CN113667735A - Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 - Google Patents
Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113667735A CN113667735A CN202110890688.5A CN202110890688A CN113667735A CN 113667735 A CN113667735 A CN 113667735A CN 202110890688 A CN202110890688 A CN 202110890688A CN 113667735 A CN113667735 A CN 113667735A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alkbh5
- protein
- kit
- antibody
- diabetic retinopathy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000959153 Homo sapiens RNA demethylase ALKBH5 Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102100039083 RNA demethylase ALKBH5 Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 title claims abstract description 42
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 21
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 18
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 13
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 abstract description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 21
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 4
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010019030 Hair colour changes Diseases 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006093 RNA methylation Effects 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007488 abnormal function Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/16—Ophthalmology
- G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及糖尿病视网膜病变检测技术领域，尤其涉及一种ALKBH5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用。本发明提供了检测ALKBH5蛋白的分子在制备用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒或检测试剂中的用途。可实现对DR的早期诊断，特别是在出现视网膜明显病变之前进行早期筛查、评估DM患者出现DR的风险，进行早期干预与宣教。以及评估已经发生DR的患者，其疾病进展的风险和预后情况。
Description
技术领域
本发明涉及糖尿病视网膜病变检测技术领域，尤其涉及一种ALKBH5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用。
背景技术
糖尿病(DM)是我国常见的内分泌疾病，其患病率随着人口增长、老龄化、经济发展及生活习惯的改变，呈逐年上升趋势，预计到2030年全球范围内DM患病总人数达到3.66亿，而中国将成为DM患者最多的国家。DM所致的组织病理病变可累及多个靶器官并引起多种并发症，其中糖尿病视网膜病变(DR)是DM最常见的并发症之一，也是工作年龄人群的首要致盲疾病。在我国，75％的DM患者在确诊后的15-20年内会出现DR，对患者的视力造成严重影响。因此，深入探索DR临床早期诊治方法，显得尤为重要。诊断方面，目前的筛查方式包括眼底照相、光学相干断层扫描、荧光素眼底血管造影等。
在DR诊断方面，目前的检查和诊断方法如眼底检查、OCT等往往需要待疾病进展到一定程度、眼底出现病变时才能被发现，这些检查方法也难以在早期，尚未出现微血管病变时评估DM患者发生DR的风险，及评估已经发展DR患者的进展风险。早期诊断方法的局限也导致了治疗方案效果的有限性，包括激光光凝、抗血管内皮生长因子玻璃体腔内注射、玻璃体视网膜手术等在内的当前多种治疗手段均是针对已经出现病变的重度及增殖期的DR，并未能从根本上阻止DR的发生和其发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ALKBH5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测ALKBH5蛋白的分子在制备用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒或检测试剂中的用途。
本发明的发明人研究发现，DR患者外周血单个核细胞中ALKBH5表达异常上调，通过m6A甲基化修饰降低导致下游一系列炎症相关基因表达异常，介导视网膜局部炎症产生，最终引起DR病理过程进展。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述试剂盒或检测试剂用于外周血液样品的检测。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述试剂盒或检测试剂用于外周血液样品中外周血单个核细胞的ALKBH5表达水平的检测。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述检测ALKBH5蛋白的分子是指能够特异性检测ALKBH5蛋白是否表达的分子。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述能够特异性检测ALKBH5蛋白是否表达的分子为核酸或蛋白质。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述蛋白质为抗体。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明同时提供一种用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒，所述试剂盒包括检测ALKBH5蛋白的分子。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包含：预包被有ALKBH5抗体的96孔板、96孔板覆膜、ALKBH5蛋白标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液和ALKBH5检测数值对应指数表。
本发明的有益效果：
(1)实现对DR的早期诊断，特别是在出现视网膜明显病变之前进行早期筛查。
(2)评估DM患者出现DR的风险，进行早期干预与宣教。
(3)评估已经发生DR的患者，其疾病进展的风险和预后情况。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
外周血单个核细胞是人体内重要的免疫细胞，其功能变化、分子表达改变往往预示着疾病状态的发生和发展。既往已有许多研究证实，外周血单个核细胞功能异常或某些标志基因表达的改变，是疾病早期重要标志，可用于临床疾病的早期诊治中。
m6A甲基化修饰是重要RNA表达调控机制，主要指RNA腺嘌呤第6位氮原子上连接的一个氢原子被甲基基团所取代，从而影响RNA的表达、剪切和翻译等多个层面，广泛参与细胞的分化与功能。作为一个RNA去甲基化酶，ALKBH5主要发挥“擦除”基因中m6A甲基化修饰的作用，进而降低mRNA的m6A甲基化修饰水平。
实施例1
本发明的发明人研究发现，DR患者外周血单个核细胞中ALKBH5表达异常上调，通过m6A甲基化修饰降低导致下游一系列炎症相关基因表达异常，介导视网膜局部炎症产生，最终引起DR病理过程进展。
具体实验过程如下：
(1)我们首先抽取DR患者外周血，并以正常人外周血作为对照，使用ficoll法分离其中的单个核细胞，随后通过trizol法提取外周血单个核细胞的RNA并进行逆转录，通过定量PCR法检测ALKBH5表达和炎症相关基因表达。
(2)通过上述方法提取RNA，通过RIP实验检测炎症相关基因的m6A甲基化修饰水平，利用RNAi技术和过表达技术在外周血单个核细胞中敲除/过表达ALKBH5，进而检测炎症相关基因的m6A甲基化修饰水平和表达水平。
实施例2
我们进一步探索外周血单个核细胞中m6A修饰水平和ALKBH5表达水平在DR患者早期诊断和预后评估中的价值。通过制备ELISA试剂盒，我们对DR大鼠模型的外周血单个核细胞的m6A甲基化水平和ALKBH5表达水平进行检测，结果发现对比正常大鼠，DR大鼠外周血单个核细胞中m6A甲基化水平在建模后1周开始降低，在8周时降低最为明显；而ALKBH5表达在建模后1周就开始升高，且在4周时达到峰值，而DR大鼠视网膜在建模后8周才可以观察到病变。此外，m6A甲基化水平与其视网膜病变严重程度呈负相关关系。具体实验过程如下：
(1)DR大鼠模型的制备
8周雄性SPF级SD大鼠，适应性饲养1周后进行建模。糖尿病组建模前禁食16h，称重空腹体重，尾静脉取血测定血糖浓度，一次性腹腔注射链脲佐菌素STZ(65mg/kg)，72h、96h、120h后应用稳步血糖测定仪检测随机血糖，测定体重，观察一般情况如体型及毛发颜色变化。每组取尾静脉血测量血糖，连续3次血糖≥16.7mmol/L，并出现典型的“三多一少”症状者，即可确定为糖尿病模型。
(2)检测DR大鼠和正常大鼠中m6A甲基化水平和ALKBH5表达水平
采用断尾法收集大鼠血清，按照上述方法分离外周血单个核细胞并提取RNA进行逆转录，通过荧光定量PCR法检测ALKBH5表达水平，通过m6A甲基化检测试剂盒检测其总m6A甲基化水平。
实施例3
我们进一步采集DR患者外周血单个核细胞，检测其m6A甲基化水平和ALKBH5表达水平，结果提示对比正常对照和不伴DR的DM患者，DR患者的m6A甲基化水平明显降低、ALKBH5表达明显升高，且与其视网膜病变严重程度明显相关。这些结果提示外周血单个核细胞的m6A甲基化修饰水平和ALKBH5表达水平可以作为DR的早期诊断和预后评估指标。具体实验过程如下：
筛选正常人、不伴DR的DM患者、患有DR的DM患者，按照上述方法分离外周血单个核细胞，提取其RNA并进行逆转录，通过荧光定量PCR法检测ALKBH5表达水平，并与患者视网膜病变评分进行相关性分析。
实施例4 m6A甲基化修饰检测试剂盒及其制备
(1)m6A甲基化修饰检测试剂盒的组成
96孔板、96孔板覆膜、m6A结合抗体、m6A结合溶液、m6A修饰片段标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液、m6A甲基化检测数值对应指数表。
(2)m6A试剂盒制备步骤
①96孔板包被：配置pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，加入m6A结合溶液500ul，同时加入待测样本1ml，于4℃孵育过夜。弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
②标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液配置：吸取100ml PBS缓冲液，加入0.1g BSA，充分混匀。
③洗涤液配置：1000ml PBS缓冲液，加入1ml Tween溶液，充分混匀。
④终止液：配置2mol/L硫酸溶液，室温静置备用。
实施例5 ALKBH5检测试剂盒及其制备
(1)ALKBH5检测试剂盒的组成
预包被有ALKBH5抗体的96孔板、96孔板覆膜、ALKBH5蛋白标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液、ALKBH5检测数值对应指数表。
(2)ALKBH5试剂盒制备步骤
①96孔板抗体包被：配置pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，稀释ALKBH5抗体至5ug/ml，每孔加入0.2ml，于4℃孵育过夜。弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
②标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液配置：吸取100ml PBS缓冲液，加入0.1g BSA，充分混匀。
③洗涤液配置：1000ml PBS缓冲液，加入1ml Tween溶液，充分混匀。
④终止液：配置2mol/L硫酸溶液，室温静置备用。
实施例6检测m6A甲基化修饰和ALKBH5的方法
(1)抽取DR患者外周血5ml，加入ficoll溶液，10000×g离心15min，留取中间白膜层，用反复液氮冻融法进行裂解。
(2)从试剂盒取一支标准品，10000rpm离心1min，用1ml样本稀释液溶解，通过倍比稀释法进行稀释7次(15.6-1000ng)。
(3)每孔加入标准品或检测样品(ALKBH5试剂盒)或m6A抗体溶液(m6A试剂盒)100ul，贴上覆膜，于摇床室温孵育2h。
(4)弃去液体，每孔加入洗涤液200ul，洗涤3次，每次1min。
(5)用生物素标记抗体稀释液溶解稀释生物素标记抗体，每孔加入100ul，于摇床室温孵育1h。
(6)同步骤(4)。
(7)用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液溶解稀释辣根过氧化物酶标记亲和素，每孔加入100ul，于摇床室温孵育1h。
(8)同步骤(4)。
(9)每孔加入TMB底物显色液100ul，室温避光孵育30min。
(10)每孔加入终止液50ul。
(11)通过酶标仪在450nm波长检测各孔光密度，通过拟合标准曲线计算出实际数值。
结果分析：
(1)检测范围：0.1-100ng/ml。
(2)特异性：与其他RNA甲基化修饰和m6A相关酶等无交叉反应。
(3)回收率：
| 样本 | 回收率范围(％) | 平均回收率(％) |
| 血清(n＝10) | 100-106 | 103 |
| 血浆(n＝10) | 82-93 | 88 |
| 细胞培养上清(n＝10) | 85-94 | 90 |
(4)线性：
(5)准确性：批内差CV<6.4％，批间差CV<5.8％
(6)研究结果
表1 m6A检测数值对应指数
表2 ALKBH5检测数值对应指数
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.检测ALKBH5蛋白的分子在制备用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒或检测试剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒或检测试剂用于外周血液样品的检测。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒或检测试剂用于外周血液样品中外周血单个核细胞的ALKBH5表达水平的检测。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测ALKBH5蛋白的分子是指能够特异性检测ALKBH5蛋白是否表达的分子。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述能够特异性检测ALKBH5蛋白是否表达的分子为核酸或蛋白质。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述蛋白质为抗体。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
8.一种用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测ALKBH5蛋白的分子。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：预包被有ALKBH5抗体的96孔板、96孔板覆膜、ALKBH5蛋白标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液和ALKBH5检测数值对应指数表。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110890688.5A CN113667735A (zh) | 2021-08-04 | 2021-08-04 | Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110890688.5A CN113667735A (zh) | 2021-08-04 | 2021-08-04 | Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113667735A true CN113667735A (zh) | 2021-11-19 |
Family
ID=78541301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110890688.5A Pending CN113667735A (zh) | 2021-08-04 | 2021-08-04 | Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113667735A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118360388A (zh) * | 2024-06-14 | 2024-07-19 | 中南大学湘雅二医院 | 环状RNA及其m6A甲基化修饰的应用 |
| CN119716058A (zh) * | 2024-12-12 | 2025-03-28 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 特异性结合nse蛋白或其编码基因的物质在制备arn诊断产品或预后产品中的用途 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090203602A1 (en) * | 2006-09-01 | 2009-08-13 | Cohava Gelber | Compositions and methods for diagnosis and treatment of type 2 diabetes |
| CN104212908A (zh) * | 2014-09-26 | 2014-12-17 | 陈有信 | 一种糖尿病视网膜病变代谢记忆检测试剂及其应用 |
| CN108796063A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-13 | 云南省第二人民医院 | Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用 |
| WO2019040664A1 (en) * | 2017-08-22 | 2019-02-28 | Salk Institute For Biological Studies | RNA TARGETING METHODS AND COMPOSITIONS |
| WO2020179953A1 (ko) * | 2019-03-07 | 2020-09-10 | (주)레티마크 | 당뇨망막병증 진단용 복합 마커 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-08-04 CN CN202110890688.5A patent/CN113667735A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090203602A1 (en) * | 2006-09-01 | 2009-08-13 | Cohava Gelber | Compositions and methods for diagnosis and treatment of type 2 diabetes |
| CN104212908A (zh) * | 2014-09-26 | 2014-12-17 | 陈有信 | 一种糖尿病视网膜病变代谢记忆检测试剂及其应用 |
| WO2019040664A1 (en) * | 2017-08-22 | 2019-02-28 | Salk Institute For Biological Studies | RNA TARGETING METHODS AND COMPOSITIONS |
| CN108796063A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-13 | 云南省第二人民医院 | Micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用 |
| WO2020179953A1 (ko) * | 2019-03-07 | 2020-09-10 | (주)레티마크 | 당뇨망막병증 진단용 복합 마커 및 이의 용도 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118360388A (zh) * | 2024-06-14 | 2024-07-19 | 中南大学湘雅二医院 | 环状RNA及其m6A甲基化修饰的应用 |
| CN118360388B (zh) * | 2024-06-14 | 2024-08-16 | 中南大学湘雅二医院 | 环状RNA及其m6A甲基化修饰的应用 |
| CN119716058A (zh) * | 2024-12-12 | 2025-03-28 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 特异性结合nse蛋白或其编码基因的物质在制备arn诊断产品或预后产品中的用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tanaka et al. | Profiles of extracellular miRNAs in the aqueous humor of glaucoma patients assessed with a microarray system | |
| Ulhaq et al. | The role of IL-6-174 G/C polymorphism and intraocular IL-6 levels in the pathogenesis of ocular diseases: a systematic review and meta-analysis | |
| Wölfler et al. | Altered expression of progesterone receptor isoforms A and B in human eutopic endometrium in endometriosis patients | |
| JP2008502908A (ja) | 肝臓疾患に関連する方法およびシステム | |
| JP5555940B2 (ja) | 増殖糖尿病網膜症の検出方法および予防・治療剤のスクリーニング方法 | |
| CN113667735A (zh) | Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 | |
| CN113176414B (zh) | 用于高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的铁代谢相关蛋白质标记物组合物及其应用 | |
| González‐Palomo et al. | Profile of urinary exosomal microRNAs and their contribution to diabetic kidney disease through a predictive classification model | |
| Kolovos et al. | A multitrait open-angle glaucoma polygenic risk score stratifies risk of glaucoma diagnosis and severity in eyes with pseudoexfoliation | |
| CN110702930A (zh) | 24-羟基胆固醇在制备抑郁症诊断治疗相关产品的用途 | |
| CN102534009A (zh) | 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| US20100203553A1 (en) | Histochemical and biomarker for liver fibrosis | |
| CN113848327A (zh) | 用于高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的标志物组合物及其应用 | |
| KR101470795B1 (ko) | 당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도 | |
| CN118033143A (zh) | 一种用于预测缺血性卒中发生的血清生物标志物及其应用 | |
| CN113403385B (zh) | Mef2c在诊断和治疗哮喘中的用途 | |
| Surasmiati et al. | Serum microRNA-126 expression as a biomarker of diabetic retinopathy | |
| CN117590006B (zh) | 生物标志物在制备诊断Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用 | |
| CN117607462B (zh) | 生物标志物在制备诊断后巩膜炎的产品中的应用 | |
| WO2020140425A1 (zh) | 一组血清差异蛋白组合在制备用于检测孤独症的试剂中的应用 | |
| CN117590007A (zh) | 生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用 | |
| CN108546751A (zh) | 蛋白s作为生物标志物在制备哮喘疾病诊断和预后效果评价试剂中的应用 | |
| JP2020020755A (ja) | 肝硬変の診断方法、非アルコール性脂肪肝炎及び肝細胞がんの合併症の診断方法並びに非アルコール性脂肪肝炎及び食道胃静脈瘤の合併症の診断方法 | |
| CN120485350A (zh) | 用于诊断评估脓毒症心肌病的piRNA标志物、试剂盒及其应用 | |
| CN118834946A (zh) | 非经典炎症小体作为腺病毒肺炎诊断标志物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211119 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |