀，当甲烷浓度降低且菌体生物量达0.4左右时，表明甲烷氧化菌YRD-M2得到活化，菌剂制备成功。

3）甲烷氧化菌菌剂在不同环境下的硝酸盐和甲烷利用效果：

为了模拟含不同浓度硝酸盐的污水，准备包括1mM和2mM KNO₃的NMS培养基（KNO₃的添加量分别修改为0.10 g和0.23 g，其它组分和制备过程同1）。根据污水处理过程中，反应器可能会形成不同甲烷浓度和空气含量条件，污水中硝酸盐浓度也不同。因此，模拟不同甲烷浓度、空气含量和硝酸盐浓度条件，验证甲烷氧化菌YRD-M2在不同条件下的甲烷消耗和硝酸盐去除效果及形成菌体生物量情况。分别设置实验组，包括：①25%甲烷+75%空气+2 mM硝酸盐；②10%甲烷+15%氩气+75%空气+2 mM硝酸盐；③25%甲烷+30%空气+45%氩气+2 mM硝酸盐；④25%甲烷+75%空气+1 mM硝酸盐，其中甲烷含量是v/v（甲烷体积/顶空体积），空气含量是v/v（空气体积/顶空体积）。在超净工作台中，取1 mL甲烷氧化菌YRD-M2菌液作为实验组接种到上述不同处理的培养基中，同时以不添加甲烷氧化菌YRD-M2作为对照组，每个处理设3个重复，在30℃暗室条件下静止培养5天。采用破坏性取样的方式，期间用气体进样针取0.2 mL瓶内气体，利用高效气相色谱（Agilent 7820A, USA）检测甲烷浓度来确定甲烷去除效果。用无菌注射器取1 mL菌液，经0.22μm滤膜过滤除菌后，使用离子色谱仪（DionexICS-600, USA）检测硝酸盐浓度确定硝酸盐去除效果。同时，用无菌注射器取1 mL菌液，利用分光光度计（普析 TU1810，中国）在600 nm波长下检测菌液的吸光度，即为菌体密度OD₆₀₀。

从图3中可以看出，在约为25%甲烷、75%空气和2 mM硝酸盐条件下，即体系中有高浓度甲烷、空气量和硝酸盐，甲烷氧化菌YRD-M2菌株在5天内能够降解5.47 mM甲烷、1.42mM硝酸盐，菌体密度能够达到0.40（图7），具有很强地降低甲烷和硝酸盐含量的效果，同时形成较多具有应用价值的菌体。从图4中可以看出，在约为10%甲烷、75%空气和2 mM硝酸盐条件下，即体系中有较低浓度甲烷、高含量空气和硝酸盐，甲烷氧化菌YRD-M2菌株在5天内能够降解3.83 mM甲烷、1.06 mM硝酸盐，菌体密度能够达到0.40（图7），仍然具有很强地降低甲烷和硝酸盐含量的效果，同时形成较多具有应用价值的菌体。

从图5中可以看出，在约为25%甲烷、30%空气和2 mM硝酸盐条件下，即体系中有高浓度甲烷和硝酸盐、较低含量空气，甲烷氧化菌YRD-M2菌株在5天内能够降解4.34 mM甲烷、1.05 mM硝酸盐，菌体密度能够达到0.24（图7），仍然具有很强地降低甲烷和硝酸盐含量的效果，同时形成一定量的具有应用价值的菌体。从图6中可以看出，在约为25%甲烷、75%空气和1 mM硝酸盐条件下，即体系中有高浓度甲烷和空气、较低浓度硝酸盐，甲烷氧化菌YRD-M2菌株在5天内能够降解5.00 mM甲烷、0.91 mM硝酸盐，菌体密度能够达到0.30（图7），仍然表现出很强地降低甲烷和硝酸盐含量的效果，同时形成较多具有应用价值的菌体。

实施例3

甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2长时间缺氧培养后的甲烷和硝酸盐利用效果。

1）缺氧条件下NMS培养基的制备：

用电子天平分别称量0.2 g MgSO₄·7H₂O、 0.14 g CaCl₂·6H₂O和0.23 g KNO₃，并用注射器取50 mL 磷酸缓冲液 （5.44 g/L KH₂PO₄、5.68 g/L Na₂HPO₄）和2 mL微量元素液（每升含 1.0 g Na₂-EDTA、2.0 g FeSO₄·7H₂O、0.8 g ZnSO₄·7H₂O、0.03 g MnCl₂·4H₂O、0.03 g H₃BO₃、0.2 g CoCl₂·6H₂O、0.6 g CuCl₂·2H₂O、0.02 g NiCl₂·6H₂O和0.05 gNa₂MoO₄·2H₂O），添加到去离子水中，混匀后定容到1 L，加氢氧化钠调节pH值至7.0，取25ml培养基分装到125 mL西林瓶，丁基胶塞密封，再用铝盖封口。使用智能厌氧制备仪（北京艾斯普科技有限公司）抽气1 min，充高纯氮气30 s，如此循环10次，形成缺氧环境。之后，于121℃灭菌20 min。采用破坏性取样的方式，使用微电极(Unisense, 丹麦)测定西林瓶中初始溶解氧浓度，检测值为2.13 μM。

2）甲烷氧化菌缺氧条件下培养及菌体形态观察：

在超净工作台中，取1 mL甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2菌液接种到上述西林瓶25 mL培养基中，按25%（甲烷体积/顶空体积）添加量加入25 mL甲烷，此前需要提前用注射器取出同体积的25 mL瓶内气体，在30 ℃暗室条件下静止培养278天。培养结束时，采用破坏性取样的方式，使用微电极(Unisense, 丹麦)测定西林瓶中溶解氧浓度，检测值为22.3 μM。之后，进行扫描电镜观察：取2 mL菌液，5000 r/min离心3 min，弃上清；加入2mL 0.1 mol/L PBS缓冲液，重悬后5000 r/min离心3 min，重复清洗3遍；再加入1 mL 2.5%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.2），于4℃固定过夜；次日，用0.15%的戊二醛磷酸缓冲液冲洗；然后依次用30%、50%、70%、90%和无水乙醇进行梯度脱水，每次脱水15 min后于5000 r/min离心3min；再加入2 mL叔丁醇置换乙醇，5000 r/min离心3 min，弃掉大部分上清，留少量上清液用来重悬菌体，吸取0.1 mL菌液滴加到洁净盖玻片上，于超净工作台吹干；经镀金后，在扫描电子显微镜下观察菌体形态。

3）好氧条件下培养基的制备及菌株活性验证：

配制过程同实施案例2中1）NMS培养基制备。之后，在超净工作台中，取1 mL培养278天的甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2菌液接种到上述25 mL培养基中，按25%（甲烷体积/顶空体积）添加量加入25 mL甲烷，此前需要提前用注射器取出同体积的25 mL瓶内气体，在30 ℃暗室条件下静止培养9天。期间用气体进样针取0.2 mL瓶内气体，利用高效气相色谱（Agilent 7820A, USA）检测甲烷浓度来确定甲烷去除效果。用无菌注射器取1 mL菌液，经0.22μm滤膜过滤除菌后，使用离子色谱仪（Dionex ICS-600, USA）检测硝酸盐浓度确定硝酸盐去除效果。此外，对培养9天的甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2在扫描电镜下进行菌体形态观察，方法同上2）所述。

从图8中（A）可知，Methylobacter sp. YRD-M2培养278天后菌体聚集，菌体大小不均匀，能看到少量破损的菌体细胞，可能是缺氧环境对菌株具有胁迫作用，但仍能看到大部分完整的菌体细胞，表明该菌株对缺氧环境具有抗逆性。从图8中（B）可以看出，长时间缺氧培养的Methylobacter sp. YRD-M2重新转移到有氧环境后仍能迅速生长，菌体形态统一，分布均匀，菌体密度高，进一步表明Methylobacter sp. YRD-M2在缺氧条件下具有生命力。

从图9可知，长时间缺氧培养的Methylobacter sp. YRD-M2重新转移到有氧环境后仍具有氧化甲烷和利用硝酸盐的能力，7天能够利用5.22 mM甲烷和1.46 mM硝酸盐，具有较高的甲烷氧化和硝酸盐去除速率，与未缺氧培养的菌株功能相同。该结果表明，Methylobacter sp. YRD-M2在缺氧条件下仍具有生命力，接触有氧条件后能迅速恢复正常生长，恢复甲烷氧化和硝酸盐去除功能，具有很强的缺氧抗逆性。

综述所述，甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2在不同甲烷浓度和氧气含量条件下都具有较强的甲烷和硝酸盐去除功能，在好氧条件下，可以同步进行脱氮和甲烷氧化过程，菌株对缺氧环境具有抗逆性，且培养基成分容易获得，使用量少，培养简单，成本低，菌株的适应性强，稳定性好，使得菌剂在污水处理中得到广泛应用成为可能。因此，甲烷氧化菌Methylobacter sp. YRD-M2能够同步实现脱氮和甲烷氧化，且具有缺氧抗逆性，能够实现本发明的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省科学院生态环境与土壤研究所

<120> 一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 甲烷氧化菌YRD-M2(Methylobacter sp. YRD-M2)

<400> 1

ctgcccgatc aagtggtgag cgccctcccg aaggttagac tacccacttc ttttgcaacc 60

cactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcgacatt 120

ctgattcgcg attactagcg attccgactt catggagtcg agttgcagac tccaatccgg 180

actaggaccg gctttttggg atttgcttac tttcgcaagt tcgctgccct ctgtaccggc 240

cattgtagca cgtgtgtagc cctacccata agggccatga tgacttgacg tcgtccccac 300

cttcctccgg tttatcaccg gcagtctccc tagagttccc accatgatgt gctggcaact 360

aaggataagg gttgcgctcg ttacgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 420

acagccatgc agcacctgtc tcagagttcc cgaaggcact ccgctatctc taacagattc 480

tctggatgtc aagggtaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc acatgctcca 540

ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt gagttttaac cttgcggccg tactccccag 600

gcggtcaact taatgcgtta gctgcgccac taagcctgta aaaaggccca acggctagtt 660

gacatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctacc cacgctttcg 720

tacctcagcg tcagttttaa tccagagagt cgccttcgcc actggtgttc cttcagatct 780

ctacgcattt caccgctaca cctgaaattc cactctcctc tattaaactc tagttgccca 840

gtatcaaatg cagttcccag gttaagcccg gggctttcac atctgactta agcaaccgcc 900

tacgcacgct ttacgcccag taattccgat taacgcttgc accctccgta ttaccgcggc 960

tgctggcacg gagttagccg gtgcttcttc taaaggtaat gtcaagctgc cgggtattga 1020

ccggcaggtt ttcctcccaa ttgaaagtgc tttacaaccc tcaggccttc ttcacacacg 1080

cggtattgct ggatcaggct tgcgcccatt gtccaatatt ccccactgct gcctcccgta 1140

ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcgt cctctcagac cagctataga 1200

tcgtcgcctt ggtaggcctt taccccacca actagctaat ctaacgcagg ctcatctcag 1260

agcgcgaggc ccgaaggtcc cccgctttcc cccgtagggc gtatgcggta ttagcttgag 1320

tttccccaag ttgtccccca ctctgaggca gattcctacg cgttactcac ccgtccgcca 1380

ctcgtcagcg cccgaagg 1398

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物27F

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物1492R

<400> 3

ggytaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌，其特征在于：名称为甲基杆菌（Methylobacter sp.）YRD-M2，于2021年9月24日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61952。

2.权利要求1所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌的应用，其特征在于包括如下步骤：将权利要求1所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌置于含有甲烷和硝酸盐的环境中培养，实现脱氮和甲烷减排。

3.根据权利要求2所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌的应用，其特征在于：所述的环境为水体。

4.一种具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂，其特征在于：含有培养基和权利要求1所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌。

5.根据权利要求4所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂，其特征在于：所述的培养基的组成如下：0.1～0.3 g/L七水合硫酸镁、0.10～0.18 g/L六水合氯化钙、0.5～1.5 g/L硝酸钾、45～55 mL/L 磷酸盐缓冲液、1.5～2.5 mL/L微量元素液，余量为水；

所述的磷酸盐缓冲液的组成如下：5.44 g/L KH₂PO₄、5.68 g/L Na₂HPO₄，余量为水；

所述的微量元素液的组成如下： 0.5～1.5 g/L EDTA二钠、1.5～2.5 g/L七水合硫酸亚铁、0.7～0.9 g/L七水合硫酸锌、0.02～0.04 g/L四水合氯化锰、0.02～0.04 g/L硼酸、0.15～0.25 g/L六水合氯化钴、0.5～0.7 g/L二水合氯化铜、0.01～0.03 g/L六水合氯化镍、0.04～0.06 g/L二水合钼酸钠，余量为水。

6.根据权利要求5所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂，其特征在于：

所述的培养基的组成如下： 0.2 g/L七水合硫酸镁、0.14 g/L六水合氯化钙、1 g/L硝酸钾、50 mL/L 磷酸盐缓冲液、2 mL/L微量元素液，余量为水；

所述的微量元素液的组成如下：1 g/L EDTA二钠、2 g/L七水合硫酸亚铁、0.8 g/L七水合硫酸锌、0.03 g/L四水合氯化锰、0.03 g/L硼酸、0.2 g/L六水合氯化钴、0.6 g/L二水合氯化铜、0.02 g/L六水合氯化镍、0.05 g/L二水合钼酸钠，余量为水。

7.权利要求4～6任一项所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：在培养基中接种如权利要求1所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的甲烷氧化菌，在甲烷气体存在的环境下避光培养，得到具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂。

8.根据权利要求7所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂的制备方法，其特征在于：

甲烷氧化菌的接种体积相当于培养基的体积的2～5%；

培养温度为28～32℃；

培养时间为3～5天。

9.权利要求4～6任一项所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂在环境修复中的应用。

10.根据权利要求9所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂在环境修复中的应用，其特征在于：将所述的具有脱氮功能和缺氧抗逆性的微生物制剂置于待修复的环境中培养即可。

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